ES2253358T3 - Mejoras en la visualizacion del ribosoma. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de obtención de un miembro de la pareja de unión específica (sbp) que se une a un miembro sbp complementario de interés, en donde dicho procedimiento comprende: (a) proporcionar moléculas de mRNA, cada una con una secuencia de nucleotídica que codifica un miembro de la pareja de unión específica y carece de un codón de parada en la misma pauta de lectura; (b) incubar las moléculas de mRNA en condiciones para la traducción ribosomal de moléculas de mRNA para proporcionar el miembro de la pareja de unión específica, a través del cual se forman los complejos que comprenden ribosomas, mRNA y el miembro de pareja de unión específica expresado en los ribosomas; (c) contactar los complejos con el miembro sbp complementario de interés, y seleccionar uno o más complejos que expresen el miembro de la pareja de unión específica capaz de unirse con el miembro sbp complementario o de interés en las condiciones de la selección; en donde las moléculas de mRNA se incuban con los ribosomas procariotas en un sistema de ribosomas procariotas o se incuban con ribosomas eucariotas en un sistema de expresión eucariota; el procedimiento se caracteriza porque las moléculas de mRNA comprenden además una secuencia para la encapsulación de las moléculas de mRNA en una cubierta viral, y el procedimiento comprende la proteína de cubierta viral que reconoce la secuencia para la encapsulación, con lo que se encapsulan los complejos de mRNA, el ribosoma y el miembro de unión específica expresado en la proteína de la cubierta viral.

Description

Mejoras de la visualización del ribosoma.

La presente invención se refiere a la expresión en ribosomas y se basa en diversos aspectos de diferentes mejoras realizadas por los presentes inventores, las cuales solas o en combinación proporcionan ciertas ventajas sobre las técnicas actuales.

La selección de ribosomas/polisomas implica la construcción de librerías de ácido nucleico, el cribado por hibridación y la identificación de las entidades de unión de interés. La librería se genera sintetizando un conjunto de DNAs de secuencias diversas que se transcriben a continuación para producir un conjunto de mRNAs. La traducción in vitro se utiliza para generar los polipéptidos codificados o las proteínas que se expresan en los ribosomas, y se seleccionan las interacciones de unión deseables utilizando un antígeno diana inmovilizado. El mRNA que codifica las entidades de unión puede recuperarse y utilizarse para producir un cDNA que a su vez puede amplificarse, y el proceso en general puede repetirse para enriquecer la población de genes que codifican dichas entidades de unión. Las proteínas seleccionadas se identifican posteriormente mediante clonaje individual de las secuencias codificantes y secuenciación del DNA.

La recuperación del mRNA de los complejos de polisomas se publicó por primera vez en 1973 en un artículo que describía un protocolo para capturar el mRNA que codificaba una cadena ligera de inmunoglobulina de ratón utilizando anticuerpos y oligotimidina inmovilizada (SchechPayvar y Schmike (Eru. J. Biochem. (1979) 101, 271-282), y de este modo obtuvieron los clones de cDNA de los antígenos HLA-DR de cadena pesada después de la inmunoprecipitación de los polisomas con un anticuerpo monoclonal (PNAS USA (1982) 79, 1844-1848). La producción de librerías de anticuerpos mediante expresión de ribosomas se propuso y patentó por Kawasaki (patentes americanas US 5.643.768 y U.S. 5.658.754).

Existen diversos ejemplos de la utilización de la expresión de ribosomas en sistemas eucarióticos o procarióticos. La primera demostración de selección de ligandos peptídicos que utilizó un extracto de E. coli se realizó por Mattheakis y col., (PNAS USA (1994) 91, 9022-9026 y Methods Enzymol (1996) 267, 195-207). Este grupo demostró la selección de ligandos peptídicos similares a epitopos peptídicos conocidos de un anticuerpo dado, utilizando el anticuerpo como un sustrato de selección. Los ligandos peptídicos de alta afinidad que se unen al antígeno específico de la próstata se han identificado utilizando una selección de polisomas procedentes de librerías peptídicas con un sistema de traducción de germen de trigo (Gersuk y col., (1997) Biotech y Biophys Res. Com. 232:578-582). La selección de los fragmentos de anticuerpos funcionales ha sido reportada mediante la utilización de un sistema de traducción de E. coli diseñado para aumentar el rendimiento de complejos ternarios y permitir la formación de enlaces disulfuro (Hanes y Pluckthum, PNAS USA (1997) 94, 4937-4942). Este diseño experimental se ha utilizado para seleccionar anticuerpos de una librería murina, demostrándose que la maduración por afinidad tenía lugar durante la selección debida al efecto combinado de los errores de la PCR y su selección. Se obtuvo un fragmento scFv con una constante de disociación de aproximadamente 10^{-11}M (Hanes y col., PNAS USA (1998), 95, 14130-50). También se ha demostrado el enriquecimiento en especificidad de los anticuerpos a partir de poblaciones mezcladas utilizando extractos de lisados de reticulocitos (He y Taussing (1997) NAR, 5132-5234).

La tecnología tal como se ha publicado en la bibliografía no se ha aplicado a la selección de anticuerpos que se unen a un antígeno diana directamente de una librería naïf. Hasta la fecha, las librerías creadas se han generado utilizando material de ratones inmunizados con un antígeno determinado y dichas librerías han formado la base de los procedimientos de selección por afinidad. Diversos factores pueden contribuir a la dificultad de generar anticuerpos directamente de librerías naïf. Estos incluyen los siguientes:

(1) La generación de polisomas utilizando una librería de expresión dará como resultado muchos ribosomas traduciendo el mismo mRNA, de los cuales sólo uno será capaz de traducir completamente todo el mensaje. Los ribosomas restantes traducirán parcialmente el mensaje y se paralizarán ya que no tendrá lugar la liberación del ribosoma del extremo del mensajero en este sistema. Ello puede resultar en la expresión de fragmentos polipeptídicos que posiblemente no sean capaces de formar estructuras secundarias y terciarias correctas. Estos fragmentos traducidos parcialmente pueden tener superficies hidrofóbicas expuestas y como resultado puede que estén enganchados inespecíficamente. La presencia de fragmentos polipeptídicos traducidos parcialmente en un sistema de selección resultaría en la selección inespecífica de fragmentos parcialmente traducidos, con lo que podría reducirse la eficiencia de los procesos de selección. Los presentes inventores han generado poblaciones de monosomas en lugar de polisomas, los cuales por definición impiden la generación de proteína traducida parcialmente. Un sólo ribosoma se recluta para una sola molécula de mRNA, de modo que se produce un solo polipéptido expresado de longitud completa por cada mRNA.

(2) Los polipéptidos que no pueden plegarse correctamente en el sistema de traducción in vitro, no son capaces de interactuar correctamente con su pareja de unión (p.ej., moléculas de anticuerpo que no son capaces de interactuar correctamente con el antígeno). Las proteínas se pliegan a través de estados intermedios que dejan expuestas superficies hidrofóbicas con una tendencia a la agregación. Además, las proteínas pueden plegarse mal por la formación de puentes disulfuro incorrectos. Se piensa que la formación de enlaces disulfuro intramoleculares puede ser una etapa limitante en el plegamiento de algunas proteínas. El proceso puede implicar reacciones de intercambio S-S en las que puentes S-S formados incorrectamente son reemplazados por enlaces S-S nativos. Se ha demostrado también que la formación de enlaces S-S correctos en proteína de nueva síntesis en lisados de reticulocitos de conejo depende de las cantidades relativas de tioles oxidados y reducidos (Kaderbhal y Austen, 1985, Eur. J. Biochem, 153, 167-178). La magnitud del apareamiento correcto S-S es dependiente de la cantidad de GSSG añadido en el inicio de la traducción y es también dependiente de las tasas de cambio de los niveles de tiol durante la fase de traducción. Los inventores han proporcionado una aproximación que puede utilizarse para lograr un aumento de los niveles de plegamiento correcto y en consecuencia de moléculas de anticuerpo activas (p.ej., scFv) en sistemas de expresión eucariotas, utilizando la proteína disulfuro isomerasa (PDI).

(3) Las librerías naive utilizadas como punto de partida para la selección de anticuerpos deberían ser altamente diversas e incorporar características varias que incluyen etiquetas de detección y secuencias de engarce para evitar estorbos estéricos entre el ribosoma y scFv y para permitir el plegamiento post-traduccional con eficiencia de scFv. Hasta la fecha, las librerías de anticuerpos generadas para utilizar en las selecciones de expresión de ribosomas se han producidas a partir de ratones inmunizados y se han clonadas en vectores de expresión de ribosomas diseñados específicamente (Hanes y col., PNAS USA 1998, 95:14130-50). Sin embargo, se ha demostrado que es posible la construcción y la expresión in vitro de una librería de anticuerpos presentada como una población de fragmentos de PCR, en lugar de clonarse en un vector de expresión de ribosomas (Makeyer y col., FEBS Letters 444 (1999) 177-180). Makeyev y col., describen la generación de un repertorio de scFv utilizando el ensamblamiento por PCR de segmentos del gen VH y VL con un fragmento engarce. La utilización de las técnicas de ensamblamiento por PCR para generar repertorios evita la necesidad de clonar y teóricamente permite la generación de librerías muy grandes.

La presente invención ha diseñado una nueva estrategia de ensamblamiento por PCR independiente del clonaje para generar librerías de expresión de ribosomas que contengan características para la transcripción y la traducción en el extremo 3' del fragmento, y además utilizan un casete de DNA para incorporar fragmentos de engarce en el extremo 5' de la construcción. Es posible generar librerías muy grandes que pueden generarse con una elección del casete de engarce adecuado para la librería determinada o la aplicación. Los fragmentos de engarce pueden ser estructurados o no estructurados, contienen secuencias de empaquetamiento o de replicación, o pueden utilizarse como la base para la generación de librerías de maduración por afinidad mediante extensión del engarce en el polipéptido a expresar. En este caso, se diseña un oligonucleótido mutagénico para amplificar el fragmento de engarce junto con la región del polipéptido (p.ej., VH CDR3 para una molécula scFV), la cual va a ser mutada por mutagénesis dirigida. El oligonucleótido de la mutagénesis debería abarcar la región de la mutación y también incorporar una región de anclaje cadena arriba de la región de mutagénesis para permitir el ensamblamiento eficiente por PCR de la construcción completa de polipéptido-engarce. Ejemplos de estrategias para utilizar el casete de engarce son las descritas en la Figura 1. Los presentes inventores han diseñado una nueva estrategia de mutagénesis que permite incorporar etapas de mutagénesis en un ciclo de selección de expresión ribosomal. El mRNA seleccionado puede someterse a la mutagénesis, antes de la RT-PCR, utilizando un cebador diseñado para la secuencia diana que codifica una región determinada del polipéptido o péptido (p.ej., CDR de una molécula de antibiótico). Después de las reacciones de ensamblamiento, los productos de PCR se pueden utilizar directamente en la próxima ronda de selección, permitiendo el aislamiento de moléculas de unión con capacidades de unión mejoradas en cada etapa. Esto se puede utilizar para mutagenizar todas las CDRs de una molécula de antibiótico (Figuras 7, 8 y 9 muestran las realizaciones de este aspecto de la presente invención).

(4) El RNA expresado en el sistema de expresión de ribosomas es lábil y propenso a la degradación. Se debe proporcionar, por ello, un entorno sin RNasas en todo momento del procedimiento de selección y trabajar preferentemente a 4ºC. También es un requerimiento que el antígeno sobre el cual se realiza la selección esté libre de contaminación por RNasas y esté altamente purificado. Estos requisitos limitan la aplicabilidad de la selección de la expresión de ribosomas.

Los presentes inventores han desarrollado un procedimiento para la encapsulación de RNA de expresión en ribosomas en una cubierta proteica que aumenta en gran manera la estabilidad del RNA en un intervalo de temperaturas, y lo convierte en resistente a la degradación por la RNasa.

En realizaciones preferidas, la proteína utilizada para la encapsulación es la proteína de la cubierta del virus del mosaico del tabaco (TMV), pero también se pueden utilizar proteínas de cubiertas virales, de plantas o animales.

Es posible utilizar otras proteínas de cubierta de plantas, animales o virus. Diversos virus de plantas de forma de bastón o baciliformes tienen la capacidad para autoensamblarse y estos sistemas pueden utilizarse para proporcionar reactivos de empaquetamiento para librerías de expresión de ribosomas (Hull y Davies (1983), Genetic engineering with plant viruses and their potential as vectors in Advances in Virus Research, (Lauffer y Maramorosch, eds.,) vol. 28, 1-33, Academic Press, Orlando, Fla). Dichos virus incluyen cualquier cepa viral positiva de RNA de planta o animal. Los virus de RNA de plantas incluyen, pero no se limitan a, miembros de las familias de Tobamovirus, Potexvirus, Potyvirus, Tobravirus, Cucumovirus o Comovirus. Los virus animales incluyen, aunque no se limitan a, los Tagviridae, Flaviridae, Picornaviridae y Cliviridae. También pueden utilizarse las proteínas de la cubierta derivadas de virus de DNA como el virus del mosaico de la coliflor para la encapsulación de DNA o RNA, al igual que las proteínas de la cubierta del bacteriófago lambda (revisado en Principles of Gene Manipulation, Tercera edición (1985), Old and Primrose, Blackwell, Oxford).

Las partículas de TMV nativas son extremadamente estables y retienen infectividad durante décadas. Aproximadamente unas 2100 copias de una proteína de cubierta de 17,6 KDa protegen completamente las 6,4 Kb de genoma de RNA de cadena sencilla contra la degradación. El TMV se utilizó en el autoensamblamiento espontáneo de la estructura biológica multimérica in vitro. El ensamblamiento de TMV se inicia por una interacción específica entre un agregado proteico prefabricado (20S) (el disco o la protohélice) y un origen de RNA estructurado como bucle-vástago de la secuencia de ensamblamiento (OAS), que está centrado 0,4 Kb o 0,9 Kb desde el extremo 3' del RNA genómico (Zimmer y Wilson, 1976, FEBS Lett 71, 294-298). Además del RNA de TMV nativo, la proteína de la cubierta de TMV también ha demostrado que empaqueta de forma eficiente ssRNAs quiméricos (Sleat y col., 1986, Virology, 155, 299-308) de forma independiente de la longitud y de la secuencia siempre que esté presente una región contigua del bucle 1 de la secuencia OAS (co-ordinados genómicos 5444-5518). Esto puede ocurrir in vitro, o in vivo en las plantas transgénicas del tabaco (Sleat y col., 1988, NAR 16, 3127-3140). Únicamente el ssRNA, no el ssDNA, puede empaquetarse por la proteína de cubierta. Se ha sugerido que la estabilidad excepcional de las partículas de tipo TMV frente a las proteasas y las RNasas puede aprovecharse para recuperar, almacenar y proteger las moléculas lábiles de mRNA con el fin de liberarlas en las células de plantas o animales para su consiguiente desensamblamiento co-traduccional (Gallie y col., Science, 236:1122-1124).

Los presentes inventores han demostrado que es posible generar librerías de expresión en ribosomas que contengan una OAS de empaquetamiento viral que puede encapsularse en la proteína de cubierta viral y proporcionar con ello un aumento de la estabilidad del RNA. El TMV se desensambla co-traduccionalmente in vivo (Wilson 1984, Virology, 137, 255-265) e in vitro. El RNA de expresión en ribosomas encapsulado también puede desensamblarse co-traduccionalmente. Se ha demostrado que la presencia de ribosomas translocándose en el RNA que contiene la OAS no inhibe completamente el empaquetamiento del RNA. Parece ser que la molécula de RNA se empaqueta en la dirección 3' a 5' a medida que el ribosoma progresa, pero eventualmente el proceso de empaquetamiento se puede bloquear por el ribosoma que avanza. La traducción completa del mRNA de expresión en ribosomas puede generar un complejo polipéptido-mRNA-ribosoma antes de iniciarse la reacción de empaquetamiento para producir un complejo encapsulado completamente.

Los inventores han incorporado adicionalmente en las construcciones y los procedimientos de expresión en ribosomas un molde de RNA conocido como RNA Midvariant (MDV), que permite la replicación por la Q\beta replicasa (Wu y col., PNAS, 1992, 89:11769-73). Ello permite la replicación exponencial de una librería de expresión en ribosomas in vivo. Para la replicación por Q\beta replicasa, el molde de RNA adopta una estructura secundaria para iniciar el reconocimiento y la replicación. Brown y col., Biochemistry, 1995, 34:45, 14765-74, han demostrado que existen dos sitios de unión de RNA en la Q\beta replicasa.

Linderskog y col., J. Virol. 1993 vol 67 nº 2, 1122-1126, y Weaver y col., J. Virol. 1990 vol 64, Nº6, 2642-2652, describen retrovirus con codones de terminación mutados. La reivindicación 25 de la presente invención hace referencia a una construcción de ácido nucleico de expresión en ribosomas que contiene como una de sus características reivindicadas que no codifica proteína de cubierta viral que reconozca la secuencia para la encapsulación del mRNA, dejando a parte dicho tema que accidentalmente se anticipó en los artículos anteriores, dicha reivindicación no hace referencia a la expresión en ribosomas.

Descripción resumida de las figuras

La Figura muestra un esquema de la generación de un repertorio de scFV naive ensamblados por PCR de acuerdo con una realización de la presente invención. Los cebadores PEU, Mycseq 10 e Hismyc Back son los descritos en el texto. En las realizaciones preferidas de la invención, el engarce es una secuencia poli-glicina-serina. En la construcción ensamblada, PEU es la unidad de expresión de proteínas que consiste en un promotor, una secuencia consenso y un sitio de unión al ribosoma.

La Figura 2 muestra una construcción de expresión en ribosomas de acuerdo con una realización de la presente invención:

La Figura 2A muestra las características clave: la unidad de expresión de proteínas (PEU) que consiste en el promotor T7, la secuencia consenso Kozak y el sitio de unión al ribosoma. Se incluyen diversos sitios de clonaje, tal como se muestra, y una secuencia que codifica un engarce.

La Figura 2B muestra la secuencia de la construcción de expresión en ribosomas de esta realización de la presente invención (dentro de un vector pCU). Los tripletes en negrita muestran las dianas de restricción para SfI, PstI y NotI. La región continua en negrita muestra la secuencia codificante del engarce. Las características clave de la construcción de esta realización de la presente invención son un promotor T7, un sitio de unión al ribosoma, la secuencia consenso Kozak, las dianas de clonaje SfiI/PstI/NotI, las etiquetas his y myc, la secuencia de engarce de gly-ser y la etiqueta HA.

La Figura 3 muestra el efecto del estado redox sobre la actividad de una molécula de anticuerpo (anti-TNF\alpha ScFv). Un intervalo de proporciones distintas de glutatión oxidado:reducido se añadió a las reacciones acopladas de un anti-TNF\alpha scFv y se analizó sobre TNF\alpha o BSA como control. 1= sólo tampón; 2= 10:1, oxidado:reducido; 3= 1:1, oxidado:reducido; 4= 1:10, oxidado:reducido; 5= sólo reducido.

La Figura 4 muestra el efecto de la concentración de PDI sobre la actividad anti-TNF\alpha scFv. Las reacciones acopladas se realizaron con el anticuerpo sobre TNF\alpha o BSA como control a diversas concentraciones de titulación de PDI (\mug/ml).

La Figura 5 muestra una construcción de expresión en ribosomas con la adición de TMV OAS (origen de la secuencia de ensamblamiento) para el empaquetamiento, de acuerdo con una realización de la presente invención.

La Figura 6 muestra una construcción de expresión en ribosomas con la adición de TMV OAS (origen de la secuencia de ensamblamiento) para el empaquetamiento, y las secuencias MDV como sustrato para la replicasa, de acuerdo con una realización de la presente invención.

La Figura 7 muestra un esquema de acuerdo con una realización de la presente invención para mutagénesis dirigida de una CDR de un dominio VL de una molécula de anticuerpo, integrada en un ciclo de selección de expresión en ribosomas.

La Figura 8 muestra un esquema de acuerdo con una realización de la presente invención que continúa con el esquema presentado en la Figura 7 y muestra la mutagénesis dirigida de CDRs adicionales, integradas en un ciclo de selección de expresión en ribosomas.

La Figura 9 muestra un esquema de acuerdo con una realización de la presente invención para mutagénesis sucesivas de CDRs de una molécula de anticuerpo en un ciclo de selección de expresión en ribosomas.

Procedimiento de acuerdo con la presente invención que es un procedimiento de obtención de un miembro de una pareja de unión específica (sbp) que se une a un miembro complementario de interés, y que comprende:

(a) proporcionar moléculas de mRNA, en donde cada una comprende una secuencia nucleotídica que codifica un miembro de una pareja de unión específica y carece de un codón de parada en la misma pauta de lectura;

(b) incubar las moléculas de mRNA en condiciones para la traducción por ribosomas de los mRNAs para producir el miembro de la pareja de unión específica, y en donde cada uno de los complejos formados comprenden un ribosoma, el mRNA y el miembro codificado de la pareja de unión específica expresado en el ribosoma;

(c) poner en contacto los complejos con el miembro sbp complementario de interés y seleccionar uno o más complejos que expresan un miembro de una pareja de unión específica capaz de unirse al miembro sbp complementario de interés en las condiciones de selección;

En donde, las moléculas de mRNA se incuban con ribosomas procariotas en un sistema de expresión en ribosomas procariotas o se incuban con ribosomas eucariotas en un sistema de expresión en ribosomas eucariotas;

Y el procedimiento se caracteriza porque las moléculas de mRNA comprenden además una secuencia para la encapsulación de moléculas de mRNA en una cubierta viral, y el procedimiento comprende el proporcionar la proteína de la cubierta viral que reconoce la secuencia para la encapsulación, y de este modo se permite la encapsulación en la proteína de cubierta viral del mRNA de los complejos de mRNA, ribosoma y miembro de unión específica expresado.

De acuerdo con diversas realizaciones, la presente invención proporciona la utilización de cualquiera o más de una de las siguientes características en un sistema de expresión en ribosomas para la selección de un miembro del par de unión específica (p.ej., molécula de anticuerpo) capaz de unirse con un miembro de la pareja de unión específica complementario (p.ej., un antígeno):

(i) secuencia de engarce glicina-serina, en un sistema eucariota o procariota;

(ii) proteína disulfuro-isomerasa (PDI), en un sistema eucariota;

(iii) proteína disulfuro-isomerasa (PDI) en combinación con glutatión oxidado y reducido a una proporción de entre 1:1 y 10:1, en un sistema eucariota o procariota;

(iv) adición de glutatión oxidado y reducido a una proporción de entre 1:1 y 10:1 al cabo de 30 minutos de traducción in vitro en un sistema eucariota o procariota;

(v) bloquear con heparina durante la selección, en un sistema procariota o eucariota, especialmente cuando se utiliza t-RNA de levaduras;

(vi) encapsular los complejos de miembro sbp/ribosoma en una cubierta viral, p.ej., cubierta de TMV, en combinación con la incorporación de un molde de RNA MDV, en un sistema procariota o eucariota;

(vii) utilizar un cebador mutagénico en la generación pore RT-PCR de una copia de DNA de la librería de expresión en ribosomas antes de una ronda adicional de selección, en un sistema eucariota o procariota.

Cualquiera de las realizaciones (i) a (vii) puede utilizarse en aspectos y realizaciones distintas de la presente invención.

El RNA de un complejo o complejos seleccionados puede aislarse y/o utilizarse para generar DNA, el cual a su vez puede utilizarse en la producción del miembro de la pareja de unión específica codificado y/o utilizarse en una ronda adicional de selección mediante la expresión en ribosomas (o menos preferentemente en este contexto la expresión de bacteriófagos).

Por lo general, se proporciona una librería, población o repertorio de secuencias de mRNA diversas que codifican una librería, población o repertorio de péptidos o polipéptidos diversos con el potencial para formar miembros de unión específica.

El sistema de traducción en ribosomas utilizado puede ser procariota o eucariota. Ambos se han utilizado satisfactoriamente en la materia para expresar y seleccionar diversas moléculas de unión distintas. Véase por ejemplo: Mattheakis y col., (1994) PNAS USA 91, 9022-9026; Mattheakis y col., (1996) Methods Enzymol 267, 195-207; Gersuk y col., (1997) Biotech and Biophys Res Com. 232, 578-582; Hanes y Pluckthum (1997) PNAS USA 94, 4937-4942; Hanes y col., (1998) PNAS USA 95, 14130-50; He y Taussig (1997) NAR 5132-5234.

Una construcción para la expresión de ribosomas puede comprender un promotor de RNA polimerasa (p.ej., promotor de T7 polimerasa), el sitio de unión de ribosomas, la secuencia consenso Kozak, el codón de inicio y la secuencia codificante del polipéptido, péptido o proteína. Una o más secuencias que codifican para una o más etiquetas de detección pueden incluirse para proporcionar un polipéptido, péptido o proteína que además comprende una o más etiquetas (p.ej., etiqueta de histidinas). En una construcción de acuerdo con la presente invención, pueden incorporarse una o más características que proporcionen una característica de acuerdo con la presente invención o cualquier combinación de lo mismo tal como se describe aquí.

Una construcción de DNA puede clonarse en cualquier plásmido adecuado o vector, pe.j., PUC.

De acuerdo con cualquier aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento en el cual se incluye una o más de las características (i) a (viii) anteriores (solas o en combinación con dos o más, p.ej., 3, 4, 5, 6, 7 u 8).

Por ello, en un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento que comprende las etapas (a), (b) y (c) tal como se indica, en donde cada molécula de mRNA comprende una secuencia nucleotídica que codifica un miembro de la pareja de unión y carece de un codón de parada en la pauta de lectura y comprende además una secuencia que codifica un engarce gly-ser para proporcionar una fusión del miembro de la pareja de unión específica y la secuencia de engarce expresados en la superficie de los ribosomas. El engarce puede proporcionarse en el extremo C-terminal del miembro de la pareja de unión específica. Un engarce poli-gly-ser para utilizar de acuerdo con la presente invención puede comprender o consistir en aproximadamente 24 unidades de glicina-serina (GS). 10-50 unidades de GS, 10-20, 20-30, 20-40, 22, 23, 24, 25, o 27 repeticiones GS. Otro engarce preferido comprende 1-12 unidades de glicina-serina. El engarce puede incluir uno o más aminoácidos o etiquetas adicionales en cualquiera o ambos extremos.

Los ejemplos experimentales incluidos más adelante demuestran que un engarce gly-ser puede utilizarse en la expresión en ribosomas. El número de anticuerpos específicos generados por la incorporación de un engarce GS puede ser superior en los experimentos que son idénticos excepto en la utilización de un engarce derivado del gen III.

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico (DNA o RNA) para la expresión de ribosomas que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un engarce de glicina-serina (generalmente poli-glicina-serina). Dicha construcción comprende generalmente características adicionales para la expresión en ribosomas.

En las realizaciones de la presente invención que utilizan otros aspectos en donde un engarce de glicina-serina no se utiliza, se puede utilizar un engarce estándar, p.ej., un dominio del gen III de un bacteriófago filamentoso (Hanes y Pluckthum, PNAS USA 1997, 94:4937-4942) o un dominio constante de cadena ligera kappa (He y col., Febs Letts, 1997, 450:105).

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento que comprende las etapas (a), (b) y (c) tal como se indica, en donde el sistema de traducción es eucariota y se utiliza la proteína disulfuro isomerasa (PDI) en las condiciones de incubación. PDI está disponible por Sigma y Pierce.

Los ejemplos experimentales incluidos más adelante, demuestran que la utilización de PDI aumenta la cantidad del miembro de unión específica correctamente plegado disponible para unirse con su molécula de unión complementaria, y que las condiciones cuando se incluyen en una selección modificada de expresión en ribosomas generan satisfactoriamente anticuerpos específicos contra el antígeno.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento que comprende las etapas (a), (b) y (c) tal como se indica, en donde la proteína isomerasa disulfuro (PDI) se utiliza en las condiciones de incubación, junto con el glutatión oxidado y reducido a una proporción de 1:1 y 10:1, en un sistema eucariota o procariota.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento que comprende las etapas (a), (b) y (c) tal como se indica, en donde el glutatión oxidado y reducido se añade después de completarse la traducción inicial, preferentemente al cabo de unos 30 minutos después del inicio de la traducción. Según los inventores, este hecho proporciona una mejora sobre la adición en el inicio de la traducción.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento que comprende las etapas (a), (b) y (c) tal como se indicó y además comprende la selección de complejos que contienen un miembro de unión específica capaz de unirse con el miembro de unión específica complementario de interés, mientras que se bloquea la selección inespecífica con heparina. El ejemplo 7 de más adelante muestra que al incluir la heparina como un agente bloqueante, especialmente junto con la utilización de t-RNA de levadura, da como resultado un aumento del nivel de recuperación del RNA.

La proteína de la cubierta viral y OAS pueden ser del TMV (Duram (1972). J. Mol. Biol., 67, 289-305; Goelet y col., (1982) PNAS USA 79, 5818-5822). También se pueden utilizar como proteínas de la cubierta viral las pertenecientes a las familias víricas siguientes: Tobamovirus, Potexvirus, Potyvirus, Tobravirus, Cucumovirus o Comovirus, Togaviridae, Flaviviridae, Picornaviridae y Caliviridae junto con sus secuencias de empaquetamiento. Las proteínas de la cubierta derivadas de los virus de DNA como el virus del mosaico de la coliflor también pueden utilizarse para encapsular el DNA o el RNA, al igual que las proteínas de la cubierta de los bacteriófagos.

La proteína de la cubierta viral puede proporcionarse antes de la traducción o co-traduccionalmente.

La incorporación de la OAS en la construcción de expresión de ribosomas permite que la proteína de la cubierta viral dirija la encapsulación de la construcción de RNA. La proteína de la cubierta se proporciona en una forma adecuada para iniciar la encapsulación. Esta forma es preferentemente una ``preparación de "disco", tal como se describe en Durahm (1972), J. Mol. Biol. 67, 289-305. Se ha demostrado en los ejemplos descritos más abajo que una OAS puede insertarse en la construcción en expresión de ribosomas y que el RNA derivado de esta construcción puede encapsularse en la proteína de la cubierta de TMV. El transcrito encapsulado puede traducirse in vitro para generar un scFv de tamaño adecuado, y de este modo el RNA empaquetado retiene la capacidad de ser traducido. La encapsulación de una sola especie de RNA foráneos (es decir, no TMV) se ha demostrado por Sleat y col., (1986), Virology 166, 209-308, aunque la encapsulación de poblaciones de RNA no se ha publicado en la literatura. Se ha demostrado que TMV se traduce mediante un proceso de empaquetamiento co-traduccional en el que el ribosoma de plantas quita la proteína de la cubierta viral mientras traduce el genoma viral (Wilson (1985) J. Gen. Virol. 66, 1201-1207). Este proceso de eliminación de la cubierta vírica también se ha demostrado en las partículas de "pseudovirus" de RNA foráneo producido en plantas (Plaskitt y col., (1998) Plant Microbe Interactions 1, 10-16), y es seguramente el mecanismo de traducción de las construcciones de expresión en ribosomas encapsuladas. La presencia de un ribosoma en el RNA que contenga una OAS no inhibe necesariamente la encapsulación de dicho RNA. Se ha demostrado en el sistema de expresión de una proteína de la cubierta de TMV de E. coli que la encapsulación del RNA puede tener lugar hasta alcanzar la misma posición del ribosoma, en cuyo punto se bloquea el ensamblamiento (Hwang y col., (1994) PNAS USA 91, 9067-71).

El ejemplo 4 demuestra el empaquetamiento satisfactorio del complejo de mRNA/ribosoma. Además, la adición de la proteína de la cubierta viral después de la traducción puede utilizarse para re-empaquetar el complejo mRNA/ribosoma/polipéptido y para proporcionar así más estabilidad.

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico (DNA o RNA) que comprende los siguientes elementos: el sitio de unión de la RNA polimerasa, la secuencia consenso Kozak, el sitio de unión de ribosomas, el codón de inicio, la secuencia codificante, la secuencia de engarce y la OAS. Pueden incluirse una o más características adicionales.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona una librería o población de moléculas de RNA, conteniendo cada una de estas moléculas de RNA en la librería o población una secuencia OAS viral y una secuencia que codifica un miembro de unión específica, péptido o polipéptido como por ejemplo una molécula de anticuerpo, en donde la librería o la población codifican colectivamente una población o repertorio de miembros de unión específica de secuencia diversa. En realizaciones preferidas se incluyen una o más características adicionales en las moléculas de RNA para la expresión en ribosomas.

Una librería o población de moléculas de RNA de acuerdo con la presente invención puede empaquetarse dentro de la cubierta viral, de modo que otro aspecto de la presente invención se proporciona una población de partículas víricas, que contienen una población de moléculas de RNA que codifican una población o repertorio de miembros de unión específica de secuencias diversas. Cada partícula viral en la población puede contener RNA que codifica un polipéptido o péptido de secuencia distinta.

Además de un origen de secuencia de ensamblamiento para la proteína de la cubierta viral, las moléculas de mRNA utilizadas en un procedimiento que comprende las etapas (a), (b) y (c) anteriores pueden además contener una secuencia MDV para la amplificación por la Q\beta replicasa. Ello permite la replicación de poblaciones de RNA seleccionadas sin la necesidad de realizar una etapa separada de RT-PCR.

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico (DNA o RNA) tal como se describe y comprende una secuencia MDV.

En otro aspecto de la invención, las moléculas de mRNA para la incubación en el sistema de traducción se proporcionan mediante reacciones de RT-PCR en las que al menos uno de los cebadores de la RT-PCR es un cebador mutagénico que codifica diversas secuencias distintas para la inclusión en una región definida de la región codificante del mRNA, p.ej., una región codificante de una CDR de una molécula de anticuerpo, preferentemente una CDR3 de un dominio VH de anticuerpo.

Las realizaciones de este aspecto de la invención se ilustran además en los Ejemplos 7 y 8, y en las Figuras 7,
8 y 9.

Otros aspectos de la presente invención proporcionan una librería, población o repertorio de moléculas de DNA o RNA con las características descritas para los aspectos concernientes con las construcciones de ácido nucleico, en donde la librería, la población, o el repertorio de moléculas de DNA o RNA comprenden las características para cada uno de estos aspectos y codifican colectivamente una población diversa de polipéptidos o péptidos distintos que pueden formar miembros de parejas de unión específica.

Otros aspectos proporcionan un sistema de expresión, como el sistema de expresión in vitro, p.ej., un lisado de reticulocitos de conejo o un sistema de bacterias, que comprenden una construcción de ácido nucleico o librería, población o repertorio de lo mismo, especialmente en las condiciones de cultivo para la traducción de un polipéptido o péptido a partir del ácido nucleico que lo codifica.

En las realizaciones preferidas, los miembros de unión específica para la expresión en los ribosomas son moléculas de anticuerpos, generalmente moléculas de anticuerpos de cadena sencilla, como las moléculas de anticuerpos scFv, VH, Fd (que consisten en los dominios VH y CH1), o moléculas de dAb. Los miembros de unión específica que no son anticuerpos para la expresión en otras realizaciones de la presente invención incluyen los receptores, las enzimas, los péptidos y los ligandos proteicos.

Después de la selección y la recuperación de ácido nucleico que codifica el miembro de unión específica expresado, el ácido nucleico puede utilizarse para proporcionar el miembro de unión específica codificado o puede utilizarse para proporcionar ácido nucleico adicional (p.ej., mediante la reacción de amplificación como la PCR). El ácido nucleico que codifica fragmentos del componente del miembro de la pareja de unión puede utilizarse para proporcionar moléculas de unión específicas, por ejemplo moléculas de anticuerpo reformado. Así, por ejemplo, el ácido nucleico que codifica los dominios VH y VL de una molécula de anticuerpo scFv seleccionada puede utilizarse en la construcción de secuencias que codifican moléculas de anticuerpo de otros formatos, como las moléculas Fab o el anticuerpo completo.

Además, el ácido nucleico puede someterse a cualquier técnica disponible en la materia para la alteración o la mutación de esta secuencia. Esto puede utilizarse para proporcionar una secuencia derivada. Puede proporcionarse una secuencia que codifique un derivado del miembro de unión específica seleccionado o un componente de lo mismo, por ejemplo, un derivado que comprenda una secuencia aminoacídica que difiera del miembro de unión específica seleccionado o del componente de lo mismo mediante adición, deleción, inserción y/o sustitución de una o más secuencias aminoacídicas. Un procedimiento que proporcione un tal derivado puede proporcionar una proteína de fusión o un conjugado en donde una porción adicional de un péptido o polipéptido se une al miembro de unión específica o a un componente de lo mismo, p.ej., una toxina o un marcaje.

El ácido nucleico codificante, bien esté reformado o no, puede utilizarse en la producción del polipéptido o el péptido codificado utilizando cualquier técnica disponible en la materia o los polipéptidos y péptidos mediante expresión recombinante.

Los sistemas de clonaje y expresión de un polipéptido en una diversidad de células huésped distintas son bien conocidos. Las células huésped adecuadas incluyen las bacterias, las células de mamífero, y los sistemas de levaduras y baculovirus. Las líneas celulares de mamífero disponibles en la materia para la expresión de un polipéptido incluyen las células de ovario de hámster chino, las células HeLa, las células de riñón de bebé de hámster, las células de melanoma de ratón NSO y muchas otras. Un huésped común y preferido es la bacteria E. coli.

La expresión de anticuerpos y de fragmentos de anticuerpos en las células procariotas como E. coli está bien establecida en la materia. Para una revisión, véase por ejemplo, Plückthum, A. Bio/Technology 9:545-551 (1991). La expresión en las células eucariotas en cultivo también está disponible para los expertos en la materia como una opción para la producción de un miembro de unión específica, véase las revisiones recientes, por ejemplo, M.E. (1993), Curr. Opinión Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. y col., 81995) Curr. Opinión Biotech 6:553-560.

Es posible elegir o construir los vectores adecuados que contengan secuencias reguladoras adecuadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias intensificadoras de la transcripción, genes marcadores y otras secuencias requeridas. Los vectores pueden ser plásmidos, virus como por ejemplo, fagos o fagémidos. Para más detalles véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas de las técnicas y protocolos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de DNA en las células y la expresión génica y el análisis de proteínas se describen con detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Segunda edición, Ausubel y col., eds., John Willey y Sons, 1992.

En consecuencia, para la producción de un producto polipeptídico en un sistema de expresión, es posible proporcionar el ácido nucleico que codifica un miembro de unión específica seleccionado mediante un procedimiento de la invención, o un componente de dicho miembro de unión específica (p.ej., un dominio VH y/o VL). Ello puede comprender la introducción de dicho ácido nucleico en una célula huésped. Para la introducción puede utilizarse cualquier técnica disponible. Para las células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir la transfección con fosfato cálcico, el DEAE-dextrano, la electroporación, la transfección mediada por liposomas y la transducción utilizando retrovirus u otros virus, p.ej., vaccinia o para células de insectos, los baculovirus. Para las células de bacterias, las técnicas adecuadas pueden incluir la transformación con cloruro cálcico, la electroporación y la transfección utilizando bacteriófagos.

La introducción puede proseguirse provocando o permitiendo la expresión del ácido nucleico, p.ej., mediante el cultivo de células huésped en condiciones de producción del producto codificado.

La presente invención también proporciona un procedimiento que comprende la utilización de una construcción tal como se indicó anteriormente en un sistema de expresión con el fin de expresar un miembro de unión específica o polipéptido, tal como se indicó anteriormente.

Después de la producción mediante expresión, es posible aislar y/o purificar un producto que a su vez puede formularse en una composición que comprenda al menos un componente adicional. Dicha composición puede comprender un excipiente, vehículo o portador aceptable farmacéuticamente.

Otros aspectos y realizaciones de la presente invención serán evidentes a los expertos en la materia a la luz de la presente invención.

La presente invención se ilustra además con referencia a los ejemplos experimentales siguientes.

Ejemplo 1 - Formación de monosomas

Ejemplo 2 - Mejora de las condiciones de renaturalización de ScFv en el sistema de expresión en ribosomas

Ejemplo 3 - Generación de librerías naive ensambladas por PCR mediante un casete de engarce

Ejemplo 4 - Generación de una librería empaquetable y ensamblada por PCR.

Ejemplo 5 - Generación de una librería empaquetable que incorpora un casete de RNA replicasa.

Ejemplo 6 - Generación de una librería de maduración de afinidad por ensamblado por PCR.

Ejemplo 7 - Mejora de un régimen de selección.

Ejemplo 8 - Utilización de un régimen de selección mejorado para la selección por afinidad de variantes madurados contra un receptor de superficie unido a GPI.

Ejemplo 9 - Comparación de secuencias de engarce estructuradas o no estructuradas en un formato de selección.

Ejemplo 1

Formación de monosomas a) Introducción

Una selección eficiente de la expresión en ribosomas tendrá lugar probablemente cuando un solo ribosoma traduce cada molécula de mRNA de la librería, produciéndose una sola molécula de proteína de cadena completa. Si más de un ribosoma traduce una molécula de mRNA, los ribosomas adicionales impedirán la traducción completa del mRNA debido a la presencia del ribosoma inicial estancado y no liberado. Las moléculas proteicas traducidas resultarán truncadas e incapaces de asumir correctamente las configuraciones plegadas. Como consecuencia se produce una asociación inespecífica de material incorrectamente plegado con el antígeno y se reduce la eficiencia en el proceso de selección. Los inventores anticiparon que una proporción de 1:1 de moléculas ribosomales respecto a moléculas de mRNA representa la circunstancia más favorable para asegurar la traducción de tamaño máximo de la librería con sólo un ribosoma por molécula de mRNA.

b) Determinación del número de ribosomas por mRNA en el microscopio electrónico

Se clonaron ácidos nucleicos con una secuencia codificante para un anticuerpo scFv que se conoce por su unión a FITC en un vector de expresión ribosomal (Figura 2A, 2B - la construcción clonada en un vector derivado del pUC), con o sin un codón de parada terminal. Las regiones que codifican para scFv se amplificaron por PCR con los cebadores PEU y HA mini para generar fragmentos de DNA codificantes del anticuerpo, a continuación del promotor T7, del lugar de unión ribosomal y de la secuencia consenso de Kozak. Estos productos de PCR (con o sin un codón de parada terminal) se utilizaron a continuación como moldes iniciales acoplados a un sistema de transcripción y traducción de reticulocitos de conejo que incluía lisina biotinilada en la mezcla de traducción para generar un scFv biotinilado. Las reacciones de traducción se iniciaron mediante la obtención de una mezcla inicial de 100 \mul de lisado de reticulocitos de conejo de Promega, 2,5 \mul de metionina 1 mM, 2 \mul de Transcend tRNA de Promega y 15,5 \mul de agua destilada estéril. Dos microlitros del producto de PCR (aproximadamente 200 ng) se añadieron a continuación a 48 \mul de la mezcla inicial y se incubaron durante 1 hora a 30ºC. Las diluciones de la reacción de traducción se inmovilizaron en una rejilla de microscopía electrónica y se tiñeron con acetato de uranilo, seguido con partículas de estreptavidina-oro para el marcaje de los residuos de lisina biotinilados.

En el caso de los fragmentos de PCR que incluyen un codón de parada al final del gen scFv, no se observó asociación de estreptatividina-oro con los ribosomas ensamblados. Esto era lo esperado puesto que el codón de parada podría liberar el ribosoma y así disociarse el complejo de mRNA-ribosoma-anticuerpo (ARM). En el caso del producto de PCR que no contenía un codón de parada, el complejo ARM permaneció intacto, ya que el ribosoma no se liberó. En este caso, si se observó la presencia de partículas de estreptavidina-oro en asociación con ribosomas ensamblados. Estos ribosomas ensamblados se hallaron preferentemente aislados en lugar de grupos o formando hileras. Esta es la evidencia más convincente que se tiene de que los monosomas en lugar de los polisomas se generaron por un proceso de traducción según las condiciones de concentración de ribosomas y de DNA molde empleadas en el
experimento.

Ejemplo 2

Mejora de las condiciones de renaturalización de scFv en el sistema de expresión en ribosomas i) Introducción

La mayoría del trabajo inicial de expresión en polisomas se realizó utilizando librerías peptídicas en condiciones no críticas para el plegamiento de la proteína. La expresión de proteínas mayores o de librerías de péptidos, como fragmentos de anticuerpos, es potencialmente más dependiente del entorno de oxidación/reducción en el que la proteína se traduce. La proteína se pliega como si se sintetizara en un sistema eucariótico y la variación de la relación de glutatión oxidado a reducido puede afectar significativamente la eficiencia del proceso de plegamiento. Las chaperonas y la proteína disulfuro isomerasa (PDI) son más efectivas en sistemas procariotas debido a que la nueva proteína sintetizada se libera del ribosoma antes de plegarse. Por el contrario, los sistemas eucariotas ya contienen PDI endógenas (Ryabova et al., 1997, Nature Biotechnology, 15:79-84) y no cabe esperar ningún beneficio si se añade PDI al sistema. Los presentes inventores sin embargo han demostrado que utilizar PDI, en combinación con glutation ox:red, resulta en una mayor recuperación de miembros de unión específica correctamente
plegados.

ii) Efecto de la variación en el potencial redox de la reacción de traducción in vitro sobre la actividad de scFv

Una evaluación de la proporción de fragmentos de anticuerpo scFv plegados correctamente se realizó por subclonado de un panel de fragmentos génicos de scFv existentes que se habían aislado por expresión en fagos (Tabla 1) en un vector de expresión en ribosomas (Figuras 2A, 2B). Estos anticuerpos se transcribieron y tradujeron después in vitro con una mezcla de traducción de reticulocitos de conejo. En la mezcla de la traducción se incluyó 35S-metionina y la producción de anticuerpo activo se determinó según la unión del scFv radioactivo a su antígeno. Las traducciones in vitro se iniciaron con la preparación de una mezcla inicial de lisado TNT de 100 \mul, 2,5 \mul de metionina- S^{35} y 17,5 \mul de agua destilada estéril, después se añadieron 2 \mul de producto de PCR a 48 \mul de la mezcla inicial y la reacción se incubó durante 60 minutos a 30ºC. Al final de la reacción, las muestras se trataron con un volumen igual (50 \mul) de RNAsa y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las muestras se bloqueron con 20 \mul de solución de leche Marvel al 18% en PBS 6 X durante 10 min. Se recubrieron placas de ELISA con el antígeno apropiado a 2 \mug/ml a 4º, toda la noche y a continuación se bloqueó durante 1 hora a 37ºC con 200 \mul de solución de leche Marvel al 3% en PBS. La mitad de la reacción de traducción bloqueada se añadió a los pocillos recubiertos con el antígeno y la otra mitad a un pocillo recubierto con una proteína control y se dejó progresar la unión durante 1 hora a 37º. Después de la incubación, el líquido se extrajo con una pipeta y se lavaron los pocillos con 200 \mul de PBS conteniendo Tween al 0,1%, seguido por tres lavados con 200 \mul de PBS. El scFv unido, se eluyó por la adición de 50 \mul de Trietilamina (TES) 100 mM a cada pocillo y se transfirió a una placa de centelleo que contenía 25 \mul de Tris 1 M (pH 7,4) para neutralizar el TEA. Se añadieron 100 \mul de líquido de centelleo y obtuvo la lectura de las cuentas máximas (TOP COUNT en el aparato) para cada muestra. Con las condiciones estándares de traducción in vitro para el equipo comercial. En 4/12 de los anticuerpos, se observó una expresión detectable en el ensayo de unión. La proporción de glutatión oxidado:reducido presente en la mezcla de traducción se varió después y se estudió en las nuevas condiciones el panel de anticuerpos scFv en el ensayo de unión. Las relaciones de 10:1 en oxidado:reducido, 1:1 oxidado:reducido, 1:10 oxidado:reducido y reducido únicamente, se incluyeron en la mezcla de traducción in vitro, añadiéndose después que la reacción procediera durante 30 minutos. Una proporción de 1:1 oxidado:reducido de glutation se conseguía añadiendo 50 \mul de 4 mM glutation oxidado y 4 mM de glutation reducido. Un ejemplo de efecto típico se muestra en la Figura 3. En relación de glutation oxidado:reducido de 10:1 y 1:1 el porcentaje de anticuerpo anti-TNF marcado radioactivamente que se unió al antígeno se incrementó significativamente. Esta tendencia de aumento de scFv activo en proporciones de 10:1 y 1:1 se mantuvo para todos los anticuerpos
ensayados.

iii) Evaluación del efecto de la adición de una proteína chaperona-disulfuro isomerasa en la actividad de scFv

El panel de anticuerpos scFv clonados en un vector de expresión en ribosomas se evaluó según su unión al antígeno en un formato ELISA mediante la proporción de captura de un anticuerpo radioactivo. La mezcla de traducción se preparó tal como se ha descrito más arriba. Una proporción de glutatión oxidado:reducido de 1:1 se incluyó en la solución de traducción y la proteína disulfuro isomerasa (PDI) se añadió en unos intervalos de concentración de 0 a 200 \mug/ml. Se halló que la PDI añadida a concentraciones de 10-20 \mug/ml aumentaba la señal obtenida en el ensayo de captura. En la figura 4 aparecen ejemplos de resultados donde se muestra el efecto de PDI en la actividad de
scFv.

También se determinó el tiempo de adición de PDI en la mezcla de traducción. El PDI se añadió a los 0, 10, 20 o 30 minutos después del inicio de la reacción de traducción, observándose una variación mínima en el scFv capturado, lo que sugería que el tiempo de adición no es crítico.

iv) Resumen de las mejoras en las condiciones de plegamiento de scFv en las reacciones de traducción in vitro

Para aumentar la proporción de scFv correctamente plegado, se realizaron determinaciones en la mezcla de traducción in vitro después de la inclusión de 20 \mug/ml de PDI a tiempo cero en la mezcla de reacción. Al cabo de 30 min de reacción, se añadieron GSSG 4 mM y GSH 4 mM (glutatión 1:1, oxidado: reducido) y la reacción se continuó durante otros 30 minutos adicionales. La temperatura de reacción fue de 30ºC. En estas condiciones, el número de scFv que produjeron una unión detectable en el ensayo de captura aumentó de 4/12 a 7/12 en condiciones estándares. Estos resultados se resumen en la Tabla 2. Ninguno de los scFv estudiados alteró su especificidad tras modificación de las condiciones de traducción.

Ejemplo 3

Generación de una librería naive mediante ensamblado por PCR con un casete de engarce a) Introducción

Para que se produzca un repertorio efectivo de expresión en ribosomas, se incluye un engarce para proporcionar un espacio entre el ribosoma y el polipéptido expresado.

Los engarces que se han utilizado hasta el momento, descritos en la literatura, han incluido fragmentos de proteínas con estructuras que se dan de forma natural como la proteína del gen III del bacteriófago filamentoso Fd (Hanes y Pluckthun, PNAS USA 1997, 94, 4937-4942) o dominios constantes de anticuerpo (He y Tausaig, NAR, 1997, 25: 5132-5134). Nosotros hemos incorporado un engarce glicina-serina en las construcciones de expresión en ribosomas que tiene una estructura secundaria integral mínima, en comparación con los engarces ya descritos. Esto puede utilizarse para reducir la astringencia de las condiciones de plegamiento que se requieran para una expresión eficiente en ribosomas de una proteína dada y proporcionar mayor flexibilidad en la región del engarce, reduciendo los efectos de impedimentos estéricos entre el ribosoma y la proteína expresada. El fragmento de engarce puede variar en tamaño de 2 a 400 aminoácidos, p.ej., de una sola unidad de glicina-serina a 200 unidades de glicina-serina, y puede codificar otros péptidos o proteínas que tengan una estructura secundaria limitada. Es también posible utilizar un casete de engarce como una forma para incorporar otros tipos de funciones codificadas en el repertorio de expresión en el ribosoma. Como ejemplo se pueden incluir secuencias codificantes de señales de empaquetamiento o secuencias de RNA replicasa.

b) Generación de una librería ensamblada por PCR

Un repertorio de anticuerpos scFv se amplificó por PCR a partir de una versión expandida de la librería de expresión scFv en fagos, clonada en pCantab6 (Vaughan et al., 1996). La reacción de PCR incluyó cebadores PEU y mycseq 10 con 30 ciclos de 94ºC 1 min, 55ºC 1 min, 72ºC 2 min. El producto de PCR resultante se purificó en gel. Un fragmento de engarce se produjo por PCR a partir de un vector RDV-recortable (Figura 2A, 2B) con los cebadores hismyc-Back y etiqueta-HA mediante las mismas condiciones de PCR que para scFv. Las reacciones de ensamblamiento y recuperación se realizaron con los cebadores T7 y HA mini (Anexo II). El ensamblamiento se realizó en 25 ciclos de 94ºC 1 min, 55ºC 4 min. Un décimo de la reacción de ensamblamiento (5 \mul) se añadió a la reacción de recuperación y se amplificó por PCR en 30 ciclos de 94ºC 1 min, 55ºC 1 min, 72ºC 2 min. La reacción de recuperación es una PCR que utiliza cebadores que están en los extremos de los dos fragmentos de DNA. Se obtuvo un producto ensamblado del tamaño esperado (1,1 kb) y se purificó en gel. Este producto puede utilizarse directamente como molde de inicio para una reacción acoplada de transcripción/traducción in vitro.

\newpage

Cebadores utilizados (todos escritos en dirección de transcripción 5'-3-):

1

c) Caracterización de una librería ensamblada por PCR en base a la expresión de scFv

El repertorio de scFv ensamblados con un engarce glicina-serina se utilizó como molde en una traducción in vitro utilizando las condiciones descritas en el Ejemplo 7. La reacción de traducción se migró en un gel de proteína y se realizó una transferencia de western. El ScFv se detectó hibridando la transferencia con un anticuerpo anti-etiqueta myc, seguido de un conjugado anti-especie-HRP. El nivel de producción de scFv de la librería ensamblada se estimó que se hallaba entre 50-100 \mug/ml.

d) Análisis de la diversidad de secuencias de una librería no seleccionada ensamblada por PCR

Una fracción de la librería se digirió con la enzima de restricción Bst NI que presenta una secuencia de reconocimiento que contiene 4 residuos frecuentes. La digestión de la librería con esta enzima resultó en una distribución de bandas en escalera, lo que demostraba que la librería consistía en una población mezclada de segmentos del gen scFv. Cuando la librería se digirió con Sfl I se observó una única banda del tamaño esperado. Una fracción de la librería se digirió también con Sfl I y Not I y se clonó en un vector de expresión en ribosomas para permitir la secuenciación de fragmentos individuales del gen scFv presentes en la librería. Se secuenciaron los 48 fragmentos scFv y todos se fueron distintos. Estos resultados son una indicación de que la población de segmentos del gen scFv presentes en la librería ensamblada por PCR es diversa.

Ejemplo 4

Generación de una librería ensamblada por PCR y empaquetable Incorporación de OAS de TMV en construcciones de librerías de expresión en ribosomas

Las posiciones centrales de las OAS corresponden a las posiciones 5420-5546 de la secuencia del RNA de TMV (Goelet y col., 1982, PNAS USA 79, 5818).

Una librería de fragmentos de scFv se generó por amplificación por PCR tal como se ha descrito (Ejemplo 3). Se retuvieron las etiquetas de polihistidina y myc en los fragmentos 3' de la región codificante de scFv. Mediante ligación de dos oligonucleótidos se generó un fragmento de PCR que contenía un origen de ensamblamiento de la manera siguiente.

Los oligonucleótidos HA-OAS1 y HA-OAS2 se ensamblaron juntos mediante la adición de 2 \mul (aproximadamente 100 ng) de cada oligo a 24 \mul de tampón TAQ 1X que contenía 1,5 \mul de dNTPs 5 mM y 0,5 \mul de TAQ polimerasa. Las condiciones de la reacción de ensamblamiento fueron 94ºC durante 1 min, seguido por 55ºC durante 4 min en 6 ciclos. La reacción de recuperación se inició con 10 \mul de reacción de ensamblamiento añadidos a 5 \mul del repertorio de scFv (aproximadamente 500 ng que habían sido amplificados con PEU y mycseq, Ejemplo 3) 5 \mul de dNTPs5 \muM, 5 \mul de tampón de PCR 10 X, 2,5 \mul de cebador HAmini (10 \muM), 2,5 \mul de PEU (10 \muM) y 0,5 \mul de TAQ. Las condiciones de PCR fueron 25 ciclos de 94ºC 1 min, 55ºC 1 min y 72ºC 2 min. Después de completarse las reacciones de recuperación, se observó una banda de aproximadamente 1,1 kb después de la electroforesis en gel que correspondía al resultado del ensamblamiento de scFv y el engarce OAS.

2

Se generó una versión del cebador OAS 2 que incorporaba un codón de parada en el extremo final de la etiqueta myc. Este oligonucleótido permite la producción de construcciones que no tienen la capacidad de formar complejos ARMS debido a la presencia del codón de parada lo que resulta en la liberación del ribosoma.

4

c) transcripción del RNA

El RNAse generó in vitro por transcripción del producto de PCR. Una reacción de transcripción se ensambló mediante adición de aproximadamente 4 \mug de producto de PCR (en 20 \mul de agua) a 10 \mul de tampón de transcripción, rNTPs 25mM, y 5 \mul de mezcla enzimática de T7 de Promega. La reacción se incubó durante 2 horas a 37ºC. Cuando se completó la reacción se añadió DNAasa I y la reacción se incubó durante 15 minutos más a 37ºC. La reacción de transcripción se extrajo con fenol/cloroformo y se dividió en 4 alícuotas de 12,5 \mul, añadiéndose 37,5 \mul de agua a cada alícuota y a continuación se precipitó el RNA con etanol con la adición de 5 \mul de acetato sódico 3M, 1 \mul de glucógeno y 125 \mul de etanol al 100%. La precipitación se realizó a -70ºC durante 30 min, y el RNA se sedimentó por centrifugación a 13000 rpm durante 10 min en una microcentrífuga. Los RNA precipitados y sedimentados se lavaron con etanol al 70% y se resuspendieron en 50 \mul de agua. El RNA se guardó a -70ºC.

e) Preparación de la proteína de la cubierta de TMV

El procedimiento de preparación de la proteína de cubierta de TMV se basó en el descrito por Durham, 1972, J Mol Biol 67, 289-305. El procedimiento implica la diálisis de TMV en un tampón de pH elevado (pH11) para disgregar la proteína de la cubierta del RNA viral. A continuación se realiza la diálisis a pH 8 y se captura sin RNA en columnas de DEAE celulosa. La proteína es después eluida de una columna en un pequeño volumen y se dializa en tampón con pH 5 para obtener un disco de proteína de la cubierta.

Se dializaron 0,5 ml de 10 mg/ml de la cepa U1 de TMV toda la noche a 4ºC en etanolamina 0,1 M con HCl 0,005 M. El virus se dializó durante 4 horas contra Tris 0,012 M / HCl 0,01 M y el virus degradado se centrifugó a 150 000 g durante 1 hora. El sobrenadante se cargó en una columna de 1 ml de DEAE celulosa que había sido pre-equilibrada con Tris 0,12 M /HCl 0,01M y la proteína de cubierta se eluyó con Tris 0,12 M / ClH0,1 M. Se recogieron fracciones de 1 ml y el volumen principal de la proteína se eluyó en la fracción 2. La proteína de cubierta se dializó un mínimo de 48 horas a 4ºC en acetato sódico I=0,1 a pH5.

f) Reacciones de empaquetamiento

Las reacciones de empaquetamiento se realizaron tal como describieron Sleat y col., 1986, Virology 155, 299-308. Una proporción de proteína:RNA (P/P) de 50:1 se escogió para las reacciones. Las reacciones primarias de empaquetamiento se iniciaron utilizando 7 \mug de RNA transcrito y 350 \mug de preparación de proteína de cubierta. El volumen total de la reacción fue 1 ml hecho con Tris-HCl 0,1 M a pH 8. Y la incubación fue de 2 h a temperatura ambiente. Después que se completara el empaquetamiento, las reacciones se detuvieron a 4ºC.

El éxito de las reacciones de empaquetamiento se estudió por microscopía electrónica. Las muestras de la preparación vírica original, la preparación de la proteína de cubierta y las reacciones de empaquetamiento se visualizaron en el microscopio electrónico después de tinción negativa con acetato de uranilo al 1% (p/v). El virus original y la reacción de transcripción in vitro de RNA empaquetado produjeron bastones claramente visibles, siendo los bastones generados por el RNA empaquetado in vitro más cortos que los del virus parental. No se visualizaron bastones en la preparación de proteína.

Esto demuestra la encapsulación del RNA para mejorar su estabilidad durante largos tiempos de almacenamiento y durante el proceso de selección. El RNA encapsulado puede traducirse directamente in vitro en un proceso denominado desensamblamiento co-traduccional para permitir la generación del complejo ARM. Se puede añadir proteína viral de cubierta extra a la reacción de traducción in vitro después del desensamblamiento co-traduccional para permitir el re-empaquetamiento del complejo de polipéptido/ribosoma con el polipéptido ya expresado. Este proceso genera un complejo estable de RNA con menos propensión a la degradación que el RNA sinencapsular.

Es posible expresar la proteína de la cubierta de TMV en E. coli con un RNA que contenga una OAS para generar partículas empaquetadas in vivo de pseudovirus (Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9067-9071). Esto puede utilizarse para proporcionar un medio de co-expresar la proteína de la cubierta del TMV y el mRNA que codifica una librería scFv que contenga la OAS para generar una librería empaquetada in vivo.

Ejemplo 5

Generación de una librería empaquetable que incorpora un casete de RNA replicasa v) Diseño del casete de secuencia de replicación

El RNA Midivariant (MDV) es un molde para la polimerasa de RNA Q\beta replicasa RNA-dirigida (Wu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 1992 1176973). El RNA MDV tiene dos regiones separadas de RNA que hibridan juntas para formar diferentes estructuras secundarias que permiten a la Q\beta replicasa reconocer el RNA y catalizar su amplificación potencial. Los presentes inventores han incluido las secciones de RNA MDV en una construcción de expresión en ribosomas que genera RNA que puede replicarse in vitro. Esta construcción puede también incluir TMV u otra secuencia de empaquetamiento OAS viral para permitir la encapsulación de las moléculas de RNA resultantes. El diseño de una construcción de expresión en ribosomas incorporando secuencias MDV y OAS se muestra en la figura 6.

Los cebadores para permitir la incorporación de RNA MDV en la construcción de expresión en ribosomas se muestran más abajo.

El lugar de replicación de MVD1 incluye 63 nucleótidos en el extremo 5' de la construcción como sigue (5'-3'):

100

A este segmento de 63 nucleótidos le sigue la unidad de expresión que contiene segmentos del gen scFv, las etiquetas de detección y de purificación tags, la secuencia OAS de TMV si se requiere y un engarce. El extremo 3' de la construcción incluye la secuencia 3' MDV que tiene 156 nucleótidos de longitud tal como sigue (5'-3'):

\vskip1.000000\baselineskip

101

El segmento 3' de la secuencia MDV es demasiado largo para generar la secuencia como un oligonucleótido continuo, por lo que se divide en segmentos superpuestos que pueden producirse como oligonucleótidos simples que pueden anillarse juntos. Se requieren tres oligonucleótidos MDV en total, tal como se indica a continuación:

MDV1 (codificando los 63 nucleótidos 5' de la secuencia de MDV seguida por los 23 nucleótidos del promotor T7 en negrita) (5'-3').

102

MDV2: Detección de la etiqueta HA (en negrita) seguido por los 79 nucleótidos del segmento 3' del RNA de MDV.

Sentido de transcripción 5'-3'

103

Complementario inverso (5'-3')

104

MVD3: Los restantes 77 nucleótidos del segmento 3' MDV con una superposición de 19 nucleótidos adicionales (en negrita) para el ensamblamiento de MDV2

Sentido

105

Complementario inverso

106

b) Condiciones de ensamblamiento

Los oligonucleótidos MVD2 y MDV3 se ensamblaron juntos por la adición de 2 \mul de cada uno de los oligos a 24 \mul de tampón TAQ 1 X que contenía 1,5 \mul de dNTPs 5 mM y 0,5 \mul de TAQ polimerasa. Las condiciones de la reacción de ensamblamiento fueron de 94ºC durante 1 min, seguido de 55º durante 4 min en 6 ciclos. La reacción de recuperación se inició con 10 \mul de reacción de ensamblamiento, 2 \mul de oligonucleótido MDV1 y 5 \mul del repertorio de scFv OAS (aproximadamente 500 ng que fueron amplificados por PCR con PEU y HA-back, Ejemplo 3), 5 \mul de dNTPs 5 mM, 5 \mul tampón de PCR 10 X, 2,5 \mul de MDV3 (10 \muM), 2,5 PEU (10 \muM) y 0,5 \mul TAQ. Las condiciones de PCR fueron 25 ciclos de 94ºC 1 min, 72º 21 min. Después de completar la reacción de recuperación, se purificó en gel una banda de 1,3 kb correspondiente al producto ensamblado. Este DNA se digirió con Sfi I y Nbot I y se clonó en un vector de expresión en ribosomas cortado con Sfi I/Not I, permitiendo la transcripción de mRNA de secuencia completa que puede ser replicado con la replicasa Q\beta o empaquetado en TMV CP.

\newpage

Ejemplo 6

Generación de librerías de maduración de la afinidad por ensamblamiento por PCR

La estrategia de ensamblamiento por PCR descrita en el Ejemplo 3 se aplicó a las librerías diseñadas para la maduración de la afinidad de un scFv parental. Los cebadores de PCR se diseñaron para generar el cuerpo principal de un scFv parental desde los primeros pocos residuos de VL CDR3 del inicio de la cadena pesada, tal como se muestra en la Figura 7. La porción restante de VL CDR3 (zona de elección para la mutagénesis) se generó por mutagénesis con un cebador que se superpone con el inicio de VL CDR3 emparejado con el cebador terminal del engarce (p. ej., HA-back) como se muestra en la Figura 7. Los dos fragmentos se ensamblaron y recuperaron mediante condiciones estándares para proporcionar un molde para selección de la expresión en ribosomas. El procedimiento puede modificarse generando librerías de mutantes en cada CDR, tal como se muestra en la Figura 8. También puede utilizarse para mutar secuencialmente diferentes CDRs en cada ronda de selección, como se muestra en la Figura 9.

Ejemplo 7

Un régimen de selección mejorado a) Introducción

Un polipéptido que se une a un miembro de interés sbp complementario (p.ej., una molécula de anticuerpo que se une al antígeno de interés) puede seleccionarse de una librería de polipéptidos expresados en ribosomas mediante el miembro sbp complementario (p.ej., el antígeno), bien en tubos de cribado recubiertos o en solución. Una vez el RNA ha sido capturado por las moléculas de unión, éste se eluye y se transcribe con una transcriptasa BPCR (RT-PCR) para generar DNA. Este DNA puede clonarse en un vector de expresión en ribosomas (u otro vector de expresión) o puede ser re-ensamblado para incluir una unidad de expresión proteica y un engarce apropiado y someterse a continuación a rondas de selección adicionales. En este proceso la molécula de RNA guarda la asociación con el ribosoma en el estado inicial de la selección y asegurar así que el RNA eluído sea de secuencia completa, por lo que la secuencia completa polipeptídica codificada por un DNA pueda regenerarse a partir de éste. Un ejemplo de protocolo utilizado para la selección de anticuerpos anti-FITC de una librería naive de acuerdo con varios aspectos de la presente invención, se describe más abajo.

b) Selección

Un tubo del panel de cribado se recubrió toda la noche con 1 ml de FITC-BSA a 100 mg/ml a temperatura ambiente. Al día siguiente, el tubo se bloqueó con 2 ml de BSA al 10% que contenía 1 mg/ml de tRNA y se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente seguido de 1 hora a 4ºC.

La mezcla de traducción inicial se preparó por la adición de 93,7 \mul de lisado TNT, 2,4 \mul de metionina 1mM, 2,3 \mul de PDI (a 20 \mug/ml) y un volumen máximo de 26,6 \mul de la librería ensamblada por PCR (1-2 \mug). Esta mezcla se repartió en dos reacciones de 62,5 \mul y se incubó a 30ºC durante 30 min, añadiéndose después volúmenes iguales de glutatión 4 mM oxidado-reducido a 1:1 (GSSG:GSH). La reacción se incubó durante 30 minutos adicionales a 30ºC y se diluyó inmediatamente en 750 \mul de heparina enfriada en hielo a 2,5 mg/ml en TBS 1X que contenía Tween al 0,1%, MgOAc 5 mM. Los tubos de cribado recubiertos se lavaron 3-5 veces con 1 ml de solución de bloqueo de heparina a 4ºC. La reacción de traducción se añadió al tubo y se agitó cuidadosamente durante 1 hora a 4ºC. Los pasos restantes se realizaron a 4ºC en tubos y puntas enfriados en hielo. Los tubos se lavaron 10 veces con 2 ml de bloqueante heparina y el RNA se eluyó con 200 \mul de tampón de elución (20 mM EDTA, TBS 1 X, inhibidor de la RNAasa a 1U/\mul). Para asegurar la elución eficiente de los tubos, éstos se mezclaron con ayuda del vórtex varias veces durante 10 minutos. A continuación se añadieron 100 \mul de PBS a la muestra eluída, junto con 400 \mul de tampón de lisis de un equipo de aislamiento de RNA High Pure de Boehringer. El RNA se purifió tal como se describe en el equipo y se eluyó con 50 \mul del tampón de elución del equipo.

c) RT-PCR

Se realizó la RT-PCR con el RNA purificado como molde y utilizando el equipo AB gene de RT-PCR. Una mezcla para una RT-PCR consistió en 25 \mul de mezcla de enzima, 1 \mul de enzima de RT, 5 \mul de RNA, 1 \mul de cebador Bigpam (10 \muM), 1 \mul de cebador Myc37 (10 \muM), 17 \mul de agua. De forma paralela se realizaron reacciones de control sin añadir enzima RT para demostrar la ausencia de contaminación por DNA. Las condiciones de PCR fueron 30 ciclos a 94ºC 1 min, 72ºC 2 min. El producto de PCR resultante se clonó o como un fragmento Sfi I / Not I en RDV o pCantab6 o se reensambló en una construcción de expresión en ribosomas de secuencia completa, tal como se describe más abajo.

d) Re-ensamblamiento del producto de RT-PCR

A 100 ng de producto de RT-PCR purificado en gel y 50 ng de fragmento engarce de PCR se añadieron 50 \mul de agua y 1 \mul de glucógeno, 5 \mul de 3M acetato sódico y 150 \mul de etanol al 100%. El DNA se precipitó a -70ºC durante 30 min, centrifugándose a continuación a 13000 rpm durante 20 min a 4ºC. El precipitado se lavó con etanol al 70% y se resuspendió en 25 \mul de agua. El DNA se transfirió a tubos de PCR de 0,2 ml y se añadieron 3 \mul de tampón de Taq, 1,5 \mul dNTPs y 0,5 \mul de TAQ. La reacción de ensamblamiento se realizó con 25 ciclos de 94ºC 1 min, 65ºC 4 min, 5 \mul del producto de ensamblamiento se añadieron a una mezcla de PCR estándar que contenía los cebadores PEU1 y HA-Back con una temperatura de anillamiento de 58ºC. Los productos de PCR se purificaron en gel y se utilizaron para la segunda ronda de selección.

e) Estudio del rendimiento de la selección

Para permitir el estudio de los rendimientos de varias rondas de selección de los productos de RT-PCR se digirieron con Sfi I /Not I y se clonaron en un vector de expresión en ribosomas pCantab6. Las colonias individuales resultantes de este clonaje se seleccionaron después según su unión a antígenos de elección por un ELISA de fagos tal como se ha descrito por Vaughan y col., en 1996.

f) Caracterización de un clon anti-FITC seleccionado de una librería naive de expresión en ribosomas ensamblada por PCR

El ELISA de los fagos de una población de scFv, generados por dos rondas de selección de una librería naive de expresión en ribosomas y ensamblada por PCR con FITC-BSA identificó un scFv FITC-específico. El clon que tenía una línea germinal DP50 VH, y DP116 VL, CDR3, fue el siguiente:

VH CDR3	NMVRGVGRYYYMDV
VL CDR3	CSRDSSGYHLV

La especificidad de interacción molecular con otras proteínasde este clon se midió con BiaCore y se estimó en 5 X 10^{-3} S^{-1}.

Ejemplo 8

Uso de un régimen de selección mejorado para la selección por afinidad de variantes maduradas de un anticuerpo aislado contra un receptor de superficie celular ligado a GPI.

a) Librerías de mutagénesis

Un scFv parental que reconoce un receptor de superficie celular unido a GPI de interés se aisló de una librería grande de expresión en fagos mediante técnicas estándares de selección. El clon parental presentó una K_{d} de 0,02 s^{-1} según análisis con Biacore de los scFv monoméricos se purificaron por FPLC.

El VH CDR3 parental presentó la siguiente secuencia: VHNGWYALEY. El VL CDR3 parental presentó la siguiente secuencia: NSWDSSGNHVV.

Las librerías en las que los cinco residuos centrales de VH o VL CDR3 se habían mutado, se generaron por mutagénesis de los oligonucleótidos y se clonaron en el vector de expresión en ribosomas.

Las librerías se diseñaron de la manera siguiente:

Librería H4	VHNXXXXXEY
(VH CDR3)
Librería L4	NSWXXXXXHVV
(VL CDR3)

b) Selecciones

El RNA se transcribió a partir de un plásmido preparado de cada librería con protocolos estándares. Una reacción de transcripción típica fue: 4 \mul de tampón 5 X (Promega); 20 unidades Rnasin; 4 \mul de cada ATP, GTP, UTP, CTP (2,5 mM); 1 \mul de T7 RNA polimerasa; 100 ng de DNA plasmídico, y llevado a un volumen final de 20 \mul de agua sin nucleasas. El RNA de cada librería se utilizó como material de inicio para cada ronda de selección y las selecciones subsiguientes selecciones se realizaron con el DNA lineal, tal como se describió en el Ejemplo 7. Las primeras dos rondas de selección fueron con el antígeno de elección o diana inmovilizado en plástico exactamente como se describió en el Ejemplo 7. Esto se realizó para las librerías H4 y L4. Dos rondas adicionales de selección se realizaron en una librería L4 con un antígeno biotinilado a concentraciones de 100 nM en la ronda 3 y 10 nM en la 4. Las selecciones con el antígeno biotinilado se realizaron tal como se describió en el Ejemplo 7 (b) excepto que en vez de añadir los complejos ARM a un tubo de cribado, el antígeno biotinilado se añadió directamente a la mezcla de traducción después de diluirlo en tampón heparina enfriado en hielo. La mezcla se incubó durante 1 hora a 4ºC, después, el antígeno biotinilado con los complejos ARM asociados se capturaron con bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina (Dynal), que habían sido pre-bloqueadas con solución de bloqueo de heparina (Ejemplo 7). Las bolas se lavaron, como se describió para el cribado de los tubos, excepto que no se mezclaron con ayuda del vórtex y después de cada lavado se precipitaron con ayuda de un imán para poder realizar la extracción del sobrenadante. El RNA eluido de las bolas con 200 \mul de tampón de elución (EDTA 20 mM, TBS 1 X, inhibidor de RNasa a 1 U/\mul) y la RT-PCR, el reensamblado y el análisis se llevó a cabo tal como se ha descrito (Ejemplo 7).

c) Resultados vi) Librería H4

El rendimiento de las selecciones se investigó inicialmente mediante ELISA para determinar el porcentaje de clones seleccionados que reconocían al antígeno de elección. En la librería H4 después de dos rondas de cribado, el porcentaje de los clones que fueron positivos en su unión al antígeno fue del 55%. 135 de estos clones positivos se picaron y secuenciaron y se encontró que consistían en 133 secuencias diferentes. Estos clones se prepararon como peri-preparaciones y se clasificaron mediante un análisis de BiaCore. Los cinco clones con la mayor mayor especificidad de interacción molecular según se determinó por la investigación preliminar se prepararon como los scFv monoméricos por purificación en FPLC y se determinaron las mayores especificidades de interacción molecular exactas. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Dos de los clones (B2B4 y BsH1) mejoraron su especificidad de interacción molecular en comparación con el clon parental, demostrando que el régimen de selección descrito es útil para la generación de variantes de afinidad mejoradas por mutagénesis dirigida.

ii) Librería L4

Después de cuatro rondas de selección (2 cribados en panel y 2 mediante antígeno biotinilado), el 15% de los clones seleccionados resultaron positivos para la unión al antígeno de elección, 96 clones positivos se tomaron del análisis BiaCore de la cuarta ronda, y de esos cinco, los de mayor especificidad de interacción molecular se reservaron para análisis adicionales. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Las cinco variantes CDR3 de cadena ligera mejoraron sus especificidades de interacción en comparación con el clon parental demostrando otra vez una aplicación satisfactoria del régimen de selección de la expresión en ribosomas para generar variantes mejoradas por mutagénesis dirigida.

Ejemplo 9

Comparación de engarces estructurados versus no estructurados en un formato de selección a) Introducción

El grado de estructura secundaria asociada con el engarce de la construcción de expresión en ribosomas puede influenciar la cantidad y la calidad de los anticuerpos generados por un proceso de selección de expresión en ribosomas. Para su evaluación se realizó una comparación del efecto de un engarce estructurado (gene III del bacteriófago) y un engarce no estructurado (una repetición glicina-serina), se empleó como sistema modelo una librería H4 descrita en el Ejemplo.

b) Preparación de un molde inicial

El DNA H4 amplificado por PCR se utilizó como molde de inicio. El repertorio scFv de H4 se amplificó en la librería H4 clonada (Ejemplo 8) mediante los cebadores mycseq10 y PEU. El engarce de glicina-serina se amplificó a partir del vector de expresión en ribosomas (Figura 2) por PCR con los cebadores hismyc-back y etiqueta-HA. El engarce del gen III se generó por PCR con los cebados descrito en Hanes y col., 1999, FEBS Letters 450, 105-110 con la adición de etiquetas HA, his y myc, y se utilizó como molde el gen III en el vector pCantab6. Las reacciones de ensamblamiento y recuperación se realizaron, tal como se ha descrito en el Ejemplo 3.

c) Selecciones

Se llevaron a cabo dos rondas de selección con el antígeno inmovilizado (un receptor de superficie celular unido a GPI) tal como se ha descrito previamente (Ejemplo 7). El rendimiento se investigó inicialmente por ELISA para evaluar el número de clones positivos generados por un proceso de selección y un subgrupo de clones se tomaron de un análisis Biacore para determinar las especificidades de interacción molecular.

d) Resultados

Después de dos rondas de selección el porcentaje de clones que fueron positivos por su unión al antígeno analizados en un ELISA fue del 25% en las selecciones realizadas con el engarce del gene III y del 34% en las selecciones realizadas con el engarce GS. Las especificidades de interacción molecular de 22 clones positivos de cada una de las selecciones se midieron como peripreparaciones en el BiaCore. El 36% de los clones positivos con el engarce del gen III mejoraron las especificidades de interacción molecular en comparación con el clon parental, mientras que el 40% mejoraron en los de selección con GS.

Estos resultados proporcionan una indicación del valor de la utilización de los engarces de glicina-serina en la selección en un sistema de expresión en ribosomas al generar clones que se unen al antígeno. Un mayor porcentaje de clones seleccionados mediante el engarce GS (engarce del gen III) mejoraron en términos de la especificidad de interacción molecular en comparación con el clon parental. Todos los clones positivos se seleccionaron y secuenciaron y se halló que el tipo de engarce no afectaba la diversidad de los clones seleccionados.

TABLA 1

Panel de scFv clonados en RDV1

Niveles de expresión determinados por análisis en SDS_PAGE de proteína marcada con Met-S^{35}

scFv	K_{D} (nM)	Antígeno	Niveles de Expresión
1	8	TGF#\beta-1	++
2	2	TGF-\beta2	++
3	0,3	TNF\alpha	++
4	3,7	Estradiol	++
5	0,4	IL-12	+++
6	2,0	IL-12	+++
7	200	IL-12	+++
8	2000	IL-12	+++
9	3	Fluoresceína	+++
10	?	Fluoresceína	++
11	?	Fluoresceína	+
12	?	Fluoresceína	++

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

Actividad del panel de scFv antes y después del ajuste de las condiciones de plegamiento

ScFv	F_{D} (nM)	Antígeno	Actividad-renaturalización	Actividad-plegamiento
			no modificada	modificado
1	8	TGF#\beta-1	-	+
2	2	TGF-\beta-2	-	-
3	0,3	TNF\alpha	-	+
4	3,7	Estradiol	-	-
5	0,4	IL-12	+	+
6	2,0	IL-12	+	+
7	200	IL-12	-	+/-
8	2000	IL-12	-	-
9	3	Fluoresceína	+	+
10	?	Fluoresceína	+	+
11	?	Fluoresceína	+	+
12	?	Fluoresceína	-	-

TABLA 3

Clon	Secuencia de mutagénesis	K_{d}(s^{-1})	Veces de mejora respecto
	(VH-CDR3)		a la parental
Parental	GWYAL	0,0203	-
B1B3	VNLLV	0,0233	0,87
B1F12	RSMDG	0,0283	0,71
B2B4	HAARR	0,0113	1,79
B2H1	RVRLL	5,9e-3	3,44
B2B3	FLSSI	0,0228	0,89

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4

Clon	Secuencia de mutagénesis	K_{d} (s^{-1})	Veces de mejora respecto
	(VL CDR3)		a la parental
Parental	DSSGN	0,0203	-
C5	SATHE	0,0166	1,2
C10	APHGS	0,0144	1,4
A12	TVNHD	0,0104	2,0
D1	HWQTD	7,4e-3	2,7
H7	NTSVT	2,5e-3	8,12

Claims (30)

1. Procedimiento de obtención de un miembro de la pareja de unión específica (sbp) que se une a un miembro sbp complementario de interés, en donde dicho procedimiento comprende:

(a) proporcionar moléculas de mRNA, cada una con una secuencia de nucleotídica que codifica un miembro de la pareja de unión específica y carece de un codón de parada en la misma pauta de lectura;

(b) incubar las moléculas de mRNA en condiciones para la traducción ribosomal de moléculas de mRNA para proporcionar el miembro de la pareja de unión específica, a través del cual se forman los complejos que comprenden ribosomas, mRNA y el miembro de pareja de unión específica expresado en los ribosomas;

(c) contactar los complejos con el miembro sbp complementario de interés, y seleccionar uno o más complejos que expresen el miembro de la pareja de unión específica capaz de unirse con el miembro sbp complementario o de interés en las condiciones de la selección;

en donde las moléculas de mRNA se incuban con los ribosomas procariotas en un sistema de ribosomas procariotas o se incuban con ribosomas eucariotas en un sistema de expresión eucariota;

el procedimiento se caracteriza porque las moléculas de mRNA comprenden además una secuencia para la encapsulación de las moléculas de mRNA en una cubierta viral, y el procedimiento comprende la proteína de cubierta viral que reconoce la secuencia para la encapsulación, con lo que se encapsulan los complejos de mRNA, el ribosoma y el miembro de unión específica expresado en la proteína de la cubierta viral.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las moléculas de mRNA se incorporan en un molde de RNA Midivariant (MDV) que facilita la replicación por la Q\beta replicasa.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la 2, en donde una secuencia de engarce de gly-ser se fusiona con el extremo C-terminal de un miembro de una pareja de unión específica.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la secuencia de engarce de gly-ser comprende 24 unidades de glicina-serina.

5. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el glutatión oxidado y reducido se añade a una proporción de 1:1 y 10:1 a los 30 minutos de la traducción ribosomal.

6. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la proteína disulfuro isomerasa (PDI) se utiliza en las condiciones de incubación, junto con el glutatión oxidado y reducido a una proporción de 1:1 y 10:1.

7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el sistema de traducción es eucariótico y se utiliza la proteína disulfuro isomerasa (PDI) en las condiciones de incubación.

8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende la selección de complejos que contienen un miembro de unión específica capaz de unirse al miembro de unión específica complementario de interés, mientras se bloquea la selección inespecífica con heparina.

9. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde las moléculas de mRNA para la incubación en el sistema de traducción se proporcionan mediante reacciones de RT-PCR en las que al menos un cebador de RT-PCR es un cebador mutagénico que codifica diversas secuencias distintas para la inclusión en una región definida de la secuencia nucleotídica codificante de un miembro de una pareja de unión específica.

10. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde se utilizan la proteína de la cubierta del virus del mosaico del tabaco (TMV) y la secuencia para la encapsulación ("secuencia de origen de ensamblamiento", "OAS").

11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que además comprende la obtención del mRNa de un complejo seleccionado en la etapa (c).

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el mRNA se obtiene de un complejo seleccionado que expresa un miembro de una pareja de unión específica (un "miembro seleccionado de una pareja de unión específica") se amplifica y copia en el DNA que codifica el miembro seleccionado de la pareja de unión específica.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en donde se proporciona el DNA en un sistema de expresión para la producción de un producto, el cual es el miembro seleccionado de la pareja de unión o una cadena polipeptídica del miembro seleccionado de la pareja de unión específica.

\newpage

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, que además comprende el aislamiento y la purificación del producto.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, que además comprende la formulación del producto en una composición que contiene al menos un componente adicional.

16. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el DNA que codifica el miembro seleccionado de la pareja de unión específica o una cadena polipeptídica del miembro seleccionado de la pareja de unión específica se facilita dentro de una secuencia nucleotídica para proporcionar una secuencia nucleotídica que codifica una proteína de fusión, la cual comprende el miembro seleccionado de la pareja de unión específica, o una cadena polipeptídica del miembro seleccionado de la pareja de unión específica, fusionado con aminoácidos adicionales.

17. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el miembro seleccionado de la pareja de unión específica comprende un dominio de anticuerpo VH y/o VL y los aminoácidos adicionales comprenden un dominio constante de anticuerpo.

18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16 o la 17, en donde el DNA que comprende dicha secuencia nucleotídica que codifica la mencionada proteína de fusión se proporciona en un sistema de expresión para la producción de un producto, el cual es la proteína de fusión.

19. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18 que además comprende el aislamiento o la purificación del producto.

20. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 que además comprende la formulación del producto en una composición que comprende al menos un componente adicional.

21. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el DNA que codifica el miembro seleccionado de la pareja de unión específica, o una cadena polipeptídica del miembro seleccionado de la pareja de unión específica se muta para codificar un polipéptido que comprenda una secuencia aminoacídica que difiera del miembro seleccionado de la pareja de unión específica o cadena polipeptídica del miembro seleccionado de la pareja de unión específica.

22. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el DNA mutado que codifica dicho polipéptido se proporciona en un sistema de expresión para la producción de un producto, el cual es el mencionado polipéptido.

23. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, que además comprende el aislamiento o la purificación del producto.

24. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23, que además comprende la formulación del producto en una composición que comprende al menos un componente adicional.

25. Construcción de ácido nucleico de expresión en ribosomas que consta de un DNA o un RNA que contiene los siguientes elementos: un sitio unión al ribosoma, un codón de inicio, una secuencia codificante de una proteína de fusión que comprende un polipéptido y una secuencia de engarce, la secuencia codificante que carece de un codón de finalización y una secuencia para la encapsulación del mRNA en una cubierta viral, en donde:

el polipéptido es un miembro de una pareja de unión específica que es una molécula de anticuerpo o un receptor;

la secuencia de engarce es una secuencia no estructurada, gli-ser, un dominio de la proteína del gen III de un bacteriófago filamentoso, o un dominio constante de cadena ligera kappa;

la secuencia para la encapsulación es una OAS de TMV; y/o

la construcción no codifica la proteína de la cubierta viral que reconoce la secuencia de encapsulación del mRNA.

26. Librería o población de moléculas de RNA que comprenden cada una los siguientes elementos: un sitio de unión a la RNA polimerasa, una secuencia consenso Kozak, un sitio de unión al ribosoma, un codón de inicio, una secuencia codificante de una proteína de fusión que comprende un polipéptido y una secuencia de engarce, la secuencia codificante que carece de un codón de terminación y una secuencia para la encapsulación del mRNA en una cubierta viral; y cada molécula de RNA en la librería o la población contiene una secuencia que codifica un miembro de una pareja de unión específica; y en donde la librería o la población codifican colectivamente una población o repertorio de miembros de parejas de unión específica de secuencias diversas.

27. Librería o población de moléculas de RNA de acuerdo con la reivindicación 26, las cuales se empaquetan dentro de la proteína de la cubierta viral.

28. Población de partículas virales que contienen una población o librería de moléculas de RNA de acuerdo con la reivindicación 27.

29. Sistema de expresión que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 25 o la librería o población de acuerdo con la reivindicación 26 en las condiciones de cultivo para la producción de proteína de fusión que comprende el polipéptido y la secuencia de engarce.

30. Sistema de expresión de ribosomas para la selección de un miembro de la pareja de unión específica capaz de unirse a un miembro complementario de una pareja de unión específica, siendo dicho sistema de expresión en ribosomas un sistema eucariótico o procariótico y en donde el mRNA de los complejos comprende el ribosoma, el mRNA y el miembro de la pareja de unión específica codificado y expresado en el ribosoma se encapsulan en una cubierta viral.