CN114395565A - 苹果感病基因及其在抗病性调控中的应用 - Google Patents

苹果感病基因及其在抗病性调控中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种苹果感病基因MdLRRP1及其含有的特异性基因片段，苹果感病基因MdLRRP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，特异性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。苹果感病基因MdLRRP1编码蛋白具有富亮氨酸重复序列。本发明还提供了苹果感病基因MdLRRP1在调控苹果抗病性、培育苹果抗病植株中的应用，通过苹果感病基因MdLRRP1沉默可显著提高对苹果树腐烂病菌的抗性。本发明揭示了感病基因MdLRRP1在苹果抗枝干病害方面的重要功能，为创制苹果抗病新种质提供了物质储备和技术支持。

Description

苹果感病基因及其在抗病性调控中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及植物病害防治及抗性植株选育，具体涉及苹果感病基因及其抗病性能表征。
背景技术
在植物生长的环境中，存在种类繁多的微生物，其中一些微生物会为了获取生存所需的营养而危害植物，成为植物的病原微生物。病原微生物攻击植物，不仅会影响植物正常的生长发育，还表现出不同的植物病害病状。植物对病原微生物入侵的应对，除了植物组织表面的物理屏障外，还在与病原微生物长期斗争的过程中进化形成复杂的免疫系统来抵抗病原微生物的胁迫。
植物应对病原微生物胁迫的分子机制已有较多的文献报道，在此不作赘述。在调控植物免疫过程中，类受体激酶（Receptor-like kinase，RLK）和类受体蛋白（Receptor-like protein，RLP）发挥了十分重要的作用。RLKs和RLPs共同的结构特征是含有一个胞外结构域以及一个跨膜结构，并且二者的胞外结构域多为一定数量的富亮氨酸重复序列（Leucine-rich repeat，LRR）结构。LRR结构最早发现于人类血清，之后在其它动物、植物和微生物中相继发现，其结构主要特征是在一定区段内呈现出规律连续的亮氨酸（Leucine）分布。含LRR结构的蛋白广泛参与植物生理调节，相关研究综述参见文献《植物富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶的生物学功能》（马媛媛等，植物生理与分子生物学学报，2005（04））。区别于典型的LRR-RLKs和LRR-RLPs，植物中还存在一类特殊的LRR蛋白，在植物免疫过程中发挥了十分关键的作用。这类LRR蛋白胞外只含有一定数量的LRR结构，不含跨膜结构和胞内结构域，在不同物种分布的广泛性、定位的多样性决定了其功能的复杂性。LRR结构使该类蛋白能够感知形态各异的配体进而激发植物的一系列的生理反应、信号转导以及抗逆和抗病反应等。
苹果是世界上栽培最广泛的果品之一，我国苹果栽培面积大、经济价值高，在产业脱贫中发挥着巨大作用。然而，由于多种病害侵袭危害，对苹果产业的发展造成了不可估量的损失。其中，苹果树腐烂病是由苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）引起的真菌病害，一直是对苹果安全生产威胁很大的毁灭性病害，被果农称为苹果树“癌症”。病菌主要侵染苹果树枝干的皮层和木质部，引起主干、大枝树皮溃烂、整树枯死，严重时甚至造成大量死树毁园。苹果树腐烂病的防治方法主要以农业防治和化学防治为主，但提高苹果树抗病性是最经济、有效、绿色、持久的防治方法。目前尚缺少对苹果树腐烂病具有高抗的苹果品种，提高苹果树抗病性是苹果抗病育种研究中的热点和难点。
发明内容
本发明要解决的技术问题：利用分子生物学和基因工程提高苹果树的抗病性，发掘具有调控苹果树抗病性的功能基因，采取有效手段拓展功能基因在提高苹果树抗病性方面的应用。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种苹果感病基因MdLRRP1，沉默苹果感病基因MdLRRP1能够增强苹果对腐烂病的抗性，可为绿色、持久地防治苹果树腐烂病和创制苹果抗腐烂病新种质提供技术支持。为了完整无异议地理解本发明的技术方案，本发明所述“苹果”的含义是指苹果树（苗），或通过组织培养的方式获得的组培苗，而非单纯地理解为可食用的苹果果实。
基于本发明的记载，本发明首次提出苹果感病基因MdLRRP1及其特异性基因片段在调控苹果抗病性方面的应用，所述苹果感病基因MdLRRP1核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述苹果感病基因MdLRRP1特异性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
苹果感病基因MdLRRP1含有核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的特异性基因片段。本发明通过所述苹果感病基因MdLRRP1沉默可提高对苹果树腐烂病菌的抗性。
进一步地，本发明提出苹果感病基因MdLRRP1及其特异性基因片段在培育苹果抗病植株中的应用，所述苹果感病基因MdLRRP1核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述苹果感病基因MdLRRP1特异性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。需要说明的是，本发明并没有限定培育苹果抗病植株的具体实现方式，基于苹果感病基因MdLRRP1及其特异性基因片段，本领域普通技术人员结合现有技术，不难实现苹果抗病植株的培育工作。同时，结合本发明的记载，苹果抗病植株优选为抗苹果树腐烂病的植株。
作为培育苹果抗病植株应用的优选实施方式，可通过基因工程创制苹果抗病植株，降低所述苹果感病基因MdLRRP1在苹果植株中的表达丰度。
还有，本发明给出了一种提高苹果抗病性的方法，其包括调控苹果感病基因MdLRRP1在苹果植株中的表达；所述苹果感病基因MdLRRP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
作为提高苹果抗病性方法的优选实施方式，其包括降低所述苹果感病基因MdLRRP1表达。基于本发明的记载，通过降低所述苹果感病基因MdLRRP1的表达丰度（表达量），可以提高对苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）的侵染抗性。
还有，本发明提供了一种抗苹果树腐烂病的植株，其通过实现苹果感病基因MdLRRP1沉默的方式获得，所述苹果感病基因MdLRRP1核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本领域普通技术人员，基于苹果感病基因MdLRRP1及其特异性基因片段的功能，在结合现有技术的基础上，可以获得抗苹果树腐烂病的植株。
如上所述，本发明基于苹果感病基因MdLRRP1给出的提高苹果抗病性方法，以及获得抗苹果树腐烂病的植株，为解决苹果抗病育种研究难题提供了一种行之有效的技术路径，可以说是目前为止最经济、有效、绿色、持久的防治苹果树腐烂病的方法，同时有效克服了以农业防治和化学防治为主防治苹果树腐烂病的技术缺陷。
因此，本发明请求保护苹果感病基因MdLRRP1及其含有的特异性基因片段就显得尤为重要。所述苹果感病基因MdLRRP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述特异性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
基于本发明的记载，本发明还请求保护一种表达载体，其含有核苷酸序列如SEQID NO：2所示的特异性基因片段。
本发明还进一步研究了所述苹果感病基因MdLRRP1编码蛋白的生物学特性，获知其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。为了完整无异议地理解本发明的技术方案，需要补充说明的是，本发明所述苹果感病基因用倾斜字体“MdLRRP1”表示，苹果感病基因MdLRRP1编码蛋白用非倾斜字体“MdLRRP1”表示。当然，本领域普通技术人员可以根据本发明的记载，可以清楚、完整地理解相关基因及其编码蛋白的含义与表述。
与现有技术相比，本发明“苹果感病基因及其在抗病性调控中的应用”具有下述的有益效果或优点：
1）本发明首次揭示苹果感病基因MdLRRP1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。苹果感病基因MdLRRP1含有核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的特异性基因片段。通过调控苹果感病基因MdLRRP1表达，提高苹果抗病性。本发明为解决苹果抗病育种研究难题提供了一种行之有效的技术方案，可为创制苹果抗腐烂病新种质提供技术支持。
2）本发明在提高苹果抗病性方面意义重大。借助基因工程技术，通过苹果感病基因MdLRRP1沉默，可提高对苹果树腐烂病菌的抗性，本发明为从分子生物学角度防治苹果树腐烂病提供了新的解决思路。
3）本发明进一步揭示苹果感病基因MdLRRP1编码蛋白MdLRRP1富含亮氨酸重复序列结构。更重要的是，生物信息学分析发现，苹果感病基因MdLRRP1高度保守且广泛分布，可以广泛应用于基因工程领域，有着巨大的经济价值和应用前景，预测其可能成为一个用于多种植物遗传改良的优质基因资源。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将本发明实施例中所设计附图做简单的说明，显而易见地，所列出的附图仅仅是本发明实施例的一部分内容的呈现。
图1是本发明实施例提供的苹果感病基因及其在抗病性调控应用中的研究技术路线图。
图2是本发明实施例提供的苹果感病基因MdLRRP1在苹果根、茎、叶、花、芽、果等不同组织中的相对表达量。
图3是本发明实施例提供的苹果感病基因MdLRRP1编码蛋白MdLRRP1的亚细胞定位结果。其中，A是MdLRRP1-GFP融合蛋白在烟草细胞质壁分离处理前明场下的细胞视野图；B是MdLRRP1-GFP融合蛋白在烟草细胞质壁分离处理前绿色荧光示意图；C是MdLRRP1-GFP融合蛋白在烟草细胞质壁分离处理后明场下的细胞视野图；D是MdLRRP1-GFP融合蛋白在烟草细胞质壁分离处理后绿色荧光示意图，箭头所指位置为胞外区域。
图4是本发明实施例提供的苹果感病基因MdLRRP1沉默植株荧光鉴定结果。其中。其中，A是阴性对照野生型苹果组培苗叶片荧光观察图；B是苹果感病基因MdLRRP1沉默株系RNAi-1叶片荧光观察图；C是苹果感病基因MdLRRP1沉默株系RNAi-2叶片荧光观察图；D是苹果感病基因MdLRRP1沉默株系RNAi-3叶片荧光观察图。
图5是本发明实施例提供的苹果感病基因MdLRRP1沉默植株叶片相对表达量鉴定结果，其中，WT为野生型苹果组培苗，RNAi-1、RNAi-2、RNAi-3分别为苹果感病基因MdLRRP1沉默株系。
图6是本发明实施例提供的苹果感病基因MdLRRP1的基因沉默载体在蛋白水平的鉴定结果，其中，WT为野生型苹果组培苗，RNAi-1、RNAi-2、RNAi-3分别为苹果感病基因MdLRRP1沉默株系。
图7是本发明实施例提供的苹果感病基因MdLRRP1沉默株系抗苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）侵染的表型观察结果，其中，WT为野生型苹果组培苗，RNAi-1、RNAi-2、RNAi-3分别为苹果感病基因MdLRRP1沉默株系。
图8是本发明实施例提供的苹果感病基因MdLRRP1沉默株系抗苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）侵染的菌斑大小统计结果，其中，WT为野生型苹果组培苗，RNAi-1、RNAi-2、RNAi-3分别为苹果感病基因MdLRRP1沉默株系。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和图1所示的技术路线图，对本发明做进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。
实施例1
本实施例给出苹果感病基因MdLRRP1及其特异性片段的获取方法。
本发明揭示的苹果感病基因MdLRRP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其是从网站National Center for Biotechnology Information（NCBI）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中获得，基因号为XM_008387406.2。苹果感病基因MdLRRP1含有特异性基因片段，该特异性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。具体地，苹果感病基因MdLRRP1的特异性片段是在网站NCBI Conserved Domain Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行结构域分析后，选取的非保守区片段，该片段即为苹果感病基因MdLRRP1的特异性片段。
实施例2
本实施例对苹果感病基因MdLRRP1表达模式进行分析，选用苹果品种“富士苹果”的根、茎、叶、花、芽、果等不同组织作为供试材料。采集不同组织样品后立即放到液氮中速冻，提取组织总RNA，反转录后进行定量检测。
本实施例的RNA提取试剂盒采用北京华越洋生物科技有限公司的多糖多酚植物RNA提取试剂盒。反转录选用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit。定量分析仪器使用LightCycler 96 real-time PCR machine（Roche）。定量分析试剂为RealStarGreen Mixture（GenStar，Beijing，China）。
qPCR分析苹果感病基因MdLRRP1在不同组织中的相对表达量，以反转录得到的cDNA为模板。qPCR程序如下：95℃ 10分钟，95℃ 15秒进行40个循环，60℃ 30秒，72℃ 30秒。通过2–ΔΔCT方法对qPCR结果进行定量分析，分析结果（平均值±标准差）见图2。如图2所示，苹果感病基因MdLRRP1在根中的相对表达量为1.00834±0.12424，在茎中的相对表达量为0.583416±0.07649，在叶中的相对表达量为1.62911±0.04815，在花中的相对表达量为1.97966±0.37914，在芽中的相对表达量为0.064004±0.033836，在果中的相对表达量为1.48006±0.28851。由图2能够得到，苹果感病基因MdLRRP1在“富士苹果”的叶、花和果中具有相对较高的表达丰度。
实施例3
本实施例给出苹果感病基因MdLRRP1的亚细胞定位，所用载体为含有GFP标签的pCAMBIA1302载体。通过同源重组的方法将苹果感病基因MdLRRP1构建到pCAMBIA1302载体中，得到重组载体。将构建好的重组载体转化到农杆菌GV3101菌株中。摇菌，5000 rpm离心3分钟，使用侵染液（10 mM MgCl2，10 mM MES和150 μM Ace）悬浮菌体后用无针注射器注射4周龄烟草叶片，在温室中培养两天后观察荧光。荧光观察使用奥林巴斯FV3000激光共聚焦显微镜。
图3给出了苹果感病基因MdLRRP1的亚细胞定位结果。如图3所示，在烟草细胞质壁分离处理前，MdLRRP1-GFP融合蛋白荧光主要集中在细胞膜；在烟草细胞质壁分离处理后，在胞外区域观察到荧光，表明苹果感病基因MdLRRP1编码蛋白MdLRRP1能够分泌到胞外区域。
实施例4
本实施例提供苹果感病基因MdLRRP1的基因沉默分析。
1.表达载体的构建
沉默苹果感病基因MdLRRP1的载体选用含有GFP标签的pK7GWIWG2D（Ⅱ）载体和中间载体pDONR222。本实施例提供的表达载体的构建方法，包括：通过Gateway方法首先使用BP酶将苹果感病基因MdLRRP1的特异性片段构建到中间载体pDONR222上，随后使用LR酶将其构建到最终载体pK7GWIWG2D（Ⅱ）上。
2.基因沉默株系的培养
将构建好的重组载体转化到农杆菌EHA105菌株中，摇菌并侵染野生型苹果组培苗。苹果组培苗在25℃（光照16 h/黑暗8 h）条件下培养，培养基为添加0.2 mg/L 6-BA、0.2mg/L IAA的MS培养基，每隔4周继代一次。继代时，切取茎尖部分，留有2-3片嫩叶，移至新的MS培养基上进行培养。
取4周龄苹果组培苗，用镊子夹取叶片至菌液中浸泡。用手术刀垂直叶脉轻划3-4条伤口，浸泡7 min后用镊子夹出叶片置于无菌滤纸上吸干液体，平展铺在不含抗生素的培养基上，室温黑暗培养2-3 d后转移至含有25 mg/L卡那霉素的筛选培养基上，黑暗培养25-28 d。当观察到叶片伤口处有白色或浅绿色嫩芽长出时，将平板转移至光下培养。见光3 周后可观察到白色或绿色嫩芽，将绿色抗性芽切下转移至筛选培养基上继续筛选培养直到抗性芽分化出茎尖，标记株系（基因沉默株系），进行鉴定。
3.基因沉默株系的鉴定
（1）荧光鉴定
在卡那霉素培养基筛选之后，采集苹果感病基因MdLRRP1沉默株系的叶片，同时使用野生型苹果组培苗叶片作为对照，在荧光显微镜下进行观察。图4给出了苹果感病基因MdLRRP1沉默植株荧光鉴定结果。如图4所示，阴性对照野生型苹果组培苗叶片没有绿色荧光，苹果感病基因MdLRRP1沉默株系RNAi-1、RNAi-2、RNAi-3的叶片均有绿色荧光。
（2）相对表达量鉴定
在卡那霉素培养基筛选之后，采集苹果感病基因MdLRRP1沉默株系的叶片，同时使用野生型苹果组培苗叶片作为对照，采集样品后立即放到液氮中速冻，提取RNA，反转录后进行定量检测。
使用反转录得到的cDNA为模板进行qPCR分析，qPCR程序如下：95℃ 10分钟，95℃15秒进行40个循环，60℃ 30秒，72℃ 30秒。通过2–ΔΔCT方法对qPCR结果进行定量分析。分析结果（平均值±标准差）见图5。
如图5所示，苹果感病基因MdLRRP1在野生型苹果组培苗（WT）叶片中的相对表达量为1.015545±0.159982，在苹果感病基因MdLRRP1沉默株系RNAi-1叶片中的相对表达量为0.563018±0.041241，在苹果感病基因MdLRRP1沉默株系RNAi-2叶片中的相对表达量为0.61864±0.04405，在苹果感病基因MdLRRP1沉默株系RNAi-3叶片中的相对表达量为0.64783±0.023401。由此得出，三个MdLRRP1基因沉默株系的MdLRRP1基因的相对表达量均显著低于野生型苹果组培苗。
4.蛋白水平鉴定
在卡那霉素培养基筛选之后，采集苹果感病基因MdLRRP1沉默株系的叶片，同时使用野生型苹果组培苗叶片作为对照，采集样品后立即放到液氮中速冻提取蛋白，并用Western blot进行检测。
蛋白提取所用裂解液为索莱宝公司的非变性组织/细胞裂解液。将液氮冷冻的叶片样品研磨成粉末，加入裂解液混匀后静置30分钟，然后4℃ 10000 rpm离心，上清即为蛋白。将提取的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转PVDF膜，用GFP抗体进行孵育。
苹果感病基因MdLRRP1的核苷酸序列委托上海生工生物工程股份有限公司测序。经核苷酸序列比对及翻译，苹果感病基因MdLRRP1编码蛋白MdLRRP1的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。其中，氨基酸序列第28-183个氨基酸为LRR结构，LRR结构内是保守的11残基序列基序（LxxLxLxxN/CxL），LRR折叠在一起形成螺线管蛋白结构域，即为富亮氨酸重复结构域。
图6给出了苹果感病基因MdLRRP1的基因沉默载体在蛋白水平的鉴定结果。如图6所示，苹果感病基因MdLRRP1沉默株系RNAi-1、RNAi-2、RNAi-3用GFP标签抗体均能检测出条带，而野生型苹果组培苗检测不出条带。
由本实施例的鉴定结果可知，苹果感病基因MdLRRP1的基因沉默载体己经整合到了苹果组培苗植株中，并且MdLRRP1基因被成功沉默。
实施例5
本实施例提供苹果感病基因MdLRRP1沉默植株的抗病性鉴定。
选取4周龄生长健壮、状态一致的苹果感病基因MdLRRP1沉默株系和野生型苹果组培苗，在叶片上分别接种苹果树腐烂病菌（Valsa mali）。所用苹果树腐烂病菌（Valsa mali）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏日期2021年05月18日，保藏编号CGMCC No. 22441。具体接种操作为：用无菌注射器针头在叶片上扎3个相邻小孔，将4 mm腐烂病菌菌饼贴于小孔上，喷水保湿，在25℃条件下培养40小时后观察表型。
图7给出了苹果感病基因MdLRRP1沉默株系（RNAi-1、RNAi-2、RNAi-3）和野生型苹果组培苗抗苹果黑腐皮壳菌侵染的表型观察结果。如图7所示，三个苹果感病基因沉默株系的菌斑大小均小于野生型苹果组培苗。
将三个MdLRRP1基因沉默株系叶片与野生型组培苗叶片上的菌斑大小用ImageJ软件进行统计。图8给出了菌斑大小统计结果（平均值±标准差）。苹果感病基因MdLRRP1沉默株系RNAi-1叶片的菌斑大小为27.801 mm2±0.984，RNAi-2叶片的菌斑大小为28.671 mm2±3.356，RNAi-3叶片的菌斑大小为29.731 mm2±2.762。野生型苹果组培苗叶片的菌斑大小为52.297 mm2±2.875。
本实施例的鉴定结果说明在苹果中沉默感病基因MdLRRP1基因能够显著提高苹果对腐烂病菌的抗性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 西北农林科技大学深圳研究院
<120> 苹果感病基因及其在抗病性调控中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 651
<212> DNA
<213> 苹果(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
atggcggcgg catccaggtt cttcttcact ctaaccctaa ccctaagcgt atgcctcctt 60
ccgctggtgt atgccaactc cgaaggcgac gctttgtaca cgttccggcg gagcttgtcg 120
gatcccgata acctgctcca gagctgggat cctaccctcg tcaacccttg cacttggttt 180
cacatcacct gcaaccagga caatcgcgtt acccgagtgg atttaggtaa ttcaaacctc 240
tctggacatt tggtacctga actaggaaag cttgagcatc ttcaatatct ggagctttac 300
aaaaataaca ttcaaggaac tattccagct gagcttggta acctgaagag cctcattagc 360
ttggacttat ataacaacaa catatcgggg accattcctc cgtcgttggg gaaattgaaa 420
tcacttgtgt ttttgcgtct caatgacaat aggttaactg ggccaatccc cagggatctt 480
acgggtattt caagcctcaa agttgtggat gtatcaaaca ataatttatg tgggacgatt 540
cctaccagtg gaccatttga gcacatcccc ttgaacaact ttgagaacaa ccatcgactc 600
gaaggtccag aattgttggg gcttgcaagt tacgatacaa actgctcgta a 651
<210> 2
<211> 200
<212> DNA
<213> 苹果(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
caatgacaat aggttaactg ggccaatccc cagggatctt acgggtattt caagcctcaa 60
agttgtggat gtatcaaaca ataatttatg tgggacgatt cctaccagtg gaccatttga 120
gcacatcccc ttgaacaact ttgagaacaa ccatcgactc gaaggtccag aattgttggg 180
gcttgcaagt tacgatacaa 200
<210> 3
<211> 216
<212> PRT
<213> 苹果(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
Met Ala Ala Ala Ser Arg Phe Phe Phe Thr Leu Thr Leu Thr Leu Ser
1 5 10 15
Val Cys Leu Leu Pro Leu Val Tyr Ala Asn Ser Glu Gly Asp Ala Leu
20 25 30
Tyr Thr Phe Arg Arg Ser Leu Ser Asp Pro Asp Asn Leu Leu Gln Ser
35 40 45
Trp Asp Pro Thr Leu Val Asn Pro Cys Thr Trp Phe His Ile Thr Cys
50 55 60
Asn Gln Asp Asn Arg Val Thr Arg Val Asp Leu Gly Asn Ser Asn Leu
65 70 75 80
Ser Gly His Leu Val Pro Glu Leu Gly Lys Leu Glu His Leu Gln Tyr
85 90 95
Leu Glu Leu Tyr Lys Asn Asn Ile Gln Gly Thr Ile Pro Ala Glu Leu
100 105 110
Gly Asn Leu Lys Ser Leu Ile Ser Leu Asp Leu Tyr Asn Asn Asn Ile
115 120 125
Ser Gly Thr Ile Pro Pro Ser Leu Gly Lys Leu Lys Ser Leu Val Phe
130 135 140
Leu Arg Leu Asn Asp Asn Arg Leu Thr Gly Pro Ile Pro Arg Asp Leu
145 150 155 160
Thr Gly Ile Ser Ser Leu Lys Val Val Asp Val Ser Asn Asn Asn Leu
165 170 175
Cys Gly Thr Ile Pro Thr Ser Gly Pro Phe Glu His Ile Pro Leu Asn
180 185 190
Asn Phe Glu Asn Asn His Arg Leu Glu Gly Pro Glu Leu Leu Gly Leu
195 200 205
Ala Ser Tyr Asp Thr Asn Cys Ser
210 215

Claims (10)

1.苹果感病基因MdLRRP1及其特异性基因片段在调控苹果树腐烂病抗性方面的应用，所述苹果感病基因MdLRRP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述苹果感病基因MdLRRP1特异性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述苹果感病基因MdLRRP1沉默，提高对苹果树腐烂病菌的抗性。
3.苹果感病基因MdLRRP1及其特异性基因片段在培育腐烂病抗病植株中的应用，所述苹果感病基因MdLRRP1核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述苹果感病基因MdLRRP1特异性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过基因工程创制苹果抗病植株，降低所述苹果感病基因MdLRRP1在苹果植株中的表达丰度。
5.一种提高苹果树腐烂病抗病性的方法，其特征在于，包括调控苹果感病基因MdLRRP1在苹果植株中的表达；所述苹果感病基因MdLRRP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括降低所述苹果感病基因MdLRRP1表达。
7.一种抗苹果树腐烂病的植株，其通过实现苹果感病基因MdLRRP1沉默的方式获得，所述苹果感病基因MdLRRP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
8.一种苹果感病基因MdLRRP1及其含有的特异性基因片段，其特征在于，所述苹果感病基因MdLRRP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述特异性基因片段的核苷酸序列如SEQID NO：2所示。
9.一种表达载体，其含有权利要求8所述的特异性基因片段。
10.苹果感病基因MdLRRP1的编码蛋白，其特征在于，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：3所示。
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