CN110724660B

CN110724660B - 一种樟子松针叶原生质体的制备方法及应用

Info

Publication number: CN110724660B
Application number: CN201911139202.3A
Authority: CN
Inventors: 李伟; 朱茜雅; 韩方旭; 钮世辉
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2019-11-20
Filing date: 2019-11-20
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2039-11-20
Also published as: CN110724660A

Abstract

本发明公开了一种制备樟子松针叶原生质体的方法，属于物细胞生物技术领域。所述方法包括（1）获得墇子松幼苗针叶，获得所述针叶叶条；（2）将所述叶条进行预处理；（3）将叶条放入酶解液中进行酶解；（4）将叶条从酶解液中取出，放入W5'溶液中，室温、避光、振荡，使得原生质体释放至所述W5'溶液中；（5）将包含原生质体的W5'溶液转移至100μm的尼龙网上进行过滤；（6）将包含原生质体的W5'溶液置于冰上30min，吸取上清液，加入预冷的W5'溶液中重悬原生质体。利用本发明，可获得较多数量并且状态良好、耐受性强的原生质体。

Description

一种樟子松针叶原生质体的制备方法及应用

技术领域

本发明属于植物细胞生物技术领域，具体地，涉及一种樟子松针叶原生质体的制备方法及应用。

背景技术

植物原生质体是指通过质壁分离能分开的由质膜包围的有活力的细胞团。虽因失去了细胞壁的保护而比较脆弱，但每个原生质体都含有该个体的全部遗传信息，在适宜的培养条件下，具有再生成与其亲本相似个体的全能性。此外，原生质体能够克服性细胞的不亲和障碍，进行远缘的体细胞杂交，可创造出有性杂交所不能得到的种间或属间杂种，并扩大遗传物质基础；而且，在同一时间内获得的大量原生质体在遗传上是同质的，这为植物生理学、细胞生物学、体细胞遗传学等理论研究提供了理想材料。原生质体还可摄取外源细胞器、病毒、核酸等各种大分子，可作为遗传转化的理想受体，进行分子育种、基因瞬时表达分析、基因互作研究等。

植物细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素、果胶及少量蛋白质，通常采用酶解法制备原生质体。做为模式植物的拟南芥的原生质体分离步骤已十分成熟（Yoo S D, Cho YH, Sheen J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system fortransient gene expression analysis[J]. Nat Protoc, 2007,2(7):1565-1572.）。此外，已经有多种被子植物实现了原生质体的优化，如非洲菊（宋爱华, 张文斌, 孙姝兰,等.非洲菊原生质体制备及瞬时转化系统的建立[J]. 植物学报，2017，52(4):511–519.），杨树（郭传敏. 杨树原生质体分离及电融合技术体系的研究[D]. 南京林业大学,2007.）、橡胶树（(王凉洁. 橡胶树叶肉细胞原生质体的制备及瞬时表达系统对植物免疫反应的检测[D].海南大学,2014.）、桑树（羿德磊,王海朋,崔为正,袁传忠,王洪利.桑树原生质体分离条件的优化试验[J].蚕业科学,2012,38(02):204-209）等，但是，裸子植物相对较少。在针叶树中，国内外对火炬松（Pinustaeda L.）（唐巍, 欧阳藩, 郭仲琛. 影响火炬松胚性悬浮细胞原生质体的胚胎发生的因素(英文)[J]. Developmental & Reproductive Biology,1997(02):56-63.），海岸松（GOMEZ-MALDONADO J, CRESPILLO R, AVILA C, et al.Efficient Preparation of Maritime Pine (Pinus pinaster) Protoplasts Suitablefor Transgene[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 2001.）等研究基础较好的树种开发了原生质体制备体系，但这些体系分离效率低且分离后的原生质体状态差，难以进行后续实验，且重复性较差。

樟子松（Pinus sylvestris var. mongolica）为常绿乔木，产于我国黑龙江大兴安岭海拔 400~900 m山地及海拉尔以西、以南一带砂丘地区。樟子松林木具有生长较快、适应性强、抗风沙、耐干旱、耐瘠薄、抗严寒的特点，是东北大兴安岭山区及西部砂丘地区的重要造林树种，也是重要用材、生态和景观树种，具有重要的经济、生态和社会价值。而且，有研究表明：樟子松乙醇提取物具有较强的抗氧化能力，可作为天然的抗氧化剂（张力凡，薛煜，王岩等. 樟子松乙醇提取物体外抗氧化活性研究[J]. 植物研究2019，39(3)：458—465.），对于预防老年痴呆症、关节炎、肿瘤、动脉粥样硬化、帕金森氏病等疾病有重要作用。但是，对其生物学深层次的研究较少，且暂无关于其原生质体分离的研究。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种制备墇子松针叶原生质体的方法。

本发明提供的一种制备墇子松针叶原生质体的方法包括以下步骤：

（1）获得墇子松幼苗针叶，切除下胚轴，沿生长方向纵切，获得所述针叶叶条；

（2）将步骤（1）获得的所述叶条进行预处理；

（3）将叶条放入酶解液中进行酶解；

（4）将叶条从酶解液中取出，放入W5'溶液中，室温、避光、振荡，使得原生质体释放至所述W5'溶液中；

（5）将步骤（4）获得的包含原生质体的W5'溶液转移至100μm的尼龙网上进行过滤；

（6）将包含原生质体的W5'溶液置于冰上30min，吸取上清液，加入预冷的W5'溶液中重悬原生质体，

其中，所述W5'溶液是指包含BSA的W5溶液。

在本发明的一些实施方案中，所述获得墇子松幼苗针叶，具体包括以下步骤：选取墇子松种子，放入清水浸泡的水苔中，放置于光照16/8h黑暗的气候箱中进行萌发；2周后，选取生长状态良好墇子松幼苗，摘取针叶。

在本发明的一些实施方案中，所述预处理是指将所述叶条置于甘露醇溶液中。经过预处理，可释放叶片中存在的次生代谢产物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述甘露醇溶液的浓度为0.2～1.0M，例如0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1.0M。在本发明的一些优选实施方案中，所述甘露醇溶液的浓度为0.4～0.7M，例如0.4M、0.425M、0.45M、0.475M、0.5M、0.525M、0.55M，0.575M、0.6M、0.625M、0.65M、0.675M、0.7M。在本发明的一些更优选实施方案中，所述甘露醇溶液的浓度为0.5M。

在本发明的一些实施方案中，所述酶解液的10mL体系配制方法如下：

（a）依次加入纤维素酶R10 0.15g，果胶酶Y23 0.04g，纤维素酶RS 0.1g，半纤维素酶0.1g，1M甘露醇6mL，2M KCl 0.1mL，2M MES 1mL；

（b）将步骤（a）获得的溶液于55℃水浴10min，冷却至室温；

（c）向步骤（b）获得的冷却后的溶液中依次加入1M RbCl₂ 0.1mL，10% BSA 0.1mL，ddH₂O 2.7mL，即得到所述酶解液。

在本发明的一些具体实施方案中，所述2M MES在使用前于70℃水浴5min。

在本发明的一些实施方案中，所述酶解的条件是：室温、黑暗静置8～12h。

在本发明的一些实施方案中，所述W5'溶液中含有BSA的质量分数为1%～20%，例如为0%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%。在本发明的一些优选实施方案中，所述W5'溶液中含有BSA的质量分数为2%。

在本发明的一些优选实施方案中，在步骤（5）和步骤（6）之前进一步包括向包含原生质体的W5'溶液已被转移的叶条上再次加入W5'溶液，颠倒清洗叶条，将清洗叶条后的W5'溶液进行步骤（6）的过滤，重复多次，例如1-10次，再例如5-7次。如此，经过多次洗涤叶条，提高原生质体产量。

在本发明的又一些优选实施方案中，步骤（6）重复多次，例如1次、2次、3次、4次、5次。如此，经多次洗涤并富集原生质体，可获得较多状态良好的樟子松原生质体。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有效效果：

1.高效制备樟子松原生质体不仅为樟子松分子育种、基因瞬时表达分析、基因互作研究、功能基因亚细胞定位、蛋白质互作、下游靶基因筛选、单细胞测序、原生质体悬浮培养等研究提供了技术保障，也为其他物种原生质体分离的研究提供了技术依据。

2.利用本发明制备得到的原生质体数量多，10mL酶解液体系大概能得到10⁵个原生质体。

3.利用本发明制备得到的原生质体状态良好，耐受性强。

附图说明

图1示出了本发明实施例1所得原生质体状态。A：10倍视野下观察结果；B：20倍视野下观察结果；C：20倍视野下观察结果；D：40倍视野下观察结果。

图2示出了不同甘露醇浓度下实验所得原生质体数目箱线图。

图3示出了含不同浓度BSA的W5'洗涤酶解后叶条进行实验所得原生质体数目箱线图。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例 1 幼嫩樟子松针叶原生质体的制备

（1）选取樟子松种子50粒，放入清水浸泡的水苔中，放置于光照16/8h黑暗的气候箱中进行萌发。2周后，选取生长状态良好、一致的20棵樟子松幼苗用锋利的手术刀片去除下胚轴，沿生长方向纵切，置于0.5M甘露醇溶液中。

（2）制备10mL酶解液体系：依次向离心管中加入纤维素酶R10 0.15g，果胶酶Y230.04g，纤维素酶RS 0.1g，半纤维素酶0.1g，1M甘露醇6mL，2M KCl 0.1mL，2M MES 1mL（在使用前提前70℃水浴5min）。将溶液55℃水浴10min，冷却至室温。向冷却了的溶液依次加入1MRbCl₂ 0.1mL，10% BSA 0.1mL，ddH₂O 2.7mL。酶解液配置完成。

（3）将切好的叶条放入酶解液中酶解8～12h（室温，黑暗，静置）。

（4）用镊子将叶条从酶解液中取出，放到15mL W5'（RbCl+2%BSA）溶液中，避光50rpm室温30min让原生质体释放出来。吸取上清液到另一个离心管中，再加入5mL W5'（RbCl+2%BSA）溶液，来回颠倒10-20次清洗叶条。（该步骤重复5-7次能提高原生质体产量）。

（5）用100μm的尼龙网过滤上述溶液，并将滤液放在冰上放置30min。用剪过的枪头吸去上清液，加入预冷的10mL W5'（RbCl+2%BSA）溶液中重悬原生质体，在冰上放置30min。

（6）用剪过的枪头吸去上清液，加入预冷的10mL W5'（RbCl+2%BSA）溶液中重悬原生质体，在冰上放置30min。（该步骤重复一次）。

最终在光学显微镜下看到具有良好状态和可观数量的原生质体（结果如图1所示）。10mL酶解液体系大概能得到10⁵个原生质体。

实施例2 不同浓度甘露醇对原生质体制备的影响

选取来自同一株的油松种子300粒，放入清水浸泡的水苔中，放置于光照时间16h、黑暗时间8h的气候箱中进行萌发。2周后，选取生长状态的一致的240棵樟子松幼苗用锋利的手术刀片去除下胚轴，沿生长方向纵切，随机均分，每份20棵，分别置于0.4M、0.5M、0.525M、0.55M、0.575M、0.6M、0.625M、0.65M、0.675M、0.7M、0.8M、0.9M甘露醇溶液中。

之后步骤同实施例1。

最终在光学显微镜下看到具有良好状态和可观数量的原生质体，对原生质体进行计数，结果如图2所示。从图2中可以看出，当甘露醇浓度由0.4M增加到0.5M时，最终得到的原生质体数量出现显著增加（增加4倍左右），然而当甘露醇浓度稍微增加，到0.525M时，最终得到的原生质体数量出现急剧下降现象。随着甘露醇浓度进一步增加，最终得到的原生质体数量维持相对稳定的数量范围。由此可知，当甘露醇浓度为0.5M时，最终得到的原生质体数量最多。

实施例3 W5'（RbCl）中加入不同浓度BSA对原生质体制备的影响

（1）选取樟子松种子300粒，放入清水浸泡的水苔中，放置于光照16/8h黑暗的气候箱中进行萌发。2周后，选取生长状态的一致的180棵樟子松幼苗用锋利的手术刀片去除下胚轴，沿生长方向纵切，随即均分为13份，每份置于0.5M甘露醇溶液中。

（4）此步骤除W5'（RbCl+2%BSA）分别用含0%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20% BSA的W5（RbCl）替换外，其他操作均与实施例1相同。

以下步骤除使用W5（RbCl）含有的BSA浓度不同，其他操作步骤均与实施例1相同。

最终在光学显微镜下看到具有良好状态和可观数量的原生质体，对原生质体进行计数，结果如图3所示。结果可知，当BSA含量从0%增加到1%时，最终得到的原生质体数量出现显著增加（增加5倍左右），并且当BSA含量进一步增加到2%时，最终得到的原生质体数量出现继续增加（高达0%时的6倍左右）。然而，随着BSA含量进一步增加，最终得到的原生质体数量反而不断降低，当增加到10%以上，如15%、15%，最终得到的原生质体数量甚至低于不含BSA（0%）的水平，即发挥相反的效果。由此可知，当BSA含量为2%时，最终得到的原生质体数量最多，效果最好。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种制备樟子松针叶原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）获得樟子松幼苗针叶，切除下胚轴，沿生长方向纵切，获得所述针叶叶条；

（2）将步骤（1）获得的所述叶条置于0.5M甘露醇溶液中进行预处理；

（3）将叶条放入酶解液中进行酶解；

（5）将步骤（4）获得的包含原生质体的W5'溶液转移至100μ m的尼龙网上进行过滤；

（6）将包含原生质体的W5'溶液置于冰上30min，吸取上清液，加入预冷的W5'溶液中重悬原生质体，其中，所述W5'溶液是指包含BSA的W5溶液，所述W5'溶液中含有BSA的质量分数为1%～10%，所述酶解液的10mL体系配制方法如下：

（a）依次加入纤维素酶R10 0.15g，果胶酶Y23 0.04g，纤维素酶RS0.1g，半纤维素酶0.1g，1M甘露醇6mL，2M KCl 0.1mL，2M MES1mL；

（b）将步骤（a）获得的溶液于55℃水浴10min，冷却至室温；

（c）向步骤（b）获得的冷却后的溶液中依次加入1M RbCl2 0.1mL，10% BSA 0.1mL，ddH2O 2.7mL，即得到所述酶解液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2M MES在使用前于70℃水浴5min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解的条件是：室温、黑暗静置8～12h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述W5'溶液中含有BSA的质量分数为2%。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（5）和步骤（6）之2前进一步包括向包含原生质体的W5'溶液已被转移的叶条上再次加入W5'溶液，颠倒清洗叶条，将清洗叶条后的W5'溶液进行步骤（6）的过滤，重复5-7次。