CN114214264B - 一种草莓原生质体分离纯化及基因瞬时表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了草莓原生质体分离纯化及基因瞬时表达的方法，草莓原生质体分离纯化的方法包括以下步骤：(1)使用无菌草莓种子放入培养基中培养，获得无菌草莓幼苗；取新发幼嫩的叶片，灭菌放入甘露醇溶液中浸泡30‑90min；(2)将甘露醇溶液浸泡后的叶片放入酶解液中，在真空环境中放置5‑10min后取出，进行酶解5‑7h；酶解后用细胞滤筛去除杂质，离心，获得草莓原生质体；所述的酶解液包括1‑5％Cellulase R10、0.1‑3％Macerozyme R10、0.3‑0.7mol/L甘露醇、5‑15mmol/L MES、0.01‑0.1％BSA、5‑15mmol/L CaCl2。本发明的分离纯化方法获取的草莓原生质体细胞透亮、内溶物清晰可见、活性较高，可以顺利完成草莓基因瞬时表达及亚细胞定位检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种草莓原生质体分离纯化及基因瞬时表达的方法。
背景技术
栽培草莓(Fragaria×ananassa，蔷薇科，草莓属，以下称草莓)是我国一种重要的经济作物，其风味可口、外观诱人、附价值高。由于质地柔软、富含营养，草莓的果实品质影响采收后果实的生理、病理变化，并直接与经济价值相关。生物技术的发展加速了作物品质改良的速度，结合基因组学，通过作物品质相关基因的表达调控优化作物品质，已在诸多农作物中得以实现。Edger等人于2019年(参见文章“Origin and evolution of theoctoploid strawberry genome”，Nature Genetics，51：541–547，2019)发布高质量八倍体草莓基因组，经重注释后，为草莓生物技术领域研究提供可靠参比基因组。然而，目前草莓物种仍未建立稳定的遗传体系，有参基因组中的基因功能难以得到验证。草莓系多年生植物，生长周期长，其染色体倍性为八倍体，纯合植株难以获得。结合遗传学、分子生物学技术，使用原生质体作为转化对象，从核酸、蛋白等多个层面，研究草莓内源基因的调控，极大程度的解决了草莓稳定遗传植株难以获得的问题，加速草莓转化体系的构建。原生质体是分子生物学研究非常好的实验对象，然而成熟草莓叶片细胞壁坚硬，病虫害多，果实液泡程度大，叶绿体极少，诸多原因导致在草莓物种中仍旧缺乏原生质体提纯及转化体系。
植物原生质体即无细胞壁的完整植物细胞结构，DNA、RNA、蛋白等生物大分子可以通过聚乙二醇(以下称PEG)-钙离子融合、电穿孔、微针注射法递送进原生质体。目前原生质体已应用于细胞融合、基因功能验证、基因下游信号转导、单细胞测序、合成生物学等传统及前沿领域的研究当中。由于草莓的瞬时表达、原生质体转化体系尚不成熟，草莓内源基因的定位、功能验证、信号转导等分子生物学实验需借助拟南芥、烟草等模式植物完成。然而由于进化导致的种间差异及草莓染色体融合导致的多倍体基因组的复杂性，使用模式植物对草莓基因进行研究，无法提供有力的生物学证据。更进一步地，使用草莓原生质体作为研究材料，可以实现前沿生物学技术在草莓上的应用。
植物原生质体于1960年被Cocking(参见文章“A method for the isolation ofplant protoplasts and vacuoles”，Nature，187：962-963，1960)使用酶解法首次分离，经多次优化后应用于拟南芥等模式植物，中国专利CN109355246A公开了一种拟南芥叶肉细胞原生质体的提取方法，该方法采用1％纤维素酶，0.25％离析酶，0.4mol/L甘露醇，20mmol/L氯化钾，20mmol/L 2-吗啉乙磺酸，10mmol/L氯化钙，0.1％牛血清蛋白，pH＝5.7作为酶解液提取拟南芥原生质体，提取时间为30-90min。然而，经发明人试验，该方法无法直接应用于草莓原生质体的提取，所提取的原生质体数量少、细胞形态各异、内溶物浑浊。不同植物细胞壁结构及组分不同，对酶的耐受性不同，原生质体的提取对于酶解液配方、酶解液浓度、酶解时间等诸多条件限制。中国专利CN112251395A公开了一种枇杷叶片原生质体提取方式，使用1-5.4％纤维素酶RS、1.8-4.7％离析酶R-10作为酶解液酶解2-4h释放原生质体。中国专利CN112760276A公开了一种柑橘外植体原生质体的提取方法，然而，提纯原生质体，需要培养外植体，将限速原生质体提纯步骤。中国专利CN102505004A公开了一种草莓原生质体的提纯方法，其采用1.0-2.0％纤维素酶Cellulase Onozuka R-10、0.5-1.0％果胶酶Pectolyase Y-23、0.6mol/L的甘露醇、0.1-0.2％2-(N-吗啡啉)乙磺酸MES、0.05mol/L的CaCl2作为酶解液酶解草莓叶片11-14h，从该专利中图片文件可观察到，此方法提纯的原生质体细胞大小、形态不一，细胞数量稀疏，细胞内溶物浑浊，一些细胞出现明显的破损，不适用于后续分子生物学实验。发明人发现使用成熟的草莓叶片进行酶解，发现由于细胞壁过硬，叶片在酶解液中无法正常释放原生质体；而使用果实、外植体等进行提取，无法获得完整的原生质体细胞或原生质体细胞叶绿体过少、活性过低，无法满足下游生物技术实验需求。
基因瞬时表达技术，即将带有特定启动子、特定序列及目的基因的质粒转化至细胞内，使基因在一定时间内进行胞内高表达。瞬时表达技术常用于对特定基因进行定位，更具体地，将目的基因的N端或C端与荧光蛋白结合，结合荧光显色技术，在电子显微镜下观察目的基因编码的目的蛋白的亚细胞定位，原生质体内含有除细胞壁外的所有细胞器，使用本物种原生质体可以为目的蛋白亚细胞定位提供有力分子证据。公开号为CN105647965A的中国专利文献公开了一种柑橘原生质体转化及提纯的方法，包括：使用酶解法提取柑橘原生质体，并向原生质体中递送外源质粒，实现了柑橘原生质体的瞬时表达。然而，由于草莓与柑橘的异源性及细胞特性的不同，该方法无法直接应用于草莓原生质体的转化，草莓原生质体的转化及基因的瞬时表达仍需另辟蹊径。
原生质体的转化需要极高活性的原生质体，然而，目前国内外仍缺乏高质量草莓原生质体成熟的提纯方法，更无草莓原生质体相关的转化方法。
发明内容
本发明提供了一种草莓原生质体分离纯化及基因瞬时表达的方法，使用该方法提纯的草莓原生质体细胞透亮、内溶物清晰可见、活性较高，可以顺利完成蛋白瞬时表达及亚细胞定位检测。
本发明的技术方案如下：
一种草莓原生质体分离纯化的方法，包括以下步骤：
(1)使用无菌草莓种子放入培养基中培养，获得无菌草莓幼苗；取新发幼嫩的叶片，灭菌放入甘露醇溶液中浸泡30-90min；
(2)将甘露醇溶液浸泡后的叶片放入酶解液中，在真空环境中放置5-10min后取出，进行酶解5-7h；酶解后用细胞滤筛去除杂质，离心，获得草莓原生质体；
所述的酶解液包括1-5％Cellulase R10、0.1-3％Macerozyme R10、0.3-0.7mol/L甘露醇、5-15mmol/L MES、0.01-0.1％BSA、5-15mmol/L CaCl2。
现有的酶解方法中，叶片组织坚硬、酶解效率极低。不同植物细胞壁结构及组分不同，对酶的耐受性不同，原生质体的提取对于酶解液配方、酶解液浓度、酶解时间等诸多条件限制。本发明使用草莓幼嫩叶片，采用特定的酶解液进行酶解，可以有效地提取释放高浓度的原生质体，使用该方法提纯的原生质体细胞透亮、内溶物清晰可见、活性较高，可以顺利完成蛋白瞬时表达及亚细胞定位检测。
草莓种子须取用放置时间短的，形态饱满、活力高的草莓种子。草莓种子可以采用次氯酸钠溶液消毒，次氯酸钠溶液浓度为10％(v/v)，消毒时间为5min，消毒后用灭菌清水清洗三次。
步骤(1)中，无菌草莓种子需光照-黑暗交替培养，培养温度为25±1℃；将无菌草莓种子放入培养基前，须在4℃黑暗条件下放置10-15天。
步骤(1)中，所述的培养基为草莓MS培养基，包括MS培养基粉剂4.44g/L、蔗糖15g/L、琼脂5g/L；pH为5.8。
优选的，所述的酶解液包括3％Cellulase R10、1.5％Macerozyme R10、0.5mol/L甘露醇、5-15mmol/L MES、0.01-0.1％BSA、5-15mmol/L CaCl2。
最优选的，所述的酶解液包括3％Cellulase R10、1.5％Macerozyme R10、0.5mol/L甘露醇、10mM MES、0.1％BSA、10mM CaCl2。
酶解液的配制方法包括：将配方浓度的甘露醇、MES、Cellulase R10、MacerozymeR10在烧杯中用蒸馏水溶解，在55℃条件下加热10min；冷却到室温后，再依次加入配方浓度的BSA、CaCl2。优选地，酶解液须冷却到室温后再使用。
优选的，草莓叶片与酶解液的质量体积比为1：2-5。此时能充分满足草莓原生质体提取要求，酶解液过少导致细胞壁酶解不充分，有较多杂质，原生质体释放少；酶解液过多导致原生质体浓度低，原生质体质量、活性差。
步骤(2)中，真空环境的真空度为0.08-0.1Mpa。
步骤(2)中，在摇床中进行酶解；摇床转速50-70rpm，温度为25℃。
本发明在酶解法提取草莓原生质体过程，需在每一步对原生质体进行质量控制，以保证方法顺利实施，原生质体质控步骤将按照下述方法进行：
步骤(2)酶解完成后首先观察叶片酶解情况，若存在较多未酶解的叶片则弃去；取1μL酶解后的液体在光学显微镜下镜检，若细胞透亮、细胞器明显可见则可用于进一步研究，若细胞黑而浑浊，则弃去。
步骤(2)中，过网筛后离心，离心后圆底离心管底部有较多浅绿色沉淀，即为草莓原生质体细胞，且数量多；若无沉淀或沉淀较少、沉淀发白，则提取细胞少、质量差，不符合后续实验需求。
通过本发明草莓原生质体分离纯化的方法获得质量高、活性好的草莓原生质体后，为实现原生质体内基因的瞬时表达，本发明还公开了使用PEG-钙离子法递送已构建瞬时表达载体，建立草莓原生质体转化体系的方法。
一种通过钙离子-PEG递送法进行草莓基因瞬时表达的方法，包括以下步骤：
(i)向上述方法获取的草莓原生质体加入W5溶液，混匀后0℃静置20-30min；
(ii)静置后离心弃去上清液，向细胞沉淀加入MMG溶液，混匀后得细胞溶液，计算细胞数量；
将表达载体预先加入离心管中，随后将细胞溶液加入离心管底部，混匀后加入PEG4000溶液，于室温放置8-15min；
(iii)之后向离心管中加入W5溶液，离心后去上清，再加入W5溶液以悬浮原生质体，在26-28℃条件下进行培养24-36h；
(iv)将步骤(iii)中完成培养的细胞室温离心，去上清液，保留底部250μL细胞，轻弹悬浮细胞，用于草莓基因瞬时表达实验。
W5溶液用于悬浮、清洗原生质体。所述的W5溶液包含154mmol/L NaCl、125mmol/LCaCl2、5mmol/L KCl、2mmol/L MES；优选地，所述的W5溶液中的MES须调整pH至5.7。
步骤(i)中，所用W5溶液须在4℃预冷。
优选的，步骤(i)-(iv)中，离心转速不大于120g，加速度、减速度为2；步骤(i)中离心温度为4℃；步骤(ii)-(iv)中离心温度为25℃。
具体地，步骤(ii)中，使用血细胞计数器计算细胞数量，该方法所提取草莓原生质体可达到3.2×106个/mL。
优选的，步骤(ii)中，所述的表达载体的用量为10-15μg。
具体地，所述的表达载体须带有植物可识别的强启动子，并确认已将表达的目的片段构建进入载体序列；更具体地，若有荧光定位等特殊需求，须在表达片段N端或C端加入荧光蛋白标签序列，若在N端构建荧光蛋白序列，则须去除终止密码子。
不同平均分子量、浓度的PEG所达到的核酸递送效果不同，经过实验验证，40％PEG4000对于草莓原生质体的核酸递送效果最佳。因此，优选的，步骤(ii)中，PEG4000溶液的体积百分比浓度为40％(v/v)。
进一步优选地，PEG4000溶液在摇床中室温条件下溶解30min；或55℃热水浴溶解，恢复到室温后使用。
优选的，步骤(ii)中，所述的MMG溶液包含0.4mol/L甘露醇、15mmol/L MgCl2、4mmol/L MES，MMG溶液pH为5.7。
步骤(iv)中，草莓基因瞬时表达实验包括亚细胞定位实验、BiFC实验、RT-qPCR实验、Co-IP实验、RNA-seq实验、ChIP-seq实验、单细胞测序实验。
优选的，用于亚细胞定位实验时，取少量步骤(iv)获得的细胞悬浮液于激光共聚焦显微镜下观察；用于BiFC实验时，则检测步骤(iv)获得的细胞悬浮液的荧光强度；用于RT-qPCR实验时，则提取步骤(iv)获得的细胞中RNA检测基因表达量；用于Co-IP实验时，则对步骤(iv)获得的细胞悬浮液进行下游免疫印记反应。
优选的，用于亚细胞定位实验或BiFC实验时，需2×105个细胞；用于Co-IP实验或RT-qPCR实验时，需4×105个细胞；用于RNA-seq实验或ChIP-seq实验时，需1×107个细胞；用于单细胞测序时，需2×107个细胞。
上述所有离心速度均不超过120g，加、减速度均为2，以保证细胞不破碎。操作中所使用的移液器枪头均为去尖枪头、所用离心管均为圆底离心管。
本发明利用草莓无菌苗幼嫩叶片所提取草莓原生质体，规避了成熟草莓叶片无法直接提纯的方法，规避了草莓果实、外植体无法提纯高活性、富含叶绿体的原生质体的问题，本发明的原生质体分离和纯化方法为草莓物种首创。同时，本发明的原生质体分离和纯化方法获取的草莓原生质体可应用于包括但不限于以上所述的分子生物学实验。
附图说明
图1为实施例1所制备的原生质体在光学显微镜下形态图；其中，(a)是10倍显微镜下观察图；(b)为45倍显微镜下观察图；
图2为实施例1所制备的原生质体在电子显微镜下的形态图；
图3为实施例3中RT-qPCR的结果；其中，(a)为组成型表达基因23S的CT值，(b)为诱导性表达基因FaCERK的CT值；
图4为实施例4所用pC1300-35S-gfp质粒的结构图；
图5为实施例4中质粒转化后原生质体在共聚焦显微镜下所观察的结果；(a)为10倍放大时共聚焦显微镜的图像，(b)为45倍放大时共聚焦显微镜的图像。
具体实施方式
实施例1
本实施例针对原生质体提取时甘露醇浸泡浓度进行优化，所用草莓品种为“红颜”，涉及以下步骤：
(1)将“红颜”草莓种子放入培养皿中，加入一定量的水，在4℃条件下培养12天；
将低温培养后的种子浸入10％次氯酸钠中消毒5min，随后立即使用无菌水清洗3次，自然晾干后，将种子置于MS培养基中，方法所用“红颜”草莓种子在温度为20±1℃，光照强度为60lux的培养房中进行培养；
(2)约30天后待叶片长出后，取长势较好，较绿的叶片，将超净台台面用酒精消毒，待挥发干后，在台面上用手术刀将叶片衰老、较硬、颜色发黄或发黑的部分去除，将所剩幼嫩的叶片切成2mm×2mm左右的方块；
(3)将嫩叶方片放入0.5M甘露醇溶液中浸泡60min；
(4)弃去甘露醇溶液，加入事先配置好的酶解液，在真空环境中放置5-10min，待酶解液渗透入组织，且大部分叶片沉入烧杯底部后，从真空环境中取出；
(5)将烧杯在摇床中进行酶解数小时，而后使用75μm细胞筛过滤杂质；
(6)将过滤后的草莓原生质体转移至5mL圆底离心管，120g离心5min，加速度、减速度均为2；
(7)弃去酶解液，向离心管中缓缓加入2mLMMG溶液，手指轻弹充悬细胞，光学显微镜镜检观察，并在血细胞计数版上进行计数。
表1位本发明所使用试剂及其来源公司。
表1
草莓叶片与原生质体之间结构紧密，传统直接酶解法不适合其提取，故本发明使用高渗溶液甘露醇对草莓叶片进行浸泡，使质壁一定程度的分离，参照实例1的实施步骤，发明人对草莓原生质体提取所需甘露醇浓度，本实施例着重优化不同浓度甘露醇对草莓原生质体形态的影响，优化按照以下酶解液配方进行：
a.0.3M甘露醇，3％Cellulose R10，1.5％Macerozyme R10，10mM MES，0.1％BSA，10mM CaCl2，pH＝5.7。
b.0.5M甘露醇，3％Cellulose R10，1.5％Macerozyme R10，10mM MES，0.1％BSA，10mM CaCl2，pH＝5.7。
c.0.7M甘露醇，3％Cellulose R10，1.5％Macerozyme R10，10mM MES，0.1％BSA，10mM CaCl2，pH＝5.7。
在摇床(55rpm，25℃)中进行提取6h后，通过光学显微镜观察发现，组a全视野原生质体形态正常，细胞透亮，细胞器可见，但全视野数量十分少，细胞数量不满足后续实验要求；组b原生质体数量较多，细胞大多为规整圆形，细胞透亮，可见细胞器，且形态正常；组c可见较多细胞碎屑、杂质，有一定数量的原生质体，但细胞呈现长条状，细胞器拥挤，不适用于下游方法实施。
将上述组b所得原生质体放在光学显微镜下进行观察，观察结果如图1所示。进一步地，本发明方法使用0.5M甘露醇作为原生质体提取液配方。
实施例2
实施例2针对Cellulase R10、Macerozyme R10两种酶的浓度进行优化，其步骤与实施例1相同，酶解液成分按照以下比例进行配制：
d.0.5M甘露醇，1％Cellulose R10，0.5％Macerozyme R10，10mM MES，0.1％BSA，10mM CaCl2，pH＝5.7。
e.0.5M甘露醇，1％Cellulose R10，1.5％Macerozyme R10，10mM MES，0.1％BSA，10mM CaCl2，pH＝5.7。
f.0.5M甘露醇，1％Cellulose R10，2.5％Macerozyme R10，10mM MES，0.1％BSA，10mM CaCl2，pH＝5.7。
g.0.5M甘露醇，3％Cellulose R10，0.5％Macerozyme R10，10mM MES，0.1％BSA，10mM CaCl2，pH＝5.7。
h.0.5M甘露醇，3％Cellulose R10，1.5％Macerozyme R10，10mM MES，0.1％BSA，10mM CaCl2，pH＝5.7。
i.0.5M甘露醇，3％Cellulose R10，2.5％Macerozyme R10，10mM MES，0.1％BSA，10mM CaCl2，pH＝5.7。
j.0.5M甘露醇，5％Cellulose R10，0.5％Macerozyme R10，10mM MES，0.1％BSA，10mM CaCl2，pH＝5.7。
k.0.5M甘露醇，5％Cellulose R10，1.5％Macerozyme R10，10mM MES，0.1％BSA，10mM CaCl2，pH＝5.7。
l.0.5M甘露醇，5％Cellulose R10，2.5％Macerozyme R10，10mM MES，0.1％BSA，10mM CaCl2，pH＝5.7。
(1)将20±1℃培养的“红颜”草莓叶片取下，用无菌清水清洗三次后，在超净台内自然晾干，将晾干后的叶片放入无菌水中，在超净台中过夜培养；
(2)将所得叶片在超净台中用手术刀将衰老、较硬、颜色发黄的部分去除，将所剩幼嫩的叶片切成2mm×2mm左右的方片，用于后续实验；
(3)将叶片放入0.5M甘露醇溶液中浸泡60min，按照以下表格中酶解液浓度进行酶解，并取酶解液镜检观察；
表2是不同酶浓度条件下草莓原生质体提取的结果，酶解时间为6小时。
表2
进一步地，基于上述结果，3％Cellulase R10、1.5％Macerozyme R10所获原生质体数量最多、形态最佳，故本发明所述叶片原生质体提取液选取3％Cellulase R10、1.5％Macerozyme R10作为酶解液配方。
进一步地，取使用该酶解液所提取的原生质体悬浮液于电子显微镜下进行镜检观察，结果如图2所示。
实施例3
本发明所获草莓原生质体可用于下游分子生物学实验验证，本实施例旨在使用本发明所得原生质体进行分子生物学常用的RT-qPCR实验。
(1)将MS培养基中所得“红颜”草莓新鲜幼嫩的叶片用无菌水清洗三遍后，放入无菌水中，过夜培养；
在超净台中去除较粗的叶脉和衰老的叶片，将叶片用手术刀切成2mm×2mm左右的方片；
(3)将叶片放入0.5M甘露醇溶液中浸泡60min，随后使用清水清洗，自然晾干后放入酶解液中进行酶解5h，所述酶解液包含：0.5M甘露醇，3％Cellulose R10，1.5％Macerozyme R10，10mM MES，0.1％BSA，10mM CaCl2，pH＝5.7；
(4)酶解后用75μm细胞滤筛滤去的杂质，转移至圆底离心管中，120g离心5min，取一滴进行镜检观察；
(3)收集圆底细胞沉淀，即原生质体，沿管壁缓缓加入4mL W5溶液，手指轻弹混匀，离心10min后收集沉淀，加入5mL W5溶液，手指轻弹混匀，于冰上静止20-30min；
(4)120g加减速为2，离心后收集细胞沉淀，加入2mL MMG溶液并混匀，取一滴至血细胞计数板下进行计数。向悬浮液中加入100nM浓度的几丁质(溶解于MMG溶液)，25℃下孵育2.5h。分别取含有4×103、4×104、4×105、4×106个细胞的悬浮液体积，使用Trizol法提取原生质体RNA，并反转录为cDNA，取相同体积cDNA模板进行实时荧光定量PCR检测组成型表达基因23S及诱导型表达基因FaCERK；
通过实时荧光定量PCR获得23S、FaCERK基因表达的CT值，使用4×103个原生质体细胞进行RT-qCPR时，而基因均无法检测到表达量；使用4×104个原生质体进行RT-qPCR时，23S可检测到表达量，但CT值过高，提示模板浓度低，FaCERK无法检测到表达量；使用4×105及4×106个细胞时，23S、FaCERK均可以检测到正常的表达量。表明本发明所获原生质体可正常进行下游RT-qPCR实验。
实施例4
本发明所创新方法旨在提纯高活性的原生质体应用于分子生物学实验，本实施例使用钙离子-PEG法向本方法所获原生质体中递送外源DNA，并成功进行瞬时表达，获得内源蛋白亚细胞定位信息。
(1)将MS培养基所得新鲜幼嫩的、长势较好的“红颜”草莓绿色叶片取下，在无菌水中过夜培养；
(2)在超净台中将叶片用手术刀切成2mm×2mm左右的方片，将叶片放入0.5M甘露醇溶液中浸泡60min，清水清洗并晾干后放入酶解液中酶解5h，所述酶解液包含：0.5M甘露醇，3％Cellulose R10，1.5％Macerozyme R10，10mM MES，0.1％BSA，10mM CaCl2，pH＝5.7，酶解后用75μm细胞滤筛滤去杂质，转移至圆底离心管中，120g加减速为2，离心5min；
(3)收集圆底细胞，加入4mL W5溶液，混匀后120g加减速为2，离心10min，收集沉淀细胞并加入5mL W5溶液，混匀后于冰上静止30min；
(4)4℃、120g加减速为2，离心后收集细胞，加入2mL MMG溶液，轻弹混匀，计算细胞数量。在离心管底加入10-15μg含有目的基因的pC1300-35S-gfp，结构如图4所示，将200μL细胞溶液缓缓加入管底，混匀后加入200μL PEG4000溶液，室温放置15min；
(5)缓缓加入1.5mL W5溶液至离心管中，4℃、120g加减速为2离心5min后去除上清，再沿管壁加入1mL W5悬浮原生质体，在27±1℃培养箱中进行培养30h；
(6)室温、120g加减速为2离心5min后去上清液，保留250μL原生质体细胞，轻弹以悬浮细胞。取少量细胞于Olympus，FV3000激光共聚焦显微镜下观察。
本发明所得原生质体活性高，可顺利用于亚细胞定位，如图5所示，可推测目的基因定位于细胞核、细胞质当中。
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种草莓原生质体分离纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）使用无菌草莓种子放入培养基中培养，获得无菌草莓幼苗；取新发幼嫩的叶片，灭菌放入甘露醇溶液中浸泡30-90min；所述的草莓的品种为红颜；
（2）将甘露醇溶液浸泡后的叶片放入酶解液中，草莓叶片与酶解液的质量体积比为1：2-5，在0.08-0.1Mpa的真空环境中放置5-10min后取出，进行酶解5-7h；酶解后用细胞滤筛去除杂质，离心，获得草莓原生质体；
所述的酶解液由3% Cellulase R10、1.5% Macerozyme R10、0.5mol/L甘露醇、10mMMES、0.1% BSA、10mM CaCl2组成；
酶解液的配制方法包括：将配方浓度的甘露醇、MES、Cellulase R10、Macerozyme R10在烧杯中用蒸馏水溶解，在55℃条件下加热10min；冷却到室温后，再依次加入配方浓度的BSA、CaCl2。
2.一种通过钙离子-PEG递送法进行草莓基因瞬时表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（i）向如权利要求1所述的方法获取的草莓原生质体加入W5溶液，混匀后0℃静置20-30min；
（ii）静置后离心弃去上清液，向细胞沉淀加入MMG溶液，混匀后得细胞溶液，计算细胞数量；
将表达载体预先加入离心管中，随后将细胞溶液加入离心管底部，混匀后加入PEG4000溶液，于室温放置8-15min；
（iii）之后向离心管中加入W5溶液，离心后去上清，再加入W5溶液以悬浮原生质体，在26-28℃条件下进行培养24-36h；
（iv）将步骤（iii）中完成培养的细胞室温离心，去上清液，保留底部250μL细胞，轻弹悬浮细胞，用于草莓基因瞬时表达实验；
草莓基因瞬时表达实验包括对免疫诱导基因进行RT-qPCR实验或RNA-seq实验；用于RT-qPCR实验时，需4×105个细胞；用于RNA-seq实验时，需1×107个细胞。
3.根据权利要求2所述的通过钙离子-PEG递送法进行草莓基因瞬时表达的方法，其特征在于，所述的W5溶液包含154mmol/L NaCl、125 mmol/L CaCl2、5 mmol/L KCl、2 mmol/LMES；所述的MMG溶液包含0.4mol/L甘露醇、15mmol/L MgCl2、4mmol/L MES，MMG溶液pH为5.7；PEG4000溶液的体积百分比浓度为40%。
4.根据权利要求2所述的通过钙离子-PEG递送法进行草莓基因瞬时表达的方法，其特征在于，步骤（ii）-（iv）中，离心转速不大于120g，加速度、减速度为2，离心温度为25℃。
5.根据权利要求2所述的通过钙离子-PEG递送法进行草莓基因瞬时表达的方法，其特征在于，用于亚细胞定位实验时，取少量步骤（iv）获得的细胞悬浮液于激光共聚焦显微镜下观察；用于BiFC实验时，则检测步骤（iv）获得的细胞悬浮液的荧光强度；用于RT-qPCR实验时，则提取步骤（iv）获得的细胞中RNA检测基因表达量；用于Co-IP实验时，则对步骤（iv）获得的细胞悬浮液进行下游免疫印记反应。
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| 红颜"草莓原生质体制备及瞬时转化体系的建立;杜小云等;《生物资源》;第41卷(第6期);第532-538页 * |
| 罗伯•里德（Rob Reed）等.《生物分子科学实验技术》.湖南科学技术出版社,2001,(第1版),第88页. * |
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