CN107043736B - 一种直接使用结缕草叶片制备原生质体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种直接使用结缕草叶片制备原生质体的方法，涉及制备原生质体的方法。本方法是：①在做实验的前5天时，对结缕草进行霍格兰喷施；②在做实验的前2天改用蒸馏水喷施；③在进行试验的前30分钟，喷蒸馏水，覆上保鲜膜；④剪取带有茎的幼嫩叶片，放入装有蒸馏水的烧杯中；⑤用干净滤纸吸取叶片上的水；⑥将结缕草叶片切割成细条；⑦健康的原生质体应是圆形的并没有其他细胞。相比使用愈伤组织提取原生质体的方法，采用叶片制备原生质体明显了提高实验效率，并简化了实验步骤，节约大量时间及人力，不需要专门进行愈伤组织培养。
Description
技术领域
本发明涉及制备原生质体的方法，尤其涉及一种直接使用结缕草叶片制备原生质体的方法。
背景技术
原生质体培养和植株再生技术具有使用范围广和可行性强等优点，是植物生物工程的基础。由于原生质体具有结构简单、发育同步性好、群体数量大、DNA分子易于进入细胞，易获得纯合性转化子的特点，及其培养技术与有关的细胞、 分子和遗传等学科的交叉渗透，使植物原生质体的研究越来越受到重视。结缕草是一种多年生暖季型草坪草。结缕草的特性为叶片厚硬而近革质，耐磨，喜温暖湿润气候和耐高温。结缕草有一定的耐荫性，耐寒可耐-38.5℃的低温。耐旱，在严重干旱条件下变黄，但在紧接着浇水或下雨的条件下即可恢复。结缕草有深的根茎系统可以吸收更深层土壤的水分。另外，结缕草还具有耐病虫害、耐盐碱和耐粗放管理等特性。因此，结缕草广泛应用在高尔夫球场、足球场以及固土护坡和道路绿化等方面。总之，结缕草具有很强的抗逆性与适应性，是一种很有发展潜力的草坪草。
鉴于结缕草具有广泛的优良性状，目前，国内外很多草坪草研究者开始对其进行抗逆生理、基因克隆、基因文库构建和转基因植株性状检测等更为细致的研究。为了获得相关实验所需的结缕草原生质体实验材料，许多研究机构的实验室开始对结缕草进行愈伤组织培养，通过愈伤组织植被原生质体。然而，愈伤组织培养缓慢，程序复杂，严重影响了科研工作的进程；另外由于结缕草草种自身原因导致黄化苗难培养，无法通过黄化苗制备原生质体，许多实验室常常会面临这样的情况：实验的一切准备工作都已就绪，而单单所需的结缕草愈伤组织材料尚不能达到实验的要求，从而耽误了宝贵的时间。因此，急需一种可以直接使用结缕草叶片制备原生质体的方法来解决此问题。
原生质体的分离方法有两种：机械分离法和酶解分离法。机械分离法由于产量低、方法繁琐费力以及对分生组织和液泡化程度不高的细胞不适用的特点，现在已很少有人使用。酶解分离法为目前普遍采用的原生质体分离方法，选择适宜材料是成功分离原生质体的关键，叶片可以得到大量比较均一的原生质体且不使母细胞受到破坏，许多资料报道双子叶植物分离原生质体的最佳材料是叶片。此外，子叶、胚轴、茎尖及愈伤组织、悬浮培养物和体细胞胚等均可作为分离原生质体的材料。但是，采用愈伤组织和细胞悬浮物往往需要经若干次的继代培养才能达到适合分离原生质体的状态；而继代时间的长短在很大程度上影响所获得原生质体的活力和产量。
目前尚没有见到使用结缕草叶片制备原生质体的报道，因此需要摸索一种直接使用结缕草叶片制备原生质体的方法，保证材料符合实验要求和及时的供应，简化实验步骤，缩短实验周期。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种直接使用结缕草叶片制备原生质体的方法，在直接使用结缕草叶片的情况下，制备出原生质体，达到相关实验的使用要求。
本发明的目的是这样实现的：
具体地说，本方法包括下列步骤：
①在做实验的前5天时，对结缕草（本实验选用温室培养了30天和90天的结缕草为实验材料）进行霍格兰喷施，每天1次；
②在做实验的前2天改用蒸馏水喷施，每6小时1次，并用保鲜膜覆盖，保证叶片湿润；
③在进行试验的前30分钟，喷蒸馏水，覆上保鲜膜；
④在喷完蒸馏水30分钟后，剪取带有茎的幼嫩叶片，选取较长的结缕草叶将剪下的嫩叶捆成圆柱状小捆，放入装有蒸馏水的烧杯中，保证叶片10min内沉入水中；
⑤在10min后取出结缕草，用干净滤纸吸取叶片上的水，此时叶片仍保持圆柱状，并及时进行下一步骤；
⑥首先使用全新的刀片将结缕草叶片切割成细条，0.01mm≤细条宽≤1mm，切割一小部分后及时用将切好的苗条放在含10mL酶溶液的培养皿中，切割完毕后用锡箔纸包裹培养皿，抽真空30min后放置30℃的黑夜中培养，4个小时后从培养皿中取10μL，在显微镜下观察原生质体；
⑦健康的原生质体应是圆形的并没有其他细胞
A、酶解完成后，原生质体及酶的混合液经35μm(100mμ)的筛网，除去未完全酶解的材料；
B、滤液经300g离心5分钟，去掉上清；
C、向沉淀的原生质体加入等3mL的W5溶液使其悬浮，再向管底加入5mL的CPW20溶液（附加20%蔗糖的CWP盐溶），150g离心4分钟，两相中间出现一条纯净的原生质体带；
D、小心取出并以W5溶液重悬后等到纯净的原生质体，采用植物的荧光素二乙酸（FDA）染色法染色后取少量纯化后的原生质体悬浮液显微镜下观察拍照。
本发明的关键点：
1、使用结缕草叶片制备原生质体，一定要保证结缕草叶片健康肥大，实验前喷施营养液很关键，喷施营养液应采用喷壶进行适量喷施并保持通风；
2、实验前两天开始覆盖保鲜膜，使叶片鲜嫩，过早容易使结缕草长菌得病，太晚覆膜达不到效果；
3、实验前两天喷施蒸馏水减少生菌可能性，一定要时刻保持叶片有水，严格按照每6小时一次的频率进行浇水；
4、剪下的嫩叶应捆成圆柱状小捆，放入装有蒸馏水的烧杯中保证叶片完全沉入水中，不可散开浸泡，叶片容易漂浮；
5、使用全新的刀片将结缕草叶片切割成细条，0.01mm≤细条宽≤1mm，叶片切割越小越好，伤口越多接触面积越大，越容易解离出原生质体。
本发明具有下列优点和积极效果：
相比使用愈伤组织提取原生质体的方法，采用叶片制备原生质体明显了提高实验效率，并简化了实验步骤，节约大量时间及人力，不需要专门进行愈伤组织培养。
附图说明
图1.1是30天的结缕草图片，
图1.2是90天的结缕草图片；
图2.1是30天的结缕草浇水并覆盖保鲜膜的图片，
图2.2是90天的结缕草浇水并覆盖保鲜膜的图片；
图3.1是30天结缕草苗制备的原生质体图片（10倍镜下），
图3.2是30天结缕草苗制备的原生质体的活性检测图片（10倍镜下）；
图3.3是90天结缕草苗制备的原生质体图片（10倍镜下），
图3.4是90天结缕草苗制备的原生质体的活性检测图片（10倍镜下）；
图3.5是90天结缕草苗制备的原生质体图片（20倍镜下），
图3.6是90天结缕草苗制备的原生质体的活性检测图片（20倍镜下）。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细说明：
1、2017年5月1日，对结缕草（本实验选用温室培养了30天和90天的结缕草为实验材料）进行霍格兰喷施，以后每天1次；
如图1.1-1.2，喷施霍格兰营养液后，植株生命活力变强，叶片变幼嫩。
2、2017年5月4日改用蒸馏水喷施，每6小时1次，并用保鲜膜覆盖，保证叶片湿润；
如图2.1-2.2，叶片挂满水珠，覆膜减缓叶片水分蒸发。
3、2017年5月6日上午9：30，对结缕草进行喷蒸馏水，覆上保鲜膜；
4、2017年5月6日上午10：00，剪取带有茎的幼嫩叶片，选取较长的结缕草叶将剪下的嫩叶捆成圆柱状小捆，放入装有蒸馏水的烧杯中，10min，保证叶片沉入水中；
5、2017年5月6日10：20取出结缕草，用干净滤纸吸取叶片上的水，此时仍保持叶片呈圆柱状；
6、2017年5月6日10：30使用全新的刀片将结缕草叶片切割成≤1mm宽的细条；切割一小部分后及时用将切好的苗条放在含10毫升酶溶液的培养皿中，切割完毕后用锡箔纸包裹培养皿，抽真空30min后放置30摄氏度的黑夜中培养，4个小时后从培养皿中取10μL，在显微镜下观察原生质体；
7、2017年5月6日16：30酶解完成后，原生质体及酶的混合液经35μm (100mμ)的筛网，除去未完全酶解的材料；滤液经300g离心5分钟，去掉上清；向沉淀（原生质体）加入3ml的W5溶液使其悬浮，再向管底加入5ml的CPW20溶液（附加20%蔗糖的CPW盐溶），150 g离心4分钟，两相中间出现一条纯净的原生质体带，小心取出并以W5溶液重悬后等到纯净的原生质体，采用植物的荧光素二乙酸（FDA）染色法染色后取少量纯化后的原生质体悬浮液显微镜下观察拍照；
如图3.1-3.6，所得到的原生质体大，碎片少，量多，活性强，达到相关实验的使用要求。
Claims (1)
1.一种直接使用结缕草叶片制备原生质体的方法，其特征在于：
①在做实验的前5天时，对结缕草进行霍格兰喷施，每天1次；
②在做实验的前2天改用蒸馏水喷施，每6小时1次，并用保鲜膜覆盖，保证叶片湿润；
③在进行试验的前30分钟，喷蒸馏水，覆上保鲜膜；
④在喷完蒸馏水30分钟后，剪取带有茎的幼嫩叶片，选取较长的结缕草叶将剪下的嫩叶捆成圆柱状小捆，放入装有蒸馏水的烧杯中，保证叶片10min内沉入水中；
⑤在10min后取出结缕草，用干净滤纸吸取叶片上的水，此时叶片仍保持圆柱状，并及时进行下一步骤；
⑥首先使用全新的刀片将结缕草叶片切割成细条，0.01mm≤细条宽≤1mm，切割一小部分后及时将切好的细条放在含10mL酶溶液的培养皿中，切割完毕后用锡箔纸包裹培养皿，抽真空30min后放置30℃的黑夜中培养，4个小时后将酶解完成的原生质体及酶的混合液经35μm的筛网，除去未完全酶解的材料，滤液经300g离心5分钟，去掉上清，向沉淀的原生质体加入3mL的W5溶液使其悬浮，再向管底加入5mL的CPW20溶液，150g离心4分钟，两相中间出现一条纯净的原生质体带，小心取出并以W5溶液重悬后得到纯净的原生质体，采用植物的荧光素二乙酸染色法染色后取少量纯化后的原生质体悬浮液显微镜下观察拍照，健康的原生质体应是圆形的并没有其他细胞；所述的CPW20溶液为添加20％蔗糖的CPW溶液。
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