CN112980764B - 一种快速高效的香茅原生质体制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速高效的香茅原生质体制备方法，属于植物细胞工程领域。采用健康生长的香茅组培苗为实验材料，使用CPW溶液配制酶解液，采用低速震荡酶解法对香茅叶片进行酶解消化，高效的制备原生质体。最后利用蔗糖密度梯度离心法纯化收集高质量的香茅原生质体。本发明简单方便，易于操作，且分离得到的原生质体产量高，细胞完整，呈球形，富含叶绿体，具有较高活力。本发明为利用香茅叶片瞬时转化体系进行基因功能鉴定、亚细胞定位、蛋白质互作以及香茅细胞融合、单细胞测序等方面的研究应用提供重要基础。

Description

一种快速高效的香茅原生质体制备方法

技术领域

本发明属于植物细胞工程领域，涉及一种快速高效的香茅原生质体制备方法。

背景技术

香茅(Cymbopogon citratus)，是香茅属多年生具有芳香气味的草本植物，原产于热带地区，如印度、斯里兰卡等，在我国的广东、海南、云南等地广泛分布。古书记载香茅草性味甘、辛、性温,有疏风通络,温中止痛、醒脑、止泻的功效。香茅用作茶饮具有一定的保健作用，其药理作用主要为抗菌、抗炎、镇痛、抗氧化、抗肿瘤、抗焦虑、降压、降血糖等。其茎叶提取的精油在食物、防腐、医药等领域有着广泛的应用。

原生质体指细胞通过质壁分离，能够和细胞壁分开的那部分细胞物质，包括细胞膜、细胞质和细胞核，换言之原生质体就是除去细胞壁的被细胞膜包围的“裸露细胞”。植物原生质体由于失去了细胞壁的包被，更易接受外源DNA等物质，是进行基因功能鉴定、亚细胞定位、蛋白质互作等方面的研究的理想材料。

另外原生质体融合技术对于培育新品种同样有着重要意义。目前对香茅的研究主要集中在有效化学成分的提取、分离及活性研究上。未发现关于香茅原生质体制备的研究报道，因此，现在急需一种快速高效的香茅原生质体的制备方法，为后续利用原生质体进行基因功能鉴定、亚细胞定位、蛋白质互作以及细胞融合、单细胞测序等方面的研究打下坚实的基础。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种简单、快速高效的香茅原生质体制备方法。利用本发明的方法可获得大量活性高的原生质体，进而为后续利用原生质体进行基因功能鉴定、亚细胞定位、蛋白质互作以及细胞融合、单细胞测序等方面的研究打下坚实的基础。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供一种香茅原生质体的制备方法，利用香茅组培幼苗为材料，利用CPW溶液配制酶解液，采用低速震荡酶解法对香茅叶片进行酶解消化，制备原生质体；通过蔗糖密度梯度离心法来纯化收集香茅原生质体。

作为一个实施方案，以组织培养的香茅幼嫩叶片为材料，利用纤维素酶和离析酶酶解去除细胞壁，通过蔗糖密度梯度离心获得健康完整的香茅叶肉原生质体。

作为一个实施方案，所述制备方法包括以下步骤：

S1、香茅组培苗培养：剪取香茅的健壮的幼茎，消毒后移至1/2MS培养基培养；

S2、原生质体酶解：选取步骤S1中生长状态良好的组培幼苗，弃叶片下部及顶部，切成条状，放入酶解液中(使酶解液充分浸没叶片)；(然后置于水平摇床上)25℃-30℃避光条件下，50-60rpm低速震荡酶解3-4h，最后70-80rpm振荡5-10分钟；

S3、原生质体分离：吸取步骤S2所得酶解混合液，过滤，滤液离心；

S4、蔗糖密度梯度离心法纯化：将步骤S3所得离心产物弃上清，用W5溶液重悬原生质体沉淀，然后在滤液下层注入含10％-20％的蔗糖的CPW溶液，避免震荡混溶，离心，在两液相之间出现一条绿色带，即纯净的原生质体；

S5、原生质体收集：(用移液器)吸取中间层的原生质体，加入W5溶液，离心，弃上清，加入MMG溶液悬浮沉淀。

作为一个实施方案，步骤S1中，培养时间约2-3周。

作为一个实施方案，步骤S1中，所述消毒的具体方法为：先用无菌水浸泡后流水冲洗，然后在超净台中用医用酒精浸泡5-10min，无菌水冲洗2-3次，再用次氯酸钠溶液浸泡5-10min，最后用无菌水冲洗3-7次。

作为一个具体实施案例，步骤S1中，用无菌水浸泡后流水冲洗，然后在超净台中用医用酒精(75％酒精)浸泡10min，无菌水冲洗3次，再用10％的次氯酸钠溶液浸泡5min，最后用无菌水冲洗5次。

作为一个实施方案，步骤S1中，所述的1/2MS培养基配制方法如下：每2.2g MS粉末和15g蔗糖溶于1L灭菌水中，用NaOH调节PH至5.8，加入7.5g琼脂，121℃高压蒸汽灭菌25min。

作为一个实施方案，步骤S2中，所述的酶解液的配方如下：1.5﹪纤维素酶R10(Cellulase R10)，0.75﹪离析酶R10(Macerozyme R10)，0.4M甘露醇(mannitol)，10mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES，pH5.7)，用CPW溶液配制。

作为一个具体实施案例，步骤S2中，选取上一步中生长状态良好的组培苗，弃去叶片的下部及顶部，用解剖刀切成0.5-1mm的条状，放入装有酶解液的培养皿中，然后真空抽提1小时，使酶解液充分浸没叶片，后置于水平摇床上，30℃避光条件下50r/min低速震荡酶解3-4h，最后70rpm振荡5-10分钟便于更有效地释放原生质体。

作为一个实施方案，步骤S3中，滤液的离心速率为500-800r/min，离心时间为5-10min。

作为一个具体实施案例，步骤S3中，用移液枪(减掉枪头)吸取上一步所得酶解混合液，用漏斗和200目尼龙网过滤(为提高回收率可用W5溶液冲洗叶片残渣)，收集至50mL离心管中，500r/min离心7min。

作为一个实施方案，步骤S3中，过滤前用W5溶液冲洗叶片残渣。

作为一个实施方案，W5溶液的配方如下：154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，2mMMES(pH5.7)。

作为一个实施方案，步骤S4中，所述离心的速率为500-800r/min，离心时间为5-10min。

作为一个实施方案，步骤S4中，原生质体沉淀用5-10mL W5溶液重悬，滤液下层缓慢注入适量含20％的蔗糖的CPW溶液。

作为一个实施方案，步骤S4中，步骤S4中，含10％-20％的蔗糖的CPW溶液配制方法如下：每2-4g蔗糖，溶于20mL的CPW溶液中，现用现配。

作为一个具体实施案例，步骤S4中，将上一步所得离心产物弃上清，用2mL W5溶液重悬原生质体沉淀，然后用注射器在滤液下层缓慢注入5mL 20％的蔗糖溶液，避免震荡混溶，800r/min离心5min，在两液相之间出现一条绿色带，即纯净的原生质体。

作为一个实施方案，步骤S5中，所述离心的速率为500-800r/min，离心时间为5-10min。

作为一个具体实施案例，步骤S5中，用移液器小心吸取中间层的原生质体，移入干净的离心管中，加入2mL W5溶液，500r/min离心7min，弃上清，再加入1-2mL MMG溶液悬浮沉淀。

作为一个实施方案，步骤S5中，中间层的原生质体加入W5溶液，离心弃上清后再加入1-2mL MMG溶液悬浮沉淀。

作为一个实施方案，所述的MMG溶液的配方为：4mM MES(pH5.7)、0.4M mannitol、15mM MgCl₂，0.22μm过滤灭菌，4℃保存。所述过滤灭菌是在超净工作台中上用0.22μm过滤器过滤灭菌。

作为一个实施方案，所述的CPW溶液配方为：27.2mg/L KH₂PO₄、101mg/L KNO₃、1480mg/L CaCl₂·2H₂O、246mg/LMgSO₄·7H₂O、2.5mg/L Fe₂(SO₄)₃·6H₂O、0.16mg/L KI，0.025mg/L CuSO₄·5H₂O。在超净工作台中上用0.22μm过滤器过滤灭菌，4℃保存。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明利用组织培养技术获得无菌的香茅组培苗，为香茅原生质体的分离制备提供了理想的外植体，可循环继代使用，操作简便且可常年进行；

2)本发明以香茅组培苗为材料，采用低速震荡酶解法对香茅叶片进行酶解消化，高效的制备原生质体；

3)本发明利用不同甘露醇浓度、不同酶解时间及采用不同时期叶片为材料的对照组合来分离纯化香茅的原生质体，建立了最佳香茅原生质体制备体系；该体系酶解效率高，酶解时间短；

4)本发明通过蔗糖密度梯度离心法来纯化收集香茅原生质体，去除了破碎的植物细胞，分离纯化后的原生质体产量高细胞完整，呈球形，富含叶绿体，具有较高活力；

5)在本发明的基础上，可进行原生质体培养、瞬时转化、细胞融合、单细胞测序等操作，对香茅基因功能的研究和遗传性状的改良具有重要意义。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为用于香茅组培苗制备原生质体的流程；

图2为蔗糖密度梯度离心纯化后的香茅原生质体；

图3为普通酶液和CPW酶液对香茅原生质体酶解的影响对比示意图；

图4为酶解液中甘露醇浓度不同对结果的影响示意图；

图5为蔗糖密度梯度离心纯化前后的对比示意图；

图6为蔗糖密度梯度离心法纯化中的蔗糖溶液浓度不同对结果的影响示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例涉及一种快速高效的香茅原生质体的制备方法，具体包括以下步骤：香茅组培苗培养；香茅原生质体酶解；香茅原生质体分离纯化；香茅原生质体收集；香茅原生质体观察，制备流程如图1所示，具体包括如下步骤：

(1)香茅组培苗培养：剪取香茅的健壮的幼茎，用无菌水浸泡后流水冲洗，然后在超净台中用75％酒精浸泡10min，无菌水冲洗3次，再用10％的次氯酸钠溶液浸泡5min，最后用无菌水冲洗5次，后移至灭菌的1/2MS培养基培养约3周左右，直至其长出叶片。

(2)香茅原生质体酶解：选取上步中生长状态良好的组培苗叶片，弃去叶片的下部及顶部，用解剖刀切成0.5-1mm的条状，放入装有10mL酶解液的培养皿中，然后真空抽提1h，使酶解液充分浸没叶片，然后置于水平摇床上，30℃避光条件下，50r/min低速震荡酶解4h，最后以70rpm振荡5-10分钟便于更有效地释放原生质体；

(3)香茅原生质体分离：用移液枪(剪掉枪头)吸取上步所得酶解混合液，用漏斗和200目尼龙网过滤(为提高回收率可用W5溶液冲洗叶片残渣)，收集至50mL离心管中，500r/min离心7min；

(4)蔗糖密度梯度离心法纯化：将上步所得离心产物弃上清，用2mL W5溶液重悬原生质体沉淀，然后用注射器在滤液下层缓慢注入5mL 20％的蔗糖溶液，避免震荡混溶，800r/min离心5min，在两液相之间出现一条绿色带，即纯净的原生质体；

(5)香茅原生质体收集：用移液器小心吸取中间层的原生质体，移入干净的离心管中，加入2mL W5溶液，500r/min离心7min，弃上清，加入1-2mL MMG溶液悬浮沉淀；

(6)原生质体观察：用移液枪(剪掉枪头)吸取一滴(5)步骤中的细胞悬浮液于载玻片上，置于光学显微镜下观察，并拍照记录。

其中，步骤(1)中所述的1/2MS培养基配制方法如下：2.2g MS粉末和15g蔗糖溶于1L灭菌水中，1M NaOH调节PH至5.8，加入7.5g琼脂，121℃高压蒸汽灭菌25min。

步骤(2)中所述的酶解液的配方如下：1.5﹪CellulaseR10(纤维素酶)，0.75﹪Macerozyme R10(离析酶)，0.4M mannitol(甘露醇)，10mM MES(pH5.7，2-(N-吗啡啉)乙磺酸)，用CPW溶液配制；

步骤(3)和(4)中所述的W5溶液的配方如下：154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，2mM MES(pH5.7)。

步骤(4)中所述的20％的蔗糖溶液配制方法如下：称取4g蔗糖，溶于20mL的CPW溶液中，现用现配。

步骤(5)中所述的MMG溶液的配方为：4mM MES(pH5.7)、0.4M mannitol、15mMMgCl₂，在超净工作台中上用0.22μm过滤器过滤灭菌，4℃保存。

其中，CPW溶液配方为：27.2mg/L KH₂PO₄、101mg/L KNO₃、1480mg/L CaCl₂·2H₂O、246mg/LMgSO₄·7H₂O、2.5mg/L Fe₂(SO4)₃·6H₂O、0.16mg/L KI，0.025mg/L CuSO₄·5H₂O。在超净工作台中上用0.22μm过滤器过滤灭菌，4℃保存。

香茅原生质体如图2所示。

上述实施例1中，步骤(2)香茅原生质体酶解中的酶解液分别选用普通酶液和CPW酶液；普通酶解液的配方如下：1.5﹪CellulaseR10(纤维素酶)，0.75﹪Macerozyme R10(离析酶)，0.4M mannitol(甘露醇)，10mM MES(pH5.7，2-(N-吗啡啉)乙磺酸)，用水配制；而CPW酶液的配方为：1.5﹪CellulaseR10(纤维素酶)，0.75﹪Macerozyme R10(离析酶)，0.4Mmannitol(甘露醇)，10mM MES(pH5.7，2-(N-吗啡啉)乙磺酸)，用CPW溶液配制。结果如图3所示，由图3可知，CPW溶液配制的酶解液中获得的原生质体数目和完整性远远高于常规水溶液配制的酶解液。

步骤(2)中的酶解液中甘露醇浓度，分别设置了0.2M，0.4M，0.6M三种浓度，结果如图4所示，发现浓度为0.4M时，酶解效果最好，细胞完整性好。甘露醇浓度为0.2M或0.6M，原生质体破碎较多，得到的原生质体碎片多，质量较低，影响后续实验。

针对实施例1中的酶解时间，设置4个时间梯度：2h，3h，4h，过夜(约16小时)，按实施例1方法进行酶解和纯化，进行镜检。结果表明酶解4h时，原生质体得率最高。酶解2h或3h，叶片酶解不充分，得到的原生质体较少，而超过4h，已有部分原生质体开始破损，因此，以4h酶解时间为最佳酶解时间。

对于实施例1中的酶解液，设置不同酶浓度配对照试验，发现Cellulase R10浓度为1.5％；Macerozyme R10浓度为0.75％时，酶解效果最佳。

上述实施例1中，步骤(2)中的酶解转速分别设置了50r/min、80r/min，发现50r/min低速震荡酶解时，原生质体的完整性和获得率最佳。

针对步骤(2)中不同时期叶片材料的对香茅原生质体产量的影响，发现采用生长3-4周左右组培苗的嫩叶的产量最高，质量最佳。

上述实施例1中，步骤(4)蔗糖密度梯度离心法纯化，纯化前后的对比如图5所示，由图5可知，蔗糖密度梯度离心法纯化后细胞碎片大大减少。

上述实施例1中，步骤(4)蔗糖密度梯度离心法纯化中的蔗糖溶液浓度，分别设置了10％、15％、20％三种浓度，结果如图6所示，采用20％的蔗糖溶液，在两液相之间出现一条明显清晰的绿色带，即纯净的原生质体。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (7)

1.一种香茅原生质体的制备方法，其特征在于，采用香茅组培幼苗为材料，利用CPW溶液配制酶解液，采用低速震荡酶解法对香茅叶片进行酶解消化，制备原生质体；通过蔗糖密度梯度离心法来纯化收集香茅原生质体；所述方法包括如下步骤：

S1、香茅组培苗培养：剪取香茅的健壮的幼茎，消毒后移至1/2MS培养基培养；

S2、原生质体酶解：选取步骤S1中生长状态良好的组培幼苗，弃叶片下部及顶部，切成条状，放入酶解液中；30℃避光条件下，50rpm低速震荡酶解4h，最后70-80rpm振荡5-10分钟；

S3、原生质体分离：吸取步骤S2所得酶解混合液，过滤，滤液离心；

S4、蔗糖密度梯度离心法纯化：将步骤S3所得离心产物弃上清，用W5溶液重悬原生质体沉淀，然后在滤液下层注入含20％的蔗糖的CPW溶液，避免震荡混溶，离心，在两液相之间出现一条绿色带，即纯净的原生质体；

S5、原生质体收集：吸取中间层的原生质体，加入W5溶液，离心，弃上清，加入MMG溶液悬浮沉淀；

步骤S2中酶解液的配方如下：1.5﹪纤维素酶R10，0 .75﹪离析酶R10，0.4M甘露醇，10mM pH5.7的2-(N-吗啡啉)乙磺酸，用CPW溶液配制；

CPW溶液配方为：27.2mg/L KH₂PO₄、101mg/L KNO₃、1480mg/L CaCl₂·2H₂O、246mg/LMgSO₄·7H₂O、2.5mg/L Fe₂(SO₄)₃·6H₂O、0.16mg/L KI，0.025mg/LCuSO₄·5H₂O；

所述W5溶液的配方如下：154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，2mM pH5.7的MES。

2.根据权利要求1所述的香茅原生质体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述消毒的具体方法为：先用无菌水浸泡后流水冲洗，然后在超净台中用医用酒精浸泡5-10min，无菌水冲洗2-3次，再用次氯酸钠溶液浸泡5-10min，最后用无菌水冲洗3-7次。

3.根据权利要求1所述的香茅原生质体的制备方法，其特征在于，步骤S3中，过滤前用W5溶液冲洗叶片残渣。

4.根据权利要求1所述的香茅原生质体的制备方法，其特征在于，步骤S4中，原生质体沉淀用5-10mL W5溶液重悬，滤液下层缓慢注入含20％的蔗糖的CPW溶液。

5.根据权利要求1所述的香茅原生质体的制备方法，其特征在于，步骤S4中，含20％的蔗糖的CPW溶液配制方法如下：每4g蔗糖，溶于20mL的CPW溶液中。

6.根据权利要求1所述的香茅原生质体的制备方法，其特征在于，步骤S5中，中间层的原生质体加入W5溶液，离心弃上清后再加入1-2mL MMG溶液悬浮沉淀。

7.根据权利要求1所述的香茅原生质体的制备方法，其特征在于，

所述1/2MS培养基配制方法如下：每2.2gMS粉末和15g蔗糖溶于1L灭菌水中，用NaOH调节PH至5.8，加入7.5g琼脂，121℃高压蒸汽灭菌25min；

所述MMG溶液的配方为：4mmol/L pH5.7的MES、0.4mol/L甘露醇、15mmol/L氯化镁，0.22μm过滤灭菌，4℃保存。

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