CN105039267A - 表达小鹅瘟病毒vp2的重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达小鹅瘟病毒VP2的重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用，该重组鸭瘟病毒的基因组中插入有小鹅瘟病毒VP2基因，所述小鹅瘟病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。所述构建方法包括：(1)将pDEV-vac中gfp基因的CMV启动子替换成EF1启动子，获得pDEV-EF1；(2)将Pcmv-VP2-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1，获得pDEV-VP2；(3)将pDEV-VP2转染鸡胚成纤维细胞，拯救获得所述重组鸭瘟病毒。所述重组鸭瘟病毒与亲本毒株相比，其病毒蚀斑大小不具有显著差异，说明小鹅瘟病毒VP2基因的插入不影响鸭瘟病毒在鸡胚成纤维细胞上的增殖特性。所述重组鸭瘟病毒感染鸡胚成纤维细胞后成功表达小鹅瘟病毒VP2。所述重组病毒使番鸭成功免疫产生相应抗体，为鸭瘟病毒-小鹅瘟病毒二联疫苗的研制奠定了基础。

Description

表达小鹅瘟病毒VP2的重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种表达小鹅瘟病毒VP2的重组鸭瘟病毒及其构建方法和应用。

背景技术

细菌人工染色体(bacteriaartificialchromosome，Bac)是高通量低拷贝的质粒载体，最大可以容纳300kb的DNA，并能稳定传代。Bac技术为疱疹病毒反向和正向遗传研究提供了新方法(ShizuyaH,BirrenB,KimU,etal.Cloningandstablemaintenanceof300-kilobase-pairfragmentsofhumanDNAinEscherichiacoliusinganF-factor-basedvector[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89(18):8794-8797.)。目前该技术在多种疱疹病毒相继成功应用，如1型单纯疱疹病毒(StavropoulosTA,StrathdeeCA.Anenhancedpackagingsystemforhelper-dependentherpessimplexvirusvectors[J].JVirol,1998,72:7137-7143.)、人巨细胞病毒(HCMV)(WagnerM,RuzsicsZ,KoszinowskiUH.Herpesvirusgeneticshascomeofage[J].TrendsMicrobiol,2002,10(7):318–324.)、牛I型疱疹病毒(张存,叶伟成,王一成,等.牛Ⅰ型疱疹病毒感染性细菌人工染色体的构建和gN基因缺失病毒的细胞繁殖特性[J].科学通报,2009,54(24):3823-3829.)、伪狂犬病毒(尹文玲,尹龙勃,叶伟成,等.猪伪狂犬病毒浙江株感染性细菌人工染色体克隆的构建[J].病毒学报,2010,26(4):331-335.)、马立克氏病毒(崔红玉,王云峰,石星明,等.鸡马立克氏病病毒814株细菌人工染色体的构建[J].生物工程学报,2008,24(4):569-575.)等。

鸭瘟病毒DEV属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科成员，大小约160kb，含有多个可缺失的非必需基因。目前以DEV作为载体表达外源基因已有成功的案例，LiuX等成功构建了US2基因缺失或gI/gE双基因缺失的重组鸭瘟病毒，并以之为载体表达了鹅H5亚型禽流感病毒的HA基因；LiuJ等研究证实在DEV疫苗株UL41基因内部插入外源基因既不影响病毒复制表型，也不增加鸭瘟病毒疫苗株对鸭的毒力；WangJ等也成功构建了UL44(gC)基因缺失的重组鸭瘟病毒，并以之为载体表达了H5N1禽流感病毒的HA基因。

鸭瘟病毒和鹅细小病毒(GPV)是引起番鸭和鹅发病的重要病原，给养禽业造成了严重的危害。鹅细小病毒为细小病毒科细小病毒属成员，同义名为小鹅瘟病毒。GPV基因组约5Kb，由左右2个完整的开放阅读框组成：LORF(leftORF)和RORF(rightORF)。LORF编码非结构蛋白NS1和NS2，RORF编码VP1、VP2和VP3三种结构蛋白。VP2是主要免疫功能区，可刺激机体产生中和抗体，在没有VP1的存在下，VP2可自我组装病毒样颗粒。VP2作为GPV的表面抗原之一，已被证明有良好的抗原性，是制备GPV基因工程一面的重要候选保护性抗原(李福伟,李惠敏,曹顶国,等.鹅细小病毒的分子生物学研究概况[J].水禽世界,2007.)。

发明内容

本发明提供了一种小鹅瘟病毒VP2的重组鸭瘟病毒，具有制备双联疫苗的潜质。

一种重组鸭瘟病毒，所述重组鸭瘟病毒的基因组中插入有小鹅瘟病毒VP2基因，所述小鹅瘟病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

优选的，所述基因组插入有Pcmv-VP2-BGH-pA表达框；其中VP2表示小鹅瘟病毒VP2基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾；所述基因组中gfp基因的CMV启动子替换为EF1启动子。

优选的，所述小鹅瘟病毒VP2基因插入在所述基因组的US7基因和US8基因之间。

优选的，所述的重组鸭瘟病毒以鸭瘟病毒的疫苗株作为活载体。鸭瘟病毒作为病毒活载体具有疫苗生产、储存和免疫技术成熟，且安全性良好的优势。

本发明还提供了一种重组鸭瘟病毒的构建方法，包括以下步骤：

(1)将pDEV-vac中gfp基因的CMV启动子替换成EF1启动子，获得pDEV-EF1；

(2)将Pcmv-VP2-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1，获得pDEV-VP2；

(3)将pDEV-VP2转染鸡胚成纤维细胞，拯救获得所述重组鸭瘟病毒rDEV-VP2；

其中pDEV-vac表示携带有鸭瘟病毒疫苗株全基因组的感染性细菌人工染色体克隆，VP2表示小鹅瘟病毒VP2基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾；一般情况下p起始表示质粒，r起始表示病毒；

所述小鹅瘟病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

所述CMV启动子替换成EF1启动子的方法为：

(1)以pEP-EF1-in为模板，利用核苷酸序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3的引物，扩增获得目标片段；

(2)将所述目标片段转入pDEV-vac/GS1783感受态细胞进行同源重组，筛选获得pDEV-kanEF1；

(3)敲除pDEV-kanEF1中的kan抗性基因，获得pDEV-EF1；

所述的pEP-EF1-in质粒图谱如图7所示；

所述的pDEV-vac/GS1783为携带pDEV-vac的大肠杆菌GS1783。

所述Pcmv-VP2-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1的方法为：

(1)人工合成所述小鹅瘟病毒VP2基因，插入pEP-BGH-end，获得pEP-BGH-VP2；

(2)以pEP-BGH-VP2为模板，利用核苷酸序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5的引物，扩增获得目标片段；

(3)将所述目标片段转入pDEV-EF1/GS1783感受态细胞进行同源重组，筛选获得pDEV-kanVP2；

(4)敲除pDEV-kanVP2中的kan抗性基因，获得pDEV-VP2；

所述的pEP-BGH-end质粒图谱如图8所示。

本发明在鸭瘟病毒疫苗株的基础上，结合RedE/T重组技术将pDEV-vac上gfp基因的CMV启动子替换为EF1启动子，以便于小鹅瘟病毒VP2基因准确插入到pDEV-EF1的预期位置，同时有利于启动小鹅瘟病毒VP2基因的表达。该技术不需要特定的限制性酶切位点，只需较短的同源序列，即可在生物体内完成重组过程，省去了体外DNA酶切、连接等步骤。

本发明又提供了所述的重组鸭瘟病毒在制备动物疫苗中的应用。

本发明得到的重组鸭瘟病毒与亲本毒株相比，其病毒蚀斑大小不具有显著差异，说明小鹅瘟病毒VP2基因的插入不影响鸭瘟病毒在鸡胚成纤维细胞上的增殖特性。

本发明得到的重组鸭瘟病毒感染鸡胚成纤维细胞后成功表达小鹅瘟病毒VP2，且该重组鸭瘟病毒感染番鸭后成功诱发机体产生针对VP2蛋白的抗体，为鸭瘟病毒-小鹅瘟病毒二联疫苗的研制奠定了基础。

附图说明

图1为重组克隆pDEV-VP2的BamHⅠ和XhoⅠ酶切鉴定图，其中A为以参考序列GenBank(EU082088.2)、小鹅瘟病毒VP2基因进行预测的结果，B为电泳图谱；1：pDEV-vac；2：pDEV-EF1；3：pDEV-kanVP2；4：pDEV-VP2；

图2为重组病毒蚀斑图谱，其中a：rDEV-BAC；b：rDEV-EF1；c：rDEV-VP2；d：rDEV-VP2-Cre；

图3为rDEV-BAC、rDEV-EF1和rDEV-VP2在鸡胚成纤维细胞CEFs上的蚀斑面积柱状图；

图4为rDEV-BAC、rDEV-EF1和rDEV-VP2在鸡胚成纤维细胞CEFs上的体外生长曲线，其中A为细胞裂解液，B为细胞培养上清；

图5为IFA检测重组病毒感染细胞中蛋白的表达图，其中A：rDEV-VP2-Cre；B：rDEV-Cre；

图6为Westernblot检测病毒感染细胞中VP2蛋白的表达图，其中1：rDEV-EF1；2：rDEV-VP2；3：rDEV-VP2-Cre；

图7为pEP-EF1-in载体质粒图谱；

图8为pEP-BGH-end载体质粒图谱。

具体实施方式

下列实施中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.赛德曼等主编，马学军，舒跃龙译，北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

1、序列优化、引物设计及合成

小鹅瘟病毒VP2基因序列参考GenBank(U25749.1)，由GenScript公司以鸡为宿主进行优化合成。引物分别参考序列GenBank(EU082088.2)、小鹅瘟病毒VP2基因优化序列设计，由生工公司合成。

序列见表1，引物EF1-ep1和EF1-ep2用于以EF1启动子替换pDEV-vac中gfp基因的启动子Pcmv，构建pDEV-EF1。下划线部分与pEP-EF1-in质粒序列同源，斜体序列分别和pDEV-vac序列中gfp基因的启动子Pcmv上、下游序列同源；

引物pDEVvac-in-s和pDEVvac-in-as用于将表达框Pcmv-VP2-BGH-pA插入到DEV基因组的US7基因和US8基因之间。下划线部分与pEP-BGH-VP2同源，粗体部分分别与位于US7基因和US8基因间插入位点上、下游的序列同源；

引物EF1-JD-F和EF1-JD-R用于EF1启动子替换是否成功的鉴定；

引物Rec-JD-F和Rec-JD-R用于外源基因插入BAC基因组中的验证；

引物18F和15R用于鉴定mini-F序列是否去除。

表1

2、pDEV-vac的CMV启动子替换成EF1启动子

通过RedE/T两步重组将pDEV-vac株中的CMV启动子替换成EF1启动子，便于小鹅瘟病毒VP2基因表达框(含有CMV启动子)的精确插入。本发明所述的携带有鸭瘟病毒疫苗株全基因组感染性细菌人工染色体克隆的pDEV-vac株是指文献(ChenL,YuB,HuaJ,etal.Constructionofafull-lengthinfectiousbacterialartificialchromosomecloneofduckenteritisvirusvaccinestrain[J].VirolJ,2013,10:328.)公开的感染性细菌人工染色体。通过同源重组将细菌人工染色体(BacterialArtificialChromosome,BAC)载体和GFP表达框的pHA2质粒序列插入到鸭瘟病毒疫苗株(DEV-vac)的UL15B和UL18基因之间，通过筛选获得了重组病毒rDEV，将该重组病毒的环状基因组电转化至DH10b感受态细胞，筛选获得了病毒的全长感染性克隆pDEV-vac。

感受态细胞的制备：将pDEV-vac/GS1783菌株接种于氯霉素(CAM)抗性的LB培养基中，32℃220r/min培养至OD₆₀₀为0.5～0.7，42℃水浴摇床摇15min以诱导Red重组酶表达，按常规方法制备电转化感受态细胞；

第一步Red重组：本发明所用的pEP-EF1-in质粒由浙江省农科院畜牧兽医研究所保存(由德国柏林自由大学马光刚博士赠送)，所述质粒图谱如图7所示。以pEP-EF1-in质粒为模板，用引物对EF1-ep1和EF1-ep2扩增，得到2358bp的片段。胶回收纯化片段，取200ng电转化至pDEV-vac/GS1783感受态细胞中，涂布于CAM/卡那霉素(Kan)双抗性平板上，于32℃培养36h；挑取阳性克隆提取质粒，XbaⅠ酶切筛选正确重组的克隆(pDEV-kanEF1)进行第二次重组；

第二步Red重组：将pDEV-kanEF1质粒中的Kan抗性基因删除，具体方法为:接种pDEV-kanEF1菌落于液体培养基，于32℃220r/min培养过夜，次日转接于2mLCAM-LB中，振荡培养2～4h，加入等量2％L-阿拉伯糖，继续培养1h诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶，然后再转入42℃水浴摇床培养30min进行Red重组，最后32℃培养1h；将细菌悬液作10^-3～10^-5稀释后涂布于CAM平板，32℃孵育24～48h，挑取菌落同时点种于CAM和Kan平板；XbaⅠ酶切分析Cam阳性和Kan阴性的菌落，以筛选正确重组的克隆(pDEV-EF1)；

以pDEV-EF1为模板，用引物对EF1-JD-F和EF1-JD-R进行PCR扩增，胶回收后克隆至pMD18-TVector，选取阳性克隆送至Invitrogen公司测序，测序结果与预期一致。

3、pEP-BGH-VP2质粒的构建

本发明所用的pEP-BGH-end质粒均由浙江省农科院畜牧兽医研究所保存(由南京农业大学孙学强博士赠送)，所述质粒图谱如图8所示。以鸡为宿主进行优化合成的小鹅瘟病毒VP2基因在合成时在其5’和3’端分别引入了KpnⅠ和NotⅠ酶切位点，将片段用KpnⅠ和NotⅠ进行双酶切之后插入到pEP-BGH-end相应的酶切位点中。通过PCR和酶切鉴定筛选获得阳性克隆，送Invitrogen生物公司测序，测序结果与预期一致。

4、pDEV-VP2突变体的构建

感受态细胞制备：将pDEV-EF1/GS1783菌株接种于氯霉素(CAM)抗性的LB培养基中，32℃220r/min培养至OD₆₀₀为0.5～0.7，42℃水浴摇床摇15min以诱导Red重组酶表达，按常规方法制备电转化感受态细胞。

第一步Red重组：以pEP-BGH-VP2质粒为模板，用引物pDEVvac-in-s和pDEVvac-in-as(序列见表1)扩增长度约为3913bp的片段，胶回收纯化片段，取200ng电转化至pDEV-EF1/GS1783感受态细胞中，涂布于CAM/Kan双抗性平板上，于32℃培养36h。挑取阳性克隆提取质粒，酶切筛选正确重组的克隆pDEV-kanVP2进行第二次重组。

第二步Red重组：将pDEV-kanVP2质粒中的Kan抗性基因删除，具体方法为：接种pDEV-kanVP2菌落于液体培养基，于32℃220r/min培养过夜，次日转接于2mLCAM-LB中,振荡培养2～4h，加入等量2％L-阿拉伯糖，继续培养1h诱导表达Ⅰ-SceⅠ核酸内切酶,然后再转入42℃水浴摇床培养30min进行Red重组，最后32℃培养1h。将细菌悬液作10^-3～10^-5稀释后涂布于CAM平板，32℃孵育24～48h,挑取菌落同时点种于CAM和Kan平板。以BamHⅠ和XhoⅠ酶切分析Cam阳性和Kan阴性的菌落，筛选正确的重组克隆pDEV-VP2。

以pDEV-VP2为模板，用引物Rec-JD-F和Rec-JD-R(序列见表1)扩增，获得大小约3408bp的片段，胶回收后克隆至pMD18-T载体，选取阳性克隆送至Invitrogen公司测序，测序结果与预期一致。

5、突变体的鉴定

分别提取pDEV-vac、pDEV-EF1、pDEV-kanVP2和pDEV-VP2DNA，经过BamHⅠ和XhoⅠ酶切鉴定，电泳图谱(图1B)与预测结果(图1A)基本一致，且以引物对Rec-JD-F和Rec-JD-R进行PCR扩增片段测序结果也与预期一致，说明小鹅瘟病毒VP基因按照预期结果插入。

6、重组病毒在CEFs细胞中的拯救

用碱裂解法分别提取pDEV-vac、pDEV-EF1和pDEV-VP2质粒，根据Promega磷酸钙转染试剂盒说明书转染鸡胚成纤维细胞CEFs，于37℃5％CO₂继续培养，待出现70～80％病变后收取病毒，拯救的病毒分别命名为rDEV-BAC、rDEV-EF1和rDEV-VP2(图2a-c)。

为了去除rDEV-VP2病毒基因组上的mini-F序列，将4μgpDEV-VP2和1μgCre重组酶表达质粒pCAGGS-NLS/Cre(由德国柏林自由大学OsterriederN博士惠赠)以磷酸钙法共转染至CEFs细胞，第二天铺上含有1.5％甲基纤维素的DMEM培养基，放于37℃CO₂培养箱继续培养，直至出现病毒蚀斑，挑取非荧光蚀斑进行稀释和传代，经过几轮重复，直至获得纯化的非荧光蚀斑病毒。抽提病毒DNA，采用18F/15R引物对进行PCR扩增鉴定mini-F序列是否去除。鉴定正确的病毒命名为rDEV-VP2-Cre(图2d)。

7、重组病毒的细胞增殖特性

7.1重组病毒蚀斑大小的测定

将rDEV-BAC、rDEV-EF1和rDEV-VP2病毒冻存液用不同稀释度进行稀释，接种于12孔板中的单层鸡胚成纤维细胞CEFs上，2h后，换上含有1.5％甲基纤维素的DMEM培养基，放于37℃CO₂培养箱培养48h，在荧光显微镜下每种病毒各拍100张蚀斑照片，用ImageJ软件来测量不同病毒的蚀斑面积，计算各病毒的平均值，将rDEV-BAC蚀斑面积设成100％，其他病毒蚀斑面积以之为标准换算成百分比。如图3所示，rDEV-VP2蚀斑面积较rDEV-BAC增加了0.3％(P＝0.119)，较rDEV-EF1减少了12.2％(P＝0.061)。

7.2生长曲线

以常规病毒学方法测定rDEV-BAC、rDEV-EF1和rDEV-VP2的体外增殖特性。鸡胚成纤维细胞CEFs单层接种0.02MOI病毒后，依次吸附90min，PBS(pH＝7.2)洗涤2次，以冰浴的CBS缓冲液(40mmol/L柠檬酸钠、10mmol/L氯化钾、135mmol/L氯化钠，pH＝3.0)处理3min，PBS(pH＝7.2)洗涤2次，加入1mL维持液继续培养。接种后0、12、24、36、48、60、72h分别收集细胞培养上清和细胞，细胞用PBS(pH＝7.2)洗涤2次。收集的上清和细胞冻存于-80℃直至进行滴度测定。分别取100μL细胞培养上清和细胞裂解液按照常规的方法测定TCID₅₀，每个稀释度重复接种3孔。计算上述各时间点收获的病毒毒价，绘制病毒在体外的多步生长曲线。

如图4(A)所示，rDEV-VP2在细胞内的滴度从12h到72h稳步增加，并于60h达到最高，12到48h之内病毒滴度较rDEV-EF1和rDEV-BAC稍有降低，而60h时高于后两者。如图4(B)所示rDEV-VP2病毒在上清中的滴度，从12h到72h稳步增加，并与对照rDEV-BAC和rDEV-EF1无显著差异。

8、小鹅瘟病毒VP2蛋白的表达分析

8.1间接免疫荧光检测(IFA)蛋白表达

制备对照毒株rDEV-Cre：取4μgpDEV-vac以磷酸钙法转染至CEFs，转染细胞放于37℃CO₂培养箱3～6天，直至荧光出现，收获病毒，命名为rDEV-BAC。为了去除rDEV-BAC病毒基因组上的mini-F序列，将4μgpDEV-vac和1μgCre重组酶表达质粒pCAGGS-NLS/Cre以磷酸钙法共转染至CEFs细胞，第二天铺上含有1.5％甲基纤维素的DMEM培养基，放于37℃CO₂培养箱继续培养，直至出现病毒蚀斑，挑取非荧光蚀斑进行稀释和传代，经过几轮重复，直至获得纯化的非荧光蚀斑病毒。抽提病毒DNA，采用18F/15R引物对进行PCR扩增鉴定mini-F序列是否去除。鉴定正确的病毒命名为rDEV-Cre。

分别接种rDEV-VP2-Cre和对照毒株rDEV-Cre于96孔板的CEFs细胞中，培养72h，PBS(pH＝7.0)洗涤三次，用预冷的甲醇/丙酮(1：1)固定液于-20℃固定30min，用含1％NP-40的PBS洗涤。一抗采用小鼠抗GPVVP2多克隆抗体(1：100)，于37℃湿盒中孵育1h，洗涤三次之后，滴加伊文斯兰溶液稀释的FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1：100)，再置于37℃孵育1h，同样洗涤之后，碱性甘油封片，于Olympus荧光显微镜下观察。

如图5所示rDEV-VP2-Cre感染细胞中检测出特异的绿色荧光(A)，而对照病毒感染细胞呈阴性(B)，初步表明VP2蛋白在重组病毒感染细胞中获得了表达。

8.2Westernblot方法检测蛋白表达

分别接种rDEV-EF1、rDEV-VP2和rDEV-VP2-Cre于96孔板的CEFs细胞中，培养72h，PBS(pH＝7.0)洗涤三次，收获细胞。蛋白样品于SDS-PAGE电泳完毕，采用半干转移法将蛋白转移至PVDF膜上，取出PVDF膜，放入封闭液中4℃封闭过夜。以小鼠抗GPVVP2多克隆抗体(1：500稀释)作为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1：5000稀释)作为二抗于37℃孵育1h，最后用DAB显色法进行显色。

如图6所示rDEV-VP2和rDEV-VP2-Cre感染的细胞样品较rDEV-EF1感染的细胞样品在72kDa处有一条特异性条带，与预期蛋白大小一致，说明VP2蛋白获得了表达。

9、重组鸭瘟病毒的应用

将24只7日龄无鸭瘟抗体的番鸭随机分为3组(n＝8)，饲养于不同的房间。分别接种1×10⁶TCID₅₀rDEV-EF1、1×10⁶TCID₅₀rDEV-VP2，并设立细胞培养物作为阴性对照组。免疫后1W、2W和3W采血，分离血清，间接ELISA方法测定VP2抗体生成情况。

结果显示3组雏鸭免疫后1W、2W和3W，rDEV-VP2重组病毒免疫抗体阳转率分别为1/8、3/8和4/8，而rDEV-EF1组和细胞培养液组VP2抗体均为阴性。结果说明以鸭瘟病毒作为载体表达的外源抗原能诱发机体产生相应的抗体。

序列表

Claims (8)

1.一种重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述重组鸭瘟病毒的基因组中插入有小鹅瘟病毒VP2基因，所述小鹅瘟病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.如权利要求1所述的重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述基因组插入有Pcmv-VP2-BGH-pA表达框；其中VP2表示小鹅瘟病毒VP2基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾；所述基因组中gfp基因的CMV启动子替换为EF1启动子。

3.如权利要求1所述的重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述小鹅瘟病毒VP2基因插入在所述基因组的US7基因和US8基因之间。

4.如权利要求1所述的重组鸭瘟病毒，其特征在于，以鸭瘟病毒的疫苗株作为活载体。

5.一种重组鸭瘟病毒的构建方法，包括以下步骤：

(1)将pDEV-vac中gfp基因的CMV启动子替换成EF1启动子，获得pDEV-EF1；

(2)将Pcmv-VP2-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1，获得pDEV-VP2；

(3)将pDEV-VP2转染鸡胚成纤维细胞，拯救获得所述重组鸭瘟病毒；

其中pDEV-vac表示携带有鸭瘟病毒疫苗株全基因组的感染性细菌人工染色体克隆，VP2表示小鹅瘟病毒VP2基因，Pcmv表示启动子CMV，BGH-pA表示人球蛋白基因多聚腺苷酸尾；

所述小鹅瘟病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

6.如权利5所述的构建方法，其特征在于，所述CMV启动子替换成EF1启动子的方法为：

(1)以pEP-EF1-in为模板，利用核苷酸序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3的引物，扩增获得目标片段；

(2)将所述目标片段转入pDEV-vac/GS1783感受态细胞进行同源重组，筛选获得pDEV-kanEF1；

(3)敲除pDEV-kanEF1中的kan抗性基因，获得pDEV-EF1；

所述的pDEV-vac/GS1783为携带pDEV-vac的大肠杆菌GS1783。

7.如权利5所述的构建方法，其特征在于，所述Pcmv-VP2-BGH-pA表达框插入pDEV-EF1的方法为：

(1)人工合成所述小鹅瘟病毒VP2基因，插入pEP-BGH-end，获得pEP-BGH-VP2；

(2)以pEP-BGH-VP2为模板，利用核苷酸序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5的引物，扩增获得目标片段；

(3)将所述目标片段转入pDEV-EF1/GS1783感受态细胞进行同源重组，筛选获得pDEV-kanVP2；

(4)敲除pDEV-kanVP2中的kan抗性基因，获得pDEV-VP2。

8.如权利要求1-4任一所述的重组鸭瘟病毒在制备动物疫苗中的应用。