JP2024514890A - 向上した癌細胞死滅効能を有する非対称抗体 - Google Patents

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Abstract

【課題】本発明は、一側はｓｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含み、他の一側はＦａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ）を含む抗ＣＤ２０非対称抗体に関する。【解決手段】本発明の非対称抗体は、対称構造の抗体と比較して補体を効果的に活性化し、著しく向上した補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）を示すので、効率的な癌治療剤又は治療補助剤として有用に利用可能である。

Description

本発明は、補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）が向上した新規の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片及び／又はこれを用いた癌の予防、治療及び／又は診断用組成物に関する。
全世界の抗癌剤市場は、過去１０年間、年平均１０％～１３％の成長率を示しており、２０２２年には合計２，０００億ドルに達すると予想される。２０２０年、現在の全世界において、男性は５人のうち１人、女性は６人のうち１人が生涯１回以上の癌発病を経験しており、男性８人のうち１人と女性１１人のうち１人が癌で死亡しているほどに、癌の有病率と死亡率は持続的に増加している。
全世界の抗癌剤市場においては、１世代化学療法を始めとして、２世代標的抗癌剤と３世代免疫抗癌剤までパラダイム転換がなされている。初期の単純な癌の縮小・抑制を目的としていた治療方法から逸脱し、正常に速く分裂する細胞に対する損傷がなく、癌細胞のみを選択的に攻撃する標的抗癌治療技術が活発に研究されており、このような標的抗癌治療技術の開発は、癌細胞を選択的に標的化できるようにする、癌細胞で特異的に発現される受容体の選別、及び受容体と結合する標的化化合物の開発の二つの段階からなる。
リツキシマブは、キメラ抗（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉ）ＣＤ２０単一クローン抗体であって、腫瘍治療の目的で商用化され、米国のＦＤＡから最初に承認された単一クローン抗体治療剤である。１９８０年代初期のＣＤ２０抗原の抗体は、マウスから作られた単一クローン抗体であって、抗原との反応性には優れるが、生体半減期が短く、異種抗原による抗原性（ＨＡＭＡ、ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が誘発されるという短所を有していた。このようなマウス由来抗体の欠点を補完し、生物学的な効果を高めるために、抗原認識が行われる可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）はマウス由来で、抗体の定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）はヒト由来であるキメラ抗体であるリツキシマブが遺伝子組換え技術を通じて合成された。
ＣＤ２０抗原は、Ｂ細胞系列が細胞周期（ｃｅｌｌ－ｃｙｃｌｅ ｅｎｔｒｙ）に入ったり、Ｂ細胞に分化するのに関与するものとして知られている。ＣＤ２０抗原は、細胞の表面から容易に脱却したり変形或いは陥入しないという特性を有しており、標的分子として活用するのに適当な特徴を有している。ＣＤ２０抗原の分布は、正常細胞の場合、プレ（ｐｒｅ）Ｂ細胞段階で活性化されたＢ細胞（ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｂ ｃｅｌｌ）段階まで広範囲に分布するが、造血母細胞、形質細胞と異なる系列の細胞には分布しておらず、リンパ腫の場合は、Ｂ細胞リンパ腫と慢性リンパ性白血病のほとんど及びプレＢ細胞急性リンパ性白血病の５０％においてＣＤ２０抗原が発現され、単一クローン抗体を用いた腫瘍特異的免疫反応を誘導するのに適切な標的になり得る（Ｍａｌｏｎｅｙ ＤＧ ｅｔ ａｌ．，ＩＤＥＣ－Ｃ２Ｂ８（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ） ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｌｏｗｇｒａｄｅ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ，９０：２１８８－２１９５，１９９７；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｒｅｌａｐｓｅｄ ｉｎｄｏｌｅｎｔ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ｈａｌｆ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ａ ｆｏｕｒ－ｄｏｓｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，１６：２８２５－２８３３，１９９８）。
しかし、前記リツキシマブの場合、約半分程度の低悪性度リンパ腫患者及び約６０％～７０％程度の高悪性度リンパ腫患者において耐性を示し、ＣＤ５５又はＣＤ５９などの発現が多い場合、補体媒介性細胞毒性が減少するという一部の報告があるが、相当数の患者で反応しない理由は確実でない状況である。
本明細書全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として挿入され、本発明の属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
そこで、本発明者等は、リツキシマブに対して反応性を示さないか、これに対して耐性を有する癌細胞を効果的に死滅できる治療剤を開発するために鋭意研究・努力した。その結果、一側はｓｃＦｖを含み、他の一側はＦａｂを含む抗ＣＤ２０非対称抗体を用いる場合、著しく向上した補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）を有することを発見することによって、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、ｓｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）及びＦａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ）を含む、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が向上した抗ＣＤ２０非対称抗体（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）又はその抗原結合断片を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記核酸分子を含むベクターを提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子、又は前記核酸分子を含むベクターを有効成分として含む癌の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子、又は前記核酸分子を含むベクターの薬剤学的有効量を対象体に投与する段階を含む癌の予防又は治療方法を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子、又は前記核酸分子を含むベクターの治療用途（ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ）を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、前記抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子、又は前記核酸分子を含むベクターを有効成分として含む癌の診断用組成物を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、ｓｃＦｖを製造する段階及びＦａｂを製造する段階を含む、補体依存性細胞傷害が向上した抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、ｓｃＦｖをコーディングする核酸分子を製造する段階、及びＦａｂをコーディングする核酸分子を製造する段階を含む、補体依存性細胞傷害が向上した抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子の製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
本発明の一様態によると、本発明は、下記の段階を含む、補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）が向上した抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子の製造方法を提供する：
（ａ）配列番号１６のＬＣＤＲ１、配列番号１８のＬＣＤＲ２、配列番号２０のＬＣＤＲ３、配列番号２４のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２８のＨＣＤＲ３配列を含むｓｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）をコーディングする核酸分子を製造する段階；及び
（ｂ）配列番号３３のＬＣＤＲ１、配列番号３５のＬＣＤＲ２、配列番号３７のＬＣＤＲ３、配列番号４２のＨＣＤＲ１、配列番号４４のＨＣＤＲ２及び配列番号４６のＨＣＤＲ３配列を含むＦａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ）をコーディングする核酸分子を製造する段階。
本発明者等は、リツキシマブに対して反応性を示さないか、これに対して耐性を有する癌細胞を効果的に死滅できる治療剤を開発するために鋭意研究・努力した。その結果、一側はｓｃＦｖを含み、他の一側はＦａｂを含む抗ＣＤ２０非対称抗体を用いる場合、著しく増加した補体依存性細胞傷害を有することを発見した。
本明細書において、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、免疫学的に特定の抗原との反応性を有する免疫グロブリン分子を含む、抗原を特異的に認識する受容体としての役割をするタンパク質分子を意味し、多クローン抗体及び単クローン抗体を全て含む。
抗体は、完全な全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）抗体形態のみならず、抗体分子の抗原結合断片（抗体断片）を含む。完全な抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であって、それぞれの軽鎖は重鎖と二硫化結合で連結されている。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域は、カッパ（Ｋａｐｐａ、κ）及びラムダ（ｌａｍｂｄａ、λ）タイプを有する。
本明細書において、「抗体の抗原結合断片」という用語は、全体の抗体分子内で抗原を特異的に認識し、抗原－抗体結合機能を保有する断片を意味し、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、単一鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。断片の例としては、ＶＬ、ＶＨ、Ｃκ（又はＣＬ）及びＣＨ１ドメインで構成された１価断片（Ｆａｂ断片）；ヒンジ領域で二硫化物橋によって連結された２個のＦａｂ断片を含む２価断片（Ｆ（ａｂ’）２断片）；ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成されたＦｄ断片；抗体の一つのアーム（ａｒｍ）のＶＬ及びＶＨドメイン、及び二硫化物－連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）で構成されたＦｖ断片；ＶＨドメインで構成されたｄＡｂ断片；及び分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）又はリンカーによって選択的につながり得る二つ以上の分離されたＣＤＲの組み合わせ；を含む。また、ｓｃＦｖは、ＶＬとＶＨ領域がペアをなし、１価分子を形成した単一タンパク質鎖をなすようにリンカーによってつながり得る。このような単一鎖抗体も抗体の断片に含まれる。また、前記抗体又は抗体の断片は、２個の重鎖分子及び２個の軽鎖分子を含むテトラマー抗体；抗体軽鎖モノマー；抗体重鎖モノマー；抗体軽鎖ダイマー、抗体重鎖ダイマー；イントラボディ；１価抗体；ラクダ抗体；及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。
Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有している最小の抗体フラグメントであって、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は、ＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結されている。また、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合で連結されたり、又はＣ末端で直ぐ連結されており、二重鎖Ｆｖと同様に、ダイマーのような構造をなすことができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体の抗体をパパインで制限・切断するとＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術を通じて製作することもできる。
本明細書において、「重鎖」という用語は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ、及び３個の定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長の重鎖及びその断片を全て意味する。また、本明細書において、「軽鎖」という用語は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣκ（ＣＬ）を含む全長の軽鎖及びその断片を全て意味する。
本明細書において、「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」という用語は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））。重鎖（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び軽鎖（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）には、それぞれ３個のＣＤＲが含まれており、これらＣＤＲは、抗体が抗原又はエピトープに結合する際に主要な接触残基を提供する。前記ＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）と命名された、さらに保存された各領域に散在される。各ＶＨ及びＶＬは、３個のＣＤＲ及び４個のＦＲからなり、これらは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４の順にアミノ末端からカルボキシ末端に配列される。
本発明の抗体又は抗体断片の範囲には、ＣＤＲ領域に保存的アミノ酸置換を有する変異体が含まれ、ＣＤ２０を特異的に認識できる範囲内で添付した配列リストに記載のアミノ酸配列に対する変異体を含むことができる。例えば、抗体の結合親和度以外に、半減期、生体適合性及びその他の生物学的特性をより改善するために、抗体のアミノ酸配列に追加的な変化を与えることができる。このような生物学的均等活性を有する変異を考慮した場合、本発明の抗体又はこれをコーディングする核酸分子は、配列リストに記載の配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものとして解釈される。前記実質的な同一性は、前記本発明の配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアラインし、当業界で通常用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合、最小６１％の相同性、特定の一例によると７０％の相同性、特定の他の例によると８０％の相同性、特定の更に他の例によると９０％の相同性を示す配列を意味する。配列を比較するためのアラインメント方法は、当業界に公知となっている。アラインメントに対する多様な方法及びアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９８１）２：４８２ Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．（１９７０）４８：４４３；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）２４：３０７－３１；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ（１９８８）７３：２３７－４４；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）５：１５１－３；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８８）１６：１０８８１－９０；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．（１９９２）８：１５５－６５及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９４）２４：３０７－３１に開示されている。
本明細書において、「対称抗体」という用語は、２個の軽鎖及び２個の重鎖を有する抗体の一側及び他側が互いに対称構造（例えば、一側及び他側が同一の軽鎖可変領域及び同一の重鎖可変領域を有する抗体）を有する抗体を意味する。
本明細書において、「非対称抗体」という用語は、前記「対称抗体」ではない非対称構造の抗体を意味する。例えば、一側はＶＬ－リンカー－ＶＨを含む断片（すなわち、ｓｃＦｖ）を含み、他の一側はＶＬ－Ｃκ（又はＣＬ）－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１を含む断片（すなわち、Ｆａｂ）を含むことができる。また、一側はＦａｂを含む断片を含み、他の一側はＦａｂ及びｓｃＦｖを含む断片を含むことができる。前記非対称抗体は、さらにＦｃ部位を含むこともできる。例えば、一側はＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む断片を含み、他の一側はＶＬ－Ｃκ（又はＣＬ）－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む断片を含んで非対称構造の抗体を製作することもできる。
本明細書において、「親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）」という用語は、抗体又はその抗原結合断片と抗原との間の結合強度を意味し、これは、「結合力」としても表現され得る。
本発明の具体的な具現例によると、前記ｓｃＦｖは、配列番号５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む。
本発明の具体的な具現例によると、前記ｓｃＦｖは、配列番号５２の重鎖可変領域（ＶＨ）配列を含む。
本発明の具体的な具現例によると、前記ｓｃＦｖは、配列番号１５のＬＦＲ１、配列番号１７のＬＦＲ２、配列番号１９のＬＦＲ３、配列番号２１のＬＦＲ４、配列番号２３のＨＦＲ１、配列番号２５のＨＦＲ２、配列番号２７のＨＦＲ３及び配列番号２９のＨＦＲ４で構成された群から選ばれる配列を含む。
本発明の具体的な具現例によると、前記ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨの形態である。
本発明の具体的な具現例によると、前記リンカーは、Ｇｌｙ及びＳｅｒの組み合わせであり得る。
本発明の具体的な具現例によると、前記Ｆａｂは、配列番号５３の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む。
本発明の具体的な具現例によると、前記Ｆａｂは、配列番号５４の重鎖可変領域（ＶＨ）配列を含む。
本発明の具体的な具現例によると、前記Ｆａｂは、配列番号３２のＬＦＲ１、配列番号３４のＬＦＲ２、配列番号３６のＬＦＲ３、配列番号３８のＬＦＲ４、配列番号４１のＨＦＲ１、配列番号４３のＨＦＲ２、配列番号４５のＨＦＲ３及び配列番号４７のＨＦＲ４で構成された群から選ばれる配列を含む。
本発明の具体的な具現例によると、前記Ｆａｂは、配列番号３９のＣκ（Ｃ ｋａｐｐａ）配列を含む。
本発明の具体的な具現例によると、前記Ｆａｂは、配列番号４８のＣＨ１配列を含む。
本発明の具体的な具現例によると、前記Ｆａｂは、前記ＶＬ－Ｃκ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１の形態である。
本発明の具体的な具現例によると、前記リンカーは、Ｇｌｙ及びＳｅｒの組み合わせであり得る。
本発明の具体的な具現例によると、本発明の非対称抗体は、重鎖同士の所望でないペアの結合を防止するために、１０個乃至１００個、より具体的には１５個乃至６０個のＧｌｙ及びＳｅｒで構成されたリンカーを使用することができる。
具体的には、本発明の二重特異的抗体は、ＣＤ２０－ｓｃＦｖ－ノブ（ＶＬ－ｌｉｎｋｅｒ２０－ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３）とＣＤ２０－Ｆａｂ－ホール（ＶＬ－Ｃκ－ｌｉｎｋｅｒ４０－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）とが結合された形態であり得る。
ｌｉｎｋｅｒ２０は、前記Ｇｌｙ又はＳｅｒを２０個含むものであって、その例としては、Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒを含み得るが、これに制限されることはない。
ｌｉｎｋｅｒ４０は、前記Ｇｌｙ又はＳｅｒを４０個含むものであって、その例としては、Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒを含み得るが、これに制限されることはない。
本発明の他の様態によると、本発明は、上述した本発明の抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子を提供する。
本明細書において、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドのみならず、糖又は塩基部位が変形した類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，（１９９０）９０：５４３－５８４）。本発明の重鎖及び軽鎖可変領域をコーディングする核酸分子の配列は変形可能である。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、非保存的置換又は保存的置換を含む。
本発明の核酸分子は、前記ヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものとして解釈される。前記実質的な同一性は、前記本発明のヌクレオチド配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアラインし、当業界で通常用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合、最小８０％の相同性、特定の一例では最小９０％の相同性、特定の他の例では最小９５％の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。
本発明の更に他の様態によると、本発明は、上述した本発明の抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子を含むベクターを提供する。
本明細書において、「ベクター」という用語は、前記ポリヌクレオチド（核酸）配列を複製できる細胞への導入のためにポリヌクレオチド配列を挿入できる伝達体を意味する。ポリヌクレオチド配列は、外生（Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であり得る。ベクターとしては、プラスミド、コスミドベクター及びウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスベクターなど）を挙げることができるが、これに制限されない。当業者は、標準的な組換え技術によってベクターを構築することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，ＮＹ，１９９４など）。
本明細書において、「発現ベクター」という用語は、転写される遺伝子産物のうち少なくとも一部分をコーディングするヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。一部の場合は、その後、ＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。発現ベクターは、多様な調節配列を含むことができる。転写及び翻訳を調節する調節配列と共に、ベクター及び発現ベクターには、更に他の機能を提供する核酸配列も含まれ得る。
本発明の更に他の様態によると、本発明は、上述したベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
本明細書において、「細胞」という用語は、真核細胞及び原核細胞を含み、前記ベクターを複製できるか、ベクターによってコーディングされる遺伝子を発現できる任意の形質転換可能な細胞を意味する。細胞は、前記ベクターによって形質感染（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）、形質導入（Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）又は形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）され得るが、これは、外生のポリヌクレオチド（核酸分子）が宿主細胞内に伝達又は導入される過程を意味する。本明細書において、「形質転換」という用語は、前記形質感染及び形質導入を含む意味で使用される。
本発明の（宿主）細胞は、これに制限されないが、好ましくは、昆虫細胞又は哺乳動物細胞、より好ましくは、昆虫細胞の場合はＳｆ９、哺乳動物細胞の場合は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞、ＲＰＥ－１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｈｕｈ－７細胞、Ｃ８Ｄ１ａ細胞、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＥＳ１３細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＭＣＦ－７細胞、ＨＣ７０細胞、ＨＣＣ１４２８細胞、ＢＴ－５４９細胞、ＰＣ３細胞、ＬＮＣａＰ細胞、Ｃａｐａｎ－１細胞、Ｐａｎｃ－１細胞、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞、ＳＷ４８０細胞、ＨＣＴ１６６細胞、ＬｏＶｏ細胞、Ａ１７２細胞、ＭＫＮ－４５細胞、ＭＫＮ－７４細胞、Ｋａｔｏ－ＩＩＩ細胞、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞、ＨＴ－１４４細胞、ＳＫ－ＭＥＬ－２細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、Ｃ６細胞、ＨＴ－２２細胞、ＰＣ－１２細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などを用いることができる。
本発明の宿主細胞は、好ましくは単離された宿主細胞である。
本発明の更に他の様態によると、本発明は、上述した本発明の抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子、又は前記核酸分子を含むベクターを有効成分として含む癌の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。
本発明の更に他の様態によると、本発明は、上述した本発明の抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子、又は前記核酸分子を含むベクターの薬剤学的有効量を対象体に投与する段階を含む癌の予防又は治療方法を提供する。
本発明の更に他の様態によれば、本発明は、上述した本発明の抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子、又は前記核酸分子を含むベクターの治療用途を提供する。
本明細書において、「予防」という用語は、疾患又は疾病を保有していると診断されたことはないが、このような疾患又は疾病にかかる可能性のある対象体における疾患又は疾病の発生を抑制することを意味する。
本明細書において、「治療」という用語は、（ａ）疾患、疾病又は症状の発展の抑制；（ｂ）疾患、疾病又は症状の軽減；又は（ｃ）疾患、疾病又は症状を除去することを意味する。本発明の組成物を対象体に投与すると、ＣＤ２０に対してリツキシマブと同等レベルの結合力を示し、リツキシマブに比べて有意な補体活性能及び／又はこれによるＣＤＣ効果によって癌細胞の増殖を抑制することによって癌の進行を阻害したり、これによる症状を除去又は軽減させる役割をする。よって、本発明の組成物は、それ自体が癌治療用組成物になることもあり、或いは、他の薬理成分と共に投与され、その治療反応性を向上させる治療補助剤として適用されることもある。そこで、本明細書において、「治療」又は「治療剤」という用語は、「治療補助」又は「治療補助剤」の意味を含む。
本明細書において、「投与」又は「投与する」という用語は、本発明の組成物の治療的有効量を対象体に直接投与することによって、対象体の体内で同一の量が形成されるようにすることを意味する。
本発明において、「治療的有効量」という用語は、本発明の薬剤学的組成物を投与しようとする個体に組成物内の薬理成分が治療的又は予防的効果を提供するのに十分な程度に含有された組成物の含量を意味し、これは、「予防的有効量」を含む意味である。
本明細書において、「対象体」という用語は、制限なしで、ヒト、マウス、ラット、ギニーピッグ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ヒヒ又はアカゲザルを含む。具体的には、本発明の対象体はヒトである。
本発明の具体的な具現例によると、本発明の組成物で予防又は治療可能な癌は、ＣＤ２０陽性癌である。
ＣＤ２０陽性癌は、例えば、リンパ腫、白血病などの血液癌、及び黒色腫、肺癌、甲状腺癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、頭頸部癌、胃癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮頸部癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸部癌、子宮内膜細胞癌などの固形癌を含み、好ましくは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）（ＮＨＬ）、濾胞性リンパ腫（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、びまん性大細胞型Ｂ－細胞性リンパ腫（ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、マントル細胞リンパ腫（ｍａｎｔｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、慢性リンパ性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、小リンパ球性リンパ腫（ｓｍａｌｌ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＳＬＬ））、辺縁帯リンパ腫（ｍａｒｇｉｎａｌ ｚｏｎｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＭＺＬ））、リンパ形質細胞性リンパ腫（Ｌｙｍｐｈｏｐｌａｓｍａｃｙｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ（ＬＰＬ））、原発性マクログロブリン血症（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ（ＷＭ））などを含むが、これに制限されることはない。
本発明の更に他の様態によると、本発明は、上述した本発明の抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子、又は前記核酸分子を含むベクターを有効成分として含む癌の診断用組成物を提供する。
本発明で使用される抗体又はその抗原結合断片と対象になる癌については既に詳細に説明したので、過度な重複を避けるために、それについての記載は省略する。
本明細書において、「診断」という用語は、特定の疾患に対する個体の感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）の判定、特定の疾患を現在の個体が有しているかどうかの判定、及び特定の疾患にかかった一つの客体の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）の判定を含む。
ＣＤ２０は、Ｂ細胞リンパ腫及び慢性リンパ性白血病などの癌組織において、正常レベルに比べて高い発現レベルを示す典型的な癌診断マーカーであって、ＣＤ２０に特異的に結合する本発明の抗体は、生物学的試料内の腫瘍の存在を正確に判定することができる。併せて、本発明の抗体は、多様な免疫アッセイ方法を通じて腫瘍内のＣＤ５５の発現レベルを正確に測定し、該当の腫瘍のＣＤＣ薬物に対する治療敏感性を予測することによって、癌の性格に合わせたオーダーメード型治療戦略を早期に樹立する際に有用に利用可能である。
本明細書において、「診断用組成物」という用語は、対象体の癌発病の有無を判断したり、ＣＤＣ薬物に対する治療敏感性を予測するために、ＣＤ２０タンパク質の発現量測定手段として本発明の抗体を含む統合的な混合物（ｍｉｘｔｕｒｅ）又は装備（ｄｅｖｉｃｅ）を意味し、これは、「診断用キット」として表現されることもある。
本明細書において、「生物学的試料」という用語は、組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、尿、リンパ液、脊髓液、組織剖検試料（脳、皮膚、リンパ節、脊髓など）、細胞培養上清液、破裂された真核細胞及び細菌発現系を含むが、これに制限されない。
生物学的試料において、ＣＤ２０タンパク質の検出は、比色法（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）、電気化学法（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ）、蛍光法（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）、発光法（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）、粒子計数法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）、肉眼測定法（ｖｉｓｕａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）又は閃光計数法（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を用いた抗原－抗体複合体形成の検出を通じて行うことができる。本明細書において、「検出」という用語は、抗原－抗体複合体の形成有無を判定するための一連の過程を意味する。検出は、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子又は放射性同位元素を含む多様な標識体を用いて実施することができる。
検出標識体として使用される酵素は、例えば、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ及びβ－ラクタマーゼを含み、蛍光物としては、フルオレセイン、Ｅｕ３＋、Ｅｕ３＋キレート又はクリプテートなどを含み、リガンドとしてはビオチン誘導体などを含み、発光物としては、アクリジニウムエステル及びイソルミノール誘導体などを含み、微小粒子としては、金コロイド及び着色されたラテックスなどを含み、放射性同位元素としては、５７Ｃｏ、３Ｈ、１２５Ｉ及び１２５Ｉ－ボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）試薬などを含むことができる。
本発明の一具現例によると、抗原－抗体複合体は、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて検出することができる。本発明の抗体は検出標識を有することができ、検出標識を有さない場合は、本発明の抗体を捕獲することができ、検出標識を有する更に他の抗体を処理して確認することができる。
本発明の更に他の様態によると、本発明は、下記の段階を含む、補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）が向上した抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する：
（ａ）配列番号１６のＬＣＤＲ１、配列番号１８のＬＣＤＲ２、配列番号２０のＬＣＤＲ３、配列番号２４のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２８のＨＣＤＲ３配列を含むｓｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を製造する段階；及び
（ｂ）配列番号３３のＬＣＤＲ１、配列番号３５のＬＣＤＲ２、配列番号３７のＬＣＤＲ３、配列番号４２のＨＣＤＲ１、配列番号４４のＨＣＤＲ２及び配列番号４６のＨＣＤＲ３配列を含むＦａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ）を製造する段階。
本発明の更に他の様態によると、本発明は、下記の段階を含む、補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）が向上した抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子の製造方法を提供する：
（ａ）配列番号１６のＬＣＤＲ１、配列番号１８のＬＣＤＲ２、配列番号２０のＬＣＤＲ３、配列番号２４のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２８のＨＣＤＲ３配列を含むｓｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）をコーディングする核酸分子を製造する段階；及び
（ｂ）配列番号３３のＬＣＤＲ１、配列番号３５のＬＣＤＲ２、配列番号３７のＬＣＤＲ３、配列番号４２のＨＣＤＲ１、配列番号４４のＨＣＤＲ２及び配列番号４６のＨＣＤＲ３配列を含むＦａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ）をコーディングする核酸分子を製造する段階。
本発明の非対称抗体は、安定的に会合できる第１及び第２サブユニットからなるＦｃ領域を含むことができる。本明細書において、「Ｆｃ領域」という用語は、全長抗体の定常領域のうち少なくとも一部分を含有する抗体重鎖のＣ末端領域を意味し、これは、野生型配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を全て含む。ＩｇＧのＦｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３ドメインを含む。本発明の非対称抗体のＣＨ３領域は、野生型又は変異体ＣＨ３ドメイン（例えば、その一つの鎖に導入された「突出部」（「ノブ」）及びその他の鎖に相応する導入された「空洞（ｃａｖｉｔｙ）」（「ホール」）を有するＣＨ３ドメインであり得る。
本発明の具体的な具現例によると、本発明の非対称抗体は、重鎖同士の所望でないペアの結合を防止するためにノブ－イントゥ－ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）方法を使用することができる。「ノブ－イントゥ－ホール」方法［ＵＳ５，７３１，１６８；ＵＳ７，６９５，９３６；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）］は、異種二量体の生成を促進し、同種二量体の生成を阻害するために、突出部が空洞に位置し得るように第１ポリペプチドの界面に突出部（「ノブ」）を導入し、第２ポリペプチドの界面には相応する空洞（「ホール」）を導入する。突出部は、第１ポリペプチドの界面から小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例、チロシン又はトリプトファン）に置換することによって構成される。大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（例、アラニン又はトレオニン）に置換することによって、突出部と同一又は類似する大きさの相互補完的空洞が第２ポリペプチドの界面に生成される。
本発明の具体的な具現例によると、本発明の非対称抗体は、ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３の形態のｓｃＦｖと、ＶＬ－Ｃκ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３の形態のＦａｂとが結合された形態であり得る。
本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ｉ）本発明は、一側はｓｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含み、他の一側はＦａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ）を含む、補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）が向上した抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片を提供する。
（ｉｉ）本発明の非対称抗体は、対称構造の抗体と比較して著しく向上した補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）を示すので、リツキシマブなどの抗癌剤に耐性が誘導された多様な疾患において薬物の耐性を根本的に除去し、治療反応性を著しく改善する効率的な治療剤又は治療補助剤として有用に利用可能である。
ＩｇＧと非対称形態の抗体を示す模式図である。
非対称形態の抗ＣＤ２０抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。
非対称形態の抗ＣＤ２０抗体のＣＤ２０に対する親和度分析ＥＬＩＳＡ結果を示す図である。
リツキシマブと非対称形態の抗ＣＤ２０抗体の補体活性能をＣ４ｄ濃度測定で比較したＥＬＩＳＡ結果を示す図である。
リツキシマブに対する耐性を示すＲａｍｏｓ－ＲＲ細胞においてリツキシマブと非対称形態の抗ＣＤ２０抗体のＣＤＣ効果を比較した結果を示す図である。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものに過ぎなく、本発明の要旨に従って、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
実施例１．動物細胞発現のための非対称形態の抗ＣＤ２０抗体クローニング
非対称形態の抗ＣＤ２０抗体は、重鎖同士の所望でないペアと結合することを防止するためにノブ－イントゥ－ホール技法を使用し、軽鎖同士の誤った結合を防止するためにはＧｌｙ及びＳｅｒで構成されたリンカーを使用した。ＣＤ２０－ｓｃＦｖ－ノブ（ＶＬ－ｌｉｎｋｅｒ２０－ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３）とＣＤ２０－Ｆａｂ－ホール（ＶＬ－Ｃκ－ｌｉｎｋｅｒ４０－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）の形態でそれぞれクローニングを進行し、ＣＤ２０－ｓｃＦｖ－ノブの場合は、Ｄｒｕｇ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに出たリツキシマブシーケンス（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に基づいて表１のプライマー組み合わせを用いてＰＣＲを行った。増幅された遺伝体は、ＢｓｓＨＩＩとＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、イギリス）酵素を用いて処理し、同様に、同一の制限酵素で処理された動物細胞発現用ベクターであるｐＭＡＺベクターにライゲーションした。ライゲーションが完了したプラスミドは、ＤＨ５αコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、イギリス）に熱衝撃を加えて形質転換し、確保したコロニーを大量培養することによってプラスミドを収得した。
ＣＤ２０－Ｆａｂ－ホール（ＶＬ－Ｃκ－ｌｉｎｋｅｒ４０－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）の形態を作るためには、ＣＤ２０－ｓｃＦｖ－ノブと同様に、Ｄｒｕｇ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに出たリツキシマブシーケンスに基づいて表２のプライマー組み合わせを用いてＰＣＲを行った。増幅された遺伝体は、ＢｓｓＨＩＩとＸｂａＩ酵素を用いて処理し、同様に、同一の制限酵素で処理された動物細胞発現用ベクターであるｐＭＡＺベクターにライゲーションした。ライゲーションが完了したプラスミドは、ＤＨ５αコンピテントセル（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、イギリス）に熱衝撃を加えて形質転換し、確保したコロニーを大量培養することによってプラスミドを収得することによってシーケンス分析（表３）を完了した。
ＣＤ２０－ｓｃＦｖ－ノブのクローニング時に使用されるプライマーリスト
ＣＤ２０－Ｆａｂ－ホールのクローニング時に使用されるプライマーリスト
ＣＤ２０－ｓｃＦｖ－ノブとＣＤ２０－Ｆａｂ－ホールのアミノ酸配列
実施例２．動物細胞での発現及び精製
非対称形態の抗ＣＤ２０抗体は、配列番号１３及び１４の配列を用いてそれぞれのプラスミドをポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）と１５０ｍＭのＮａＣｌを用いてＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に形質感染させ、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）で３７℃の温度、８％のＣＯ２及び５５％の湿度条件下で７日間培養した。発現細胞培養液を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清液を採取してから０．２２μｍのフィルターを通じてろ過した。ろ過された上清液は、４℃でＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）レジン１ｍｌに結合するように誘導した。結合されたレジンは、１０ｃｖ（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ）のＰＢＳ溶液で洗浄した後、１００ｍＭのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．７）溶液を用いて結合された抗体を溶出した後、１Ｍのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和した。ｐＨ７．２～７．４のＰＢＳで緩衝液の交換を行った後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて精製された抗体の軽鎖と重鎖の大きさ及び純度を確認した結果、理論的計算値と一致する分子量及び高い純度を確認できた（図２）。
非対称形態の抗ＣＤ２０抗体は、一側の結合部位がＦａｂで、他の一側の結合部位がｓｃＦｖであるヘテロ形態である。ＦａｂのＣカッパ部分を用いてＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔで精製すると、二重抗体の精製時に生成可能性が最も高いと知られているノブ－ノブホモダイマー又はノブモノマー（Ｇｉｅｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｎｏｂ ａｎｄ ｈｏｌｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ，３４（２）３９７－４０４）の生成を抑制し、所望の形態であるヘテロダイマーのみを得ることができる。
実施例３．ＥＬＩＳＡを通じた非対称形態の抗ＣＤ２０抗体のＣＤ２０結合力確認
前記実施例２で製作した非対称形態の抗ＣＤ２０抗体がターゲットとする抗原であるＣＤ２０に対する親和度を間接ＥＬＩＳＡで確認した。
間接ＥＬＩＳＡは、５０μｌのＰＢＳに１μｇ／ｍｌでＣＤ２０細胞外ドメインループ（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ｌｏｏｐ）領域抗原を希釈してから９６ウェル免疫プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）に入れ、４℃で保管して一晩中吸着させた。４％のスキムミルク（ＢＤ、米国）が含まれた緩衝溶液を用いて常温で１時間反応させた後、０．５％のＴｗｅｅｎ ２０（Ａｍｒｅｓｃｏ、米国）が含まれた緩衝溶液で３回洗浄し、順次的濃度（０．１、０．３、１、３、１１、３３、１００ｎＭ）で希釈したそれぞれの抗体を１ウェル当たり５０μｌずつ処理した。抗原に抗体が結合できるように常温で２時間反応させた後、０．５％のＴｗｅｅｎ ２０（Ａｍｒｅｓｃｏ、米国）が含まれた緩衝溶液で３回洗浄した。抗ヒト免疫グロブリンＦｃ－ＨＲＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、米国）を１：３，０００で２％のスキムミルク（ＢＤ、米国）が含まれた緩衝溶液を用いて希釈してから１ウェル当たり５０μｌずつ処理した後、常温で１時間反応させた。反応が終了した後、０．５％のＴｗｅｅｎ ２０（Ａｍｒｅｓｃｏ、米国）が含まれた緩衝溶液で３回洗浄した後、３，３'，５，５'－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を５０μｌずつ入れて１０分間発色させた。分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ、米国）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定し、その結果を図３に示した。その結果、非対称形態の抗ＣＤ２０抗体は、ＣＤ２０に対してリツキシマブと同等レベルの結合力を示した。
実施例４．Ｃ４ｄ ＥＬＩＳＡを通じた非対称形態の抗ＣＤ２０抗体の補体活性能確認
前記実施例２で製作した非対称形態の抗ＣＤ２０抗体の補体活性能をＣ４ｄ ＥＬＩＳＡを通じて確認した。Ｃ４ｄは、補体古典経路の活性化に対するマーカーであって（Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｓ ａｎｄ ｃｏｎｓ ｆｏｒ Ｃ４ｄ ａｓ ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，８１（７）６２８－３９）、Ｃ４ｄ濃度の測定で補体活性能の確認が可能である。
まず、１００μｇ／ｍｌ濃度のリツキシマブ又は非対称形態の抗ＣＤ２０抗体１０μｌを１ｍｇ／ｍｌ濃度の補体（Ｑｕｉｄｅｌ、米国）９０μｌで１時間反応させた後で１０倍希釈し、ＭｉｃｒｏＶｕｅ補体Ｃ４ｄフラグメントＥＩＡキット（Ｑｕｉｄｅｌ、米国）を用いてＣ４ｄ濃度を確認し、その結果を図４に示した。その結果、非対称形態の抗ＣＤ２０抗体は、補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）が主要な治療メカニズムであるリツキシマブに比べてＣ４ｄ濃度を増加させた。これは、非対称形態の抗ＣＤ２０抗体の補体活性能がリツキシマブに比べて優れることを意味する。
実施例５．リツキシマブ耐性細胞株であるＲａｍｏｓ－ＲＲでの非対称形態の抗ＣＤ２０抗体のＣＤＣ効果確認
リツキシマブに対する耐性を示すＲａｍｏｓ－ＲＲにおいて、リツキシマブと非対称形態の抗ＣＤ２０抗体のＣＤＣ効果を確認した。１サンプル当たり５×１０５個のＲａｍｏｓ－ＲＲ細胞に、リツキシマブ又は非対称形態の抗ＣＤ２０抗体をそれぞれ２０μｇ／ｍｌの濃度になるように２０％の補体血清ヒト（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｓｅｒａ ｈｕｍａｎ）（Ｓｉｇｍａ、米国）が添加されたＲＰＭＩ培地で希釈し、最終的に１００μｌを処理した後、３７℃／５％／ＣＯ２条件下で２時間にわたって培養した。その後、７－ＡＡＤとＦＩＴＣアネキシンＶアポトーシス検出キットを用いてＦＡＣＳ分析装備であるＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）で死滅細胞を確認し、ＣＤＣを観察した（図５）。Ｒａｍｏｓ－ＲＲ細胞は、リツキシマブに対するＣＤＣ効果が低かったが、非対称形態の抗ＣＤ２０抗体は、その効果を増加させた。
このような結果は、ＩｇＧ抗体に比べて非対称形態の抗体が補体を効果的に活性化し、ＣＤＣを効果的に誘導することを示し、ＣＤＣが主要な治療メカニズムである癌治療用抗体の場合、非対称形態の抗体が癌治療にさらに有利であることを意味する。
以上では、本発明の各実施例に対して説明したが、該当の技術分野で通常の知識を有する者であれば、特許請求の範囲に記載された本発明の思想から逸脱しない範囲内で、構成要素の付加、変更、削除又は追加などによって本発明を多様に修正及び変更可能であり、これも本発明の権利範囲内に含まれると言えるだろう。

Claims (22)

  1. 下記の構成を含む、補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）が向上した抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片：
    （ａ）配列番号１６のＬＣＤＲ１、配列番号１８のＬＣＤＲ２、配列番号２０のＬＣＤＲ３、配列番号２４のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２８のＨＣＤＲ３配列を含むｓｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）；及び
    （ｂ）配列番号３３のＬＣＤＲ１、配列番号３５のＬＣＤＲ２、配列番号３７のＬＣＤＲ３、配列番号４２のＨＣＤＲ１、配列番号４４のＨＣＤＲ２及び配列番号４６のＨＣＤＲ３配列を含むＦａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ）。
  2. 前記ｓｃＦｖは、配列番号５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片。
  3. 前記ｓｃＦｖは、配列番号５２の重鎖可変領域（ＶＨ）配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片。
  4. 前記ｓｃＦｖは、配列番号１５のＬＦＲ１、配列番号１７のＬＦＲ２、配列番号１９のＬＦＲ３、配列番号２１のＬＦＲ４、配列番号２３のＨＦＲ１、配列番号２５のＨＦＲ２、配列番号２７のＨＦＲ３及び配列番号２９のＨＦＲ４で構成された群から選ばれる配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片。
  5. 前記ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨの形態であることを特徴とする、請求項１に記載の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片。
  6. 前記リンカーは、Ｇｌｙ及びＳｅｒの組み合わせであることを特徴とする、請求項５に記載の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片。
  7. 前記Ｆａｂは、配列番号５３の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片。
  8. 前記Ｆａｂは、配列番号５４の重鎖可変領域（ＶＨ）配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片。
  9. 前記Ｆａｂは、配列番号３２のＬＦＲ１、配列番号３４のＬＦＲ２、配列番号３６のＬＦＲ３、配列番号３８のＬＦＲ４、配列番号４１のＨＦＲ１、配列番号４３のＨＦＲ２、配列番号４５のＨＦＲ３及び配列番号４７のＨＦＲ４で構成された群から選ばれる配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片。
  10. 前記Ｆａｂは、配列番号３９のＣκ（Ｃ ｋａｐｐａ）配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片。
  11. 前記Ｆａｂは、配列番号４８のＣＨ１配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片。
  12. 前記Ｆａｂは、ＶＬ－Ｃκ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１の形態であることを特徴とする、請求項１に記載の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片。
  13. 前記リンカーは、Ｇｌｙ及びＳｅｒの組み合わせであることを特徴とする、請求項１２に記載の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片。
  14. 請求項１の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子。
  15. 請求項１４の核酸分子を含むベクター。
  16. 請求項１５のベクターで形質転換された単離された宿主細胞。
  17. 請求項１の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子、又は前記核酸分子を含むベクターを有効成分として含む癌の予防又は治療用薬剤学的組成物。
  18. 請求項１の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子、又は前記核酸分子を含むベクターの薬剤学的有効量を対象体に投与する段階を含む癌の予防又は治療方法。
  19. 請求項１の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子、又は前記核酸分子を含むベクターの治療用途。
  20. 請求項１の抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子、又は前記核酸分子を含むベクターを有効成分として含む癌の診断用組成物。
  21. 下記の段階を含む、補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）が向上した抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片の製造方法：
    （ａ）配列番号１６のＬＣＤＲ１、配列番号１８のＬＣＤＲ２、配列番号２０のＬＣＤＲ３、配列番号２４のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２８のＨＣＤＲ３配列を含むｓｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を製造する段階；及び
    （ｂ）配列番号３３のＬＣＤＲ１、配列番号３５のＬＣＤＲ２、配列番号３７のＬＣＤＲ３、配列番号４２のＨＣＤＲ１、配列番号４４のＨＣＤＲ２及び配列番号４６のＨＣＤＲ３配列を含むＦａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ）を製造する段階。
  22. 下記の段階を含む、補体依存性細胞傷害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）が向上した抗ＣＤ２０非対称抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子の製造方法：
    （ａ）配列番号１６のＬＣＤＲ１、配列番号１８のＬＣＤＲ２、配列番号２０のＬＣＤＲ３、配列番号２４のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２８のＨＣＤＲ３配列を含むｓｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）をコーディングする核酸分子を製造する段階；及び
    （ｂ）配列番号３３のＬＣＤＲ１、配列番号３５のＬＣＤＲ２、配列番号３７のＬＣＤＲ３、配列番号４２のＨＣＤＲ１、配列番号４４のＨＣＤＲ２及び配列番号４６のＨＣＤＲ３配列を含むＦａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ）をコーディングする核酸分子を製造する段階。
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