CN108359685B - 一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC具在亚单位疫苗和核酸疫苗中的应用，利用原核表达方法制备得到该重组蛋白，制备所述迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的步骤具体包括，pMD18‑T‑tolC载体的构建，重组表达载体体pET‑32a‑tolC的构建，迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的原核表达及验证，迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的验证，迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的可溶性分析及纯化；利用Western blot检测迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC，以及使用动物实验评估其免疫保护力。通过本发明公开的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC，为进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗靶点选择奠定基础。

Description

一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC。

背景技术

迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)感染在水产养殖中十分普遍，能够引起多种海水和淡水鱼类感染发病，尤其是在我国鲽、鲆、鳗等经济鱼类产区危害严重，造成十分重大的损失。该菌1962年首次由日本学者从患红点病鳗鲡体内分离，此后发现其能够感染包括鱼类、两栖类、爬行动物、鸟类和哺乳动物在内的多种类型宿主动物。更应引起重视的是，E.tarda可以感染人，病型复杂，严重可诱发致死性败血症，近年来通过食源途径感染病例急剧增多，揭示其重要的公共卫生学意义。

目前针对迟缓爱德华菌感染疫苗研究仍处于初步阶段，虽然目前已有获批生产的商用疫苗，但其多局限于鲆鱼使用，对其他鱼类效果未知。此外该菌疫苗的开发存在难以克服的问题，一方面灭活疫苗免疫效率低下，免疫效果差强人意；另一方面，基因工程减毒疫苗虽免疫效果优良，但安全问题不容忽视，因此，基于保护性抗原筛选研究的亚单位疫苗和活载体疫苗研究成为研究的热点。

其中，TolC是存在于革兰氏阴性菌细胞外膜上的通道蛋白与ArcA和ArcB形成三聚体形式，发挥质子泵功能，在细菌对抗不利环境过程中发挥关键作用。关于该蛋白，大多数研究聚焦于其具有的参与毒力、与细菌抗逆特性，而有研究表明沙门菌TolC是其保护性抗原，能够有效防护沙门菌对动物的侵袭，揭示了其潜在的应用价值，但关于其免疫保护效果的研究很少。

因此，对外膜通道蛋白TolC进行原核表达和纯化，并进一步利用动物实验评估该重组蛋白的免疫原性和免疫保护效果，为进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗靶点选择奠定基础是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC，利用原核表达系统对其表达和纯化，通过动物实验评估该迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的蛋白的免疫原性和体液免疫效果，为进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和活载体疫苗奠定基础。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC在亚单位疫苗和核酸疫苗中的应用。

进一步地，所述的一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的原核表达方法制备方法，具体步骤如下：

1)pMD18-T-tolC载体的构建

根据GenBank上发布E.tarda参考菌株ET-1基因组序列设计扩增tolC基因引物如下：

引物P1：5'-ATGAAGAAACTGCTCCCTC-3'；SEQ ID NO：1；

引物P2：5'-TACGCCGCCGCCGGGGATC-3'；SEQ ID NO：2；

以E.tarda基因组为模板PCR扩增tolC基因，将目的基因与pMD18-T载体连接构建pMD18-T-tolC，连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆菌落进行PCR检测，阳性菌落进行序列测定，并分析其同源性；

2)重组表达载体体pET-32a-tolC的构建

引物序列如下：

P3：5'-CGGGATCCGAAAACCTGATGCAGGTATATC-3'，带有BamHⅠ酶切位点；SEQ ID NO：3；

P4：5'-GCGTCGACTACGCCGCCGCCGGGGATC-3'，带有SalⅠ酶切位点；SEQ ID NO：4；

以所述pMD18-T-tolC为模板，P3、P4为引物扩增目的基因，利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ分别对回收片段与pET-32a载体分别进行双酶切，将所述目的基因和pET-32a载体片段回收，按照比例连接，构建重组表达载体pET-32a-tolC，将所述重组表达载体pET-32a-tolC转入感受态细胞中，挑取阳性克隆进行PCR验证，所述阳性克隆提取质粒进行双酶切验证和序列测定，确保无突变和移码；

3)迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的原核表达

将重组载体pET-32a-tolC和空载体分别转化到宿主菌中，挑取单菌落接种含有氨苄青霉素(50μg/L)的液体LB培养基中，37℃震摇培养至OD₆₀₀值为0.8-1.0，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导培养4h～6h；

4)迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的验证

所述迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的验证方法为Western blot检测；

5)迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的可溶性分析及纯化

将所述阳性克隆重组菌株按所述步骤3)的条件进行扩大培养；并利用超声破碎仪破碎菌体，离心分离沉淀、上清，将细菌裂解物、上清以及沉淀分别制备蛋白样品，利用SDS-PAGE分析所述迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC在上清和沉淀中的含量；所述迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC存在于沉淀中，以包涵体形式表达；

纯化所述迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC，并利用紫外分光光度计测定纯化蛋白浓度，将纯化后的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC分装，于-70℃保存。

进一步地，步骤2)中所述感受态细胞为DH5α。本发明在使用重组表达质粒pET-32a-pagC转化时，DH5a可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补，可用于筛选鉴别重组菌株。

进一步地，步骤2)中所述目的基因与所述pET-32a载体片段按照3-5:1的比例连接。其中目的基因与所述pET-32a载体片段按照3-5:1的比例连接，连接效率最高。

进一步地，步骤3)中所述宿主菌为BL21工程菌。

进一步地，步骤3)中所述液体LB培养基为含有氨苄青霉素的液体LB培养基，其中所述氨苄青霉素的浓度为25-50μg/mL。其中氨苄青霉素的浓度过高，细菌不长；浓度过低，难以实现对杂菌的抑制作用。

进一步地，所述Western blot检测步骤如下：

1)将权利要求1所述步骤3)中的菌悬液离心收集菌体，菌体沉淀后用PBS洗涤并重悬；

2)加入4×Loading Buffer，充分混匀后煮沸8-15min并离心，收集上清液即为蛋白样品；

3)利用SDS-PAGE分析蛋白表达，以His-Mab为一抗、山羊抗鼠HRP-IgG为二抗进行Western blot检测；其中所述一抗浓度为1:600～1000；所述二抗浓度为1:2000～5000。

进一步地，所述4×Loading Buffer的加入量为迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC体积的三分之一。

进一步地，所述迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC通过动物实验评估其免疫保护力；

所述动物实验评估方法为：在动物免疫前后，分别以眶下窦采取动物血液并分离血清，以纯化的所述迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC作为包被抗原，利用间接ELISA方法检测动物血清中抗体的效价，以阴性血清OD₄₅₀平均值加3倍标准差作为阴阳性判定标准。

本发明公开提供了一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC，至少有以下优点：

(1)本发明公开的原核表达重组迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC够被E.tarda阳性血清所识别，且在E.tarda自然感染过程中，该蛋白可诱导机体产生抗体，即本发明中原核表达的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC具有较好的免疫原性。

(2)迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC能够使机体产生较高水平特异性抗体，且在加强免疫后达到最高水平，本发明中的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC可在血清学诊断上进行应用。

(3)本发明公开的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC免疫小鼠后能够使95％的免疫小鼠得到保护，即本发明中的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC在E.tarda疫苗研究中具有广阔的前景，为进一步研制迟缓爱德华菌亚单位苗和活载体疫苗提供了参考。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的不同菌株tolC基因同源性分析；

图2附图为本发明提供的PCR扩增大肠杆菌tolC基因的琼脂糖凝胶电泳图；

其中，泳道M为Marker；泳道1为tolC基因；

图3附图为本发明提供的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE鉴定电泳图；

其中，泳道M为Marker；泳道1和泳道2为pET-32a-tolC/BL21；泳道3为pET-32a/BL21；

图4附图为本发明提供的鉴定迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC在大肠杆菌中表达的Western blot鉴定图；

其中，泳道1为pET-32a-tolC/BL21；泳道2为pET-32a/BL21；

图5附图为本发明提供的大肠杆菌表达His-TolC可溶性分析的SDS-PAGE电泳图；

其中，泳道M为Marker；泳道1为pET-32a-tolC/BL21；泳道2为细菌裂解产物的可溶性成分；泳道3为细菌裂解液的沉淀成分；

图6附图为本发明提供的His-TolC纯化效果的SDS-PAGE电泳图；

图7附图为本发明提供的Western blot分析阳性血清对His-TolC蛋白的识别图；

图8附图为本发明提供的His-TolC蛋白对小鼠的免疫保护效果图；

图9附图为本发明提供的免疫小鼠血清的抗体水平变化图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1pMD18-T-tolC载体的构建

根据GenBank上登录的E.tarda参考菌株ET-1基因组序列(CP001135.1)基因设计扩增tolC基因引物，引物如下：

引物P1：5'-ATGAAGAAACTGCTCCCTC-3'；SEQ ID NO：1；

引物P2：5'-TACGCCGCCGCCGGGGATC-3'；SEQ ID NO：2；

以E.tarda基因组为模板PCR扩增tolC基因，以质粒pMD18-T为载体，将目的基因与pMD18-T载体连接构建pMD18-T-tolC，将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆菌落进行PCR检测，将阳性菌落由生工生物公司进行序列测定并从GenBank上寻找E.tarda参考菌株及其它肠杆菌科细菌tolC基因序列，分析其同源性。结果如图1所示，爱德华菌属成员间tolC基因高度保守，但与大肠杆菌、沙门菌等其他肠杆菌科细菌同源性低。

实施例2重组表达载体体pET-32a-tolC的构建

TolC蛋白含有22个氨基酸残基的信号肽分子，可能影响蛋白的原核表达或产量，本研究设计引物去除TolC蛋白信号肽部分仅对其成熟体进行表达。

设计的引物序列如下：

P3：5'-CGGGATCCGAAAACCTGATGCAGGTATATC-3'，带有BamHⅠ酶切位点；SEQ ID NO：3；

P4：5'-GCGTCGACTACGCCGCCGCCGGGGATC-3'，带有SalⅠ酶切位点；SEQ ID NO：4；

以pMD18-T-tolC为模板，P3、P4为引物扩增目的基因即用于表达的tolC基因片段，tolC基因片段琼脂糖凝胶如图2，由图2可知，tolC基因的大小为1356bp。利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ分别对回收片段与pET-32a载体分别进行双酶切，将目的基因和pET-32a载体片段回收，按照3:1比例连接，构建重组表达载体pET-32a-tolC，将构建重组表达载体pET-32a-tolC转入DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆进行PCR验证，所述阳性克隆提取质粒，质粒经BamHⅠ和SalⅠ双酶切，回收的tolC基因片段，进行琼脂糖凝胶鉴定tolC基因，出现大小与PCR扩增结果一致的条带；同时质粒进行序列测定，确保无突变和移码。

实施例3迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的原核表达及验证

将重组载体pET-32a-tolC和空载体pET-32a分别转化BL21工程菌中，将阳性克隆接种含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，其中氨苄青霉素的浓度为50μg/mL，37℃震摇培养至OD₆₀₀值为1.0，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导培养5h，离心收集菌体，菌体沉淀PBS洗涤3次后，重悬，加入迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC体积三分之一的4×Loading Buffer，充分混匀后煮沸10min，离心，收集上清液即为蛋白样品；利用SDS-PAGE分析蛋白表达，结果如图3，结果显示，在68ku处诱导表达出目的蛋白。进一步用Western blot方法确认目的蛋白在大肠杆菌中的表达情况，其中以His标签单克隆抗体His-MAb为一抗，浓度为1:1000、以HRP标记山羊抗小鼠IgG即HRP-IgG为二抗，浓度为1:5000，Western blot的检测结果如图4，由图4可知，于68ku处出现目的条带，证明重组蛋白His-TolC能够表达。

实施例4迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的可溶性分析及纯化

将重组菌株按照实施例3中条件进行扩大培养，离心收集菌体；利用超声破碎仪破碎菌体，离心分离沉淀、上清，将细菌裂解物、上清以及沉淀分别制备蛋白样品，利用SDS-PAGE分析目的蛋白在上清和沉淀中的含量，结果如图5，图5表明重组蛋白主要存在于沉淀中，以包涵体形式表达。进一步纯化包涵体，获得较为纯净的重组蛋白，并利用SDS-PAGE分析纯化后的重组蛋白，结果如图6；同时利用紫外分光光度计测定纯化蛋白的浓度为0.94mg/mL，将纯化蛋白分装，于-70℃保存。

实施例5动物免疫试验

将40只健康昆明鼠随机分成两组，即迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC免疫组和阴性对照组，每组20只。迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC免疫组，每只昆明鼠注射50μg迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC(弗氏完全佐剂乳化)，背部皮下多点初次免疫昆明鼠，2周后和30d后分别使用上述方法加强免疫；同时，阴性对照组，每只昆明鼠注射等体积PBS(弗氏完全佐剂乳化)。在昆明鼠免疫前后，以眶下窦分别采取小鼠血液并分离血清，以纯化的重组TolC蛋白作为包被抗原，利用间接ELISA方法检测小鼠血清中抗体的效价，以阴性血清OD₄₅₀平均值加3倍标准差作为阴阳性判定标准，结果如图9。由如图9可知，迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC免疫小鼠能够产生较高水平特异性抗体，在加强免疫后达到最高水平。第48天后分别对两组昆明鼠腹腔接种5LD50(2.0×10⁷cfu)迟缓爱德华菌ET-13菌液，感染后观察4d，统计死亡数量，结果如图8，由如图8可知，迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC免疫小鼠后，具有较好的保护力，保护率为95％。

制备E.tarda感染小鼠阳性血清，利用Western blot方法检测迟缓爱德华菌外膜蛋白的免疫原性，结果如图6，由图6可知E.tarda感染小鼠阳性血清可以特异性识别迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC。

综上所述，本发明中的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC，能够被E.tarda阳性血清所识别，且在E.tarda自然感染过程中，该蛋白可诱导机体产生抗体，即本发明中原核表达的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC对E.tarda感染具有较好的免疫保护力，且在加强免疫后达到最高水平，能够使95％的免疫小鼠得到保护，本发明公开的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC在E.tarda疫苗研究中具有广阔的前景。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 河北科技师范学院

<120> 一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaagaaac tgctccctc 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacgccgccg ccggggatc 19

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggatccga aaacctgatg caggtatatc 30

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgtcgacta cgccgccgcc ggggatc 27

Claims (4)

1.具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC在制备亚单位疫苗中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

1)pMD18-T-tolC载体的构建

根据GenBank上发布E.tarda参考菌株ET-1基因组序列设计扩增tolC基因引物如下：

引物P1：5'-ATGAAGAAACTGCTCCCTC-3'；SEQ ID NO：1；

引物P2：5'-TACGCCGCCGCCGGGGATC-3'；SEQ ID NO：2；

以E .tarda基因组为模板PCR扩增tolC基因，将目的基因与pMD18-T载体连接构建pMD18-T-tolC，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取单克隆菌落进行PCR检测，阳性菌落进行序列测定，并分析其同源性；

2)重组表达载体pET-32a-tolC的构建

根据TolC蛋白特性，设计引物序列如下：

P3：5'-CGGGATCCGAAAACCTGATGCAGGTATATC-3'，带有BamH I酶切位点；SEQ ID NO：3；

P4：5'-GCGTCGACTACGCCGCCGCCGGGGATC-3'，带有Sal I酶切位点；SEQ ID NO：4；

以所述pMD18-T-tolC为模板，P3、P4为引物扩增目的基因，利用限制性内切酶EcoRI和SalI分别对目的基因与pET-32a载体进行双酶切，将目的基因和pET-32a载体片段回收，将所述目的基因与所述pET-32a载体片段按照3-5:1的比例连接，构建重组表达载体pET-32a-tolC，将所述重组表达载体pET-32a-tolC转入所述大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性克隆进行PCR验证，所述阳性克隆提取质粒进行双酶切验证和序列测定，确保无突变和移码；

3)迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的原核表达及验证

将重组载体pET-32a-tolC和空载体分别转化到宿主菌BL21工程菌中，挑取单菌落接种含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃震摇培养至OD₆₀₀值为0.8-1.0，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导培养4h～6h，得菌悬液；

所述液体LB培养基为含有氨苄青霉素的液体LB培养基，其中所述氨苄青霉素的浓度为25-50μg/mL；

4)迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的验证

所述迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的验证方法为Western blot检测；

5)迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC的可溶性分析及纯化

将所述阳性克隆重组菌株按所述步骤3)的条件进行扩大培养；并利用超声破碎仪破碎菌体，离心分离沉淀、上清，将细菌裂解物、上清以及沉淀分别制备蛋白样品，利用SDS-PAGE分析所述迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC在上清和沉淀中的含量；纯化迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC，并利用紫外分光光度计测定纯化蛋白浓度，将纯化迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC分装，于-70℃保存；

6）制备亚单位疫苗

将纯化迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC采用弗氏完全佐剂乳化，制备迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC亚单位疫苗。

2.根据权利要求1所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC在制备亚单位疫苗中的应用，其特征在于，所述Western blot检测步骤如下：

1)将步骤3)中的所述菌悬液离心收集菌体，菌体沉淀后用PBS洗涤并重悬；所述PBS洗涤不少于3次；

2)加入4×Loading Buffer，充分混匀后煮沸8-15min并离心，收集上清液即为蛋白样品；

3)利用SDS-PAGE分析蛋白表达，以His-Mab为一抗、山羊抗鼠HRP-IgG为二抗进行Western blot检测；其中所述一抗浓度为1:600～1000；所述二抗浓度为1:2000～5000。

3.根据权利要求2所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC在制备亚单位疫苗中的应用，其特征在于，所述4×Loading Buffer的加入量为迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC体积的三分之一。

4.根据权利要求1所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC在制备亚单位疫苗中的应用，其特征在于，所述迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC通过动物实验评估其免疫保护力；

所述动物实验评估方法为：在动物免疫前后，分别以眶下窦采取动物血液并分离血清，以纯化的所述迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC作为包被抗原，利用间接ELISA方法检测动物血清中抗体的效价，以阴性血清OD₄₅₀平均值加3倍标准差作为阴阳性判定标准。

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