CN111089973B

CN111089973B - 牛水泡性口炎的检测试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN111089973B
Application number: CN201911329708.0A
Authority: CN
Inventors: 许梦娇; 沈志功
Original assignee: Bazhou Yanchuang Technology Co ltd
Current assignee: Bazhou Yanchuang Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2023-10-27
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: CN111089973A

Abstract

本发明提供一种牛水泡性口炎的检测试剂盒及其制备方法，属于分子生物学技术领域，包括固相，固相上固定了VSV抗原，VSV抗原包括重组P_1‑87蛋白，P_1‑87蛋白包含SEQ ID NO.1氨基酸序列，终止液，含有检测用抗体的液相，检测用抗体包括用于检测IgG的HRP‑抗牛IgG抗体。本发明提供的试剂盒以牛水泡性口炎病毒截短的P蛋白建立间接ELISA诊断方法，能够使重组蛋白内部的抗原决定簇发生暴露，提高抗原效价，提高抗原特异性，进而提高检出率。

Description

牛水泡性口炎的检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及牛水泡性口炎的检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

水泡性口炎(Vesicular stomatitis,VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitis virus,VSV)引起的一种具有高度接触性的人兽共患传染病，临床上主要引起感染动物出现水泡性疾病，以在感染动物的口腔、唇部、舌、乳头以及感染动物的蹄冠等部位黏膜或皮肤出现水泡性口炎病变为特征。VSV主要经患病动物的唾液以及水泡液进行传播。此外，该病还能够引起感染动物脑膜脑炎的发生，出现明显的神经症状。

VSV的诊断方法经历了一个逐渐发展的过程，最早是通过临床症状的观察来确诊，由于该病与口蹄疫、猪水泡病等临床症状相似，所以临床症状观察所得诊断可靠性不高，极易出现误诊的情况。随后，免疫学和分子生物学技术逐渐得到发展，这对兽医临床上大规模的检测是一次跨时代的改革，这些检测方法包括中和试验、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、PCR检测方法等，这些检测方法都具有较好的检测效果，但是对实验条件要求较高，在一般的养殖场无法进行试验，而且检测成本相对较高、需要专业的实验室人员操作，鉴于这些不足和限制，非常有必要建立一种操作简单、使用方便的检测方法用于针对该病的临床诊断、疫情监测以及流行病学调查。

现有技术如授权公告号为CN 105334322B的中国发明专利，公开了一种水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原及其制备方法。一种水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；编码该重组N蛋白抗原的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。将该发明的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原应用于制备快速检测水泡性口炎病毒抗体的试纸条，特异性好，灵敏度高，具有检测快速、操作简便，检测样品量少，检测成本较低等优点，为水泡性口炎病毒抗体检测和水泡性口炎流行病学调查提供良好的检测手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛水泡性口炎的检测试剂盒及其制备方法，该发明以牛水泡性口炎病毒截短的P蛋白建立间接ELISA诊断方法，能够使重组蛋白内部的抗原决定簇发生暴露，提高抗原效价，提高抗原特异性；纯化重组蛋白时可以省去杂蛋白洗脱的步骤，提高纯化后重组蛋白浓度。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

提供一种牛水泡性口炎的检测试剂盒，其特征在于包括：

固相，上述的固相上固定了VSV抗原，上述VSV抗原包括重组P_1-87蛋白，上述P_1-87蛋白包含SEQ ID NO.1氨基酸序列；

终止液；

含有检测用抗体的液相，上述的检测用抗体包括用于检测IgG的HRP-抗牛IgG抗体。磷酸化蛋白在病毒合成中起关键作用，主要是替换并连接核衣壳蛋白，参与病毒壳体形成。蛋白隣酸化程度可以直接影响病毒基因组转录效率，蛋白高水平憐酸化可使病毒转录醃保持转录活性最大化。磷酸化蛋白(P)是一种具有多种功能的蛋白质，而且该蛋白为强碱性，呈现磷酸化的状态。病毒的转录活性与多种蛋白相关，而P蛋白有利于病毒转录酶的转录活性，影响其转录效率，在转录过程中起到了关键的作用。本发明选择截短的P蛋白基因片段在IND和NJ型水泡性口炎病毒截短具有高度同源性，且该区域抗原表位密集且交叉性较多，可以同时检测IND和NJ型水泡性口炎病毒。

作为优选，上述VSV抗原固定在固相上的方法包括以下步骤：

用包被液稀释重组P_1-87蛋白至浓度为2-2.5μg/mL，加入2,3-二巯基丙磺酸钠，二丙二乙酸钠，混合均匀，按照每孔90-100μL的量加入酶标板，37℃包被2h，4℃继续包被10-16h，用PBS-T洗涤多次；

按照每孔90-100μL的量将封闭液加入酶标板，37℃封闭2h，用PBS-T洗涤多次。血清中能够受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分，IgG的吸附性很强，非特异性IgG可与直接吸附到固相载体上，这些非特异的IgG均可以和酶标二抗发生反应而造成加高阴性本底或假阳性。包被抗原时，向抗原中加入2,3-二巯基丙磺酸钠，二丙二乙酸钠，能够使重组VSV P_1-87蛋白内部的抗原决定簇发生暴露，有利于与血清中的特异性IgG抗体发生结合，提高亲和力，提高抗原效价，提高抗原特异性，进而提高检出率。

作为优选，上述重组P_1-87蛋白的制备方法包括以下步骤：

S1、P_1-87蛋白的原核表达系统的构建；

S2、重组蛋白的诱导表达；

S3、重组蛋白的分离纯化。

作为优选，上述步骤S1中P_1-87蛋白的原核表达系统的构建，具体包括：

a、提取水泡性口炎病毒RNA，进行反转录，以反转录产物为模板进行PCR扩增，纯化回收得目的片段；

b、分别对目的片段、pET-30c(+)载体进行双酶切，然后将酶切后的目的片段和pET-30c(+)载体进行连接，转入E.coli BL21菌中，提取阳性质粒，得pETVSV-P_1-87；

c、将pETVSV-P_1-87转入E.coli BL21菌中，筛选阳性克隆，得P_1-87蛋白的原核表达系统。

作为优选，上述步骤b中双酶切所用酶为EcoRⅠ与XhoⅠ。

作为优选，上述步骤a中PCR扩增所用引物为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。

作为优选，上述步骤S2中诱导表达的重组蛋白以包涵体形式存在。包涵体的形成有利于防止重组蛋白的降解，从而有利于重组蛋白的纯化。

作为优选，上述步骤S3中重组蛋白的分离纯化方法为：

a、菌体裂解：将诱导好的菌液离心收集菌体，用pH8.0的TE洗涤两次，重悬于pH8.0的TE中，超声破碎处理，离心收集沉淀，溶解于含6M盐酸胍的Tris-HCl缓冲液中，冰上静置0.8-1.2h，间歇混匀溶解，离心收集上清；

b、重组蛋白纯化：将步骤a中收集的上清加入镍离子柱，再加入结合缓冲液(0.1MNaH₄PO₄，0.2M熊果苷，质量分数3％的硫酸葡聚糖钠盐，0.01M Tris-Cl pH8.0)将其轻轻混匀，混悬30-40min，用洗脱缓冲液(0.1M NaH₄PO₄，0.01M Tris-Cl pH4.5)洗下目的蛋白，离心收集上清；

c、重组蛋白的复性：用100mM EDTA煮透析袋8-10min，将将步骤b中收集的上清装入透析袋，4℃下在PBS液中透析2-3d，期间换液2-3次。重组抗原中混有大肠杆菌的其他杂蛋白，受过大肠杆菌感染后，血清中的抗大肠杆菌抗体可和这些杂蛋白产生反应而引起假阳性，因此，抗原纯度对ELISA诊断方法成功与否十分关键。本试验采用的pET30c属于硫氧还原蛋白融合型表达载体，硫氧还原蛋白是一种高效的融合蛋白配偶体，表达产物含有6个组氨酸残基，可用Ni-NTAHis·Bind树脂纯化表达产物，纯化时在结合缓冲液中加入硫酸葡聚糖钠盐，熊果苷，能够有效防止杂蛋白与树脂结合、与目的蛋白之间形成二硫键，能够防止目的蛋白与杂蛋白共纯化，可以省去杂蛋白洗脱的步骤，提高纯化后重组蛋白的浓度，提高纯化后重组蛋白的抗原性，进而提高检出率，且简化了操作步骤，降低了成本。

本发明提供一种硫酸葡聚糖钠盐和熊果苷在提高Ni-NTA His·Bind树脂纯化重组蛋白效率中的用途。

本发明提供一种采用上述试剂盒检测牛水泡性口炎病毒IgG抗体的方法。

本发明优点在于：

1、本发明选择截短的P蛋白基因片段在IND和NJ型水泡性口炎病毒截短具有高度同源性，且该区域抗原表位密集且交叉性较多，可以同时检测IND和NJ型水泡性口炎病毒；

2、本发明能够使重组VSV P_1-87蛋白内部的抗原决定簇发生暴露，有利于与血清中的特异性IgG抗体发生结合，提高亲和力，提高抗原效价，提高抗原特异性，进而提高检出率；

3、本发明能够有效防止杂蛋白与树脂结合、与目的蛋白之间形成二硫键，能够防止目的蛋白与杂蛋白共纯化，可以省去杂蛋白洗脱的步骤，提高纯化后重组蛋白的浓度，提高纯化后重组蛋白的抗原性，进而提高检出率，且简化了操作步骤，降低了成本。

附图说明

图1为本发明试验例1中纯化后重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图2为本发明试验例1中纯化后重组蛋白的浓度；

图3为本发明试验例2中Western-blot检测结果；

图4为本发明试验例3中试验例3中抗原稀释度的测定结果；

图5为本发明试验例3中试验例3中的抗原阻断曲线；

图6为本发明试验例4中试验例4中符合率的测定结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1：本发明的技术路线是，首先，提取VSV-NJ病毒的总RNA，反转录成cDNA，通过PCR扩增出P_1-87的基因。然后构建pETVSV-P_1-87重组质粒。再转化质粒得到P_1-87蛋白的原核表达系统，通过诱导表达、分离纯化得到重组P_1-87蛋白。最后组装成牛水泡性口炎的检测试剂盒。

细胞及细胞株采用：E.coli BL21，用于pETVSV-P_1-87阳性质粒的筛选和重组P_1-87蛋白的表达。

Axyprep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂购自Invitrogen公司。TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶及内切酶均购自NEB公司。DNA胶回收试剂盒购自天根公司。

实验方法：

1.VSV-NJ病毒RNA的提取

取200μLVSV-NJ毒株扩增后的病毒液按Axyprep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒的操作程序提取VSV-NJ总RNA。

2.P_1-87蛋白的原核表达系统的构建

2.1VSV-NJ-P_1-87蛋白基因的PCR扩增：

以提取的VSV-NJ RNA为模板，快速将其溶于20μL DEPC H₂O中，取5μL用于反转录反应；以NJ-P-XF(序列为SEQ ID NO.3)、NJ-P-XR(序列为SEQ ID NO.4)为引物。按如下反应体系(20μL)将各成分加在0.5mL小离心管中：

按上述比例加好反应物后，于70℃水浴5min后，立即冰浴2-3min，快速加入RNA酶抑制剂1μL，M-MLV反转录酶1μL，混匀后37℃水浴1h即得到cDNA。

以反转录得到的cDNA作为模板，NJ-P-XF及NJ-P-XR为引物，PCR扩增P_1-87蛋白基因。反应体系(30μL)如下：

混匀，置PCR扩增仪中，94℃预变性3min，再按如下程序循环：94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，经35个循环后，72℃延伸10min。

经1％琼脂糖凝胶电泳后，按照OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒使用说明书回收纯化的目的片段。

2.2重组pETVSV-P_1-87质粒的构建：

将纯化的VSV-NJ-P_1-87蛋白基因的PCR产物分别用EcoRⅠ与XhoⅠ对目的片段、pET-30c(+)载体进行双酶切，将酶切后的目的片段和pET-30c(+)载体进行连接。酶切体系如下：

混合均匀后放入37℃水浴锅中，反应4h，1％琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带，用OMEGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化酶切产物。连接体系如下：

放于PCR仪中，16℃反应12h，反应结束后，将EP管置于冰盒中。

将连接产物10μL加至100μL E.coli BL21感受态细胞中，冰上放置30min；42℃热激90s，立即置于冰上2min；加入500μL LB液体培养基，37℃、200r/min震荡培养1h；均匀地涂布于含卡那霉素的LB平板上，倒置于37℃培养箱中培养过夜。小量法提取质粒并进行酶切和PCR分析、鉴定，阳性表达质粒再次转化于BL21(DE3)感受态细胞中，涂板、提质粒、经PCR、酶切鉴定，阳性克隆送上海博亚测序。得到的P_1-87基因为270bp，测得序列如SEQ IDNO.2所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

P_1-87基因，SEQ ID NO.2：

AACAGATATCATGGACAGTGTTGATAGGCTCAAGACTTACTTAGCCACTTATGATAATTTGGATTCTGCCTTGCAGGATGCCAATGAATCTGAGGAAAGACGAGAGGATAAATATCTCCAAGACCTCTTCATCGAAGATCAAGGAGATAAACCAACTCCGTCATATTATCAGGAAGAAGAATCGTCAGATTCAGATACTGATTATAATGCTGAACATCTTACGATGCTGTCACCGGATGAAAGAATAGACAAGTGGGAAGAAGATTTGCC

P_1-87基因的氨基酸序列，SEQ ID NO.1：

MDSVDRLKTYLATYDNLDSALQDANESEERREDKYLQDLFIEDQGDKPT PSYYQEEESSDSDTDYNAEHLTMLSPDERIDKWEEDLP

SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1对应如下：

3.重组蛋白的诱导表达

挑取含质粒pETVSV-P_1-87的单菌落接种于含50μL/mL卡那霉素的5mL LB培养液中，37℃过夜，次日以1/100(V/V)的比例转接到20mL含卡那霉素的LB培养液中，37℃培养至OD₆₀₀达0.6左右，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续诱导培养3h。

4.重组蛋白的分离纯化

将诱导好的菌液8000r/min离心15min收菌，用pH8.0的TE洗涤两次，重悬于pH8.0的TE中，超声破碎处理，10000r/min离心10min收集沉淀，溶解于含6M盐酸胍的Tris-HCl缓冲液中，冰上静置1h，间歇混匀溶解，离心收集上清；向收集的上清中加入Ni-NTA His·Bind树脂，再加入结合缓冲液(0.1M NaH₄PO₄，0.2M熊果苷，质量分数3％的硫酸葡聚糖钠盐，0.01M Tris-Cl pH8.0)将其轻轻混匀，混悬30min，用25μL洗脱缓冲液(0.1M NaH₄PO₄，0.01MTris-Cl pH4.5)洗下目的蛋白，离心收集上清。

5.重组蛋白的复性

用100mM EDTA煮透析袋10min，将收集的上清装入透析袋，4℃下在PBS液中透析2d，期间换液2次。

6.重组P_1-87蛋白抗原的鉴定

经SDS-PEG电泳检测得到15kDa左右的蛋白特征带，为预期分子量的目的蛋白。

7.组装牛水泡性口炎的检测试剂盒

ELISA筛选出合适重组P_1-87蛋白抗原后，组装牛水泡性口炎的检测试剂盒。该试剂盒包括抗体包被条板、阴性对照血清、阳性对照血清、试剂稀释液、酶标二抗、10×浓缩洗涤液、显色剂、终止液。具体组成见表1。

表1牛水泡性口炎的检测试剂盒组分

抗原包被板条的制备包括以下步骤：用包被液(0.05M，pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释重组P_1-87蛋白至浓度为2μg/mL，加入2,3-二巯基丙磺酸钠，二丙二乙酸钠，混合均匀，按照每孔100μL的量加入96孔酶标板，37℃包被2h，4℃继续包被12h，用PBS-T洗涤3次；按照每孔100μL的量将封闭液(50mlPBS液中加入0.25g BSA)加入酶标板，37℃封闭2h，用PBS-T洗涤3次。

阴性对照血清为未感染水泡性口炎的牛的阴性血清。阳性对照血清为感染水泡性口炎的牛的阳性血清。试剂稀释液为pH值为7.2、牛血清白蛋白含量为1％(W/V)的磷酸盐缓冲液。浓缩洗涤液为pH值为7.2、吐温20含量为0.1％(V/V)的磷酸盐缓冲液。显色剂是四甲基联苯胺。终止液为1N HCL(1N盐酸)。封板膜为与酶标板的板面大小一致的透明塑料膜。以上所述的酶标二抗选自HRP-羊抗牛IgG抗体、HRP-羊抗牛IgG抗体、HRP-羊抗牛IgG抗体中的一种，但不限于此。

利用本发明的试剂盒进行牛水泡性口炎的检测，采用间接ELISA抗体检测法。重组P_1-87蛋白抗原包被于酶标板上，分别加入待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清，37℃孵育30min，洗涤后加入酶标二抗，待检血清、阳性对照血清中的牛水泡性口炎抗体会与包被于酶标板上的重组P_1-87蛋白抗原结合，形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与牛水泡性口炎抗体特异性结合，游离的成分被洗去。加入显色剂，若反应孔中有牛水泡性口炎抗体，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂变蓝，加终止液变黄。在450nm处测OD值。具体包括以下步骤：

试验所需自备试验器材：

1)酶标仪(450nm检测波长滤光片，570nm或690nm校正波长滤光片)；

2)高精度加液器及一次性吸头：0.5-10μL，2-20μL，20-200μL，200-1000μL；

3)微孔板振荡器，双蒸水或去离子水。

标本收集：

1)收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管；

2)血浆抗凝剂推荐使用EDTA，避免使用溶血，高血脂标本；

3)标本应清澈透明，悬浮物应离心去除；

4)标本收集后若不及时检测，需按一次使用量分装，冻存于-20℃或-70℃冰箱避免反复冻融；

5)可根据标本的实际情况，做适当倍数稀释。

注意事项：

1)试剂盒使用前请保存在2-8℃；

2)阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗体积小，运输中颠簸和可能的倒置会使液体沾到管壁或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000rpm离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底；

3)从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后再配制洗涤液；

4)不同批号的试剂盒组份不能混用(洗涤液和反应终止液除外)；

5)充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻晃动酶标板，使加入孔中的反应液混匀；

6)酶免试验中阳性对照血清、阴性对照血清和样本检测时建议作复孔。

检测前准备工作：

1)提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温；

2)将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:20)，未用完的放回4℃冰箱；

3)阳性对照血清、阴性对照血清：根据需要进行稀释；

4)酶标二抗工作液：按当次试验所需用量，用试剂稀释液稀释酶标二抗(1:5000)配置成生物素化抗体工作液。使用前30分钟准备。仅供当日使用。

洗涤方法：

1)自动洗板机：要求注入的洗涤液为350μL，注入与吸出间隔20-30秒。洗板4次；

2)手工洗板：每孔加洗涤液350μL，静置30秒后甩尽孔内液体，在厚迭吸水纸上拍干，洗板5次。

操作步骤：

1)从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内封存于4℃；

2)留空白孔(若使用双波长读板，空白孔可以不设)；

3)提前准备好样本、阳性对照血清、阴性对照血清；

4)先将阳性对照血清、阴性对照血清分别加入相应孔中(100μL/孔)；在每个样本孔中加入50μL样本稀释液和50μL样本(此时样本已做了1:2倍稀释，计算结果时样本含量要乘以2)，用封板胶纸封住反应孔；

5)37℃孵育1h。最好使用微量振荡器(最低频率，100rpm)；

6)提前15分钟制备酶标二抗工作液，室温避光放置；

7)洗板5次；

8)除空白孔外，加入酶标二抗工作液(100μL/孔)。用封板胶纸封住反应孔；

9)37℃孵育30min。最好使用微量振荡器(最低频率，100rpm)；

10)洗板5次；

11)加入显色底物(包括空白孔)100μL/孔，37℃避光孵育15分钟；

12)加入终止液(包括空白孔)100μL/孔，混匀后即刻测量OD₄₅₀值(10分钟内)。

结果判断：

样本的OD₄₅₀≧阴阳临界值0.3，可以在99.9％的水平上判定为阳性。

对比例1：

对重组蛋白进行分离纯化时，结合缓冲液中未加入硫酸葡聚糖钠盐，其余部分和实施例1完全一致。

对比例2：

对重组蛋白进行分离纯化时，结合缓冲液中未加入熊果苷，其余部分和实施例1完全一致。

对比例3：

对重组蛋白进行分离纯化时，结合缓冲液中未加入硫酸葡聚糖钠盐和熊果苷，其余部分和实施例1完全一致。

对比例4：

重组蛋白的分离纯化：向收集的上清中加入Ni-NTA His·Bind树脂，再加入结合缓冲液(0.1M NaH₄PO₄，0.01M Tris-Cl pH8.0)将其轻轻混匀，混悬30-40min，用250μL漂洗缓冲液(0.1M NaH₄PO₄，0.01M Tris-Cl pH6.3)洗去杂蛋白，用25μL洗脱缓冲液(0.1MNaH₄PO₄，0.01M Tris-Cl pH4.5)洗下目的蛋白，离心收集上清。

对比例5：

抗原包被板条的制备过程中未加入2,3-二巯基丙磺酸钠，其余部分和实施例1完全一致。

对比例6：

抗原包被板条的制备过程中未加入二丙二乙酸钠，其余部分和实施例1完全一致。

对比例7：

抗原包被板条的制备过程中未加入2,3-二巯基丙磺酸钠和二丙二乙酸钠，其余部分和实施例1完全一致。

对比例8：

抗原包被板条的制备过程中未加入2,3-二巯基丙磺酸钠和二丙二乙酸钠，其余部分和对比例4完全一致。

试验例1：

重组蛋白纯度的检测：将纯化后的重组蛋白使用SDS-PAGE电泳进行检测。

重组蛋白浓度的检测：用Thermo公司的BCA蛋白浓度试剂盒对纯化后的蛋白进行浓度检测，按照说明书步骤进行。纯化后重组蛋白的SDS-PAGE电泳图见图1。纯化后重组蛋白浓度的测定结果见图2。

由图1可以看出，实施例1和对比例4均出现单一明显的条带，且分子量约为15kDa，与预期结果相符，而对比例1、对比例2、对比例3均出现许多杂带；由图2可以看出，实施例1中重组蛋白的浓度明显高于对比例4，这说明，纯化重组蛋白时在结合缓冲液中加入硫酸葡聚糖钠盐，熊果苷，能够有效防止杂蛋白与树脂结合、与目的蛋白之间形成二硫键，防止杂蛋白与目的蛋白共纯化，可以省去蛋白洗涤的步骤，提高纯化后重组蛋白浓度。

试验例2：

重组蛋白的抗原性鉴定

Western-blot检测：将纯化的重组蛋白电转印至硝酸纤维素膜上，电转条件为18V电压30min，转印后的硝酸纤维素膜放入含50g/L脱脂奶粉的PBS封闭液中4℃封闭过夜。将封闭好的硝酸纤维素膜放入经PBS 1：100倍稀释的牛水泡性口炎病毒的抗体中，室温作用1h，用PBST洗涤3次，再与经PBS 1：2000倍稀释的HRP标记羊抗牛IgG室温作用1h，用PBST洗涤3次，TMB显色试剂盒显色，扫描记录。Western-blot检测结果见图3。

由图3可以看出，实施例1和对比例4中纯化后的重组蛋白能够牛水泡性口炎病毒的抗体发生特异性反应，而对比例1、对比例2、对比例3均出现非特异性反应，且实施例1的条带比对比例4更深，这说明，纯化重组蛋白时在结合缓冲液中加入硫酸葡聚糖钠盐，熊果苷，可以省去树脂漂洗和杂蛋白洗脱的步骤，提高纯化后重组蛋白的浓度，提高纯化后重组蛋白的抗原性。

试验例3：

抗原效价的测定：采用双方阵试验，取酶标板(8×12)，横排用包被液将纯化后的抗原(初始浓度为1.2mg/mL)按200、300、400、500、600、800倍稀释，每孔100μL，4℃下作用过夜，次日弃去包被液，经洗涤后每孔加入120μL封闭液，置37℃下温育2h，弃孔内封闭液，竖排前六行将制备好的阳性血清从10、20、40、80、160、320倍稀释，竖排后六行将制备好的阴性血清10、20、40、80、160、320倍稀释。取阳性血清孔中OD值接近1.00左右的血清浓度，相应的阴性血清OD值较低的的血清浓度为最佳稀释浓度，相应的抗原稀释度为抗原的使用效价。抗原稀释度的测定结果见图4。

由图4可以看出，实施例1的抗原稀释度为600倍，明显高于对比例4、对比例5、对比例6、对比例7、对比例8，对比例4明显高于对比例8，这说明，包被抗原时，向抗原中加入2,3-二巯基丙磺酸钠，二丙二乙酸钠，能够使重组VSV P_1-87蛋白内部的抗原决定簇发生暴露，有利于与血清中的特异性IgG抗体发生结合，提高亲和力，提高抗原效价。

特异性检测：阳性血清按1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200稀释后取50μL与20μg/mL稀释的重组蛋白混匀后，于37℃作用1h后，按ELISA试验测定其OD值，同时设阳性和阴性对照。抗原阻断曲线见图5。

由图5可以看出，实施例1的阻断作用明显大于对比例4、对比例5、对比例6、对比例7、对比例8，对比例4的阻断作用明显大于对比例8，对比例5、对比例6、对比例7的抗原阻断曲线重叠，这说明，包被抗原时，向抗原中加入2,3-二巯基丙磺酸钠，二丙二乙酸钠，能够使重组VSV P_1-87蛋白内部的抗原决定簇发生暴露，能够提高亲和力，提高抗原特异性。

试验例4：

临床检测：釆用市场上已获得生产许可的同类型试剂盒与本试剂盒进行比较，按试剂盒说明书以及操作方法对117份牛血清进行检测，计算该试剂盒的阳性符合率、阴性符合率及总符合率。符合率的测定结果见图6。

由图6可以看出，实施例1的阳性符合率、阴性符合率及总符合率菌明显高于对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6、对比例7、对比例8。对比例4均明显大于对比例8，这说明，包被抗原时，向抗原中加入2,3-二巯基丙磺酸钠，二丙二乙酸钠，能够提高抗原效价、提高抗原特异性，进而提高抗原试剂盒检出率，对比例7均明显大于对比例8，这说明，纯化重组蛋白时在结合缓冲液中加入硫酸葡聚糖钠盐，熊果苷，可以省去树脂漂洗和杂蛋白洗脱的步骤，能够提高纯化后重组蛋白的浓度，提高纯化后重组蛋白的抗原性，进而提高试剂盒检出率，且简化了操作步骤，降低了成本。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims

1.一种重组P_1-87蛋白的制备方法，所述P_1-87蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括以下步骤：

S1、P_1-87蛋白的原核表达系统的构建；

S2、重组蛋白的诱导表达，诱导表达的重组蛋白以包涵体形式存在；

S3、重组蛋白的分离纯化；

其中，所述步骤S1具体包括：

b、利用EcoRⅠ与XhoⅠ分别对目的片段、pET-30c(+)载体进行双酶切，然后将酶切后的目的片段和pET-30c(+)载体进行连接，转入E.coli BL21菌中，提取阳性质粒，得pETVSV-P_1-87；

c、将pETVSV-P_1-87转入E.coli BL21菌中，筛选阳性克隆，得P_1-87蛋白的原核表达系统；

所述步骤S3具体包括：

b、重组蛋白纯化：将步骤a中收集的上清加入镍离子柱，再加入结合缓冲液将其轻轻混匀，混悬30-40min，用洗脱缓冲液洗下目的蛋白，离心收集上清；所述结合缓冲液为0.1MNaH₄PO₄，0.2M熊果苷，质量分数3％的硫酸葡聚糖钠盐，0.01M Tris-Cl pH8.0；所述洗脱缓冲液为0.1M NaH₄PO₄，0.01M Tris-Cl pH4.5；

c、重组蛋白的复性：用100mM EDTA煮透析袋8-10min，将将步骤b中收集的上清装入透析袋，4℃下在PBS液中透析2-3d，期间换液2-3次。