CN117440971A - 具有提高的癌细胞杀灭功效的非对称抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一侧包含scFv(单链可变片段(Single‑chainvariable fragment))及另一侧包含Fab(抗原结合片段(Fragmentantigen‑bin ding))的抗CD20非对称抗体(asymmetricantibody)。与对称结构的抗体相比，本发明的非对称抗体通过有效激活补体来表现出显著提高的补体依赖性细胞毒性作用(ComplementDependentCytotoxicity，CDC)，从而可以有效用作有效的癌症治疗剂或治疗辅助剂。

Description

具有提高的癌细胞杀灭功效的非对称抗体

技术领域

本发明涉及补体依赖性细胞毒性作用(Complement Dependent Cytotoxicity，CDC)得到提高的新型抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段和/或利用其的用于预防、治疗和/或诊断癌症的组合物。

背景技术

全世界抗癌剂市场在过去10年表现出10％-13％的年平均增长率，预计2022年可达共2000亿美金。2020年当前，男性平均每五人中的一人，女性每六人中的一人一生中经历一次以上的癌症发病，男性每八人中的一人，女性每十一人中的一人因癌症导致死亡，而且癌症的发病率和致死率还在持续增加。

全世界抗癌剂市场从第一代的化学疗法开始经历了第二代的靶向抗癌剂至现在的第三代免疫抗癌剂。为了挣脱初期单纯以癌症的减少、抑制为目的的治疗方法的藩篱，有关不损伤正常生长的细胞而只选择性地攻击癌细胞的靶向抗癌治疗技术的研究正活跃地进行着，这样的靶向抗癌治疗技术的开发包括如下步骤：筛选能够选择性地靶向癌细胞并在癌细胞中特异性表达的受体；以及开发与受体结合的靶向化化合物。

利妥昔单抗作为嵌合抗CD20(chimeric anti-CD20)单克隆抗体而用于肿瘤治疗目的，是最早在美国食品药品监督管理局(FDA)获得认可的单克隆抗体。二十世纪八十年代，初期的CD20抗原的抗体作为从小鼠中制备的单克隆抗体，虽然与抗原的反应性优秀，但却具有生物体内半衰期短并诱发因异源抗原引起的抗原性(人抗鼠抗体(HA MA，humananti-mouse antibody))的缺点。为了改善这样的小鼠来源抗体的缺点并提高生物学效果，通过基因重组技术合成了实现抗原识别的可变区(variable region)来源于小鼠而抗体的恒定区(constant region)来源于人类的嵌合抗体-利妥昔单抗。

已知CD20抗原与B细胞系列进入细胞周期(cell-cycle entry)或分化为B细胞相关。CD20抗原具有不易从细胞表面脱落或变形或被凹入细胞内的特性，因此具有用作靶向分子的适当特征。在正常细胞的情况下，CD20抗原从前(pre-)B细胞阶段到激活的B细胞(activate d B cell)阶段广泛分布，但不在造血母细胞、浆细胞及其他系列的细胞中分布，在淋巴瘤的情况下，在B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病以及50％的前B细胞淋巴细胞白血病中表达CD20抗原，因此能够成为诱导利用单克隆抗体的肿瘤特异性免疫反应的适当靶向(MaloneyDG et al.,IDEC-C2B8(Rituximab)anti-CD20 monoclonalantibodytherapy in patients with relapsed lowgrade non-Hodgkin'slymphoma.Blood,90:2188-2195,1997；McLaughlin P et al.,Rituximab chimeri canti-CD20 monoclonal antibody therapy for relapsed indolent lymp homa:half ofpatients respond to a four-dose treatment program.JClin Oncol,16:2825-2833,1998)。

然而，上述利妥昔单抗在约一半低分化淋巴瘤患者及约60-70％左右的高分化淋巴瘤患者中显出耐药性，据报道，在CD55或CD59等表达多的情况下，补体介导的细胞毒性将减少，但尚不明确不在大多数患者中反应的原因。

在本说明书全文中，将参照大量论文及专利文献并标示其引用。引用的论文及专利文献的全部公开内容将作为参照插入本说明书中以进一步明确说明本发明所属技术领域的水平及本发明的内容。

发明内容

技术问题

于是，本发明人为了开发能够有效杀灭对利妥昔单抗不显出反应性或具有耐药性的癌细胞的治疗剂而几经努力研究。结果，发现在利用包含一侧为scFv及另一侧为Fab的抗CD20非对称抗体的情况下，具有显著提高的补体依赖性细胞毒性作用，从而完成本发明。

因此，本发明的目的在于，提供包含scFv(单链可变片段(Singl e-chainvariable fragment))及Fab(抗原结合片段(Fragment antigen-binding))的补体依赖性细胞毒性作用(CDC)得到提高的抗CD20非对称抗体(asymmetric antibody)或其抗原结合片段。

本发明的再一目的在于，提供编码上述抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

本发明的另一目的在于，提供包含上述核酸分子的载体。

本发明的还有一目的在于，提供由上述载体转化的宿主细胞。

本发明的又一目的在与，提供包含上述抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段、编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子或包含上述核酸分子的载体作为有效成分的用于预防或治疗癌症的药物组合物。

本发明的又一目的在于，提供预防或治疗癌症的方法，包括向对象给予药学有效量的上述抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段、编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子或包含上述核酸分子的载体的步骤。

本发明的又一目的在于，提供上述抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段、编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子或包含上述核酸分子的载体的治疗用途(for use intherapy)。

本发明的又一目的在于，提供包含上述抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段、编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子或包含上述核酸分子的载体作为有效成分的用于诊断癌症的组合物。

本发明的又一目的在于，提供补体依赖性细胞毒性作用得到提高的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段的制备方法，包括：制备scF v的步骤；以及制备Fab的步骤。

本发明的又一目的在于，提供编码补体依赖性细胞毒性作用得到提高的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段的核酸分子的制备方法，包括：制备编码scFv的核酸分子的步骤；以及制备编码Fab的步骤。

本发明的其他目的及优点将通过下述发明的详细说明、发明要求保护范围以及附图得到进一步明确。

技术方案

根据本发明的一实施方式，本发明提供编码补体依赖性细胞毒性作用得到提高的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段的核酸分子的制备方法，包括：步骤(a)，制备编码包含序列16的LCDR1、序列18的LCDR2、序列20的LCDR3、序列24的HCDR1、序列26的HC DR2以及序列28的HCDR3序列的scFv的核酸分子；以及步骤(b)，制备编码包含序列33的LCDR1、序列35的LCDR2、序列37的LCD R3、序列42的HCDR1、序列44的HCDR2以及序列46的HCDR3序列的Fab的核酸分子。

本发明人为了开发能够有效杀灭对利妥昔单抗不显出反应性或具有耐药性的癌细胞的治疗剂而几经努力研究。结果，发现在利用包含一侧为scFv及另一侧为Fab的抗CD20非对称抗体的情况下，具有显著提高的补体依赖性细胞毒性作用。

本说明书中的术语“抗体(antibody)”是指包括在免疫学上与特定抗原具有反应性的免疫球蛋白分子在内的起到特异性识别抗原的受体作用的蛋白质分子，包括单克隆抗体及多克隆抗体两者。

抗体不仅包括完整的全长(full-length)抗体，还包括抗体分子的抗原结合片段(抗体片段)。完整的抗体为具有2个全长轻链及2个全长重链的结构，各轻链通过二硫键与重链连接。重链的恒定区有伽马(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)及伊普西龙(ε)型，亚型有伽马1(γ1)、伽马2(γ2)、伽马3(γ3)、伽马4(γ4)、阿尔法1(α1)及阿尔法2(α2)。轻链的恒定区有卡帕(kappa，κ)及兰布达(lambd a，λ)型。

本说明书中的术语“抗体的抗原结合片段”是指在整个抗体分子内特异性识别抗原并具有抗原-抗体结合功能的片段，包括单域抗体(sdAb)、单链抗体(scFv)、Fab、F(ab')、F(ab')2以及Fv等。片段的例包括：由VL、VH、Cκ(或CL)及CH1结构域构成的一价片段(Fab片段)；在铰链区包含通过二硫桥连接的二价Fab片段的二价片段(F(ab')2片段)；由VH与CH1结构域构成的Fd片段；由抗体的一个臂(arm)的VL与VH结构域以及二硫键合的Fv(sdFv)构成的Fv片段；由VH结构域构成的dAb片段；以及分离的互补决定区(CDR)或可以通过接头选择性地连接的两个以上分离的CDR的组合。并且，scFv可以通过接头连接，使得VL与VH区域配对以形成构成一价分子的单一蛋白质链。这样的单链抗体也包括在抗体的片段中。并且，上述抗体或抗体的片段包括：包含2个重链分子和两个轻链分子的四聚体抗体；抗体轻链单体；抗体重链单体；抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体；胞内抗体；一价抗体；骆驼抗体；以及单域抗体(sdAb)。

Fv为仅具有重链可变区及轻链可变区的最小的抗体片段，生成Fv片段的重组技术在专利合作条约(PCT)国际公开专利申请第WO 88/10649、WO 88/106630、WO 88/07085、WO88/07086及WO 88/09344号中公开。双链Fv(two-chain Fv)通过非共价键连接重链可变区与轻链可变区，单链Fv(single-chain Fv)通常可以通过肽接头以共价键连接重链的可变区与单链的可变区，或者直接在C-末端连接来形成与双链Fv相同的二聚体结构。这样的抗体片段可以利用蛋白水解酶来获得(例如，若使用木瓜蛋白酶限制性切割整个抗体，则可以获得Fab，若使用胃蛋白酶切割，则可以获得F(ab')2片段)，也可以通过基因重组技术来制备。

本说明书中的术语“重链”是指包含具有用来赋予对抗原的特异性的充分的可变区序列的氨基酸序列的可变结构域VH以及3个恒定结构域CH1、CH2及CH3的全长重链及其片段。并且，本说明书中的术语“轻链”是指包含具有用来赋予对抗原的特异性的充分的可变区序列的氨基酸序列的可变结构域VL以及恒定结构域Cκ(或CL)的全长轻链及其片段。

在本说明书中，术语“CDR(互补决定区(complementarity deter miningregion))”是指免疫球蛋白的重链及轻链的超变区(hypervaria ble region)的氨基酸序列(Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th Ed.,U.S.Department of Health and HumanServices,National Institutes of Health(1987))。重链(HCDR1、HC DR2及HCDR3)及轻链(LCDR1、LCDR2及LCDR3)中各包含3个CDR，这些CDR在抗体与抗原或表位的结合中提供主要的接触残基。上述CDR分布在称为骨架区(FR)的得到进一步保守的区域中。各VH及VL由3个CDR和4个FR形成，它们从氨基末端至羧基末端依次排列为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。

本发明的抗体或抗体片段的范围中包括在CDR区域中具有保守性氨基酸取代的变异体，可以能够在特异性识别CD20的范围内包括随附的序列表中记载的有关氨基酸序列的变异体。例如，除抗体的结合亲和度以外，还可以为进一步改善半衰期、生物相容性等其他生物学特性而给抗体的氨基酸序列带来追加的变化。若考虑具有这样的生物学同等活性的变异，则本发明的抗体或编码其的核酸分子应解释为包括与序列表中记载的序列示出实质同一性(substantial identity)的序列。上述实质同一性是指在将任意其他序列与本发明的序列以最大对应的方式对齐并利用本发明所属技术领域通常使用的算法分析对齐的序列时，示出最少61％的同源性，根据一特定例，示出70％的同源性，根据再一特定例，示出80％的同源性，根据还一特定例，示出90％的同源性。用于序列比较的对齐方法是本发明所属技术领域中公知的。有关对齐的多种方法及算法记载在如下文献中：Smith andWaterman,Adv.Appl.Math.(1981)2:482Needleman and Wunsch,J.Mol.Bio.(1970)48:443；Pearson and Lipman,Methods in Mol.Biol.(1988)24:307-31；Higgins and Sharp,Gene(1988)73:237-44；Higgins and Sharp,CABIOS(1989)5:151-3；Corpet etal.Nuc.Acids Res.(1988)16:10881-90；Huang et al.Comp.Appl.BioSci.(1992)8:155-65；以及Pearson et al.Meth.Mol.Biol.(1994)24:307-31。

本说明书中的术语“对称抗体”是指具有2个轻链及2个重链的抗体具有一侧与另一侧相互对称的结构(例如，一侧及另一侧具有相同的轻链可变区及相同的重链可变区的抗体)的抗体。

本说明书中的术语“非对称抗体”是指不是上述“对称抗体”的非对称结构的抗体。例如，可以包括一侧包含VL-接头-VH的片段(即，scFv)以及另一侧包含VL-Cκ(或CL)-接头-VH-CH1的片段(即，Fab)。并且，可以包括一侧包含Fab片段及另一侧包含Fab和scFv的片段。上述非对称抗体还可以包含Fc部位。例如，可以通过包括一侧包含VL-接头-VH-CH2-CH3的片段及另一侧包含VL-Cκ(或CL)-接头-VH-CH1-CH2-CH3的片段来制备非对称结构的抗体。

本说明书中的术语“亲和度(affinity)”是指抗体或其抗原结合片段与抗原间的结合强度，因此也可以表达为“结合力”。

根据本发明的具体实例，上述scFv包含序列51的轻链可变区(VL)序列。

根据本发明的具体实例，上述scFv包含序列52的重链可变区(VH)序列。

根据本发明的具体实例，上述scFv包含选自由序列15的LFR1、序列17的LFR2、序列19的LFR3、序列21的LFR4、序列23的HF R1、序列25的HFR2、序列27的HFR3以及序列29的HFR4组成的组中的序列。

根据本发明的具体实例，上述scFv为VL-接头-VH形式。

根据本发明的具体实例，上述接头可以为Gly与Ser的组合。

根据本发明的具体实例，上述Fab包含序列53的轻链可变区序列。

根据本发明的具体实例，上述Fab包含序列54的重链可变区序列。

根据本发明的具体实例，上述Fab包含选自由序列32的LFR1、序列34的LFR2、序列36的LFR3、序列38的LFR4、序列41的HF R1、序列43的HFR2、序列45的HFR3以及序列47的HFR4组成的组中的序列。

根据本发明的具体实例，上述Fab包含序列39的Cκ(C kappa)序列。

根据本发明的具体实例，上述Fab包含序列48的CH1序列。

根据本发明的具体实例，上述Fab为VL-Cκ-接头-VH-CH1形式。

根据本发明的具体实例，上述接头为Gly与Ser的组合。

根据本发明的具体实例，为了避免重链之间形成所不希望的配对，本发明的非对称抗体可以使用10个至100个由Gly与Ser构成的接头，更具体地，可以使用15个至60个由Gly与Ser构成的接头。

具体地，本发明的双特异抗体可以为CD20-scFv-旋钮(knob)(VL-linker20-VH-CH2-CH3)与CD20-Fab-孔(hole)(VL-Cκ-linker40-VH-CH1-CH2-CH3)结合的形式。

linker20包含20个上述Gly或Ser，其例可以包括Gly Gly Gly Gly Ser Gly GlyGly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly G ly Ser，但不限定于此。

linker40包含40个上述Gly或Ser，其例可以包括Gly Gly Gly Gly Ser Gly GlyGly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly G ly Ser Gly Gly Gly Gly Ser GlyGly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gl y Ser Gly Ser Gly Ser Ser，但不限定于此。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供编码前述本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

本说明书中的术语“核酸分子”具有包括脱氧核糖核酸(基因组脱氧核糖核酸(gDNA)及互补脱氧核糖核酸(cDNA))以及核糖核酸分子在内的含义，作为核酸分子中基本结构单位的核苷酸不仅包括自然的核苷酸，还包括糖或碱基部位被修饰的类似物(analogue)(Schei t,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980)；Uhlman&Peyman,Chemical Reviews,(1990)90:543-584)。本发明的编码重链及轻链可变区的核酸分子的序列可以变形。上述变形包括核苷酸的追加、缺失或者非保守性取代或保守性取代。

本发明的核酸分子应解释为还包括对于上述核苷酸序列示出实质同一性的核苷酸序列。上述实质同一性是指在将任意其他序列与本发明的序列以最大对应的方式对齐并利用本发明所属技术领域通常使用的算法分析对齐的序列时，示出最少80％的同源性的核苷酸序列，根据一特定例，示出最少90％的同源性的核苷酸序列，根据另一特定例，示出最少95％的同源性的核苷酸序列。

根据本发明的还一实施方式，本发明提供包含编码前述本发明的抗体或其抗原结合片段的核酸分子的载体。

本说明书中的术语“载体”是指为了将上述多核苷酸(核酸)序列导入能够复制的细胞中而能够插入多核苷酸序列的运载体。多核苷酸序列可以为外源性(Exogenous)或异源性(Heterologous)。载体可以为质粒、粘粒载体以及病毒载体(逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒载体等)，但不限定于此。普通技术人员可以通过标准的重组技术构建载体(Maniatis,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988；以及Ausu bel et al.,In:Current Protocolsin Molecular Biology,John,Wiley&Sons,Inc,NY,1994等)。

本说明书中的术语“表达载体”是指包含编码所要转录的基因产物中的至少一部分的核苷酸序列的载体。在一部分情况下，此后核糖核酸分子翻译为蛋白质、多肽或肽。表达载体中可包含多种调节序列。除调节转录及翻译的调节序列以外，载体及表达载体还可以包含还提供其他功能的核酸序列。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供由前述载体转化的宿主细胞。

本说明书中的术语“细胞”包括真核细胞及原核细胞，是指能够复制上述载体或能够通过载体表达所编码的基因的任意可转化的细胞。细胞可以通过上述载体被转染(Transfected)、转导(Transduced)或转化(Transformed)，这是指外源性的多核苷酸(核酸分子)向宿主细胞内转运或导入的过程。本说明书中的术语“转化”以包括上述转染及转导在内的含有来使用。

本发明的(宿主)不受限制，但优选地，可以利用昆虫细胞或哺乳动物细胞，更优选地，昆虫细胞可以利用Sf9细胞，哺乳动物细胞可以利用HEK293细胞、HeLa细胞、ARPE-19细胞、RPE-1细胞、Hep G2细胞、Hep3B细胞、Huh-7细胞、C8D1a细胞、Neuro2A细胞、CH O细胞、MES13细胞、BHK-21细胞、COS7细胞、COP5细胞、A549细胞、MCF-7细胞、HC70细胞、HCC1428细胞、BT-549细胞、PC3细胞、LNCaP细胞、Capan-1细胞、Panc-1细胞、MIA PaCa-2细胞、SW480细胞、HCT166细胞、LoVo细胞、A172细胞、MKN-45细胞、MKN-74细胞、Kato-III细胞、NCI-N87细胞、HT-144细胞、SK-MEL-2细胞、SH-SY5Y细胞、C6细胞、HT-22细胞、PC-12细胞、NIH3T3细胞等。

优选地，本发明的宿主细胞为分离的宿主细胞。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含前述本发明的抗体或其抗原结合片段、编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子或包含上述核酸分子的载体作为有效成分的用于预防或治疗癌症的药物组合物。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供预防或治疗癌症的方法，包括向患者给予药学有效量的前述本发明的抗体或其抗原结合片段、编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子或包含上述核酸分子的载体的步骤。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供前述本发明的抗体或其抗原结合片段、编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子或包含上述核酸分子的载体的治疗用途。

本说明书中的术语“预防”是指在虽然未诊断为患有疾患或疾病但却具有罹患上述疾患或疾病的可能性的对象中抑制疾患或疾病的发生的行为。

本说明书中的术语“治疗”是指：(a)抑制疾患、疾病或症状的发展；(b)减轻疾患、疾病或症状；或者(c)消除疾患、疾病或症状。向对象给予本发明的组合物时，对CD20表现出与利妥昔单抗(rituxi mab)同等水平的结合力，因比利妥昔单抗更为显著的补体激活能力和/或由此引起的补体依赖性细胞毒性作用效果而抑制癌细胞的增殖来抑制癌症的进程，或起到消除或减轻由此引起的症状的作用。因此，本发明的组合物本身可以成为用于治疗癌症的组合物，或者应用为与其他药理成分一同给药来提高其治疗反应性的治疗辅助剂。因此，本说明书中的术语“治疗”或“治疗剂”包括“治疗辅助”或“治疗辅助剂”的含义。

本说明书中的术语“给药”或“给予”是指通过向对象直接给予治疗有效量的本发明的组合物来在对象体内形成相同的量的行为。

本发明中的术语“治疗有效量”是指组合物含有的药理成分的含量为向所要给予本发明的药物组合物的个体提供治疗或预防效果的充分的含量，为包括“预防有效量”在内的含义。

本说明书中的术语“对象”不受限制地包括人类、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、猴、黑猩猩、狒狒或恒河猴。具体地，本发明的对象为人类。

根据本发明的具体实例，可以使用本发明的组合物预防或治疗的癌症为CD20阳性癌症。

CD20阳性癌症包括例如淋巴瘤、白血病等血液癌以及黑色素瘤、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、头颈部癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈部癌、子宫内膜细胞癌等固体癌，优选地，包括B细胞非霍奇金淋巴瘤(non-Hodg kin'slymphomas，NHL)、滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma)、弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuselarge B cell lymphoma)、套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leu kemia)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocyticlymphoma，SLL)、边缘区淋巴瘤(marginal zone lymphoma，MZL)、淋巴浆细胞淋巴瘤(Lymphoplasmacytic lymphoma，LDL)、原发性巨球蛋白血症(Wald enstrommacroglobulinemia，WM)等，但不限定于此。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含前述本发明的抗体或其抗原结合片段、编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子或包含上述核酸分子的载体作为有效成分的用于诊断癌症的组合物。

上述内容中已说明了本发明中使用的抗体或其抗原结合片段以及作为对象的癌症，为避免过度的重复，将省略其记载。

本说明书中的术语“诊断”包括个体对特定疾病的敏感性(susce ptibility)的判定、个体现在是否患有特定疾病的判定，以及对已患有特定疾病的个体的预后(prognosis)的判定。

CD20为在B细胞淋巴瘤及慢性淋巴细胞白血病等癌组织中表现出比正常水平高的表达水平的典型的癌症诊断标记物，与CD20特异性结合的本发明的抗体可以准确判定生物学试样内肿瘤的存在。同时，本发明的抗体可以通过多种免疫分析方法准确测定肿瘤内CD55的表达水平来预测相关肿瘤对补体依赖性细胞毒性药物的治疗敏感度，从而可以在早期建立根据癌症性质的针对性治疗战略方面有效使用。

本说明书中的术语“诊断用组合物”作为为了判断对象是否罹患癌症或预测对补体依赖性细胞毒性药物的治疗敏感性而测定CD20蛋白的表达量的工具，是指包含本发明的抗体的整合的混合物(mixture)或设备(device)，因此，也可以表达为“诊断用试剂盒”。

本说明书中的术语“生物学试样”包括组织、细胞、全血、血清、血浆、唾液、尿液、淋巴液、脊髓液、组织解剖试样(脑、皮肤、淋巴结、脊髓等)、细胞培养上清液、裂解的真核细胞及细菌表达系统，但不限定于此。

生物学试样中CD20蛋白的检测可以通过利用比色法(colormetri c method)、电化学法(electrochemical method)、荧光法(fluorimetri c method)、发光法(luminometry)、粒子计数法(particle counting method)、肉眼测定法(visualassessment)或闪烁计数法(scintillation counting method)等的抗原-抗体复合物形成的检测来进行。本说明书中的术语“检测”是指用来判定是否形成抗原-抗体复合物的一系列过程。检测可以使用包括酶、荧光物、配体、发光物、微粒子或放射性同位素在内的多种标记物来实施。

用作检测标记物的酶可以包括例如乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶以及β-内酰胺酶等，荧光物可以包括荧光素、Eu³⁺、Eu³⁺螯合物或穴状化合物等，配体可以包括生物素衍生物等，发光物可以包括吖啶酯及异鲁米诺衍生物等，微粒子可以包括胶体金及彩色乳胶等，放射性同位素可以包括⁵⁷Co、³H、¹²⁵I及¹²⁵I-邦顿(Bonton)猎人(Hunter)试剂等。

根据本发明的一实例，可以利用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测抗原-抗体复合物。本发明的抗体可以具有检测标记物，若不具有检测标记物，则可以处理具有能够捕获本发明的抗体的检测标记物的其他抗体来确认。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供补体依赖性细胞毒性作用得到提高的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段的制备方法，包括：步骤(a)，制备包含序列16的LCDR1、序列18的LCDR2、序列20的LCDR3、序列24的HCDR1、序列26的HCDR2以及序列28的HCDR3序列的scFv；以及步骤(b)，制备包含序列33的LCDR1、序列35的LCDR2、序列37的LCDR3、序列42的HCDR1、序列44的HCDR2以及序列46的HCDR3序列的Fab。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供编码补体依赖性细胞毒性作用得到提高的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段的核酸分子的制备方法，包括：步骤(a)，制备编码包含序列16的LCDR1、序列18的LCDR2、序列20的LCDR3、序列24的HCDR1、序列26的HC DR2以及序列28的HCDR3序列的scFv的核酸分子；以及步骤(b)，制备编码包含序列33的LCDR1、序列35的LCDR2、序列37的LCD R3、序列42的HCDR1、序列44的HCDR2以及序列46的HCDR3序列的Fab的核酸分子。

本发明的非对称抗体可以包含由能够稳定缔合的第一及第二亚单元形成的Fc区域。本说明书中的术语“Fc区域”是指含有全长抗体的恒定区中至少一部分的抗体重链的C-末端，其包括野生型序列Fc区域和变异体Fc区域。IgG的Fc区域包括IgG CH2及IgG CH3结构域。本发明的非对称抗体的CH3区域可以为野生型或变异体CH3结构域(例如，可以为具有在其一个链导入的“突出部”(“旋钮”)以及在其另一链导入相应的“空洞(cavity)”(孔))的CH3结构域。

根据本发明的具体实例，为了避免重链之间形成所不希望的配对，本发明的非对称抗体可以使用旋钮入孔(knob-into-hole)方法。“旋钮入孔”方法(US 5,731,168；US7,695,936；Ridgway et al.,Prot Eng9,617-621(1996)；Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001))在第一多肽表面导入突出部(“旋钮”)并在第二多肽的表面导入相应的空洞(“孔”)以能够使突出部插入空洞来促进异源二聚体生成并抑制同源二聚体生成。突出部通过在第一多肽的表面将小的氨基酸支链取代为更大的支链(例如酪氨酸和色氨酸)来构成。通过将大的氨基酸支链取代为小的支链(例如丙氨酸和苏氨酸)来在第二多肽的表面生成与突出部相同或相似大小的互补性的空洞。

根据本发明的具体实例，本发明的非对称抗体可以为VL-linker-VH-CH2-CH3形式的scFv与VL-Cκ-linker-VH-CH1-CH2-CH3形式的Fa b结合的形式。

发明的效果

概括本发明的特征及优点如下。

(i)本发明提供一侧包含scFv及另一侧包含Fab的补体依赖性细胞毒性作用得到提高的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段。

(ii)与对称结构的抗体相比，本发明的非对称抗体表现出显著提高的补体依赖性细胞毒性作用，可以在诱导利妥昔单抗等抗癌剂耐药性的多种疾病中从根本上消除耐药性并有效用作显著改善治疗反应性的有效的治疗剂或治疗辅助剂。

附图说明

图1示出IgG与非对称形式的抗体的示意图。

图2为非对称形式的抗CD20(anti-CD20)抗体的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果。

图3为非对称形式的抗CD20抗体对CD20的亲和度分析酶联免疫吸附测定结果。

图4为通过测定C4d浓度来比较利妥昔单抗与非对称形式的抗CD20抗体的补体激活能力的酶联免疫吸附测定结果。

图5为在表现出对利妥昔单抗的耐药性的Ramos-RR细胞中比较利妥昔单抗与非对称形式的抗CD20抗体的补体依赖性细胞毒性作用效果的结果。

具体实施方式

以下，通过实施例更为详细地说明本发明。但这些实施例仅用于更为具体地说明本发明，本发明所属技术领域的普通技术人员应该自明的是，根据本发明的要旨，本发明的范围不限定于这些实施例。

实施例

实施例1.克隆用于动物细胞表达的非对称形式的抗CD20抗体

为了避免重链之间与所不希望的对(pair)配对，非对称形式的抗CD20抗体使用旋钮-孔方法，为避免轻链之间的错配，使用由Gly与Ser构成的接头(linker)。分别以CD20-scFv-旋钮(VL-linker20-VH-CH2-CH3)和CD20-Fab-孔(VL-Cκ-linker40-VH-CH1-CH2-CH3)形式进行克隆，CD20-scFv-旋钮基于药物数据银行(Drug Data Bank)所示的利妥昔单抗序列(sequence)利用表1所示的引物组合进行聚合酶链式反应(PCR)。扩增的基因组处理BssHII和XbaI(新英格兰生物实验室(New England Biolab)，英国)酶，将其连接到同样以相同的限制酶处理的作为动物细胞表达用载体的pMAZ载体。通过施加热冲击将连接完毕的质粒转化到DH5α感受态细胞(competent cell)(新英格兰生物实验室，英国)后，通过大量培养获得的菌落来获得质粒。

为了制备CD20-Fab-孔(VL-Cκ-linker40-VH-CH1-CH2-CH3)形式，与CD20-scFv-旋钮同样基于药物数据银行所示的利妥昔单抗序列利用表2所示的引物组合进行聚合酶链式反应。扩增的基因组处理BssHII和XbaI酶，将其连接到同样以相同的酶处理的作为动物细胞表达用载体的pMAZ载体。通过施加热冲击将连接完毕的质粒转化到DH5α感受态细胞(新英格兰生物实验室，英国)后，通过培养获得的菌落获得质粒并完毕序列分析(表3)。

表1

克隆CD20-scFv-旋钮时使用的引物列表

表2

克隆CD20-Fab-孔时使用的引物列表

表3

/>

CD20-scFv-旋钮和CD20-Fab-孔的氨基酸序列

实施例2.在动物细胞中表达及纯化

利用序列13及序列14的序列各质粒将非对称形式的抗CD20抗体利用聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)(Polysciences公司，美国)和150mM的氯化钠(NaCl)转染(Transfection)到HEK293F细胞(英杰公司(Invitrogen)，美国)，在Freestyle 293表达培养基(expression medium)(英杰公司，美国)中以37℃的温度、8％的CO₂以及55％湿度(Humidity)的条件培养7天。以4000rpm离心分离表达细胞培养液10分钟后，取上清液并通过0.22μm的过滤器(filter)过滤。在4℃的温度下诱导过滤的上清液与1ml的KappaSelect(GE Healthcare公司，美国)树脂结合。使用10cv(柱体积(column volume))的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤结合的树脂(resin)后，使用100mM的甘氨酸盐酸盐(glycine-HCl)(pH 2.7)溶液洗脱结合的抗体后，使用1M的Tris-HCL(pH 9.0)中和。使用pH7.2～7.4的磷酸盐缓冲溶液进行缓冲液更换(buffer change)后，通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳确认纯化的抗体的轻链和重链的大小及纯度，结果可以确认与理论计算值一致的分子量和高的纯度(图2)。

非对称形式的抗CD20抗体为一侧的结合部位是Fab而另一侧的结合部位是scFv的异型(hetero form)。利用Fab的Cκ(C kappa)部分通过KappaSelect纯化时可以抑制已知纯化双抗体时可能性最高的纽扣-纽扣同源二聚体(knob-knob homodimer)或纽扣单体(knobmo nomer)(Giese,et al.,Bispecific antibody process development:Ass embly andpurification of knob and hole bispecific antibodies.Biotec hnol Prog,34(2)397-404)的生成并只获得所希望形式的异源二聚体。

实施例3.通过酶联免疫吸附测定确认非对称形式的抗CD20抗体与CD20的结合力

通过间接酶联免疫吸附测定(indirect ELISA)确认上述实施例2中制备的非对称形式的抗CD20抗体对作为靶向抗原的CD20的亲和度。

Indirect ELISA为在50μl的磷酸盐缓冲溶液中将CD20胞外域环(ectodomainloop)区域的抗原稀释为1μg/ml并放入96孔免疫酶标板(康宁公司(Corning)，美国)后，在4℃的温度下保管并过夜吸附。在常温下使用包含4％的脱脂牛奶(skim milk)(BD公司，美国)的缓冲溶液反应1小时后，使用包含0.5％的吐温20(Tween 20)(Am resco公司，美国)的缓冲溶液洗涤3次，向各孔处理50μl的按照顺序浓度(0.1nM、0.3nM、1nM、3nM、11nM、33nM、100nM)稀释的各抗体。在常温下反应2小时来使抗体能够与抗原结合后，使用包含0.5％的吐温20(Amresco公司，美国)的缓冲溶液洗涤3次。使用包含2％的脱脂牛奶的缓冲溶液将抗人免疫球蛋白Fc-HRP抗体(Jackson Imm unoresearch公司，美国)以1∶3000的比例稀释并向每孔处理50μl后，在常温下反应1小时。反应结束后，使用包含0.5％的吐温20(Amres co公司，美国)的缓冲溶液洗涤3次后，每孔放入50μl的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine，TMB)(赛默飞世尔公司(ThermoFisher Scientific)，美国)后显色10分钟。利用分光光度计(博腾公司(Biotek)，美国)在450nm的波长中测定吸光度，结果如图3所示。结果，非对称形式的抗CD20抗体对CD20表现出与利妥昔单抗同等水平的结合力。

实施例4.通过C4d酶联免疫吸附测定确认非对称形式的抗CD20抗体的补体激活能 力

通过C4d酶联免疫吸附测定确认上述实施例2中制备的非对称形式的抗CD20抗体的补体激活能力。C4d为有关补体经典途径的激活的标记物(marker)(Cohen,et al.,Prosand cons for C4d as a bioma rker.Kidney Int.,81(7)628-39)，可以通过测定C4d浓度来确认补体激活能力。

首先使10μl的100μg/ml浓度的利妥昔单抗或非对称形式的抗CD 20抗体与90μl的1mg/ml浓度的补体(快臻公司(Quidel)，美国)反应1小时后，稀释10倍并使用MicroVue补体C4d片段EIA试剂盒(Complement C4d Fragment EIA kit)(快臻公司，美国)测定C4d浓度，结果如图4所示。结果，与作为补体依赖性细胞毒性的主要治疗机制的利妥昔单抗相比，非对称形式的抗CD20抗体的C4d浓度增加。这表示非对称形式的抗CD20抗体的补体激活能力比利妥昔单抗优秀。

实施例5.在作为利妥昔单抗耐药性细胞株的Ramos-RR中确认非对称形式的抗 CD20抗体的补体依赖性细胞毒性作用

在对利妥昔单抗表现出耐药性的Ramos-RR中确认利妥昔单抗以及非对称形式的抗CD20抗体的补体依赖性细胞毒性作用。向5×10⁵个Ramos-RR细胞的各个样品处理100μl的使用添加有20％的人补体血清(complement sera human)(西格玛公司(Sigma)，美国)的RPMI培养基稀释为20μg/ml浓度的利妥昔单抗或非对称形式的抗CD20抗体后，在37℃/5％CO₂的条件下培养2小时。然后，利用含7-AAD的FI TC膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒(FITCAnnexin V Apoptosis Det ection Kit with 7-AAD)(生物传奇公司(BioLegend)，美国)通过作为荧光激活细胞分选(FACS)分析设备Attune NxT(赛默飞世尔公司，美国)确认细胞凋亡来观察补体依赖性细胞毒性作用(图5)。利妥昔单抗对Ramos-RR细胞的补体依赖性细胞毒性作用低，但非对称形式的抗CD20抗体增加了该效果。

这样的结果表明，与IgG抗体相比，非对称形式的抗体通过有效激活补体来有效诱导补体依赖性细胞毒性作用，表示在以补体依赖性细胞毒性作用为主要治疗机制的癌症治疗用抗体的情况下，非对称形式的抗体更有利于癌症治疗。

以上，说明了本发明的实施例，本发明所属技术领域的普通技术人员可以在不脱离发明要求保护范围中记载的本发明的思想范围内通过结构要素的附加、变更、删除或追加等来多种多样地修正及变更本发明，这些也包括在本发明的权力范围内。

<110> SG医疗株式会社

<120> 具有提高的癌细胞杀灭功效的非对称抗体

<130> HPC-10589

<150> KR 10-2021-005092

<151> 2021-04-20

<160> 54

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL Primer (F) CD20-scFv-knob

<400> 1

cgcagcgagc gcgcactccc agatcgtcct gagtcagagc c 41

<210> 2

<211> 86

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL Primer (R) CD20-scFv-knob

<400> 2

agagccgcca gatccactgc ctcctccacc gctaccgcca ccaccactcc cgcctccgcc 60

cttaatctcc aatttagttc ccccgc 86

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH Primer (F) CD20-scFv-knob

<400> 3

gcagtggatc tggcggctct caggtccagc tccaacagcc c 41

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH Primer (R) CD20-scFv-knob

<400> 4

ggtgggcatg tgtgagtttt gtctgagccg ccagcactca ccgtcacagt ggtac 55

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH Primer (F) CD20-scFv-knob

<400> 5

gacaaaactc acacatgccc acc 23

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH Primer (R) CD20-scFv-knob

<400> 6

ctctccctgt ccccgggtaa atgactagaa cta 33

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL- CK Primer (F) CD20-Fab-hole

<400> 7

cgcagcgagc gcgcactccc agattgtcct gtctcagtct cctgc 45

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL- CK Primer (R) CD20-Fab-hole

<400> 8

cggccgccgt gcgagatctt ttgatttcca gtttagttcc gccg 44

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH Primer (F) CD20-Fab-hole

<400> 9

caagtccaac tgcaacaacc ggg 23

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH Primer (R) CD20-Fab-hole

<400> 10

ggaagaccga tgggcccttg aagctagcgg cggaaaccgt tgtgccagag 50

<210> 11

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH Primer (F) CD20-Fab-hole

<400> 11

gcaagcttca agggc 15

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH Primer (R) CD20-Fab-hole

<400> 12

ctctccctgt ccccgggtaa atgactagaa cta 33

<210> 13

<211> 477

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD20-scFv-knob

<400> 13

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gln Val

115 120 125

Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val

130 135 140

Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met

145 150 155 160

His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala

165 170 175

Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly

180 185 190

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

195 200 205

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

210 215 220

Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly

225 230 235 240

Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys

245 250 255

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

260 265 270

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

275 280 285

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

290 295 300

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

305 310 315 320

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

325 330 335

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

340 345 350

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

355 360 365

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

370 375 380

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys

385 390 395 400

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

405 410 415

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

420 425 430

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

435 440 445

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

450 455 460

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470 475

<210> 14

<211> 706

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD20-Fab-hole

<400> 14

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Arg Thr Ala Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gln

245 250 255

Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser

260 265 270

Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn

275 280 285

Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly

290 295 300

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

305 310 315 320

Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

325 330 335

Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

340 345 350

Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala

355 360 365

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Phe Lys Gly Pro Ser Val

370 375 380

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

385 390 395 400

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

405 410 415

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

420 425 430

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

435 440 445

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

450 455 460

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

465 470 475 480

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

485 490 495

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

500 505 510

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

515 520 525

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

530 535 540

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

545 550 555 560

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

565 570 575

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

580 585 590

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

595 600 605

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

610 615 620

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

625 630 635 640

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

645 650 655

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

660 665 670

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

675 680 685

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

690 695 700

Gly Lys

705

<210> 15

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LFR1 of CD20-scFv-knob

<400> 15

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys

20

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR1 of CD20-scFv-knob

<400> 16

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LFR2 of CD20-scFv-knob

<400> 17

Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR2 of CD20-scFv-knob

<400> 18

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 19

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LFR3 of CD20-scFv-knob

<400> 19

Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR3 of CD20-scFv-knob

<400> 20

Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LFR4 of CD20-scFv-knob

<400> 21

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 22

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Linker of CD20-scFv-knob

<400> 22

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Ser Gly Gly Ser

20

<210> 23

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HFR1 of CD20-scFv-knob

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

20 25 30

<210> 24

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR1 of CD20-scFv-knob

<400> 24

Ser Tyr Asn Met His

1 5

<210> 25

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HFR2 of CD20-scFv-knob

<400> 25

Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR2 of CD20-scFv-knob

<400> 26

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 27

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HFR3 of CD20-scFv-knob

<400> 27

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR3 of CD20-scFv-knob

<400> 28

Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val

1 5 10

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HFR4 of CD20-scFv-knob

<400> 29

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210> 30

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH2 of CD20-scFv-knob

<400> 30

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

115 120

<210> 31

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH3 of CD20-scFv-knob

<400> 31

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 32

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LFR1 of CD20-Fab-hole

<400> 32

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys

20

<210> 33

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR1 of CD20-Fab-hole

<400> 33

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His

1 5 10

<210> 34

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LFR2 of CD20-Fab-hole

<400> 34

Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR2 of CD20-Fab-hole

<400> 35

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 36

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LFR3 of CD20-Fab-hole

<400> 36

Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 37

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LCDR3 of CD20-Fab-hole

<400> 37

Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LFR4 of CD20-Fab-hole

<400> 38

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 39

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Ckappa of CD20-Fab-hole

<400> 39

Arg Thr Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 40

<211> 40

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Linker of CD20-Fab-hole

<400> 40

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser

35 40

<210> 41

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HFR1 of CD20-Fab-hole

<400> 41

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

20 25 30

<210> 42

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR1 of CD20-Fab-hole

<400> 42

Ser Tyr Asn Met His

1 5

<210> 43

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HFR2 of CD20-Fab-hole

<400> 43

Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR2 of CD20-Fab-hole

<400> 44

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 45

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HFR3 of CD20-Fab-hole

<400> 45

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 46

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HCDR3 of CD20-Fab-hole

<400> 46

Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val

1 5 10

<210> 47

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HFR4 of CD20-Fab-hole

<400> 47

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210> 48

<211> 103

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH1 of CD20-Fab-hole

<400> 48

Ala Ser Phe Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

100

<210> 49

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH2 of CD20-Fab-hole

<400> 49

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

115 120

<210> 50

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH3 of CD20-Fab-hole

<400> 50

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 51

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL of CD20-scFv-knob

<400> 51

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 52

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH of CD20-scFv-knob

<400> 52

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 53

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VL of CD20-Fab-hole

<400> 53

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 54

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VH of CD20-Fab-hole

<400> 54

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115 120

Claims (22)

1.一种抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段，其补体依赖性细胞毒性作用得到提高，其特征在于，包含：

(a)单链可变片段，包含序列16的LCDR1、序列18的LCDR2、序列20的LCDR3、序列24的HCDR1、序列26的HCDR2以及序列28的HCDR3序列；以及

(b)抗原结合片段，包含序列33的LCDR1、序列35的LCDR2、序列37的LCDR3、序列42的HCDR1、序列44的HCDR2以及序列46的HCDR3序列。

2.根据权利要求1所述的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述单链可变片段包含序列51的轻链可变区序列。

3.根据权利要求1所述的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述单链可变片段包含序列52的重链可变区序列。

4.根据权利要求1所述的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述单链可变片段包含选自由序列15的LFR1、序列17的LFR2、序列19的LFR3、序列21的LFR4、序列23的HFR1、序列25的HFR2、序列27的HFR3以及序列29的HFR4组成的组中的序列。

5.根据权利要求1所述的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述单链可变片段为VL-接头-VH形式。

6.根据权利要求5所述的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述接头为Gly与Ser的组合。

7.根据权利要求1所述的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗原结合片段包含序列53的轻链可变区序列。

8.根据权利要求1所述的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗原结合片段包含序列54的重链可变区序列。

9.根据权利要求1所述的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗原结合片段包含选自由序列32的LFR1、序列34的LFR2、序列36的LFR3、序列38的LFR4、序列41的HFR1、序列43的HFR2、序列45的HFR3以及序列47的HFR4组成的组中的序列。

10.根据权利要求1所述的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗原结合片段包含序列39的Cκ序列。

11.根据权利要求1所述的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗原结合片段包含序列48的CH1序列。

12.根据权利要求1所述的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述抗原结合片段为VL-Cκ-接头-VH-CH1形式。

13.根据权利要求12所述的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述接头为Gly与Ser的组合。

14.一种核酸分子，其特征在于，编码权利要求1所述的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段。

15.一种载体，其特征在于，包含权利要求14所述的核酸分子。

16.一种分离的宿主细胞，其特征在于，由权利要求15所述的载体转化。

17.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段、编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子或包含上述核酸分子的载体作为有效成分。

18.一种预防或治疗癌症的方法，其特征在于，包括向对象给予药学有效量的权利要求1所述的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段、编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子或包含上述核酸分子的载体的步骤。

19.权利要求1所述的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段、编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子或包含上述核酸分子的载体的治疗用途。

20.一种用于诊断癌症的组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段、编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子或包含上述核酸分子的载体作为有效成分。

21.一种补体依赖性细胞毒性作用得到提高的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，包括：

步骤(a)，制备包含序列16的LCDR1、序列18的LCDR2、序列20的LCDR3、序列24的HCDR1、序列26的HCDR2以及序列28的HCDR3序列的单链可变片段；以及

步骤(b)，制备包含序列33的LCDR1、序列35的LCDR2、序列37的LCDR3、序列42的HCDR1、序列44的HCDR2以及序列46的HCDR3序列的抗原结合片段。

22.一种编码补体依赖性细胞毒性作用得到提高的抗CD20非对称抗体或其抗原结合片段的核酸分子的制备方法，其特征在于，包括：

步骤(a)，制备编码包含序列16的LCDR1、序列18的LCDR2、序列20的LCDR3、序列24的HCDR1、序列26的HCDR2以及序列28的HCDR3序列的单链可变片段的核酸分子；以及

步骤(b)，制备编码包含序列33的LCDR1、序列35的LCDR2、序列37的LCDR3、序列42的HCDR1、序列44的HCDR2以及序列46的HCDR3序列的抗原结合片段的核酸分子。