CN112851806A - 一种Homer的抗原肽及其抗体与应用 - Google Patents

一种Homer的抗原肽及其抗体与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Homer的抗原肽及其抗体与应用，属于生物技术领域。本发明的抗原肽为Homer(1‑240)片段的抗原肽，其氨基酸序列为CLECVSSQAN。以该抗原肽为抗原制备的抗体能够特异性识别Homer(1‑240)片段、而不识别Homer蛋白全长，可以用于检测人脑标本及动物标本中Homer蛋白被剪切的程度，用于阿尔兹海默病发病机制的研究，用于阿尔兹海默病的早期诊断等。

Description

一种Homer的抗原肽及其抗体与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Homer的抗原肽及其抗体与应用。
背景技术
阿尔兹海默病(Alzheimer disease,AD)是临床上最常见的神经变性疾病，也是导致老年人痴呆的最常见原因。60岁以上老年人患病率高达5％，给社会和家庭带来沉重负担[1,2]。目前认为突触功能异常是AD患者的早期病理表现，也是导致痴呆的重要病理学基础[3-5]，但AD患者脑内突触功能异常的原因尚不清楚。
Homer作为一种突触后支架蛋白，主要介导细胞内多蛋白复合体的组装，参与调控突触结构，细胞内钙离子信号和神经元发育等[6]。为了明确AD患者突触功能异常的机制，我们对AD患者的脑组织标本进行了质谱分析，发现AD患者脑组织中Homer被剪切形成片段，而正常脑组织中未检测到这些片段。进一步分析发现，这些片段都是在天冬酰胺残基(asparagine,N)后面被剪切。天冬酰胺内肽酶(AEP)是目前文献报道的唯一一种特异性剪切天冬酰胺残基的蛋白酶[7,8]。AEP是一种蛋白酶，它高度特异性地识别并剪切其底物的天冬酰胺残基[9,10]。申请人的前期研究发现，在AD发病过程中脑内的AEP异常激活，促进tau蛋白和β-淀粉样蛋白的沉积，这些研究结果已发表在Nature Medicine和NatureCommunications等杂志上[11,12]。
我们的进一步研究发现，AEP剪切Homer的N240位点，形成Homer(1-240)片段，导致突触功能障碍。因此，检测实验动物标本及人体液中的Homer(1-240)片段对AD发病机制的理解具有重要的作用。但目前为止，尚无检测脑内被AEP剪切产生的Homer(1-240)片段的抗体，给相关研究带来了极大的不便。
参考文献：
1.Chan KY,Wang W,Wu JJ,Liu L,Theodoratou E,Car J,Middleton L,Russ TC,Deary IJ,Campbell H,Wang W,Rudan I.Epidemiology of Alzheimer's disease andother forms of dementia in China,1990-2010:a systematic review andanalysis.Lancet.2013,381:2016-2023.
2.Jia J,Wang F,Wei C,Zhou A,Jia X,Li F,Tang M,Chu L,Zhou Y,Zhou C,CuiY,Wang Q,Wang W,Yin P,Hu N,Zuo X,Song H,Qin W,Wu L,Li D,Jia L,Song J,Han Y,Xing Y,Yang P,Li Y,Qiao Y,Tang Y,Lv J,Dong X.The prevalence of dementia inurban and rural areas of China.Alzheimers Dement.2014,10:1-9.
3.Cai Q,Tammineni P.Mitochondrial aspectes of synaptic dysfunctionalin Alzheimer's disease.J Alzheimers Dis.2017,57:1087-1103.
4.Scheff SW,Price DA,Schmitt FA,Mufson EJ.Hippocampal synaptic lossin early Alzheimer's disease and mild cognitive impairment.NeurobiolAging.2006,27:1372-1384.
5.Yoshiyama Y,Higuchi M,Zhang B,Huang M,Iwata N,Saido TC,Maeda J,Suhara T,Trojanowski JQ,Lee VM.Synapse loss and microglial activation precedetangles in a P301S tauopathy mouse model.Neuron.2007,53:337-351.
6.Nicholas E Clifton,Simon Trent,Kerrie L Thomas,JeremyHall.Regulation and Function of Activity-Dependent Homer in SynapticPlasticity.Mol Neuropsychiatry.2019,5(3):147-161.
7.Li DN,Matthews SP,Antoniou AN,Mazzeo D,Watts C.Multistepautoactivation of asparaginyl endopeptidase in vitro and in vivo.J BiolChem.2003,278:38980-38990.
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9.Zhao L,Hua T,Crowley C,Ru H,Ni X,Shaw N,Jiao L,Ding W,Qu L,Hung LW,Huang W,Liu L,Ye K,Ouyang S,Cheng G,Liu ZJ.Structural analysis of asparaginylendopeptidase reveals the activation mechanism and a reversible intermediatematuration stage.Cell Res.2014,24:344-358.
10.Dall E,Brandstetter H.Mechanistic and structural studies on AEPexplain its zymogenicity,distinct activation pathways,and regulation.ProcNatl Acad Sci U S A.2013,110:10940-10945.
11.Zhang Z,Song M,Liu X,Kang SS,Kwon IS,Duong DM,Seyfried NT,Hu WT,Liu Z,Wang JZ,Cheng L,Sun YE,Yu SP,Levey AI,Ye K.Cleavage of tau byasparagine endopeptidase mediates the neurofibrillary pathology in Alzheimer's disease.Nat Med.2014,20:1254-1262.
12.Zhang Z,Song M,Liu X,Su Kang S,Duong DM,Seyfried NT,Cao X,Cheng L,Sun YE,Ping Yu S,Jia J,Levey AI,Ye K.Delta-secretase cleaves amyloidprecursor protein and regulates the pathogenesis in Alzheimer's disease.NatCommun.2015,6:8762.
发明内容
本发明的目的是开发针对Homer(1-240)片段的抗体，提供一种Homer(1-240)片段的抗原肽及其抗体与应用，用于AD及衰老相关疾病的发病机制研究和疾病早期诊断。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种Homer(1-240)片段的抗原肽，其氨基酸序列为：CLECVSSQAN。
一种抗体，以上述抗原肽为抗原制备得到。进一步地，所述的抗体以Ac-CLECVSSQAN与载体蛋白交联后得到的交联多肽为抗原制备得到，所述的载体蛋白优选为KLH。所述的抗体可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体。
进一步地，所述的多克隆抗体为兔多克隆抗体。
进一步地，所述的兔多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：以上述交联多肽为免疫原免疫家兔，收集家兔血液制备抗血清，将抗血清分离纯化得到兔多克隆抗体。所述的抗血清的分离纯化采用常规技术手段进行，即采用抗原亲和层析法对所述抗血清进行纯化，以得到纯化的兔多克隆抗体。
本发明Homer(1-240)片段的抗原肽具有很好的免疫原性，以其为免疫原得到的兔多克隆抗体特异性好、效价高，只识别AEP剪切形成的Homer(1-240)片段，而不识别全长的Homer；效价可以达到1∶512000。基于所述抗体的特异性，其可用于检测人脑标本及动物标本中Homer蛋白被剪切的程度，用于AD发病机制的研究，用于AD的早期诊断等。
一种检测Homer蛋白被剪切的程度的试剂，包括上述抗体。
一种AD早期诊断试剂，包括上述抗体。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)现有的Homer抗体都是无差异性地识别全长的Homer蛋白，而我们发现Homer被剪切后形成的Homer(1-240)片段才是具有神经毒性作用的部分，因此检测该片段具有重要的意义。目前尚无特异性识别Homer(1-240)片段的抗体，基于本发明抗原肽得到的特异性识别Homer(1-240)片段的抗体解决了这一问题。
(2)本发明的抗Homer(1-240)片段的抗体能够用于AD的早期诊断。
附图说明
图1为酶联免疫吸附实验检测抗Homer 1-240抗体滴度的结果图。
图2为抗Homer 1-240抗体的特异性检测结果图。AEP剪切Homer形成Homer 1-240片段，抗Homer 1-240抗体能够特异性识别Homer 1-240片段而不识别全长的Homer。
图3为使用抗Homer 1-240抗体进行免疫印迹实验的结果图。抗Homer 1-240抗体可检测到AD患者脑内和AD小鼠模型脑内的Homer 1-240片段。
图4为使用抗Homer 1-240抗体进行免疫组织化学实验的结果图。抗Homer 1-240抗体可检测到AD患者脑内的Homer 1-204片段。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1兔多克隆抗体(抗Homer 1-240抗体)的制备
本实施例所用抗原肽(Ac-CLECVSSQAN)由人工化学合成得到(南京金斯瑞生物科技有限公司)。合成的抗原肽进行质谱鉴定，鉴定正确后利用HPLC进行纯化和纯度鉴定。
将上述抗原肽偶联到载体蛋白KLH上得到抗原肽-KLH偶联物，以其作为免疫原免疫新西兰兔制备多克隆抗体。具体步骤如下：
(1)实验前采集动物血液，并制备免疫前血清。采集的血液离心后收集上清即得到血清。
(2)初次免疫：每只兔子皮下多点注射乳化的1mL抗原肽-KLH偶联物和弗氏完全佐剂的混合液(体积比1:1)，其中，抗原肽含量为0.5mg。
(3)初次免疫一周后，按照初次免疫的方法进行第二次加强免疫。
(4)第二次加强免疫一周后，按照初次免疫的方法进行第三次加强免疫。
(5)第三次加强免疫一周后，采集血液制备抗血清。
采用抗原亲和层析法对抗血清进行纯化，得到纯化的抗Homer 1-240抗体(抗-Homer N240)(1mg/mL)用于下述实验。
实施例2检测抗体滴度
(1)将未交联的抗原肽4μg/mL溶解于包被液(0.05M碳酸盐缓冲液pH 9.6)中。
(2)在96孔酶标板中加入100μL(1)中溶解抗原肽的包被液4℃过夜。
(3)次日，倒空液体并拍干残留液体，洗涤液每隔5分钟加入，冲洗三次。
(4)每孔加入150μL封闭液，37℃孵育1h。
(5)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗三次。
(6)每孔加入按梯度稀释的抗Homer 1-240抗体100μL，37℃孵育1h。
(7)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗三次。
(8)每孔加入按1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(1mg/mL)，37℃孵育1h。
(9)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗三到四次。
(10)拍干孔中残留液体，每孔加入100μL混合的显色液A、B，37℃避光显色30min。
(11)每孔加入50～100μL 2M H2SO4终止显色，并立即读取450nm OD值，检测结果见图1，抗Homer 1-240抗体的滴度达到1∶512000。
实施例3抗Homer 1-240抗体特异性的细胞学检测
(1)表达带GST标签的Homer的质粒(GST-Homer)的构建：以HEK293细胞cDNA文库为模板，使用引物FP和RP扩增得到Homer基因序列，通过连接、转化DH5α将Homer基因连接到pcDNA3.1-N-GST载体上，构建得到表达带GST标签的Homer的质粒。其中，引物FP、RP序列如下：
FP：ACGCGTCGACTATGGGGGAACAACCTATCTTCAGC；
RP：TCGAGCGGCCGCTTAGCTGCATTCTAGTAGCTTGGCC。
(2)细胞转染：将表达带GST标签的Homer(GST-Homer)的质粒转染到HEK293细胞内。
(3)制样：细胞转染2d后，收集细胞，PBS洗一遍，加裂解液(50mM柠檬酸钠，5mMDTT，0.1％CHAPS，0.5％TX-100，pH＝6.0)冰上裂解30min，取上清至新的EP管中，加入20μLglutathione sepharose 4B GST-tagged protein purification resin(GEHealthcare)，4℃孵育过夜。用裂解液洗4次，1000rpm离心5min弃去上清。加入90μL裂解液，混匀后分成三管，30μL/管，其中一管加入5μL重组AEP酶(rAEP，北京义翘神州)，另外两管管作为对照，一管加入5μL pH 6.0的buffer(50mM柠檬酸钠，5mM DTT，0.1％CHAPS，0.5％TX-100，pH＝6.0)，一管加入5μL pH 7.4的buffer(50mM柠檬酸钠，5mM DTT，0.1％CHAPS，0.5％TX-100，pH＝7.4)，37℃孵育30min，加入5×SDS loading buffer，混匀，100℃沸水煮10min。
(4)跑胶：将制好的样品按照图2的顺序进行点样，80V恒压跑胶20min后，120V恒压跑胶到Marker分开至合适的位置，为了同时检测两个不同的抗体，在两块不同的胶上点同样的样品。
(5)转膜：提前配好转膜液，4℃预冷，按照负极-海绵-滤纸-胶-NC膜-滤纸-海绵-正极的顺序将胶和膜用转膜夹固定好，220mA恒流转膜75min。
(6)封闭：转膜完成后，将膜用TTBS溶液洗涤一次后，置于5％奶粉中，放置于摇床上室温封闭1h。
(7)孵育一抗：封闭完成后，孵育一抗，一抗采用3％的奶粉进行稀释(GST抗体(Proteintech，1mg/mL)：1:10000，抗Homer 1-240抗体(抗-Homer N240)：1:2000)，4℃摇床孵育过夜。
(8)洗膜：室温采用TTBS溶液洗膜40min，每10min换一次洗膜液。
(9)孵育二抗：采用3％的奶粉将辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG二抗(用于抗GST抗体)或辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(用于抗Homer 1-240抗体)按照1:10000比例进行稀释，室温孵育1h。
(10)洗膜：室温采用TTBS溶液洗膜1h，每10min换一次洗膜液。
(11)显影：使用ECL显影液对膜进行曝光显影。
结果见图2，抗Homer 1-240抗体能够特异性识别Homer 1-240片段，而不识别全长的Homer。
实施例4抗Homer1-240抗体在人和AD模型小鼠脑组织样本中的特异性检测
1、免疫印迹实验：
(1)制样：5例AD患者和4例非AD对照的脑组织标本来自于美国Emory老年痴呆研究中心。不同年龄阶段的P301S小鼠(AD模型鼠)麻醉灌注后取得脑组织标本。将脑组织样本加入NP40(碧云天，使用前加入Cocktail和磷酸酶抑制剂)裂解。冰上裂解30min。4℃15000g离心30min。取上清，加入5×loading buffer煮样。
(2)跑胶：将样本按照图3的顺序进行点样，80V恒压跑胶20min后，120V恒压跑胶到Marker分开至合适的位置，为了检测三个抗体(分别为抗-Homer FL，抗-Homer 1-240，和抗-GAPDH)，在三块不同的胶上点同样的样品。
(3)转膜：提前配好转膜液，4℃预冷，按照负极-海绵-滤纸-胶-NC膜-滤纸-海绵-正极的顺序将胶和膜用转膜夹固定好，220mA恒流转膜75min。
(4)封闭：转膜完成后，将膜用TTBS溶液洗涤一次后，置于5％奶粉中，放置于摇床上室温封闭1h。
(5)孵育一抗：封闭完成后，孵育一抗，一抗采用3％的奶粉进行稀释(Homer-FL抗体(Cell Signaling Technology)：1:1000，抗-Homer 1-240抗体：1:2000，GAPDH抗体：1:10000)，4℃摇床孵育过夜。
(6)洗膜：室温采用TTBS溶液洗膜40min，每10min换一次洗膜液。
(7)孵育二抗：采用3％的奶粉将辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(Proteintech,1mg/mL)按照1:10000比例进行稀释，室温孵育1h。
(8)洗膜：室温采用TTBS溶液洗膜1h，每10min换一次洗膜液。
(9)显影：使用ECL显影液对膜进行曝光显影。
结果见图3，AD病人中存在Homer 1-240片段，并且在AD小鼠模型脑内Homer 1-240片段随着年龄增加。抗-Homer 1-240抗体可识别人和小鼠中的Homer 1-240片段。
2、免疫组织化学实验：
(1)脑片：AD患者和非AD脑组织石蜡切片来自于美国Emory大学痴呆研究中心。
(2)脱蜡，水化脑片：将脑组织石蜡切片放入二甲苯中，进行脱蜡，将蜡脱干净后，脑片依次放入95％、85％、75％的无水乙醇中，分别放置5min，然后放入ddH2O中。
(3)抗原修复：将脑片放入100mM柠檬酸钠(pH＝6.0)抗原修复液中，于92℃修复20min，待自然冷却后，PBS洗三遍，每次5min。
(4)3％双氧水孵育10min，阻断内源性过氧化物酶，以减少非特异性背景染色，PBS洗三遍，每次5min。
(5)封闭：3％BSA封闭30min。
(6)孵一抗：孵育抗Homer 1-240抗体，抗体采用3％BSA溶液按照1:500的比例稀释，4℃孵育过夜。
(7)洗一抗：PBS洗三遍，每次5min。
后面步骤采用absin公司的免疫组化试剂盒进行实验：
(8)加入100μL一抗放大剂(试剂盒中的C液)，孵育10min，PBS洗三遍，每次5min。
(9)加入100μL二抗(试剂盒中的D液)，避光，孵育10min，PBS洗三遍，每次5min。
(10)配制新鲜显色液：将试剂盒中的E液和F液按照3:100的比例进行配制，混匀，待用。
(11)显色：在脑片上加入100μL新鲜显色液进行孵育，并在显微镜下观察，脑片被染上色后用去离子水进行冲洗，终止显色反应。
(12)苏木素染核。
(13)透明，将组织片子依次放入75％无水乙醇-85％无水乙醇-95％无水乙醇-二甲苯，分别放置5min。
(14)封片：中性树胶封片。
(15)显微镜观察，拍照。
结果见图4，使用抗Homer1-240抗体进行免疫组织化学实验，可以检测到AD患者脑内Homer 1-204片段。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种Homer的抗原肽及其抗体与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Leu Glu Cys Val Ser Ser Gln Ala Asn
1 5 10
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgcgtcgac tatgggggaa caacctatct tcagc 35
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgagcggcc gcttagctgc attctagtag cttggcc 37

Claims (10)

1.一种Homer 1-240片段的抗原肽，其特征在于：氨基酸序列为：CLECVSSQAN。
2.一种抗体，其特征在于：以权利要求1中所述的抗原肽为抗原制备得到。
3.一种抗体，其特征在于：以Ac-CLECVSSQAN与载体蛋白交联后得到的交联多肽为抗原制备得到。
4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于：所述的载体蛋白为KLH。
5.根据权利要求2-4任一项所述的抗体，其特征在于：所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的抗体，其特征在于：所述的多克隆抗体为兔多克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的抗体，其特征在于：所述的兔多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：以权利要求3或4中的交联多肽为免疫原免疫家兔，收集家兔血液制备抗血清，将抗血清分离纯化得到兔多克隆抗体。
8.权利要求2-7任一项所述的抗体的应用，其特征在于：所述的应用包括：检测人脑标本或动物标本中Homer被剪切程度，阿尔兹海默病发病机制的研究。
9.一种检测Homer被剪切程度的试剂，其特征在于：包括权利要求2-7任一项所述的抗体。
10.一种阿尔兹海默病早期诊断试剂，其特征在于：包括权利要求2-7任一项所述的抗体。
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