CN111117943A - 一种叶绿体膜质分离方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物分离工程技术领域，特别是涉及一种叶绿体膜质分离方法。由于其基因组相对于拟南芥来说要大得多，研究起来比较困难。现在还没有一套合适的分离方法来获得纯度高，质量好的叶绿体膜相或者水相成分。本申请提供了一种叶绿体膜质分离方法，包括：1)将叶片剪碎放入研磨缓冲液GB中，然后进行破碎；2)分离破碎的叶片细胞中的叶绿体，获得纯度高、形态完整的叶绿体；3)将叶绿体进行裂解，然后去除类囊体膜；4)将叶绿体的水相和膜相进一步进行分离，获得纯度高、分离干净的膜质成分。广泛适用于在烟草及其相关双子叶植物中研究叶绿体，对深入了解叶绿体的生物学功能具有重要意义。
Description
技术领域
本申请属于生物分离工程技术领域，特别是涉及一种叶绿体膜质分离方法。
背景技术
叶绿体是植物细胞特有的细胞器，由双层膜所包被。它能够进行光合作用，将活跃的光能转化为稳定的化学能。此外，它还参与脂肪酸、氨基酸、维生素等重要生物大分子的合成。叶绿体内含有多种蛋白质，有的由细胞核编码，有的由叶绿体自身所编码，这些蛋白质参与了许多重要的生物学过程。分离叶绿体双层膜与基质对于揭示叶绿体的生理学作用及叶绿体蛋白质的功能等方面具有重要的生物学意义，因此叶绿体膜质分离方法广泛应用于叶绿体生理学作用及叶绿体蛋白质功能分析等研究中。
获得分离彻底的膜质成分是进行叶绿体生理学功能研究的重要前提条件。但是，叶绿体位于细胞中，所以在进行叶绿体膜质分离前，需要先提取叶绿体。由于叶绿体比较小，提取技术比较繁琐，同时存在着诸多因素的干扰，如裂解液的浓度，裂解时间，离心速度及时间等，导致很难获得分离彻底的膜质成分。
本生烟草(Nicotiana benthamiana)是属于茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana)的一种植物，具有生长速度快、生命周期短、易于基因转化及适合温室培养等优点，因而被研究者选择作为模式植物来进行研究。然而，以本生烟草为研究体系，采用叶绿体膜质分离技术解析叶绿体生理功能的研究尚且匮乏。此外，由于其基因组相对于拟南芥来说要大得多，研究起来比较困难。现在还没有一套合适的分离方法来获得纯度高，质量好的叶绿体膜相或者水相成分。
申请内容
1.要解决的技术问题
基于以本生烟草为研究体系，采用叶绿体膜质分离技术解析叶绿体生理功能的研究尚且匮乏。此外，由于其基因组相对于拟南芥来说要大得多，研究起来比较困难。现在还没有一套合适的分离方法来获得纯度高，质量好的叶绿体膜相或者水相成分的问题，本申请提供了一种叶绿体膜质分离方法。
2.技术方案
为了达到上述的目的，本申请提供了一种叶绿体膜质分离方法，所述方法包括如下步骤：
1)将叶片剪碎放入研磨缓冲液GB中，然后进行破碎；
2)分离破碎的叶片细胞中的叶绿体，获得纯度高、形态完整的叶绿体；
3)将叶绿体进行裂解，然后去除类囊体膜；
4)将叶绿体的水相和膜相进一步进行分离，获得纯度高、分离干净的膜质成分。
本申请的另一种实施方式为：所述步骤1中叶片为将本生烟草种子撒入土壤中，定期浇灌营养液，生长出来的叶片。
本申请的另一种实施方式为：所述土壤采用苔藓泥炭土、珍珠岩和蛭石混合物，所述苔藓泥炭土：珍珠岩：蛭石＝1:1:1。
本申请的另一种实施方式为：所述步骤1中采用榨汁机进行破碎。
本申请的另一种实施方式为：所述步骤2中，采用percoll密度梯度法分离破碎的叶片细胞中的叶绿体。
本申请的另一种实施方式为：所述步骤3中采用裂解液将叶绿体进行裂解，然后利用离心的方式去除类囊体膜。
本申请的另一种实施方式为：所述离心采用离心机进行，所述离心机在使用前，将离心机温度调到4℃进行预冷。
本申请的另一种实施方式为：所述步骤4中通过高度离心的方式将叶绿体的水相和膜相进一步进行分离。
3.有益效果
与现有技术相比，本申请提供的叶绿体膜质分离方法的有益效果在于：
本申请提供的叶绿体膜质分离方法，主要用于分析和研究叶绿体在细胞内参与各项活动的生物学作用及叶绿体定位蛋白的生理功能，对阐述叶绿体参与各项生理活动及其相关功能具有重要的生物学意义。
本申请提供的叶绿体膜质分离方法，广泛适用于在烟草及其相关双子叶植物中研究叶绿体，对深入了解叶绿体的生物学功能具有重要意义。
附图说明
图1为本申请叶绿体膜质分离方法流程示意图；
图2为本申请的水相和膜相样品免疫印迹实验结果示意图。
具体实施方式
在下文中，将参考附图对本申请的具体实施例进行详细地描述，依照这些详细的描述，所属领域技术人员能够清楚地理解本申请，并能够实施本申请。在不违背本申请原理的情况下，各个不同的实施例中的特征可以进行组合以获得新的实施方式，或者替代某些实施例中的某些特征，获得其它优选的实施实施方式。
Percoll是经过聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrolidone,PVP)处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性。Percoll混悬液的硅胶颗粒大小不一，经过高速离心后，可形成一个连续密度梯度，将比重不同的细胞分离纯化。
参见图1～2，本申请提供一种叶绿体膜质分离方法，所述方法包括如下步骤：
1)将叶片剪碎放入研磨缓冲液GB中，然后进行破碎；
2)分离破碎的叶片细胞中的叶绿体，获得纯度高、形态完整的叶绿体；
3)将叶绿体进行裂解，然后去除类囊体膜；
4)将叶绿体的水相和膜相进一步进行分离，获得纯度高、分离干净的膜质成分。
进一步地，所述步骤1中叶片为将本生烟草种子撒入土壤中，定期浇灌营养液，生长出来的叶片。
进一步地，所述土壤采用苔藓泥炭土、珍珠岩和蛭石混合物，所述苔藓泥炭土：珍珠岩：蛭石＝1:1:1。
这里的苔藓泥炭土为丹麦品氏原装进口苔藓泥炭土。
进一步地，所述步骤1中采用榨汁机进行破碎。
进一步地，所述步骤2中，采用percoll密度梯度法分离破碎的叶片细胞中的叶绿体。
进一步地，所述步骤3中采用裂解液将叶绿体进行裂解，然后利用离心的方式去除类囊体膜。
进一步地，所述离心采用离心机进行，所述离心机在使用前，将离心机温度调到4℃进行预冷。
进一步地，所述步骤4中通过高度离心的方式将叶绿体的水相和膜相进一步进行分离。
实施例
1)研究材料的培养：选择颗粒饱满的本生烟草种子撒入土壤中(进口土即苔藓泥炭土：珍珠岩：蛭石＝1:1:1)，定期浇灌营养液和清除病虫害，使烟草处于较好的生长状态，以便获得更多的、大小均一的叶绿体。
2)实验前的准备工作：配制适量研磨缓冲液GB(50mM HEPES/KOH,pH 7.5；0.33Msorbitol；1mM MgCl2；1mM MnCl2；2mM EDTA,pH8.0；5mM Na-ascorbate；0.1％BSA)和重悬缓冲液RB(50mM HEPES-KOH,pH 7.9；0.33M sorbitol；0.8mM CaCl2；5mM Na-ascorbate)；打开离心机，将温度调到4℃；洗净大离心管、漏斗和尼龙网并吹干。
3)取材：选取在土壤中生长一个月左右的状态较好的烟草，取5g叶片，剪碎到70-100mL GB中，然后用榨汁机打碎，3次点动，每次5s。
4)叶绿体的分离：将打碎后的样品过滤到圆底的大离心管中，2000g离心1-2min，加适量500μL RB重悬，小心地加到配好的percoll中(1mL 90％+2mL 40％的percoll，可以加1-2mL叶绿体悬浮液)，2000g离心15min,会看到叶绿体分为两层，上层为破碎的叶绿体，下层是完整的叶绿体，小心吸取下层叶绿体到新的离心管中，再加2mL RB混匀，500g离心2min，弃上清，加适量(1mL)RB重悬叶绿体。
5)类囊体膜的去除：500g离心2min，弃上清，加入1mL裂解液(25mM HEPES-KOH,pH8.0；4mM MgCl2)重悬沉淀，并大力涡旋振荡，5min左右。冰上放置15min，裂解后的叶绿体采用立式离心机，4℃，5,000g离心10min，上清为破碎的叶绿体内外膜，沉淀为类囊体。
6)分离膜相和水相：将上清转移到新的1.5mL EP管中，5,0000g离心40min，所得上清即为水相，沉淀即为膜相。
将得到的水相和膜相样品进行免疫印迹实验，结果如图2所示：该方法可获得分离纯度较高的膜相和水相成分。
本申请提供的叶绿体膜质分离方法，深入研究叶绿体参与生命活动不同过程中的生物学作用及叶绿体定位蛋白的生理学功能。
尽管在上文中参考特定的实施例对本申请进行了描述，但是所属领域技术人员应当理解，在本申请公开的原理和范围内，可以针对本申请公开的配置和细节做出许多修改。本申请的保护范围由所附的权利要求来确定，并且权利要求意在涵盖权利要求中技术特征的等同物文字意义或范围所包含的全部修改。
Claims (8)
1.一种叶绿体膜质分离方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1)将叶片剪碎放入研磨缓冲液GB中，然后进行破碎；
2)分离破碎的叶片细胞中的叶绿体，获得纯度高、形态完整的叶绿体；
3)将叶绿体进行裂解，然后去除类囊体膜；
4)将叶绿体的水相和膜相进一步进行分离，获得纯度高、分离干净的膜质成分。
2.如权利要求1所述的叶绿体膜质分离方法，其特征在于：所述步骤1中叶片为将本生烟草种子撒入土壤中，定期浇灌营养液，生长出来的叶片。
3.如权利要求2所述的叶绿体膜质分离方法，其特征在于：所述土壤采用苔藓泥炭土、珍珠岩和蛭石混合物，所述苔藓泥炭土：珍珠岩：蛭石＝1:1:1。
4.如权利要求1所述的叶绿体膜质分离方法，其特征在于：所述步骤1中采用榨汁机进行破碎。
5.如权利要求1所述的叶绿体膜质分离方法，其特征在于：所述步骤2中，采用percoll密度梯度法分离破碎的叶片细胞中的叶绿体。
6.如权利要求1所述的叶绿体膜质分离方法，其特征在于：所述步骤3中采用裂解液将叶绿体进行裂解，然后利用离心的方式去除类囊体膜。
7.如权利要求6所述的叶绿体膜质分离方法，其特征在于：所述离心采用离心机进行，所述离心机在使用前，将离心机温度调到4℃进行预冷。
8.如权利要求1～7中任一项所述的叶绿体膜质分离方法，其特征在于：所述步骤4中通过高度离心的方式将叶绿体的水相和膜相进一步进行分离。
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2020
- 2020-01-10 CN CN202010025856.XA patent/CN111117943A/zh active Pending
Patent Citations (1)
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| CN105907697A (zh) * | 2016-06-15 | 2016-08-31 | 河南农业大学 | 一种小麦完整叶绿体的制备方法 |
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