CN117568256A - 一种玫瑰花瓣原生质体分离及瞬时转化体系构建的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种玫瑰花瓣原生质体提取及瞬时转化体系构建的方法，具体包括：玫瑰花瓣原生质体提取方法、原生质体瞬时转化方法、检测转录因子在下游靶基因启动子上富集的方法。本发明以“冷香”玫瑰花瓣为材料，用刀片将花瓣切成2mm左右细丝状，放入酶解液中进行酶解5h左右，酶解完成后用细胞筛过滤得到原生质体，加入1×W5洗液，反复洗涤3次以上，最后进行PEG介导原生质体瞬时转化，检测转录因子在靶基因启动子上富集情况。本发明建立了玫瑰花瓣原生质体制备和瞬时转化的方法，操作简单，无需无菌组培，省去大量前期准备工作，且转化率高，可为玫瑰基因功能分析和细胞工程等应用基础研究提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及玫瑰花瓣原生质体的提取和瞬时转化方法。
背景技术
玫瑰（Rosa rugosa）系蔷薇科蔷薇属多年生常绿或落叶丛生灌木，是世界上重要的观赏和生产兼用型花卉。
玫瑰在我国有2000余年的栽培历史，当前广泛种植于全国各地，其中以山东平阴、甘肃苦水为代表，形成了具有地域特色的玫瑰栽培品种。
玫瑰是一种木本植物，具有漫长的遗传转化周期，成功率也较低，这严重限制了玫瑰基因功能验证和分子育种。
原生质体是细胞壁以内各种结构的总称，是组成细胞的一个形态结构单位。
原生质体能够直接摄取外源的DNA(质粒)，是进行遗传转化的理想受体，广泛应用于细胞生物学、组织和细胞培养、分子生物学等方面的研究。
目前，植物原生质体的在模式植物和粮食作物上研究较多，有关玫瑰原生质体制备的研究报道较少。
建立高效的玫瑰原生质体提取和瞬时转化体系，将为玫瑰基因功能验证、基因表达调控、蛋白亚细胞定位以及基因编辑等方面提供高效稳定的技术手段。
所以，建立玫瑰花瓣瞬时表达体系对于玫瑰本体基因功能研究至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种玫瑰花瓣原生质体提取和瞬时转化的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
本发明第一方面，提供了用于从玫瑰花瓣中解离原生质体的溶液，包含酶解液和W5洗液。
所述酶解液包含纤维素酶、果胶酶、KCl、 MES(即2-吗啉乙磺酸)、CaCl2、甘露醇和BSA(牛血清白蛋白)。
所述W5洗液包含154 mmol/L NaCl 、125 mmol/L CaCl2、5 mmol/L KCl和2 mmol/L MES-KOH。
本发明第二方面提供了用于玫瑰花瓣原生质体瞬时转化的溶液，包含W5洗液和PEG溶液。
所述W5洗液包含154 mmol/L NaCl、125 mmol/L CaCl2、5 mmol/L KCl和2 mmol/LMES-KOH。
所述PEG溶液包含40% PEG 4000，0.2 mmol/L Mannitol和0.1 mol/L CaCl2。
本发明第三方面提供了一种玫瑰花瓣原生质体的提取和瞬时转化的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）选择健康且无病害的“冷香”玫瑰植株；
（2）在盛花期完全开放花朵上取花瓣若干，用不锈钢双面刀片将上述花瓣切成宽2mm左右的均匀细条，使其充分浸泡在酶解用溶液中如图1所示；
（3）在黑暗、25℃条件下，上述溶液在60rpm速度下脱色摇床上摇晃酶解5h，使用70μm的细胞筛过滤花瓣，得到含有原生质体的酶解液；
（4）上述所得的酶解液用10 ml W5溶液重悬，200g低速离心10 min，弃上清，上述操作重复3次，于冰上静置30 min；
（5）加入MMG溶液悬浮原生质体；
（6）将质粒转入原生质体，所述待转化质粒、玫瑰原生质体悬浮液、PEG溶液的质量体积比为1ug：10ul：11ul，溶液混匀后室温孵育15-20min，加入W5溶液终止反应后200g离心5min，去除PEG溶液；
（7）W5溶液清洗2次后，加入5 ml W5溶液，25℃黑暗静置过夜12h，收集原生质体进行后续实验。
本发明通过上述第一方面至第三方面所述技术方案的目的主要是实现从玫瑰花瓣中简单且高效地提取原生质体和瞬时转化。
本发明的有益效果：
本发明通过优化酶浓度组合、渗透压等酶解条件建立了一种简便、快捷、高效的玫瑰花瓣原生质体分离方案，首次建立了高效、稳定的玫瑰花瓣原生质体的转化方法，原生质体的转化率可高达80％以上，为玫瑰基因功能研究和遗传性状改良提供了强力支撑。
本发明以“冷香”玫瑰的花瓣为材料，提取和瞬时转化原生质体，建立稳定的原生质体提取以及瞬时表达体系，用于检测基因表达，旨在为玫瑰基因功能的验证、基因表达调控、蛋白亚细胞定位以及基因编辑方面提供技术支持。
附图说明
图1为本发明玫瑰花瓣原生质体分离流程。
其中，图A显示选用完全开放的花朵为试验材料。
图B显示所选提取原生质体的花瓣。
图C显示用刀片切成均匀花瓣细丝浸泡在酶解液中。
图D显示消化5小时后，花瓣细丝在酶解液中释放原生质体。
图E显示用70目的细胞筛过滤含有原生质体的酶解液，去除未消化的花瓣组织。
图F显示离心后50mL离心管底部可以清晰地观察到粉红色的原生质体沉淀。
图2A为本发明实施例1中35S:Flag-MYB5-35S:GFP质粒转入原生质体后显微镜观察下的明场和暗场。
图2B为玫瑰ANR和TPS基因启动子转录起始位点前P1和P2片段位置。
图2C、图2D为染色质免疫共沉淀结合RT-qPCR (ChIP-qPCR)分析玫瑰MYB5在ANR和TPS不同启动子区段的富集情况。
实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中用到的主要试剂为酶解液、W5洗液、MMG溶液、PEG溶液。
所述酶解液包含20 mmol/L KCl、20 mmol/L MES-KOH、10 mmol/L CaCl2、0.8mol/L Mannitol（甘露醇、3% 纤维素酶、0.8%果胶酶和0.1% BSA（牛血清白蛋白）。
W5洗液包含154 mmol/L NaCl、125 mmol/L CaCl2、5 mmol/L KCl、2 mmol/L MES-KOH。
MMG溶液包含0.4 mmol/L Mannitol、15 mmol/L MgCl2、4 mmol/L MES-KOH。
PEG溶液包含40% PEG 4000、0.2 mmol/L Mannitol、0.1 mmol/L CaCl2。
实施例1、玫瑰花瓣原生质体的解离方法。
（1）选择健康且无病害的“冷香”玫瑰植株；
（2）在盛花期完全开放花朵上取花瓣若干，用不锈钢双面刀片将上述花瓣切成宽2mm左右的均匀细条，使其充分浸泡在酶解用溶液中如图1所示；
（3）在黑暗、25℃条件下，60rpm速度下在脱色摇床上摇晃酶解5h，使用70μm的细胞筛过滤花瓣，得到含有原生质体的酶解液；
（4）上述所得的酶解液用10 ml W5溶液重悬，200g低速离心10 min，弃上清，上述操作重复3次，于冰上静置30 min；
（5）加入MMG溶液悬浮原生质体。
实施例2、玫瑰花瓣原生质体瞬时转化玫瑰MYB5基因进行ChIP-qPCR实验的方法。
（1）转化：将35S:Flag-MYB5-35S:GFP质粒转入原生质体中，500 ul质粒，5ml原生质体，5.5 ml PEG溶液混匀后室温孵育15-20min。
加入W5溶液终止反应后200g离心5min，去除PEG溶液。
（2）培养：W5溶液清洗2次后，加入5 ml W5溶液，25℃黑暗静置过夜12h-16h。
（3）检测：200g低速离心10min，收集原生质体。
在ZEISS microscope下观察35S:Flag-MYB5-35S:GFP的荧光信号如图2A所示。
（4）ChIP：将收集的原生质体裂解后进行蛋白质和DNA交联，提取核酸后进行超声破碎，用Protein G beads和Flag抗体对Flag-MYB5结合的DNA片段进行富集。
解交联后纯化回收DNA。
所述方法和35S-rfa-35S-GFP载体记载在如下文献中：
Wang Q, Dai X, Pang H, Cheng Y, Huang X, Li H, Yan X, Lu F, Wei H,Sederoff RR, Li Q. BEL1-like homeodomain protein BLH6a is a negativeregulator of CAld5H2 in sinapyl alcohol monolignol biosynthesis in Poplar.Front Plant Sci. 2021, 12:695223.
（5）qPCR检测DNA富集：
分别对玫瑰ANR和TPS基因启动子转录起始位点前两个片段序列P1（对照）和P2（如图2B所示）的富集情况进行检测，图2C和D的qPCR结果表明玫瑰MYB5分别与ANR和TPS启动子P2区段结合，与P1区段不结合。
玫瑰MYB5结合ANR启动子已在如下文献中报道：
Shen Y, Sun T, Pan Q, Anupol N, Chen H, Shi J, Liu F, Deqiang D, WangC, Zhao J, Yang S, Wang C, Liu J, Bao M, Ning G. RrMYB5- and RrMYB10-regulated flavonoid biosynthesis plays a pivotal role in feedback loopresponding to wounding and oxidation in Rosa rugosa. Plant Biotechnol J.2019,17(11):2078-2095.
本实施例对此进行了验证，并提出玫瑰MYB5可能结合TPS启动子参与倍半萜的调控途径。
以上对本发明进行了详述。
虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。
总之，按本发明的原理，在不脱离本发明的范围，可在等同参数、浓度等条件下，在较宽范围内实施本发明。
因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.玫瑰花瓣原生质体的分离方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（A1）酶解：将玫瑰花瓣切成2 mm左右细丝状后放入酶解液中，所述酶解液的组成为：20mmol/L KCl 、20 mmol/L MES-KOH 、10 mmol/L CaCl2 、0.8 mol/L Mannitol、3% 纤维素酶 、0.8% 果胶酶和0.1% BSA（牛血清白蛋白），余量为水；置于室温黑暗条件下酶解5h左右，得到原生质体悬浮液；
（A2）分离：过滤步骤（A1）获得的原生质体悬浮液，收集滤液后离心，收集沉淀，然后向其中加入W5溶液，反复洗涤3次，冰上静置30分钟，弃上清，加入MMG悬浮玫瑰原生质体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解液的组成为：20 mmol/L KCl 、20mmol/L MES-KOH 、10 mmol/L CaCl2 、0.8 mol/L Mannitol、3% 纤维素酶 、0.8% 果胶酶和0.1% BSA（牛血清白蛋白），余量为水；所述W5溶液的组成为：154 mmol/L NaCl 、125mmol/L CaCl2、5 mmol/L KCl、2 mmol/L MES-KOH。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述玫瑰原生质体重悬于MMG溶液，得到玫瑰原生质体悬浮液，所述MMG溶液的组成为：0.4 mmol/L Mannitol，15 mmol/L MgCl2，4 mmol/L MES-KOH。
4.玫瑰原生质体的瞬时转化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（B1）待转化的35S：GFP质粒与权利要求3中所述玫瑰原生质体悬浮液混合，加入PEG溶液，室温条件下孵育。
5.（B2）培养：在所述混合液中加入W5溶液洗涤除去PEG溶液。离心收集沉淀后，再加入W5溶液，遮光培养，完成玫瑰原生质体的转化。
6.根据权利要求5所述的瞬时转化方法，其特征在于，所述PEG溶液中含有PEG 4000，所述PEG溶液中PEG 4000的浓度为40%。
7.根据权利要求5或6所述的瞬时转化方法，其特征在于，所述PEG溶液的组成为：40%PEG 4000，0.2 mmol/L Mannitol，0.1 mol/L CaCl2。
8.根据权利要求5-7中任一所述的瞬时转化方法，其特征在于，所述待转化质粒、所述玫瑰原生质体悬浮液、PEG溶液的质量体积比为1ug：10ul：11ul。
9.根据权利要求5-8中任一所述的瞬时转化方法，其特征在于，（B1）中所述室温孵育为室温孵育15-20min，（B2）中所述遮光培养条件为25℃、12～16h。
10.权利要求1-4中任一所述方法和/或权利要求5-9中任一所述的瞬时转化方法在基因功能的验证、基因表达调控、蛋白亚细胞定位、RNA干扰或基因编辑中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202311497309.1A CN117568256A (zh) | 2023-11-10 | 2023-11-10 | 一种玫瑰花瓣原生质体分离及瞬时转化体系构建的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CN117568256A true CN117568256A (zh) | 2024-02-20 |
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