CN113717292A - 一种针对鸡坏死性肠炎的融合蛋白疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种针对鸡坏死性肠炎的融合蛋白疫苗及其制备方法，该融合蛋白疫苗是将产气荚膜梭菌NetB毒素、α毒素的C末端以及C端截断的Tpel毒素通过接头片段“A(EAAAK)4A”进行串联，并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达纯化。将融合蛋白与蜂胶佐剂等体积混合免疫肉雏鸡，结果显示可以诱导机体产生较高的抗体水平，并且可以显著抵抗G型产气荚膜梭菌的感染。该融合蛋白疫苗既可以保持三种毒素蛋白的空间结构和免疫原性，又可以避免传统疫苗的繁琐工艺和生物安全问题，易于实现工业化生产，具有制备成本低，安全性高、效力优良的优点，能较好的预防临床上鸡坏死性肠炎的发生。

Description

一种针对鸡坏死性肠炎的融合蛋白疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术和生物制品领域，具体涉及一种针对鸡坏死性肠炎的融合蛋白疫苗及其制备方法。
背景技术
鸡坏死性肠炎(Necrotic Enteritis，NE)是家禽的一种常见细菌病，由鸡胃肠道中致病性的产气荚膜梭菌大量增殖引起的，对全球的养禽业都具有重大的经济意义。主要以临床和亚临床的形式表现：临床形式导致肉鸡群的死亡率增加，连续几天每天约有1％的损失。亚临床形式引起慢性肠粘膜损伤导致消化不佳、体重增加减少、饲料转化率受损。目前，该病在肉鸡、蛋鸡、火鸡和鹌鹑等多种禽类中都有发现，以集中在空肠和回肠的出血、溃疡、坏死为主要特征，病变的严重程度不同，从轻度的粘膜增厚、多灶性溃疡到重度的形成黄绿色假膜覆盖。传统的控制手段是在饲料中添加抗生素，但如今，全球各国相继宣布禁抗令，将引起坏死性肠炎疾病再次复发。
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens，C.perfringens)是G+、厌氧杆菌，是位于人和动物胃肠道中的良性共生生物，也能长久生存于自然环境中。但某些条件引起肠道环境变化时会导致产气荚膜梭菌种群过度增殖，分泌多种毒素继而导致各类疾病发生。最新的分类系统根据产生的主要毒素α、β、ε、ι、CPE和NetB将该菌分为七种毒素型，分别为A～G型。其中，A(产生α毒素)、C(产生α、β毒素)、G型(产生α、NetB毒素)已被证明是临床鸡坏死性肠炎发生的主要类型。在临床鸡坏死性肠炎病例中，产气荚膜梭菌cpa、netB、tpeL毒素基因的检出率较高，尤其是cpa、netB编码的α和NetB毒素被认为是鸡坏死性肠炎发病机制中的关键毒力因子，通过与肠道细胞结合进而破坏肉鸡肠道黏膜结构，导致肠道吸收营养的能力降低。而TpeL毒素的存在可以增强含netB基因的菌株毒力，加重病变程度和范围，给家禽产业造成严重损失。
疫苗是控制肉鸡场产气荚膜梭菌感染的潜在方法之一，但目前临床上尚无有效的商品化疫苗可用。利用基因工程手段构建能同时表达两种或两种以上病原体抗原的嵌合疫苗是一类新概念疫苗。三个毒素蛋白分子量大，较难直接融合在一起，或者融合后因为蛋白分子量过大表达上存在困难，但是融合各毒素蛋白的免疫原性结构域可以很好的解决这一难题。Katalani(Katalani C,Nematzadeh G,Ahmadian G,Amani J,Kiani G,Ehsani P.Insilico design and in vitro analysis of arecombinant trivalent fusion proteincandidate vaccine targeting virulence factor of Clostridium perfringens.Int JBiol Macromol.2020,146:1015-1023；Katalani C,Ahmadian G,Nematzadeh G,Amani J,Ehsani P,Razmyar J,Kiani G.Immunization with oral and parenteral subunitchimeric vaccine candidate confers protection against Necrotic Enteritis inchickens.Vaccine.2020,38(46):7284-7291)设计由NetB、α和金属肽酶免疫原性结构域组成的三价嵌合蛋白NAM并在鸡模型中证实可以减少鸡坏死性肠炎发生率。
目前，针对鸡坏死性肠炎的研究较多，但是由于该病发病机制比较复杂，靠传统的单一类毒素疫苗治疗不能起到有效的保护作用，需多种免疫原性成分联合共同保护肉鸡抵抗坏死性肠炎。此外，也进行多种产气荚膜梭菌蛋白质单独或联合作为疫苗加以评估，显示这些蛋白对预防鸡坏死性肠炎仅提供部分保护作用。这些蛋白对坏死性肠炎的致病机理尚不明确，对引起坏死性肠炎的菌株无特异性。基于这些原因，已经明确鉴定能引起或加重鸡坏死性肠炎的毒素可以考虑作为疫苗候选物。因此，根据已知的产气荚膜梭菌NetB毒素、α毒素的C末端以及C端截断的Tpel毒素均可作为疫苗抗原，本申请将这3种毒素的免疫原性结构域融合表达，制备可以同时表达多种毒素的融合蛋白并验证其免疫保护效果。
发明内容
本发明的目的是突破现有的针对鸡坏死性肠炎缺乏有效疫苗的不足，通过基因工程技术制备一种针对产气荚膜梭菌NetB、α、Tpel毒素的融合蛋白疫苗。该融合蛋白疫苗需要既能保持三种毒素蛋白的空间结构和免疫原性，又能避免传统疫苗的繁琐工艺和生物安全问题。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
针对鸡坏死性肠炎的融合蛋白，由NetB毒素、α毒素的C末端以及C端截断的Tpel毒素氨基酸通过接头肽“A(EAAAK)4A”按照顺序依次串联，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，该融合蛋白的编码基因如SEQ ID NO.8所示。
通过在宿主中表达编码基因制备针对鸡坏死性肠炎的融合蛋白，在本发明的具体实施例中，将融合蛋白的编码基因在大肠杆菌中表达，根据表达受体的密码子偏好性进行密码子优化，将优化后的序列(SEQ NO.9)插入到原核表达载体pET-28a(+)Nde I和BamH I位点，转化导入受体E.coli DH5α，获得重组质粒并导入E.coli BL21(DE3)，在IPTG诱导下表达融合蛋白，其中融合蛋白大部分以不溶性的包涵体形式存在，少数以可溶性形式存在。上述融合蛋白携带6个组氨酸标签，便于蛋白纯化，以包涵体形式表达的融合蛋白NAT经过变性、氧化还原法复性，即可成功获得高复性率、有生物活性的复性蛋白，同时以可溶性形式表达的蛋白经过镍柱纯化后，获得纯度较高的融合蛋白。
将上述融合蛋白与蜂胶佐剂按照体积比1：1混合后免疫动物，可以使动物产生较高的血清抗体水平，并且可以抵抗产气荚膜梭菌的攻击。因此，本发明公开的融合蛋白通过阻断毒素与细胞的结合来降低毒素对肠道的损伤作用有效减轻鸡坏死性肠炎的发病程度，可用于制备针对鸡坏死性肠炎的融合蛋白疫苗。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明公开了一种针对鸡坏死性肠炎的融合蛋白疫苗的制备方法，该融合蛋白将三种毒素蛋白的免疫原性部分通过接头Linker串联融合，同时保持三种毒素蛋白各自的空间结构和免疫原性，避免了三种毒素多次表达或者毒素融合后分子量大难以表达的问题。此外，该蛋白适用于原核表达系统，蛋白以包涵体的形式稳定且高产量的表达，避免了传统疫苗在制备免疫原中的繁琐工艺和生物安全问题，降低了生产成本，易于实现工业化生产。该融合蛋白应用到动物模型上，刺激机体产生体液免疫，能较好的预防临床上鸡坏死性肠炎的发生，这使得应用其制备的疫苗成本低同时免疫效果好。
附图说明
图1是含有NetB、α、Tpel毒素基因的质粒构建示意图。
图2是融合毒素NAT基因PCR扩增的电泳图，其中M：DNA Marker DL2000，1～2：融合基因NAT扩增结果，－：阴性对照。
图3是重组质粒pET-NAT的PCR、双酶切电泳图谱及测序结果。图a为重组质粒pET-NAT用片段引物扩增的电泳图，图b为载体通用引物扩增的电泳图，图c为重组质粒pET-NAT双酶切的电泳图，图d为重组质粒测序后BLAST对比结果；其中图a和b中1～5：阳性转化子PCR鉴定结果，－：阴性对照，图c中1:重组质粒pET-NAT酶切前，2：重组质粒pET-NAT酶切后。
图4是融合蛋白NAT表达的SDS-PAGE和Western-blot图谱。图a为pET-NAT表达形式的SDS-PAGE图谱，从左至右分别为M：低分子质量蛋白质标准，空载体pET-28a(+)诱导前，空载体pET-28a(+)诱导后，pET-NAT诱导前，pET-NAT诱导后全菌蛋白液体，pET-NAT含蛋白上清，pET-NAT含蛋白沉淀；图b为pET-NAT表达形式的Western blot图谱，从左至右分别为M：低分子质量蛋白质标准，空载体pET-28a(+)诱导后，pET-NAT诱导前，pET-NAT诱导后全菌蛋白液体，pET-NAT含蛋白上清，pET-NAT含蛋白沉淀。
图5是可溶性的融合蛋白NAT纯化后的SDS-PAGE图谱，从左至右分别为M：低分子质量蛋白质标准，流穿液，洗涤液，洗脱液1，洗脱液2，超滤浓缩蛋白。
图6是包涵体形式的融合蛋白NAT复性后的SDS-PAGE图谱，从左至右分别为M：低分子质量蛋白质标准，变性，复性，透析，包埋，超滤。
图7是单独佐剂或NAT免疫的肉鸡随后经口服灌胃产气荚膜梭菌CP-7激发的鸡坏死性肠炎损伤病变评分。
图8是单独佐剂或NAT免疫的肉鸡针对NAT的血清IgY抗体反应。
具体实施方式
材料说明：G型产气荚膜梭菌CP-7由华中农业大学病理实验室保存；E.coli DH5α感受态购自于宝生物；E.coli BL21(DE3)表达感受态购自于全式金。
实施例1融合蛋白NAT的制备
1、融合基因NAT的合成
本发明设计了1种融合基因，选取Tpel毒素C端截短的片段以及NetB和ɑ毒素C端免疫原性区域的氨基酸序列，具体如SEQ NO.3、SEQ NO.1、SEQ NO.2所示，其对应的编码基因如SEQ NO.7、SEQ NO.5、SEQ NO.6所示。同时设计了一个不影响3种毒素蛋白各自结构和生物活性的接头片段“A(EAAAK)4A”串联，氨基酸序列如SEQ NO.4所示，融合蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。根据大肠杆菌密码子偏好性，将融合蛋白基因序列NetB-ɑ-Tpel(简称为NAT)进行密码子优化，优化后的基因序列如SEQ NO.9所示，于生工生物工程(上海)股份有限公司合成。pET-NAT的构建图谱如图1所示。
2、引物设计与合成
根据合成的融合片段序列NAT和p ET-28a(+)质粒上的酶切位点信息设计引物。
NAT-F：GGAATTC CATATG AGCATCGGCTACTCTATCGGC
NAT-R：CG GAATTC TTATTTGTATTCGCTGTTGTTG
引物由上海生物工程股份有限合成，在正反向引物上5’端分别添加Nde I和EcoRI限制性内切酶位点，下划线标记酶切位点。
3、目的基因扩增
以合成的NAT融合片段为模板，用设计好的引物按以下反应体系进行PCR扩增：
反应体系：2×Phanta Max Buffer 25μL；dNTP Mix 1μL；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymetase 1μL；模板1μL；上、下游引物各1μL；ddH2O20μL；总体积50μL。
反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，共35次循环；最后，72℃延伸7min，4℃保存。
1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，100V电泳约30min，凝胶成像系统分析电泳结果并拍照保存。NAT扩增的电泳结果如图2所示。
4、目的片段与p ET-28a(+)载体连接、转化
将成功扩增的PCR产物电泳后进行胶回收，用限制性内切酶Nde I和EcoR I对NAT胶回收产物和p ET-28a(+)载体同时进行双酶切，37℃温浴2.5h，回收酶切后的目的产物和载体大片段；将回收的目的片段和与载体大片段连接，连接反应：酶切后p ET28a载体1μL；酶切后NAT片段4μL；10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL；T4 DNA 连接酶1μL；dd H2O 3μL；总体积10μL，16℃连接过夜。将连接产物利用热激法转化到E.coli DH5α感受态细胞中，在含Kan+抗性平板上37℃过夜培养。
5、阳性质粒的筛选及鉴定
从平板上挑取若干个形态、大小均匀的阳性克隆进行增菌，菌液分别用片段引物和载体通用引物PCR进行鉴定。将PCR鉴定为阳性的菌液按照OMEGA 公司质粒提取试剂盒说明书提取质粒。用限制性核酸内切酶Nde I和EcoR I进行双酶切鉴定。将PCR和双酶切鉴定正确的菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，最终测序无误的重组质粒命名为pET-NAT。PCR鉴定结果如图3a和3b所示，结果证明重组质粒pET-NAT用片段引物扩增在1476bp处出现目的条带，用载体通用引物扩增出1755bp的目的条带。重组质粒的双酶切鉴定结果如图3c所示，pET-NAT在5323bp和1476bp处出现载体条带和目的条带，证明重组质粒pET-NAT初步构建成功。重组质粒测序后经BLAST对比，同源性达到100％。
6、融合蛋白NAT表达形式分析和鉴定
重组质粒pET-NAT转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，在含Kan+的LB固体培养基上过夜培养，挑取形态大小均匀的单菌落进行过夜培养，提取质粒将其命名为BL21-pET-NAT。将BL21-pET-NAT接种于含Kan+的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养3h，OD600达到0.6～0.8时，取1ml菌液作为诱导前样品。其余液体加入终浓度0.8mM的IPTG进行诱导，上述诱导表达为25℃继续培养8h。取1ml样品作为诱导后菌液。同时转化p ET-28a(+)空质粒作为阴性对照，收集诱导前、后的菌液作为空白对照，用于融合蛋白表达分析。
取诱导后菌液4℃高速离心20min，弃上清，菌体沉淀用Buffer A(pH8.0)缓冲液(Tris-base 50mM，EDTA 0.5mM，NaCl 50mM，甘油5％，DTT 5mM，DTT用时再添加)重悬，在低温条件下进行高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液体。裂解后全菌蛋白液体4℃、12 000r/min条件下离心20min，分别收集裂解后上清(命名为含蛋白上清液)及沉淀(命名为含蛋白沉淀)，向蛋白沉淀中加40μL PBS重悬。向含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入5×SDS-PAGE loading Buffer，充分混匀后煮沸10min，待样品冷却后，取适量样品进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定分析。将电泳的凝胶印于PVDF膜，转膜完成后，将PVDF膜置于5％脱脂奶中缓慢摇动封闭2h。封闭完毕的PVDF膜置于用TBST稀释的抗His的鼠源单抗中(1：7000稀释)，4℃进行孵育过夜；TBST清洗膜3次，每次10min。将洗后的PVDF膜置于用TBST稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(1：20000稀释)，37℃孵育1h，TBST清洗膜3次，最后用ECL曝光，进行Western blot鉴定。结果如图4a和4b所示，结果表明pET-NAT诱导后出现明显的蛋白条带，而诱导前及空载体p ET-28a(+)诱导前、后均未出现目的蛋白条带。pET-NAT诱导后的蛋白样在高压均质处理后，在含蛋白上清和含蛋白沉淀中均含有大小为55KDa的目的蛋白。其中，绝大多数的目的蛋白主要存在于蛋白沉淀中，只有少数存在于蛋白上清中。
7、融合蛋白NAT纯化和复性
将BL21-pET-NAT接种于含Kan+的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养3h，OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度0.8mM的IPTG进行诱导，上述诱导表达为25℃继续培养8h。取IPTG诱导表达8h的菌液，4℃，7000rpm，15min，收集菌体沉淀。沉淀用1/10体积BufferA缓冲液(Tris-base 50mM，EDTA0.5mM，NaCl 50mM，甘油5％，DTT 5mM，DTT用时再添加)重悬，低温条件下，800bar压力破碎5次至菌液由粘稠变得稍微澄清，同时显微镜镜检观察到无完整菌体。4℃，12000rpm，15min离心后分别收集上清(命名为含蛋白上清液)及沉淀(命名为含蛋白沉淀)。
将含蛋白上清液用0.22μm滤膜过滤后上样至预先用上样缓冲液(NaH2PO450mM，Nacl 300mM，咪唑10mM，溶剂是水，pH8.0的溶液)平衡的镍柱。用10倍柱体积的洗涤缓冲液(NaH2PO4 50mM，NaCl 300mM，咪唑40mM，溶剂是水，pH8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白。并用洗脱缓冲液(NaH2PO4 50mM，NaCl 300mM，咪唑200mM，溶剂是水，pH8.0的溶液)冲洗挂在镍柱上的目的蛋白，收集洗脱样品，并用超滤管进行超滤浓缩，该样品称为镍柱纯化的NAT蛋白。可溶性蛋白纯化过程中，目的蛋白部分从流穿液和洗涤液中流出，洗脱的目的蛋白中杂质较多，但相较于纯化前有明显少的杂带，洗脱的蛋白进一步通过超滤浓缩置换的方式去除蛋白样品中含有的大量咪唑。图5为含上清液蛋白纯化的SDS-PAGE图谱。
同时含蛋白沉淀依次用2.0mmL尿素、含1/1000TritonX-100的0.01mM PBS(pH7.4，TritonX-100用时现加)洗涤，4℃，12000rpm，15min离心，弃上清。沉淀用Buffer A重悬，用磁力搅拌器剧烈搅拌，边搅拌边依次加入100μL DTT、1.5mL 20％的SKL(十二烷基肌氨酸钠)贮存液，剧烈搅动30min至清亮，室温静置1～2h，4℃、12000rpm离心20min，取上清。上清用磁力搅拌器轻微搅拌，边搅拌边加入1.05mL 20％PEG4000至终浓度为0.2％，加50mM的氧化型谷胱甘肽2.1mL至终浓度为1mM，随后加100mM的还原型谷胱甘肽2.1mL至终浓度为2mM，使之充分混匀，4℃避光作用静置2h(也可4℃复性过夜)。复性蛋白液转至透析袋中，4℃透析2～3天，第一天每5h换一次透析液，后两天6h换一次。4℃、10000rpm离心15min，将上清液转移回透析袋，4℃条件下用蔗糖包埋浓缩，每30min将透析袋拿起冲洗看有无沉淀至蔗糖不再溶解，收集包埋后的样品，用超滤管进行超滤浓缩。浓缩后的样品称为复性后的NAT蛋白。表达在沉淀中的包涵体蛋白经变性、复性操作后，成功重折叠于溶液中，复性后的蛋白经包埋、超滤浓缩后获得。图6为含沉淀蛋白复性过程的SDS-PAGE图谱。
实施例2融合蛋白NAT的免疫效果评价
1、融合蛋白疫苗制备
将实施例1中纯化的可溶性蛋白和复性蛋白根据蛋白浓度用无菌PBS调整到所需量，用于免疫。将融合蛋白NAT溶液分别与蜂胶佐剂按1：1等体积混匀制备混悬液疫苗。
2、动物分组及免疫
取1日龄肉雏鸡40只，随机分为5组分别为高剂量复性蛋白组、可溶性蛋白组、佐剂组、攻毒组、未处理组。前三组分别在肉鸡12日龄、26日龄时胸部注射疫苗进行首次免疫和加强免疫，0.3ml/只，佐剂组和攻毒组肉鸡同剂量、同部位注射佐剂或PBS。接种后24h观察鸡只的精神、饮食和注射部位情况。实验期间自由采食和饮水，具体免疫方案如下表：
表1免疫动物分组
Figure BDA0003282408250000081
3、G型产气荚膜梭菌攻毒实验
在33日龄开始进行攻毒实验，攻毒期间无抗生素的饲料中添加鱼粉蛋白至含量达到33％，攻毒结束后改为正常喂养。除未处理组外，其余组口服灌胃4mL产气荚膜梭菌CP-7培养物(活菌含量约为5×108～1×109CFU/只)，1天2次，连续攻毒5天(33日龄～37日龄)。所述培养物在37℃条件下在液体硫乙醇酸盐(FTG)培养基中培养12～15小时。攻毒前、后于鸡只翅下静脉采血，分离血清，于-20℃保存，用于检测抗体。攻毒期间观察和记录肉鸡存活情况，并在攻毒后1天、3天每个处理组随机选择5只鸡，安乐死后，剖检观察各组小肠(从十二指肠到回肠部分)的病变情况。小肠病变指数按照0～4分评分系统(Dahiya J,Hoehler D,Wilkie D,Van Kessel A,Drew M.Dietary glycine concentration affects intestinalClostridium perfringens and lactobacilli populations in broilerchickens1.Poultry Science.2005,84(12):1875-1885)评分细则的病变指数标准进行评定，0分：无明显病变；0.5分：肠系膜及小肠壁严重充血；1分：肠壁变薄、变脆，出血点多于5个；2分：肠腔内有气体，肠壁出现大量出血点并伴随少量坏死或溃疡点；3分：肠壁出现区域性坏死、溃疡；4分：肠腔内有大量气体并出现弥漫性坏死。应用SPSS软件对数据进行分析处理。比较多组数据时采用one-way ANOVA中的多重比较法进行分析，以P<0.05表示差异显著(*)，具有统计学意义，P＜0.01为差异极显著(**)。结果如图7显示，相较于佐剂组(2.2)和攻毒组(1.7)，高剂量复性蛋白组和可溶性蛋白组均具有显著较低的坏死性肠炎分数(分别为0.3和0.75)，表明融合蛋白NAT对抵抗坏死性肠炎提供较好的保护作用。
4、血清中特异性IgY抗体的检测
采用间接ELISA检测免疫动物抗体水平，具体方法如下：
1)包被抗原：将实施案例1中复性的NAT蛋白用0.05M pH9.0的碳酸盐包被稀释至1μg/mL，每孔100μL加入酶标板中，将包被好的板子置于4℃过夜；
2)洗涤：弃掉反应液，并在吸水纸上拍干，加300μL PBST洗涤液，轻轻震荡，弃去后再次拍干，连续洗涤3次；
3)封闭：加入200μL含5％BSA的PBST溶液，在37℃温箱中孵育2h；
4)加入待检血清：用含3％BSA的PBST溶液将待检血清从第1孔的1:50开始倍比稀释至第12孔，每孔加入100μL，37℃条件下孵育1h，重复上述洗涤步骤；
5)酶标二抗：HRP标记的山羊抗鸡IgY二抗用PBST做1:15000稀释，每孔加入100μL，37℃条件下孵育1h，重复上述洗涤步骤；
6)底物显色液：每孔加入底物显色液TMB溶液50μL，室温下避光孵育15min；
7)终止反应：每孔加入50μL的2M H2SO4终止液进行终止；
8)读数：调节酶标仪波长450nm，将终止显色的ELISA板放入酶标仪中测定各孔吸光度值(OD)。
9)结果判定：临界值定义为PBS对照孔两倍的吸光度值，免疫血清的特异性抗体滴度以临界值处血清稀释度的log10表示。结果如图8所示，发现融合蛋白NAT作为诊断抗原建立的检测方法具有较高的特异性。分别检测高剂量复性蛋白组和可溶性蛋白组在攻毒前、后血清中的针对融合蛋白NAT的抗体水平，结果表明NAT融合毒素蛋白免疫组抗体效价显著高于未接种疫苗组，显示出较高的抗体滴度。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种针对鸡坏死性肠炎的融合蛋白疫苗及其制备方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Ile Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Asn Ile Ser Val Glu Gly Lys Thr
1 5 10 15
Ala Gly Ala Gly Ile Asn Ala Ser Tyr Asn Val Gln Asn Thr Ile Ser
20 25 30
Tyr Glu Gln Pro Asp Phe Arg Thr Ile Gln Arg Lys Asp Asp Ala Asn
35 40 45
Leu Ala Ser Trp Asp Ile Lys Phe Val Glu Thr Lys Asp Gly Tyr Asn
50 55 60
Ile Asp Ser Tyr His Ala Ile Tyr Gly Asn Gln Leu Phe Met Lys Ser
65 70 75 80
Arg Leu Tyr Asn Asn Gly Asp Lys Asn Phe Thr Asp Asp Arg Asp Leu
85 90 95
Ser Thr Leu Ile Ser Gly Gly Phe Ser Pro Asn Met Ala Leu Ala Leu
100 105 110
Thr Ala Pro Lys Asn Ala Lys Glu Ser Val Ile Ile Val Glu Tyr Gln
115 120 125
Arg Phe Asp Asn Asp Tyr Ile Leu Asn Trp Glu Thr Thr Gln Trp Arg
130 135 140
Gly Thr Asn Lys Leu Ser Ser Thr Ser Glu Tyr Asn Glu Phe Met Phe
145 150 155 160
Lys Ile Asn Trp Gln Asp His Lys Ile Glu Tyr Tyr Leu
165 170
<210> 2
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val Lys Glu Leu Val Ala Tyr Ile
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr Asp Asp Tyr Met Tyr Phe
20 25 30
Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gln Glu Trp Glu Met Asp Asn
35 40 45
Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser Lys Asp Thr Tyr Thr Phe Lys
50 55 60
Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp Asp Ile Gln Asn Met Trp Ile
65 70 75 80
Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro Asp Ala Tyr Lys Pro Glu Asn
85 90 95
Ile Lys Ile Ile Ala Asn Gly Lys Val Val Val Asp Lys Asp Ile Asn
100 105 110
Glu Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn Ile Lys
115 120
<210> 3
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asn Gln Lys Ile Tyr Leu Lys Asn Asn Lys Thr Asn Ile His Phe Ser
1 5 10 15
Val Ser Ile Leu Asp Gly Val Asn Leu Met Val Glu Val Asp Phe Asn
20 25 30
Asn Lys Met Tyr His Leu Ser Leu Gln Gly Asn Glu Lys Thr Ile Cys
35 40 45
Asn Asn Met Asn Ile Ile Gln Asn Asn Ile Asn Lys Leu Phe Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Ile Lys Ser Ile Pro Tyr Phe Tyr Lys Asn Asn Gly Leu Glu
65 70 75 80
Asn Phe Ile Gly Val Phe Ser Ile Lys Asn Asn Glu Phe Ile Tyr Met
85 90 95
Leu Lys Asp Gly Asp Lys Asn Glu Ile Tyr Lys Tyr Lys Asp Asn Asn
100 105 110
Leu Val Cys Ser Phe Asn Leu Phe Asn Ile Ser Tyr Val Asp Ile Ile
115 120 125
Ser Asn Gly Asp Lys Asn Tyr Leu Lys Gly Ile Trp Asn Thr Ser Ile
130 135 140
Asn Asn Ser Glu Tyr Lys
145 150
<210> 4
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Ile Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Asn Ile Ser Val Glu Gly Lys Thr
1 5 10 15
Ala Gly Ala Gly Ile Asn Ala Ser Tyr Asn Val Gln Asn Thr Ile Ser
20 25 30
Tyr Glu Gln Pro Asp Phe Arg Thr Ile Gln Arg Lys Asp Asp Ala Asn
35 40 45
Leu Ala Ser Trp Asp Ile Lys Phe Val Glu Thr Lys Asp Gly Tyr Asn
50 55 60
Ile Asp Ser Tyr His Ala Ile Tyr Gly Asn Gln Leu Phe Met Lys Ser
65 70 75 80
Arg Leu Tyr Asn Asn Gly Asp Lys Asn Phe Thr Asp Asp Arg Asp Leu
85 90 95
Ser Thr Leu Ile Ser Gly Gly Phe Ser Pro Asn Met Ala Leu Ala Leu
100 105 110
Thr Ala Pro Lys Asn Ala Lys Glu Ser Val Ile Ile Val Glu Tyr Gln
115 120 125
Arg Phe Asp Asn Asp Tyr Ile Leu Asn Trp Glu Thr Thr Gln Trp Arg
130 135 140
Gly Thr Asn Lys Leu Ser Ser Thr Ser Glu Tyr Asn Glu Phe Met Phe
145 150 155 160
Lys Ile Asn Trp Gln Asp His Lys Ile Glu Tyr Tyr Leu Ala Glu Ala
165 170 175
Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
180 185 190
Ala Lys Ala Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val Lys Glu Leu Val
195 200 205
Ala Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr Asp Asp Tyr
210 215 220
Met Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gln Glu Trp Glu
225 230 235 240
Met Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser Lys Asp Thr Tyr
245 250 255
Thr Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp Asp Ile Gln Asn
260 265 270
Met Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro Asp Ala Tyr Lys
275 280 285
Pro Glu Asn Ile Lys Ile Ile Ala Asn Gly Lys Val Val Val Asp Lys
290 295 300
Asp Ile Asn Glu Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn Ile Lys Ala
305 310 315 320
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
325 330 335
Ala Ala Ala Lys Ala Asn Gln Lys Ile Tyr Leu Lys Asn Asn Lys Thr
340 345 350
Asn Ile His Phe Ser Val Ser Ile Leu Asp Gly Val Asn Leu Met Val
355 360 365
Glu Val Asp Phe Asn Asn Lys Met Tyr His Leu Ser Leu Gln Gly Asn
370 375 380
Glu Lys Thr Ile Cys Asn Asn Met Asn Ile Ile Gln Asn Asn Ile Asn
385 390 395 400
Lys Leu Phe Gly Ser Ser Ser Ile Lys Ser Ile Pro Tyr Phe Tyr Lys
405 410 415
Asn Asn Gly Leu Glu Asn Phe Ile Gly Val Phe Ser Ile Lys Asn Asn
420 425 430
Glu Phe Ile Tyr Met Leu Lys Asp Gly Asp Lys Asn Glu Ile Tyr Lys
435 440 445
Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Val Cys Ser Phe Asn Leu Phe Asn Ile Ser
450 455 460
Tyr Val Asp Ile Ile Ser Asn Gly Asp Lys Asn Tyr Leu Lys Gly Ile
465 470 475 480
Trp Asn Thr Ser Ile Asn Asn Ser Glu Tyr Lys
485 490
<210> 5
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcaattggtt attctatagg cggtaatata tctgttgaag gaaaaactgc tggtgctgga 60
ataaatgctt catataatgt ccaaaatact ataagctatg aacaacctga ttttagaaca 120
attcaaagaa aagatgatgc aaatttagca tcatgggata taaaatttgt tgagactaag 180
gacggttata atatagattc ttatcatgct atttatggaa atcaattatt catgaaatca 240
agattgtata ataatggtga taaaaatttc acagatgata gagatttatc aacattaatt 300
tctggtggat tttcacccaa tatggcttta gcattaacag cacctaaaaa tgctaaagaa 360
tctgtaataa tagttgaata tcaaagattt gataatgact atattttaaa ttgggaaact 420
actcaatggc gaggaacaaa caaactttcg tcaacaagtg aatataacga atttatgttt 480
aaaataaatt ggcaagatca taaaatagaa tattatctg 519
<210> 6
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aatgatccat cagttggaaa gaatgtaaaa gaactagtag cttacatatc aactagtggt 60
gagaaagatg ctggaacaga tgactacatg tattttggaa tcaaaacaaa ggatggaaaa 120
actcaagaat gggaaatgga caacccagga aatgatttta tgactggaag taaagacact 180
tatactttca aattaaaaga tgaaaatcta aaaattgatg atatacaaaa tatgtggatt 240
agaaaaagaa aatatacagc attcccagat gcttataagc cagaaaacat aaagataata 300
gcaaatggaa aagttgtagt ggacaaagat ataaatgagt ggatttcagg aaattcaact 360
tataatataa aa 372
<210> 7
<211> 450
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatcaaaaaa tatatttaaa aaataacaaa acaaatatac atttttctgt atctatttta 60
gatggagtga atttaatggt agaagtagat tttaataata aaatgtatca tttatcactt 120
caaggaaacg aaaaaacaat atgtaataat atgaatatta tacaaaataa cataaataaa 180
ttatttggat cttcaagtat aaaatcaata ccatatttct ataaaaataa tggattagaa 240
aattttattg gggtattttc aataaaaaat aatgaattta tttatatgtt aaaagatggt 300
gataaaaatg aaatatataa atataaagat aataatttag tatgtagttt taatttattt 360
aatatatctt atgtagatat aatttctaat ggagataaga attatttgaa aggaatttgg 420
aatacatcaa ttaataattc agaatataaa 450
<210> 8
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agcatcggct actctatcgg cggcaacatc agcgttgaag gcaaaaccgc gggcgcgggc 60
atcaacgcga gctacaacgt gcagaacacc atcagctacg aacagccgga tttccgcacc 120
atccagcgta aagacgacgc gaacctggcg agctgggaca tcaaattcgt tgaaaccaaa 180
gacggctaca acatcgatag ctaccacgcg atctacggta accagctgtt catgaaatca 240
cgcctgtaca acaacggcga taaaaacttc accgatgatc gtgacctgag caccctgatt 300
tccggtggtt tcagcccgaa catggcgctc gcgctgaccg cgccgaaaaa cgcgaaagaa 360
tccgttatca tcgttgaata ccagcgtttc gacaacgact acatcctgaa ctgggaaacc 420
acccagtggc gcggcaccaa caaactgagt tccacctcgg aatacaacga atttatgttc 480
aaaatcaact ggcaggacca caaaatcgaa tactacctgg cagaagctgc ggctaaagaa 540
gcggctgcga aagaagcggc agcaaaagaa gcggcggcta aagcgaacga tccgagcgtt 600
ggtaaaaacg tgaaagaact ggttgcgtac atcagcacct ccggtgaaaa agacgcgggc 660
accgacgatt acatgtactt cggtatcaaa actaaagacg gtaaaaccca ggaatgggaa 720
atggacaatc cgggcaacga tttcatgacc ggttccaaag atacctacac cttcaaactg 780
aaagacgaaa acctgaaaat cgatgatatc cagaacatgt ggatccgcaa acgtaaatac 840
accgcgttcc cggatgcgta taaaccggaa aacatcaaaa ttatcgcgaa cggcaaagtg 900
gttgtggaca aagatatcaa cgaatggatc agcggcaaca gcacctacaa catcaaagca 960
gaagcggctg cgaaagaagc ggcggcaaaa gaagcagctg ctaaagaagc tgctgccaaa 1020
gcgaaccaga aaatctacct gaaaaacaac aaaaccaaca tccatttcag cgtgtccatc 1080
ctggacggcg ttaacctgat ggttgaagtt gatttcaaca acaaaatgta ccacctgagc 1140
ctgcagggta acgaaaaaac catttgtaac aacatgaaca ttatccagaa caacatcaac 1200
aaactgttcg gctctagctc tatcaaatcc atcccgtact tctacaaaaa caacggcctg 1260
gaaaacttca ttggtgtgtt ctccatcaaa aacaacgaat ttatctacat gctgaaagat 1320
ggcgataaaa acgaaatcta caaatacaaa gacaacaacc tggtttgctc tttcaacctg 1380
ttcaacatca gctacgttga catcatctct aacggcgaca aaaactacct gaaaggcatc 1440
tggaacacct ctatcaacaa cagcgaatac aaataa 1476
<210> 9
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agcatcggct actctatcgg cggcaacatc agcgttgaag gcaaaaccgc gggcgcgggc 60
atcaacgcga gctacaacgt gcagaacacc atcagctacg aacagccgga tttccgcacc 120
atccagcgta aagacgacgc gaacctggcg agctgggaca tcaaattcgt tgaaaccaaa 180
gacggctaca acatcgatag ctaccacgcg atctacggta accagctgtt catgaaatca 240
cgcctgtaca acaacggcga taaaaacttc accgatgatc gtgacctgag caccctgatt 300
tccggtggtt tcagcccgaa catggcgctc gcgctgaccg cgccgaaaaa cgcgaaagaa 360
tccgttatca tcgttgaata ccagcgtttc gacaacgact acatcctgaa ctgggaaacc 420
acccagtggc gcggcaccaa caaactgagt tccacctcgg aatacaacga atttatgttc 480
aaaatcaact ggcaggacca caaaatcgaa tactacctgg cagaagctgc ggctaaagaa 540
gcggctgcga aagaagcggc agcaaaagaa gcggcggcta aagcgaacga tccgagcgtt 600
ggtaaaaacg tgaaagaact ggttgcgtac atcagcacct ccggtgaaaa agacgcgggc 660
accgacgatt acatgtactt cggtatcaaa actaaagacg gtaaaaccca ggaatgggaa 720
atggacaatc cgggcaacga tttcatgacc ggttccaaag atacctacac cttcaaactg 780
aaagacgaaa acctgaaaat cgatgatatc cagaacatgt ggatccgcaa acgtaaatac 840
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gaagcggctg cgaaagaagc ggcggcaaaa gaagcagctg ctaaagaagc tgctgccaaa 1020
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ctgcagggta acgaaaaaac catttgtaac aacatgaaca ttatccagaa caacatcaac 1200
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ggcgataaaa acgaaatcta caaatacaaa gacaacaacc tggtttgctc tttcaacctg 1380
ttcaacatca gctacgttga catcatctct aacggcgaca aaaactacct gaaaggcatc 1440
tggaacacct ctatcaacaa cagcgaatac aaataa 1476

Claims (6)

1.融合蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述融合蛋白的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.生物材料，其特征在于，所述生物材料表达权利要求1所述融合蛋白或含有权利要求2所述的基因，包括载体或重组微生物。
4.权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括在宿主中表达编码融合蛋白的基因。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌，表达序列如SEQID NO.9所示。
6.针对鸡坏死性肠炎的融合蛋白疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的融合蛋白。
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