CN104278007B - 一种慈姑原生质体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种慈姑原生质体的制备方法。本发明将慈姑经过慈姑茎尖培养、试管苗水培预处理、原生质体的酶解、原生质体的纯化、原生质体的悬浮得到慈姑原生质体。本发明克服了现有慈姑的常规育种非常困难，易造成栽培品种遗传基础单一，阻碍慈姑品种改良等缺陷。本发明利用了茎尖组织培养技术获得了无菌的慈姑壮苗，为原生质体的分离提供了最佳的外植体，其次采用酶解法分离出高质量的慈姑原生质体，且其产量在2×106个/克以上，活力超过80％，绝大多数为球形的，其细胞膜完整且富含叶绿体，具有较高活力，能满足后续各种研究需要。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种慈姑原生质体的制备方法。
背景技术
慈姑为多年生水生草本植物，生产上常作为一年生作物栽培，原产中国。在中国华南地区和长江流域普遍栽培，江苏太湖地区和里下河地区及珠江三角洲为主产区。慈姑常规育种困难，易造成栽培品种遗传基础单一，阻碍慈姑品种改良。
在本发明作出之前，慈姑的常规育种非常困难，易造成栽培品种遗传基础单一，阻碍慈姑品种改良。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制一种慈姑原生质体的制备方法。
本发明的技术方案是：
一种慈姑原生质体的制备方法，其主要技术特征在于步骤：
(1)慈姑茎尖培养：将慈姑茎尖接种在茎尖培养基上培养；
(2)试管苗水培预处理：将步骤(1)的试管苗移入装有无菌水的广口瓶中培养；
(3)原生质体的酶解：剪取步骤(2)的试管苗新长出的叶片，切成条状，加入酶液进行酶解；
(4)原生质体的纯化：用筛网过滤步骤(3)的酶液，并用洗液中洗，离心去上清液，再加入洗液，然后用吸管轻轻注入到蔗糖溶液界面上，离心吸取中间部分的原生质体。
(5)原生质体的悬浮：将步骤(4)纯化的原生质体悬浮于原生质体液体培养基中。
所述步骤(1)中，在25℃培养30天。
所述步骤(2)中，在25℃培养15天。
所述步骤(3)中在28℃暗条件下酶解12h。
本发明利用了茎尖组织培养技术获得了无菌的慈姑壮苗，为原生质体的分离提供了最佳的外植体，其次采用酶解法分离出高质量的慈姑原生质体，且其产量在2×106个/克以上，活力超过80％，能满足后续各种研究需要。
附图说明
图1——本发明所获得的慈姑原生质体示意图。
具体实施方式
本发明的技术思路是：
原生质体指去掉细胞壁的裸露活细胞，是进行各种细胞及遗传操作的理想材料，已广泛地应用于体细胞杂交、遗传转化、种质资源保存、基因瞬时表达、蛋白质互作、信号转导等方面。因此，原生质体技术可为慈姑的种质资源创新和遗传改良提供新的技术途径。而实现上述应用的前提是制备高产量和高活力的原生质体。
本发明所采用的技术方案主要包括以下5个步骤：
(1)慈姑茎尖培养：将一定大小的慈姑茎尖接种在茎尖培养基上，25℃培养30天。
(2)试管苗水培预处理：将步骤(1)的试管苗移入装有无菌水的广口瓶中，25℃培养15天。
(3)原生质体的酶解：剪取步骤(2)的试管苗新长出的叶片，用手术刀片将叶片切成1-2mm宽的条状，加入酶液，28℃暗条件下酶解12h。
(4)原生质体的纯化：用孔径为45μm的不锈钢筛网过滤步骤(3)的酶液，并用洗液冲洗，滤液离心去上清液，再加入洗液，然后用吸管轻轻注入到蔗糖溶液界面上，离心吸取中间部分的原生质体。
(5)原生质体的悬浮：将步骤(4)纯化的原生质体悬浮于原生质体液体培养基中，用于产量和活力的检测。
实施例：
1、慈姑茎尖培养：取0.5-1cm长度的慈姑茎尖接种在茎尖培养基(MS+0.5mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA)上，置于组织培养室(温度25℃，光照强度2500lx，光照时间16h/d)培养30天。
2、试管苗水培预处理：将步骤(1)的试管苗移入装有无菌水的广口瓶中，同步骤(1)的培养条件下培养15天。
3、原生质体的酶解：剪取步骤(2)的试管苗新长出的叶片，置于铺有滤纸的无菌培养皿中，用手术刀片将叶片切成1-2mm宽的条状，加入酶液，用封口膜封口后，28℃暗条件下酶解12h。其中酶液组成为：MS+0.25％纤维素酶+0.25％离析酶+0.25％半纤维素酶+0.0055％NaH2PO4+0.06％2-吗啉乙磺酸+0.18％CaCl2·2H2O+0.65M甘露醇+250mg/L麦芽提取物。
4、原生质体的纯化：用孔径为45μm的不锈钢筛网过滤步骤(3)的酶液，并用13％甘露醇洗液冲洗，滤液转移到10mL的离心管中，950rpm离心10min，去上清。原生质体沉淀与1.0mL 13％甘露醇洗液混匀，之后用吸管轻轻转移到预先加入了3mL 28％蔗糖的离心管中，950rpm离心2mi n，用吸管将两液面间的原生质体带吸出，转移到新的离心管中，930rpm离心4mi n，去上清。
5、原生质体的悬浮：将步骤(4)纯化的原生质体悬浮于原生质体液体培养基中(MS+0.65M甘露醇+40mg/L腺嘌呤，pH 5.6)，用于产量和活力的检测。
慈姑原生质体如图1所示，绝大多数为球形的，其细胞膜完整且富含叶绿体，具有较高活力，可用于慈姑的体细胞杂交、遗传转化、基因瞬时表达等研究。
Claims (1)
1.一种慈姑原生质体的制备方法，其特征在于步骤：
(1)慈姑茎尖培养：将慈姑茎尖接种在茎尖培养基上培养，即取0.5-1cm长度的慈姑茎尖接种在茎尖培养基即MS+0.5mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA上，置于组织培养室，温度25℃，光照强度2500lx，光照时间16h/d下培养30天；
(2)试管苗水培预处理：将步骤(1)的试管苗移入装有无菌水的广口瓶中培养，同步骤(1)的培养条件下培养15天；
(3)原生质体的酶解：剪取步骤(2)的试管苗新长出的叶片，置于铺有滤纸的无菌培养皿中，用手术刀片将叶片切成1-2mm宽的条状，加入酶液，用封口膜封口后，28℃暗条件下酶解12h；其中酶液组成为：MS+0.25％纤维素酶+0.25％离析酶+0.25％半纤维素酶+0.0055％NaH2PO4+0.06％2-吗啉乙磺酸+0.18％CaCl22H2O+0.65M甘露醇+250mg/L麦芽提取物；
(4)原生质体的纯化：用孔径为45μm的不锈钢筛网过滤步骤(3)的酶液，并用13％甘露醇洗液冲洗，滤液转移到10mL的离心管中，950rpm离心10min，去上清；原生质体沉淀与1.0mL 13％甘露醇洗液混匀，之后用吸管轻轻转移到预先加入了3mL 28％蔗糖的离心管中，950rpm离心2min，用吸管将两液面间的原生质体带吸出，转移到新的离心管中，930rpm离心4min，去上清；
(5)原生质体的悬浮：将步骤(4)纯化的原生质体悬浮于原生质体液体培养基中，其中该原生质体组成为MS+0.65M甘露醇+40mg/L腺嘌呤，pH 5.6，用于产量和活力的检测。
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