CN108307915A - 柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，包括：步骤一、取茎粗1mm以上和株高5‑10cm的柑橘幼苗植株，之后截取其上的节间茎段，然后将节间茎段浸泡于诱变处理液中于黑暗条件下进行诱变处理1‑3h，诱变处理液包含浓度0.5‑2mmol/L的叠氮化钠；步骤二、将经过诱变处理之后的节间茎段进行组织培养，至节间茎段的截面伤口处生长出再生芽；步骤三、利用SRAP分子标记方法检测出发生变异的再生芽，并对发生变异的再生芽进行生根培养，进而获得完整的柑橘突变体植株。本发明明确了叠氮化钠诱变柑橘幼年态节间茎段可产生稳定变异植株。本发明的处理方法致变效率大于10％、诱变效果显著，操作简便。
Description
技术领域
本发明属于创制柑橘变异技术领域，特别涉及一种柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法。
背景技术
叠氮化钠是一种无残毒、使用相对安全的化学诱变剂。利用叠氮化钠处理纽荷尔脐橙枝条后，在枝条的一些叶腋处生发出的新梢上具有形态变异的叶片，并且利用分子标记能检测出变异叶片与对照叶片在基因组构成上存在差异，这些结果说明叠氮化钠对柑橘细胞的遗传物质具有致变效应。由于柑橘类果树的童期较长(一般5年以上)，因此利用叠氮化钠处理柑橘种子(致使生殖细胞的遗传物质变异，再经过有性生殖形成稳定遗传)从其后代中获得稳定突变体的工作周期需要很长的时间；此外，柑橘的腋芽已处于一定的分化状态，利用叠氮化钠直接处理柑橘腋芽(接穗)，经常仅造成腋芽各分生组织细胞中少数细胞发生突变，该类突变具有不稳定的特点，即很多变异叶片叶腋处再萌发的新梢叶片又恢复到正常状态，因此亦难于获得变异性状稳定的突变体。因此，如何能够利用较短的时间获得变异性状稳定的柑橘突变体是目前正在探索的一个难题。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法。
进行单一细胞诱变再组培形成完整植株能避免嵌合突变体的产生。且，令本发明申请人感兴趣的是，柑橘节间茎段横截面伤口处的形成层细胞在一定条件下能分化发育成再生芽，且柑橘节间茎段易于获得，特别是柑橘幼年态节间茎段的再生效率很高，并且再生的芽可通过微芽嫁接和组培生根等方法形成完整的植株；至今，以柑橘实生苗胚轴和幼年态茎段作为外植体获得了90％以上的柑橘转基因植株，并且尚未见有嵌合体工程苗产生的报道。因此，申请人推断，柑橘节间茎段可作为柑橘单一体细胞的诱变试验材料，进一步地，可将其用于通过叠氮化钠化学诱变创制出稳定的柑橘突变体材料。目前，尚未发现叠氮化钠诱变柑橘幼年态节间茎段的相关研究报道，即利用叠氮化钠诱发柑橘幼年态节间茎段是否能产生稳定变异、叠氮化钠诱发柑橘幼年态节间茎段产生变异再生芽的处理条件等均未有研究报道。进一步地，若利用叠氮化钠诱发柑橘幼年态节间茎段能够产生稳定变异，如何简单有效利用叠氮化钠侵染柑橘幼年态节间茎段的处理方法亦未有任何研究报道。
为此，本发明提供的技术方案为：
一种柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，包括：
步骤一、取茎粗1mm以上和株高5-10cm的柑橘幼苗植株，之后截取所述柑橘幼苗植株上的节间茎段，然后将该节间茎段浸泡于诱变处理液中于黑暗条件下进行诱变处理1-3h，该诱变处理液包含浓度0.5-2mmol/L的叠氮化钠；步骤二、将经过诱变处理之后的节间茎段进行组织培养，至该节间茎段的截面伤口处生长出再生芽；以及步骤三、利用SRAP分子标记方法检测出发生变异的再生芽，并培养该发生变异的再生芽生根，获得柑橘突变体植株。
优选的是，所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法中，所述步骤一中，所述诱变处理液的配置方法为：称取适量的叠氮化钠加入pH值为3.00(±0.05)的0.1mol/L磷酸钾盐缓冲液中，得到所述诱变处理液。
优选的是，所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法中，所述步骤一中，所述诱变处理液包含浓度1mmol/L的叠氮化钠，进行诱变处理的时间为2h。
优选的是，所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法中，所述步骤一中，将所述节间茎段浸泡于诱变处理液中时，首先将所述节间茎段包裹于纱布袋内，之后再将纱布袋浸泡于所述诱变处理液中。
优选的是，所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法中，所述步骤二中，将经过诱变处理之后的节间茎段置于诱导培养基上进行光照培养，该诱导培养基包含：
MS盐，浓度30g/L的蔗糖、8g/L的琼脂粉和3g/L的6-苄氨基腺嘌呤，光照培养条件为：12h/d光照和12h/d黑暗，光照强度40μmol m-2s-1，培养温度为26-28℃。
优选的是，所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法中，所述步骤一中，获得所述柑橘幼苗植株的方法包括：取柑橘种子，用1％(w/v)的NaClO消毒，之后4℃放置过夜后，然后播种于MS盐固体培养基上，且播种后首先暗培养约20d，之后进行光照培养，光照培养条件为：12h/d光照和12h/d黑暗，光照强度40μmol·m-2s-1，培养温度为26-28℃，至得到所述柑橘幼苗植株。
优选的是，所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法中，所述步骤三中，SRAP分子标记方法PCR反应程序为：95℃5min；95℃1min，35℃1min，72℃2min，5个循环；95℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min。
优选的是，所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法中，所述步骤三中，获得完整的柑橘突变体植株的具体方法包括：取一直径9cm的滤纸放置于液体生根培养基的表面，将发生变异的再生芽放置于所述滤纸上，每张滤纸放置3-7个再生芽，光照培养3-5天，其中，所述生根培养基包含：1/2MS盐，浓度10g/L的蔗糖，初始浓度1g/L的吲哚丁酸和初始浓度2g/L的萘乙酸；然后调节所述生根培养基中的吲哚丁酸的浓度为1.5g/L，萘乙酸的浓度为3g/L，继续光照培养5-6天；再然后调节所述生根培养基中的吲哚丁酸的浓度为2g/L，萘乙酸的浓度为4g/L，并向液体生根培养基中加入纳米活性炭、珍珠岩、绿萝气生根粉末和太阳花植株粉末，继续光照培养5-8天，获得生根的变异苗，将该变异苗继续培养，得到变异植株，其中，所述纳米活性炭、珍珠岩、绿萝气生根粉末和太阳花植株粉末与所述液体生根培养基的质量比依次为1:4、1:4、1:10和1:20。
优选的是，所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法中，所述步骤一中，每个所述节间茎段长度约1cm。
优选的是，所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法中，所述诱变处理液在使用时，加入表面活性剂Silwet L-77，使其终浓度为0.5％(v/v)。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明明确了叠氮化钠可诱变柑橘幼年态节间茎段，且可产生稳定变异。本发明的处理方法致变效率大于10％、诱变效果显著，并且操作简便。通过本方法便于直接创制出稳定遗传的柑橘突变体材料，比通过叠氮化钠处理柑橘种子(致使生殖细胞的遗传物质变异，再经过有性生殖形成稳定遗传)获得稳定突变体的工作周期缩短了至少5年，同时检测方法也易于进行，促进了柑橘创制变异工作的进步。
此外，诱变处理液中加入表面活性剂Silwet L-77能明显提高诱变效率。将节间茎段浸泡于诱变处理液中时，首先将所述节间茎段包裹于纱布袋内，纱布袋吸水后能沉于液面之下，能避免出现部分节间茎段漂浮在液面上发生处理不完全的现象，同时易于处理结束后迅速取出所有节间茎段。生根培养基中随着培养时间和根发育情况，浓度逐渐增加，以促进再生芽生出更多的根组织，并且，在生长出一些根组织后，加入了纳米活性炭和珍珠岩等成分，增加液体培养基中的氧气含量，且为根部生长提供一定的附着物，促进其生长，绿萝气生根粉末和太阳花植株粉末中含有的促生根成分能够进一步促进生根，且与吲哚乙酸、萘乙酸等联合使用，一方面能够提高生根的数量，另一方面能够提高生根的速度。
本发明操作过程容易掌握，培养条件简单、成本较低，并且诱变效率较高及易于获得稳定的柑橘突变体材料，具有应用价值。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1A为本发明其中一个实施例中未诱变处理后节间茎段的存活情况的部分结果的照片；
图1B为本发明其中一个实施例中经诱变处理后节间茎段的存活情况的部分结果的照片；
图2为本发明其中一个实施例中经诱变处理后存活节间茎段的再生芽生发情况的部分结果的照片；
图3为本发明其中一个实施例中再生芽的分子标记检测情况的部分结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
进行单一细胞诱变再组培形成完整植株能避免嵌合突变体的产生。且，令本发明申请人感兴趣的是，柑橘节间茎段横截面伤口处的形成层细胞在一定条件下能分化发育成再生芽，且柑橘节间茎段易于获得，特别是柑橘幼年态节间茎段的再生效率很高，并且再生的芽可通过微芽嫁接和组培生根等方法形成完整的植株；至今，以柑橘实生苗胚轴和幼年态节间茎段作为外植体获得了90％以上的柑橘转基因植株，并且尚未见有嵌合体工程苗产生的报道。因此，申请人推断，柑橘节间茎段可作为柑橘单一体细胞的诱变试验材料，进一步地，可将其用于通过叠氮化钠化学诱变创制出稳定的柑橘突变体材料。目前，尚未发现叠氮化钠诱变柑橘幼年态节间茎段的相关研究报道，即利用叠氮化钠诱发柑橘幼年态节间茎段是否能产生稳定变异、叠氮化钠诱发柑橘幼年态茎段产生变异再生芽的处理条件等均未有研究报道。进一步地，若利用叠氮化钠诱发柑橘幼年态节间茎段能够产生稳定变异，如何简单有效利用叠氮化钠侵染柑橘幼年态节间茎段的处理方法亦未有任何研究报道。
本发明提供一种柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，包括：
步骤一、取茎粗1mm以上和株高5-10cm的柑橘幼苗植株，之后截取所述柑橘幼苗植株上的节间茎段，然后将该节间茎段浸泡于诱变处理液中于黑暗条件下进行诱变处理1-3h，该诱变处理液包含浓度0.5-2mmol/L的叠氮化钠。步骤二、将经过诱变处理之后的节间茎段进行培养，至该节间茎段的截面伤口处生长出再生芽。以及步骤三、利用SRAP分子标记方法检测出发生变异的再生芽，并培养该发生变异的再生芽，获得柑橘突变体材料。
本发明明确了叠氮化钠可诱变柑橘幼年态节间茎段，且可产生稳定变异。本发明的处理方法致变效率大于10％、诱变效果显著，并且操作简便。通过本方法便于直接创制出稳定遗传的柑橘突变体材料，可比利用叠氮化钠处理柑橘种子再经有性生殖获得稳定突变体的工作周期缩短了至少5年，同时检测方法也易于进行，促进了柑橘创制变异工作的进步。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤一中，所述诱变处理液的配置方法为：称取适量的叠氮化钠加入pH值为3.00(±0.05)的0.1mol/L磷酸钾盐缓冲液中，得到所述诱变处理液。例如，分别配置成终浓度为0mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L和5mmol/L的诱变处理液。
在上述方案中，作为优选，所述诱变处理液在使用时，加入表面活性剂Silwet L-77，使其终浓度为0.5％(v/v)。诱变处理液中加入表面活性剂Silwet L-77能明显提高诱变效率。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤一中，所述诱变处理液包含浓度1mmol/L的叠氮化钠，进行诱变处理的时间为2h。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤一中，将所述节间茎段浸泡于诱变处理液中时，首先将所述节间茎段包裹于纱布袋内，之后再将纱布袋浸泡于所述诱变处理液中。纱布袋吸水后能沉于液面之下，能避免出现部分节间茎段漂浮在液面上发生处理不完全的现象，同时易于处理结束后迅速取出所有节间茎段。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤二中，将经过诱变处理之后的节间茎段置于诱导培养基上进行光照培养，该诱导培养基包含：MS盐，浓度30g/L的蔗糖、8g/L的琼脂粉和3g/L的6-苄氨基腺嘌呤，光照培养条件为：12h/d光照和12h/d黑暗，光照强度40μmol·m-2s-1，培养温度为26-28℃。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤一中，获得所述柑橘幼苗植株的方法包括：取柑橘种子，用1％(w/v)的NaClO消毒，之后4℃放置过夜后，然后播种于MS盐固体培养基上，且播种后首先暗培养约20d，之后进行光照培养，光照培养条件为：12h/d光照和12h/d黑暗，光照强度40μmol·m-2s-1，培养温度为26-28℃，至得到所述柑橘幼苗植株。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤三中，SRAP分子标记方法PCR反应程序为：95℃5min；95℃1min，35℃1min，72℃2min，5个循环；95℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤三中，获得完整的柑橘突变体植株的具体方法包括：取一直径9cm的滤纸放置于液体生根培养基的表面，将发生变异的再生芽放置于所述滤纸上，每张滤纸放置3-7个再生芽，光照培养3-5天，其中，所述生根培养基包含：1/2MS盐，浓度10g/L的蔗糖，初始浓度1g/L的吲哚丁酸和初始浓度2g/L的萘乙酸；然后调节所述生根培养基中的吲哚丁酸的浓度为1.5g/L，萘乙酸的浓度为3g/L，继续光照培养5-6天；再然后调节所述生根培养基中的吲哚丁酸的浓度为2g/L，萘乙酸的浓度为4g/L，并向液体生根培养基中加入纳米活性炭、珍珠岩、绿萝气生根粉末和太阳花植株粉末，继续光照培养5-8天，获得生根的变异苗，将该变异苗继续培养，得到变异植株，其中，所述纳米活性炭、珍珠岩、绿萝气生根粉末和太阳花植株粉末与所述液体生根培养基的质量比依次为1:4、1:4、1:10和1:20，所述绿萝气生根粉末和太阳花植物粉末分别为对应植物粉碎后的颗粒。本发明的生根培养基中随着培养时间和根发育情况，浓度逐渐增加，以促进再生芽生出更多的根组织，并且，在生长出一些根组织后，加入了纳米活性炭和珍珠岩等成分，增加液体培养基中的氧气含量，且为根部生长提供一定的附着物，促进其生长，绿萝气生根粉末和太阳花植株粉末中含有的促生根成分能够进一步促进生根，且与吲哚乙酸、萘乙酸等联合使用，一方面能够提高生根的数量，另一方面能够提高生根的速度。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤一中，每个所述节间茎段长度约1cm。该长度的节间茎段能够满足诱变的需求，同时节约实验材料。
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：
实施例1
一种柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，包括如下步骤：
步骤1.诱变处理液配置：称取适量的叠氮化钠加入在pH值为3.00(±0.05)的0.1mol/L磷酸钾盐缓冲液中，分别配置成终浓度为0mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L和5mmol/L的诱变处理液。使用诱变处理液时，加入表面活性剂Silwet L-77(终浓度为0.5％)。
步骤2.将柑橘种子在超净工作台中剥去外种皮，用1％的NaClO消毒10min，于超净工作台中弃掉NaClO液体，用无菌水漂洗3次后4℃放置过夜后播种于MS培养基(pH值5.7)。播种后于暗培养约20d，再光照培养，光照培养条件为：12h光照/12h黑暗，光强40μmol·m- 2s-1，生长温度保持在26-28℃，培养10d。此时幼苗植株茎粗达到1mm以上，株高大于5cm。1LMS培养基成分为：NH4NO31.65g，KNO3 1.9g，CaCl2·2H2O 0.44g，MgSO4·7H2O 0.37g，KH2PO40.17g，KI 0.83mg，H3BO3 6.25mg，MnSO4·4H2O 22.3mg，ZnSO4·7H2O 8.65mg，Na2MoO4·2H2O0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2-EDTA·2H2O37.3mg，蔗糖30g，琼脂粉8g。
步骤3.在无菌条件下，用锐利的刀片截取植株上的节间茎段，每个节间茎段长度约1cm。设定1h、2h和3h三个处理时间。处理前将待处理节间茎段包裹于纱布袋中(纱布袋吸水后能沉于液面之下，能避免出现部分节间茎段漂浮在液面上发生处理不完全的现象，同时易于处理结束后迅速取出所有节间茎段)，再把纱布袋浸泡于不同诱变处理液中在黑暗条件下处理至相应的时间，处理结束后将节间茎段放在吸水纸上摊开以吸干节间茎段上残余的液体，然后将处理后的节间茎段平放在诱导培养基上生长，光照培养条件为：12h光照/12h黑暗，光强40μmol·m-2s-1，温度保持在26-28℃。15d后，即可观察到节间茎段横截面伤口处生长出再生芽。1L诱导培养基成分为：NH4NO3 1.65g，KNO3 1.9g，CaCl2·2H2O 0.44g，MgSO4·7H2O 0.37g，KH2PO4 0.17g，KI 0.83mg，H3BO3 6.25mg，MnSO4·4H2O22.3mg，ZnSO4·7H2O 8.65mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg，蔗糖30g，6-苄氨基腺嘌呤3g，琼脂粉8g。
步骤4.剪取再生芽的部分叶片提取其基因组DNA，利用SRAP分子标记方法检测节间茎段处理后生长出的再生芽与对照再生芽间的基因组构成差别，鉴定出遗传物质发生变异的再生芽。SRAP分子标记方法PCR反应程序为：95℃5min；95℃1min，35℃1min，72℃2min，5个循环；95℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min。PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳分离，部分筛选结果如图3所示，图3中，M示为DNA分子量标准，自胶孔处向下为别为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp八条指示条带；1-24表示为样品编号，其中1和24号为未诱变处理的对照样品，2-23号为经诱变处理的样品；胶图中所用扩增引物编号为P85：5'-TGAGTCCAAACCGGAAT-3'，5'-GACTGCGTACGAATTAGC-3'；检测结果显示，与对照等样品相比，5、10、15、16和17号样品均出现明显的差异条带，表明如上样品的基因组均发生了变异，本申请中采用的SRAP分子标记引物序列为：
注：上表中，每个引物名称对应的两条引物中，其中一条序列(上方的)是正向引物，另一条序列(下方的)是反向引物。
步骤5.培养筛选出的发生变异的再生芽，获得柑橘突变体材料。
实施例2
一种柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，包括：
步骤1.诱变处理液配置：称取适量的叠氮化钠加入在pH值为3.00(±0.05)的0.1mol/L磷酸钾盐缓冲液中，配置成终浓度为2mmol/L的诱变处理液。使用诱变处理液时，加入表面活性剂Silwet L-77(终浓度为0.5％)。
步骤2.将柑橘种子在超净工作台中剥去外种皮，用1％的NaClO消毒10min，于超净工作台中弃掉NaClO液体，用无菌水漂洗3次后4℃放置过夜后播种于MS培养基(pH值5.7)。播种后于暗培养约20d，再光照培养，光照培养条件为：12h光照/12h黑暗，光强40μmol·m- 2s-1，培养10d，生长温度保持在26-28℃。此时幼苗植株茎粗达到1mm以上，株高大于5cm。1LMS培养基成分为：NH4NO31.65g，KNO3 1.9g，CaCl2·2H2O 0.44g，MgSO4·7H2O 0.37g，KH2PO40.17g，KI 0.83mg，H3BO3 6.25mg，MnSO4·4H2O 22.3mg，ZnSO4·7H2O 8.65mg，Na2MoO4·2H2O0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2-EDTA·2H2O37.3mg，蔗糖30g，琼脂粉8g。
步骤3.在无菌条件下，用锐利的刀片截取植株上的节间茎段，每个节间茎段长度约1cm。利用诱变处理液处理1h。处理前将待处理节间茎段包裹于纱布袋中(纱布袋吸水后能沉于液面之下，能避免出现部分节间茎段漂浮在液面上发生处理不完全的现象，同时易于处理结束后迅速取出所有节间茎段)，再把纱布袋浸泡于不同诱变处理液中在黑暗条件下处理至相应的时间，处理结束后将节间茎段放在吸水纸上摊开以吸干节间茎段上残余的液体，然后将处理后的节间茎段平放在诱导培养基上生长，光照培养条件为：12h光照/12h黑暗，光强40μmol·m-2s-1，温度保持在26-28℃。15d后，即可观察到节间茎段横截面伤口处生长出再生芽。1L诱导培养基成分为：NH4NO3 1.65g，KNO3 1.9g，CaCl2·2H2O 0.44g，MgSO4·7H2O 0.37g，KH2PO4 0.17g，KI 0.83mg，H3BO3 6.25mg，MnSO4·4H2O22.3mg，ZnSO4·7H2O 8.65mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg，蔗糖30g，6-苄氨基腺嘌呤3g，琼脂粉8g。
步骤4.剪取再生芽的部分叶片提取其基因组DNA，利用如实施例1中SRAP分子标记方法检测节间茎段处理后生长出的再生芽与对照再生芽间的基因组构成差别，鉴定出遗传物质发生变异的再生芽。SRAP分子标记方法PCR反应程序为：95℃5min；95℃1min，35℃1min，72℃2min，5个循环；95℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环。
步骤5.培养筛选出的发生变异的再生芽，获得柑橘突变体材料。具体方法包括：取一直径9cm的滤纸放置于液体生根培养基的表面，将发生变异的再生芽放置于所述滤纸上，每张滤纸放置7个再生芽，光照培养5天，其中，所述生根培养基包含：1/2MS盐，浓度10g/L的蔗糖，初始浓度1g/L的吲哚丁酸和初始浓度2g/L的萘乙酸。然后调节所述生根培养基中的吲哚丁酸的浓度为1.5g/L，萘乙酸的浓度为3g/L，继续光照培养6天。再然后调节所述生根培养基中的吲哚丁酸的浓度为2g/L，萘乙酸的浓度为4g/L，并向液体生根培养基中加入纳米活性炭、珍珠岩、绿萝气生根粉末和太阳花植株粉末，继续光照培养5天，获得生根的变异苗，将该变异苗继续培养，得到变异植株，其中，所述纳米活性炭、珍珠岩、绿萝气生根粉末和太阳花植株粉末与所述液体生根培养基的质量比依次为1:4、1:4、1:10和1:20。光照培养条件为：12h光照/12h黑暗，光强40μmol·m-2s-1，温度保持在26-28℃。
实施例3
一种柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，包括：
步骤1.诱变处理液配置：称取适量的叠氮化钠加入在pH值为3.00(±0.05)的0.1mol/L磷酸钾盐缓冲液中，配置成终浓度为1mmol/L的诱变处理液。使用诱变处理液时，加入表面活性剂Silwet L-77(终浓度为0.5％)。
步骤2.将柑橘种子在超净工作台中剥去外种皮，用1％的NaClO消毒10min，于超净工作台中弃掉NaClO液体，用无菌水漂洗3次后4℃放置过夜后播种于MS培养基(pH值5.7)。播种后于暗培养约20d，再光照培养，光照培养条件为：12h光照/12h黑暗，光强40μmol·m- 2s-1)10d，生长温度保持在26-28℃。此时幼苗植株茎粗达到1mm以上，株高大于5cm。1L MS培养基成分为：NH4NO3 1.65g，KNO3 1.9g，CaCl2·2H2O 0.44g，MgSO4·7H2O 0.37g，KH2PO40.17g，KI 0.83mg，H3BO3 6.25mg，MnSO4·4H2O 22.3mg，ZnSO4·7H2O 8.65mg，Na2MoO4·2H2O0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2-EDTA·2H2O37.3mg，蔗糖30g，琼脂粉8g。
步骤3.在无菌条件下，用锐利的刀片截取植株上的节间茎段，每个节间茎段长度约1cm。利用诱变处理液处理3h。处理前将待处理节间茎段包裹于纱布袋中(纱布袋吸水后能沉于液面之下，能避免出现部分节间茎段漂浮在液面上发生处理不完全的现象，同时易于处理结束后迅速取出所有节间茎段)，再把纱布袋浸泡于不同诱变处理液中在黑暗条件下处理至相应的时间，处理结束后将节间茎段放在吸水纸上摊开以吸干节间茎段上残余的液体，然后将处理后的节间茎段平放在诱导培养基上生长，光照培养条件为：12h光照/12h黑暗，光强40μmol·m-2s-1，温度保持在26-28℃。15d后，即可观察到节间茎段横截面伤口处生长出再生芽。1L诱导培养基成分为：NH4NO3 1.65g，KNO3 1.9g，CaCl2·2H2O 0.44g，MgSO4·7H2O 0.37g，KH2PO4 0.17g，KI 0.83mg，H3BO3 6.25mg，MnSO4·4H2O22.3mg，ZnSO4·7H2O 8.65mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg，蔗糖30g，6-苄氨基腺嘌呤3g，琼脂粉8g。
步骤4.剪取再生芽的部分叶片提取其基因组DNA，利用如实施例1中SRAP分子标记方法检测节间茎段处理后生长出的再生芽与对照再生芽间的基因组构成差别，鉴定出遗传物质发生变异的再生芽。SRAP分子标记方法PCR反应程序为：95℃5min；95℃1min，35℃1min，72℃2min，5个循环；95℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环。
步骤5.培养筛选出的发生变异的再生芽，获得柑橘突变体材料。具体方法包括：取一直径9cm的滤纸放置于液体生根培养基的表面，将发生变异的再生芽放置于所述滤纸上，每张滤纸放置3个再生芽，光照培养3天，其中，所述生根培养基包含：1/2MS盐，浓度10g/L的蔗糖，初始浓度1g/L的吲哚丁酸和初始浓度2g/L的萘乙酸。然后调节所述生根培养基中的吲哚丁酸的浓度为1.5g/L，萘乙酸的浓度为3g/L，继续光照培养5天。再然后调节所述生根培养基中的吲哚丁酸的浓度为2g/L，萘乙酸的浓度为4g/L，并向液体生根培养基中加入纳米活性炭、珍珠岩、绿萝气生根粉末和太阳花植株粉末，继续光照培养5天，获得生根的变异苗，将该变异苗继续培养，得到变异植株，其中，所述纳米活性炭、珍珠岩、绿萝气生根粉末和太阳花植株粉末与所述液体生根培养基的质量比依次为1:4、1:4、1:10和1:20。光照培养条件为：12h光照/12h黑暗，光强40μmol·m-2s-1，温度保持在26℃。
效果验证
以克里迈丁红橘为实验材料，利用本发明实施例1提供的方法进行三次重复实验，实验结果统计如下：
表1叠氮化钠处理柑橘幼年态节间茎段的存活率
表2 1mmol/L诱变处理液处理柑橘幼年态节间茎段2h的存活率和再生芽率
表3 1mmol/L诱变处理液处理柑橘幼年态节间茎段2h的再生芽致变效率
表4 1mmol/L诱变处理液处理柑橘幼年态节间茎段2h的再生芽生根效率
图1A和1B为诱变处理后节间茎段的存活情况的部分结果的照片。图2所示为1mmol/L诱变处理液处理柑橘幼年态节间茎段2h后存活节间茎段的再生芽生发情况的部分结果的照片。图3为1mmol/L诱变处理液处理柑橘幼年态节间茎段2h处理后再生芽的分子标记检测情况的部分结果。
上述实施例显示，叠氮化钠浓度越高和处理时间越长，柑橘幼年态节间茎段的存活率越低(如表1所示)；诱变处理液中是否加入Silwet L-77(终浓度为0.5％)对节间茎段的存活率和产生再生芽的效率均影响不大(如表1，表2所示)；柑橘幼年态节间茎段经1mmol/L叠氮化钠处理2h后的存活率约为55％，处理后的存活节间茎段产生再生芽率约为97％(如表2所示)；SRAP分子标记检测的结果显示(如表3所示)，含Silwet L-77(终浓度为0.5％)的1mmol/L叠氮化钠处理2h后再生芽变异率约为14.49％，而不含Silwet L-77的1mmol/L叠氮化钠处理2h后再生芽变异率约为5.80％，即诱变处理液中加入表面活性剂Silwet L-77能明显提高诱变效率。
以克里迈丁红橘为实验材料，利用本发明实施例2提供的方法进行三次重复实验，实验结果统计如下：
表8 2mmol/L诱变处理液处理柑橘幼年态节间茎段1h的再生芽致变效率
表9 2mmol/L诱变处理液处理柑橘幼年态节间茎段1h的再生芽生根效率
以克里迈丁红橘为实验材料，利用本发明实施例3提供的方法进行三次重复实验，实验结果统计如下：
表10 1mmol/L诱变处理液处理柑橘幼年态节间茎段3h的再生芽致变效率
表11 1mmol/L诱变处理液处理柑橘幼年态节间茎段3h的再生芽生根效率
这里说明的数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
如上所述，本发明提出了一种柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，该方法明确了叠氮化钠对柑橘幼年态节间茎段的有效处理条件，并且操作过程相对简单，能适用于大规模创制柑橘遗传材料，进而能够推动柑橘种质创新等工作。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南省园艺研究所
<120> 柑橘幼年态茎段的叠氮化钠诱变处理方法
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Claims (10)
1.一种柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，包括如下步骤：
步骤一、取茎粗1mm以上和株高5-10cm的柑橘幼苗植株，之后截取所述柑橘幼苗植株上的节间茎段，然后将该节间茎段浸泡于诱变处理液中于黑暗条件下进行诱变处理1-3h，该诱变处理液包含浓度0.5-2mmol/L的叠氮化钠；
步骤二、将经过诱变处理之后的节间茎段进行组织培养，至该节间茎段的截面伤口处生长出再生芽；以及
步骤三、利用SRAP分子标记方法检测出发生变异的再生芽，并培养该发生变异的再生芽生根，获得完整的柑橘突变体植株。
2.如权利要求1所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，其特征在于，所述步骤一中，所述诱变处理液的配置方法为：称取适量的叠氮化钠加入pH值为3.00(±0.05)的0.1mol/L磷酸钾盐缓冲液中，得到所述诱变处理液。
3.如权利要求1所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，其特征在于，所述步骤一中，所述诱变处理液包含浓度1mmol/L的叠氮化钠，进行诱变处理的时间为2h。
4.如权利要求1所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，其特征在于，所述步骤一中，将所述节间茎段浸泡于诱变处理液中时，首先将所述节间茎段包裹于纱布袋内，之后再将纱布袋浸泡于所述诱变处理液中。
5.如权利要求1所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，其特征在于，所述步骤二中，将经过诱变处理之后的节间茎段置于诱导培养基上进行光照培养，该诱导培养基包含：MS盐，浓度30g/L的蔗糖、8g/L的琼脂粉和3g/L的6-苄氨基腺嘌呤，光照培养条件为：12h/d光照和12h/d黑暗，光照强度40μmol·m-2s-1，培养温度为26-28℃。
6.如权利要求1所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，其特征在于，所述步骤一中，获得所述柑橘幼苗植株的方法包括：
取柑橘种子，用1％(w/v)的NaClO消毒，之后4℃放置过夜后，然后播种于MS盐固体培养基上，且播种后首先暗培养约20d，之后进行光照培养，光照培养条件为：12h/d光照和12h/d黑暗，光照强度40μmol·m-2s-1，培养温度为26-28℃，至得到所述柑橘幼苗植株。
7.如权利要求1所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，其特征在于，所述步骤三中，SRAP分子标记方法PCR反应程序为：95℃5min；95℃1min，35℃1min，72℃2min，5个循环；95℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min。
8.如权利要求1所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，其特征在于，所述步骤三中，获得完整的柑橘突变体植株的具体方法包括：
取一直径9cm的滤纸放置于液体生根培养基的表面，将发生变异的再生芽放置于所述滤纸上，每张滤纸放置3-7个再生芽，光照培养3-5天，其中，所述生根培养基包含：1/2MS盐，浓度10g/L的蔗糖，初始浓度1g/L的吲哚丁酸和初始浓度2g/L的萘乙酸；
然后调节所述生根培养基中的吲哚丁酸的浓度为1.5g/L，萘乙酸的浓度为3g/L，继续光照培养5-6天；
再然后调节所述生根培养基中的吲哚丁酸的浓度为2g/L，萘乙酸的浓度为4g/L，并向液体生根培养基中加入纳米活性炭、珍珠岩、绿萝气生根粉末和太阳花植株粉末，继续光照培养5-8天，获得生根的变异苗，将该变异苗继续培养，得到完整植株，其中，所述纳米活性炭、珍珠岩、绿萝气生根粉末和太阳花植株粉末与所述液体生根培养基的质量比依次为1:4、1:4、1:10和1:20。
9.如权利要求1所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，其特征在于，所述步骤一中，每个所述节间茎段长度约1cm。
10.如权利要求2所述的柑橘幼年态节间茎段的叠氮化钠诱变处理方法，其特征在于，所述诱变处理液在使用时，加入表面活性剂Silwet L-77，使其终浓度为0.5％(v/v)。
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