NO316704B1 - Fremgangsmate for rensing av serinproteaser ved anvendelse av et immobilisert polypeptid med samme aktivitet som inhibitor DE-3 fra E. caffra, samt fremstilling og anvendelse av nevnte polypeptid - Google Patents
Fremgangsmate for rensing av serinproteaser ved anvendelse av et immobilisert polypeptid med samme aktivitet som inhibitor DE-3 fra E. caffra, samt fremstilling og anvendelse av nevnte polypeptid Download PDFInfo
- Publication number
- NO316704B1 NO316704B1 NO19963849A NO963849A NO316704B1 NO 316704 B1 NO316704 B1 NO 316704B1 NO 19963849 A NO19963849 A NO 19963849A NO 963849 A NO963849 A NO 963849A NO 316704 B1 NO316704 B1 NO 316704B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- polypeptide
- inhibitor
- nucleic acid
- host cells
- activity
- Prior art date
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 50
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 50
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 title claims abstract description 33
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 241000219767 Erythrina caffra Species 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 37
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 21
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 10
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 8
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 8
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 6
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims description 5
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 11
- 241000219766 Erythrina Species 0.000 description 29
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 5
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 3
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 3
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- -1 sulfopropyl Chemical group 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000702374 Enterobacteria phage fd Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010002231 IgA-specific serine endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- 241000194034 Lactococcus lactis subsp. cremoris Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100408135 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) phnA gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 235000014962 Streptococcus cremoris Nutrition 0.000 description 1
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- ZCHPKWUIAASXPV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;methanol Chemical compound OC.CC(O)=O ZCHPKWUIAASXPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CUJRVFIICFDLGR-UHFFFAOYSA-N acetylacetonate Chemical compound CC(=O)[CH-]C(C)=O CUJRVFIICFDLGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150044170 trpE gene Proteins 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en forbedret fremgangsmåte for rensing av serinproteaser ved anvendelse av den rekombinante inhibitor DE-3 fra Erythrina caffra. Immobiliserte trypsininhibitorer fra Erythrina (ETI) er effektive reagenser for den affinitetskromatografiske rensing av serinproteaser, spesielt plasminogenaktivatorer (C. Heussen, J. Biol. Chem. 259 (1984) 11635-11638), trypsin, ochymotrypsin og trombin (S. Onesti et al., J. Mol. Recogn. 5 (1992) 105-114). Disse trypsininhibitorer har vært kjent i lang tid (C. Heussen, Haemostasis 11
(1982) P47 (Supplement); F. J. Joubert, Phytochemistry 21 (1982) 1213-1217; F. J. Joubert, Int. J. Biochem. 14 (1982) 187-193).
Inhibitoren DE-3 fra E. caffra er spesielt egnet til
affinitetskromatografisk rensing av plasminogenaktivatorer (F. J. Joubert in Thrombosis and Haemostasis 57 (1987) 356-360). I denne publikasjon er også den komplette aminosyresekvens for denne inhibitor beskrevet. DE-3 kan isoleres og renses fra frø av E. caffra (F. J. Joubert, Int. J. Biochem. 14 (1982) 187-193).
I Teixeira et al., Biochimica et Biophysica Acta 1217 (1994) 16-22 beskrives en rekombinant ETI med en spesifikk inhibitorisk aktivitet overfor vevsplasminogenaktivator på 1,7 x 10<9> U/mmol. Den spesifikke inhibitoriske aktivitet av naturlig ETI er i sammenligning 1,94 x IO<9> U/mmol. Det analoge forhold gjelder for den inhibitoriske aktivitet overfor trypsin (2,63 x 10<I2>/3,21 x IO<12>). Den spesifikke inhibitoriske aktivitet av rekombinant ETI fremstilt etter publikasjonen av Teixeira et al. overfor trypsin og vevsplasminogenaktivator, er således 20 % lavere enn aktiviteten av naturlig ETI.
Ifølge Teixeira et al. fremstilles rekombinant ETI ved ekspresjon og renses ved hjelp av en ammoniumsulfatutfelling (80 % metning), dialyse mot vann og en cyanbromidspaltning, hvorved den N-terminale sekvens, inkludert metionin, avspaltes. Deretter utføres kromatografering på en affinitetskromatografisøyle (Sephadex G50).
Målet for foreliggende oppfinnelse er forbedring av effektiviteten av fremgangsmåter for rensing av serinproteaser under anvendelse av ETL
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for rensing av serinproteaser fra en proteinblanding ved binding av serinproteasen til et immobilisert polypeptid som besitter aktiviteten til en inhibitor DE-3 fra Erythrina caffra, fjerning av de ubundne materialer fra proteinblandingen, separering av serinproteasen fra inhibitoren, atskillelse av den immobiliserte inhibitor fra den løselige serinprotease og isolering av serinproteasen, kjennetegnet ved at det som polypeptid anvendes et polypeptid som er produktet fra en prokaryot eller eukaryot ekspresjon av en eksogen nukleinsyre (fortrinnsvis DNA) og som renses kromatografisk ved hjelp av en anionutbytter, kationutbytter eller en nikkelchelatsøyle.
Foreliggende oppfinnelse angår også anvendelse av et polypeptid med aktiviteten til en inhibitor DE-3 fra Erythrina caffra som er produktet av en prokaryot eller eukaryot ekspresjon av en eksogen nukleinsyre og som renses kromatografisk ved hjelp av en anionutbytter, kationutbytter eller nikkelchelat, for affinitetskromatografisk rensing av serinproteaser.
Det ble overraskende funnet at et rekombinant fremstilt polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse som besitter aktiviteten til en inhibitor DE-3 fra Erythrina caffra, i motsetning til inhibitor DE-3 fra E. caffra isolert fra naturlige kilder, har en betydelig høyere spesifikk affinitet overfor serinproteaser.
Under "aktivitet" av en inhibitor DE-3 fra E. caffra skal det hovedsakelig forstås den spesifikke, inhibitoriske aktivitet overfor serinproteaser, spesielt overfor vevsplasminogenaktivatorer. Inhibitorens spesifikke inhibitoriske aktivitet er således 1,07 U/mg eller høyere overfor trypsin. Inhiberingen foregår ved en binding mellom inhibitor og serinprotease.
Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt fordelaktig egnet for rensing av plasminogenaktivatorer, slik som vevsplasminogenaktivatorer (t-PA) og derivater (f.eks. mutasjoner og delesjoner). t-PA og derivater er f.eks. beskrevet i EP-B 0 093 619, USP 5 223 256, WO 90/09437 T. J. R. Harris, Protein Engineering 1 (1987) 449-458.
Fremstilling av den rekombinante inhibitor kan utføres etter fremgangsmåter kjent for fagfolk.
Ved denne fremgangsmåte fremstilles først en nukleinsyre (fortrinnsvis DNA) som er i stand til å produsere et protein som besitter aktiviteten til inhibitoren DE-3. DNA klones i en vektor som kan overføres til en vertscelle og er repliserbar i denne. En slik vektor inneholder, i tillegg til en inhibitorsekvens, operatorelementer som fordres for ekspresjon av DNA. Denne vektor som inneholder inhibitor-DNA og operatorelementene overføres i en vektor som er i stand til å uttrykke DNA for inhibitoren. Vertscellen dyrkes under betingelser som tillater ekspresjon av inhibitoren. Inhibitoren isoleres fra disse celler. Ved hjelp av egnede forholdsregler blir det dessuten sikret at aktivatoren kan innta en tertiær struktur i hvilken den oppviser inhibitoregenskaper.
Det er ikke nødvendig at inhibitoren har den nøyaktige aminosyresekvens som tilsvarer SEKVENS.ID.nr.: 2. Like egnede er inhibitorer som i det vesentlige har samme sekvens og som er polypeptider med aktivitet (bindingsevne til serinproteaser, spesielt t-PA) som en inhibitor DE-3 fra Erythrina caffra. Det har vist seg at en overensstemmelse mellom aminosyresekvensene på 80 %, fortrinnsvis 90 %, er fordelaktig. Aminosyresekvensen SEKVENS.ID.nr.: 2 er imidlertid foretrukket, hvorved, i tilfellet med ekspresjon i prokaryote vertsceller men imidlertid ikke etter eukaryot
ekspresjon, et N-terminalt metionin erholdes.
En ytterligere gjenstand for foreliggende oppfinnelse er en nukleinsyre
som i alt vesentlig er identisk med nukleotider 9 til 527 i SEKVENS.ID.nr.: 1, og som koder for et polypeptid med aktivitet som en inhibitor DE-3 fra Erythrina caffra, eller en nukleinsyre som koder for det samme polypeptid innen rammen for degenerasjonen den genetiske kode. Et DNA, spesielt et DNA med sekvens 9 til 527 i SEKVENS.ID.nr.: 1 er foretrukket. For ekspresjon i eukaryote eller prokaryote vertsceller inneholder nukleinsyrene i 5'-enden de for fagfolk kjente eukaryote eller prokaryote transkripsjons- og translasjonssignaler.
Nukleinsyresekvensen av inhibitoren er fortrinnsvis identisk med nukleotider 9 til 527 i SEKVENS.ID.nr.: 1. For å lette fremstillingen av vektorene eller optimalisere ekspresjonen kan det også utføres modifikasjoner. Slike modifikasjoner er f.eks.: -endring av nukleinsyrene for å innføre forskjellige gjenkjennelsessekvenser for restriksjonsenzymer for å lette trinnene med ligering, kloning og mutagenese, -endring av nukleinsyrene for å inkorporere gunstige kodoner for vertscellen. -supplering av nukleinsyrene med ytterligere operatorelementer for å optimalisere ekspresjonen i vertscellen.
Ekspresjonen av inhibitoren foregår fortrinnsvis i mikroorganismer som E. coli. En ekspresjon i eukaryote celler som gjær, CHO-celler eller insektceller, er imidlertid også mulig.
Ved dette anvendes biologisk funksjonelle plasmider eller virus-DNA-vektorer som i det vesentlige inneholder nukleotider 9 til 527 i SEKVENS.ID.nr.: 1, eller en nukleinsyre som koder for det samme polypeptid innen rammen for degenerasjonen av den genetiske kode. Prokaryote eller eukaryote vertsceller transformeres eller transfekteres stabilt med slike vektorer.
Oppfinnelsen angår dermed et biologisk funksjonelt plasmid eller virus-DNA-vektor, kjennetegnet ved at den inneholder en nukleinsyre.
Oppfinnelsen angår også en prokaryot eller eukaryot vertscelle, kjennetegnet ved at den transformeres eller transfekteres stabilt med en DNA-vektor.
Ekspresjonsvektorene må inneholde en promotor som tillater ekspresjon av inhibitorproteinet i vertsorganismen. Slike promotorer er kjent for fagfolk og er f.eks. lac-promotor (Chang et al., Nature 198 (1977) 1056), trp (Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057), <x>PL-promotor (Shimatake et al., Nature 292 (1981) 128) og T5-promotor (US patent nr. 4 689 406). Syntetiske promotorer som f.eks. tac-promotor (US patent nr. 4 551 433) er også egnede. Koblede promotorsystemer som f.eks. T7-RNA-polymerase/promotorsystem (Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113) er også egnede. Hybride promotorer fra en bakteriofagpromotor og operatorområdet for mikroorganismen (EP-A 0 267 851) er også egnede. I tillegg til promotor fordres også et effektivt ribosombindingssted. For E. coli betegnes dette ribosombindingssted som Shine-Dalgarno (SD)-sekvensen (Shine et al., Nature (1975) 25434; J. Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA).
For å forbedre ekspresjonen er det mulig å uttrykke inhibitorproteinet som fusjonsprotein. I dette tilfelle fusjoneres på vanlig måte et DNA som koder for den N-terminale del av et endogent bakterieprotein eller et annet stabilt protein, til 5'-enden av sekvensen som koder for inhibitorproteinet. Eksempler på slike er lacZ, trpE.
Etter ekspresjon spaltes fortrinnsvis fusjonsproteinet med enzymet (faktor Xa) (Nagai et al., Nature 309 (1984) 810). Ytterligere eksempler på spaltingsseter er IgA-protease-spaltingssetet (WO 91/11520) og Ubiquitin-spaltingssetet (Miller et al., Bio/Technology 7 (1989) 698).
Det rekombinante protein erholdt som inaktive inklusjonslegemer kan overføres i løselig aktivt protein ved hjelp av fremgangsmåter kjent for fagfolk. Ved dette reduseres inklusjonslegemene f.eks. med guanidinhydroklorid eller urea oppløst i nærvær av et reduksjonsmiddel, reduksjonsmidlet fjernes f.eks. ved dialyse og renatureres, fortrinnsvis ved anvendelse av et redokssystem som redusert og oksidert glutation.
Slike metoder er f.eks. beskrevet i US-P 4 933 434, EP-B 0 241 022 og EP-A 0 219 874.
Det er likeledes mulig å utskille proteinene fra mikroorganismene i form av aktive proteiner. Ved dette anvendes fortrinnsvis et fusjonsprotein som består av signalsekvensen og nukleinsyrene som koder for inhibitorproteinet og som er egnet for utskillelse av proteiner i den anvendte vertsorganisme (US patent nr. 4 336 336). Proteinet utskilles derved enten i mediet (for grampositive bakterier) eller i det periplasmatiske rom (for gramnegative bakterier). Mellom signalsekvensen og sekvensen som koder for inhibitoren er det fortrinnsvis anbrakt et spaltingssted som tillater avspalting av inhibitorproteinet, enten ved bearbeidelsen eller i et ytterligere trinn. Slike signalsekvenser er f.eks. ompA (Ghryeb et al., EMBO J. 3 (1984) 2437), og phoA (Oka et al., Proe. Nati. Acac. Sei. USA 82 (1985) 7212).
Vektorene inneholder dessuten ytterligere terminatorer. Terminatorer er DNA-sekvenser som signaliserer slutten på et transkripsjonsforløp. De markerer seg mest ved to strukturelle egenarter: Et omvendt gjentakende G/C-rekkeområde som intramolekylært kan danne en dobbeltheliks, så vel som et antall U (hhv. T)-rester. Eksempler er trp-attenuator og terminator i DNA hos fag fd og rrnB (Brosius et al., J. Mol. Biol. 148 (1981) 107-127).
Ekspresjonsvektorene inneholder dessuten vanligvis en selekterbar markør for å selektere transformerte celler. Slike selekterbare markører er f.eks. resistensgenet for ampicillin, kloramfenikol, erytromycin, kanamycin, neomycin og tetrasyklin (Davies et al., Ann. Rev. Microbiol. 32 (1978) 469). Egnede selekterbare markører er likeledes genene for essensielle stoffer i biosyntesen og nødvendige stoffer for celler, som f.eks. histidin, tryptofan og leucin.
Et stort antall egnede bakterielle vektorer er kjent. Vektorer for de følgende bakterier er spesielt beskrevet: Bacillus subtilis (Palva et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79 (1982) 5582), E. coli (Aman et al., Gene 40 (1985) 183; Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113), Streptococcus cremoris (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988) 655), Streptococcus lividans og Streptomyces lividans (US patent nr. 4 747 056).
En ekspresjon av inhibitorproteiner er, foruten i prokaryote mikroorganismer, også mulig i eukaryoter (som f.eks. CHO-celler, gjær- eller insektceller). Som eukaryot ekspresjonssystem er gjær- og insektceller foretrukne. Ekspresjonen i gjær kan foregå ved hjelp av tre typer av gjærvektorer (integrerende YIp (gjær-integrerende plasmider)-vektorer, repliserende YRp (gjær-replikonplasmider)-vektorer og episomale YEp (gjær-episomale plasmider)-vektorer). Dette er nærmere beskrevet i f.eks. S. M. Kingsman et al., Tibtech 5 (1987) 53-57.
Ytterligere genteknologiske fremgangsmåter for fremstilling og ekspresjon av egnede vektorer er beskrevet i J. Sambrook et al., "Ekspression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA).
Etter fremstilling utføres rensingen av rekombinant ETI kromatografisk ved hjelp av en anionutbytter, f.eks. en "Q-Sepharose"-søyle, en kationutbytter (f.eks. på sulfopropylbasis) eller ved hjelp av en nikkelchelatsøyle, som f.eks. beskrevet i Porath J. & Olin, B., Biochemistry 22 (1983), 1621-1630. Overraskende erholdes etter denne rensingsfremgangsmåte en rekombinant ETI hvis inhibitorisk aktivitet overfor serinproteaser som trypsin og vevsplasminogenaktivator er vesentlig høyere enn den inhibitoriske aktivitet av naturlig ETL
Denne oppfinnelsen gjelder dermed også fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid med samme aktivitet som en inhibitor DE-3 fra Erythrina caffra, kjennetegnet ved at dyrking av prokaryote eller eukaryote vertsceller som er transformert eller transfektert med en eksogen nukleinsyre som i alt vesentlig tilsvarer sekvensen nukleotid 9 til 527 i SEKVENS.ID.nr.: 1, eller en nukleinsyre som koder for det samme polypeptid innen rammen for degenerasjonen av den genetiske kode, på en måte som tillater vertscellene, under egnede næringsstoffbetingelser, å uttrykke polypeptidet, etterfulgt av isolering av det ønskede polypeptid som er kjennetegnet ved at det har en spesifikk inhibitorisk aktivitet på ca. 1,07 U/mg overfor trypsin.
Et således fremstilt renset polypeptid besitter aktiviteten til en inhibitor DE-3 fra Erythrina caffra og kan erholdes ved dyrkning av prokaryote eller eukaryote vertsceller som ved hjelp av en eksogen nukleinsyre (fortrinnsvis DNA) som vesentlig tilsvarer sekvensen nukleotid 9 til 527 av SEKVENS.ID.nr.: 1, eller en nukleinsyre som koder for det samme polypeptid innen rammen for degenerasjonen av den genetiske kode, transformeres eller transfekteres på en måte som, under egnede næringsstoffbetingelser, tillater at vertscellen uttrykker polypeptidet, etterfulgt av isolering av det ønskede polypeptid som besitter en spesifikk inhibitorisk aktivitet på ca. 1,07 U/mg eller høyere (fortrinnsvis 1,07 til 1,8 U/mg) overfor trypsin. Ved forskjellige tilsetninger av rekombinant ETI ble det som spesifikk aktivitet f.eks. funnet 1,2, 1,5 og 1,6 U/mg. Denne aktivitet erholdes etter kromatografisk rensing på en anionutbytter, kationutbytter eller på en nikkelchelatsøyle.
Foreliggende oppfinnelse angår ytterligere en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant polypeptid som besitter aktiviteten til en inhibitor DE-3 fra Erythrina caffra, ved dyrkning av prokaryote eller eukaryote vertsceller som ved hjelp av en eksogen nukleinsyre (fortrinnsvis DNA), som vesentlig tilsvarer sekvensen nukleotid 9-527 i SEKVENS.ID.nr.: 1, eller en nukleinsyre som koder for det samme polypeptid innen rammen for degenerasjonen av den genetiske kode, transformeres eller transfekteres på en måte som tillater at vertscellen, under egnede næringsstoffbetingelser, uttrykker polypeptidet, etterfulgt av isolering av polypeptidet fra vertscellene og kromatografisk rensing på en anionutbytter, kationutbytter eller en nikkelchelatsøyle.
Rensingen av serinproteaser under anvendelse av rekombinante ETI utføres ved hjelp av fremgangsmåter kjent for fagfolk (se f.eks. F. J. Joubert (1987)). ETI blir herved kovalent bundet til en matriks (f.eks. CNBr-Sepharosesøyle), og proteinblandingen som inneholder serinproteasen appliseres ved nøytrale eller svakt alkaliske betingelser på søylen og kromatograferingen gjennomføres. Elueringen utføres ved senking av pH til ^ 5,5, eller ved anvendelse av bufferløsninger som inneholder kaotrope midler, som f.eks. KSCN. Eluatet har en proteinrenhet høyere enn 95 % med hensyn til serinproteasen. For videre anvendelse overføres serinproteasen fortrinnsvis i den ønskede bufferløsning gjennom dialyse.
Immobiliseringen av inhibitoren og alle ytterligere fremgangsmåtetrinn for rensing av serinprotease og t-PA kan gjennomføres på analog måte som for inhibitor DE-3 isolert fra E. caffra. Slike fremgangsmåter er f.eks. beskrevet i EP-B 0 218 479, EP-B 0 112 122, USP 4 902 623. Immobiliseringen utføres egnet på en inert bærer, fortrinnsvis på CNBr-"Sepharose".
De etterfølgende eksempler og sekvensprotokollene gir en ytterligere beskrivelse av foreliggende oppfinnelse.
Eksempel 1
Ekspresjon av ETI i E . coli
sl ) Gensvntese
Under benyttelse av de foretrukne kodoner fra E. coli ble det fra aminosyresekvensen av ETI fra Erythrina caffra (Joubert og Dowdle, Thrombosis and Haemostasis 57 (3) (1987) 356-360) avledet en tilsvarende nukleinsyresekvens og denne ble fremstilt syntetisk etter metoden ifølge Beattie og Fowler (Nature 352
(1991) 548-549). For å lette kloningen ble det ved 5'-enden innføyet spaltingssted for restriksjonsenzymet EcoRI og ved 3'-enden et spaltingssted for restriksjonsenzymet Hindlll. Den syntetiske nukleinsyre ble spaltet med enzymene EcoRI og Hindlll og ligert med kloningsvektoren pBS+ (stratagene, US katalog nr. 211201, derivat av fag fl og stratagens pBS-plasmid med T3- og T7-promotorgen, ampicillinresistensgen, fl-replikasjonsstartområde, ColE-l-replikasjonsstartområde, lacl-gen, lacZ-gen og et multippelt kloningssete), som likeledes også på forhånd ble spaltet med EcoRI og Hindlll. Ligeringsinnføyelsen ble transformert i Escherichia coli. De erholdte kloner, selektert på ampicillin, ble analysert ved restriksjon med enzymene EcoRI og Hindlll. Den resulterende klon, pBS+ETI, inneholder et ytterligere EcoRI/Hindlll-fragment med en størrelse på 539 bp med SEKVENS. ID.nr.: 1. *
b) Ekspresjonsvektor
Plasmidet pBS+ETI ble spaltet med restriksjonsenzymene EcoRI og
Hindlll og fragmentet på 539 bp ble isolert. Ekspresjonsvektoren pBTacl (fra Boehringer Mannheim GmbH, katalog nr. 1081365, på basis av pUC8, H. Haymerle et al., Nucl. Acid Res. 14 (1986) 8615-8624) ble likeledes spaltet med enzymene EcoRI og Hindlll og vektorfragmentet på ca. 4,6 kb ble isolert. Begge fragmenter ble ligert og transformert i E. coli (DSM 5443) sammen med hjelperplasmidet pUBS520 (Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109-114), som inneholder lac-repressorgenet. Utvelgelsen av kloner ble utført ved hjelp av ampicillin-, hhv. kanamycinresistensen, formidlet av plasmidene. Det erholdte plasmid pBTETI inneholder, sammenlignet med utgangsvektor pBTacl, et ytterligere EcoRI/Hindlll-fragment med en størrelse på 539 bp.
På analog måte kan det i stedet for DSM 5443 også anvendes DSM 3689 som allerede inneholder et Iq-plasmid. I dette tilfelle er hjelperplasmidet pUB520 ikke
nødvendig.
c) Ekspresjon av rekombinante ETI ( recETI) i E . coli
For å undersøke ekspresjonsytelsen ble E. coli stamme DSM 5443 dyrket
med plasmider pBTETI og pUBS520 i LB-medium (Sambrook et al., Molecular Cloning (1989) Cold Spring Harbor) i nærvær av ampicillin og kanamycin (sluttkonsentrasjon 50 /ig/ml) til en optisk tetthet (OD) på 0,6 ved 550 nm. Ekspresjonen ble innledet ved tilsetning av 5 mM IPTG. Kulturen ble inkubert i ytterligere 4 timer. I tilknytning til dette ble E. coli oppsamlet ved sentrifugering og resuspendert i buffer (50 mM tris-HCl pH 8, 50 mM EDTA); ved ultralydbestråling ble det utført lysis av E. coli. Gjennom ny sentrifugering ble den uløselige proteinfraksjon (inklusjonslegemer) oppsamlet og resuspendert i den ovennevnte buffer ved ultralydbestråling. Suspensjonen ble tilsatt et 1/4 volum appliseringsbuffer (250 mM tris-HCl pH 6,8, 0,01 M EDTA, 5 % SDS, 5 % merkaptoetanol, 50 % glyserol og 0,005 % bromfenolblått) og analysert ved hjelp av en 12,5 % SDS-polyakrylamidgel. Som kontroll ble det gjennomført den samme preparering med en kultur av E. coli (pBTETI/pUBS520) som ikke var tilsatt IPTG, og applisert på
polyakrylamidgel. Ved preparering av den IPTG-induserte kultur kan det, etter farging av gelen med 0,2 % coomassie-blått R250 (oppløst i 30 % metanol og 10 % eddiksyre) og avfarging av gelen med en metanol-eddiksyreblanding, påvises et tydelig bånd med en molekylvekt på
ca. 22 kd. Dette bånd finnes ikke i preparatet av de ikke-induserte E. co/z-celler.
Eksempel 2
Renaturerinp op rensing av recETI
50 g inklusjonslegemer (IB) ble oppløst i 0,1 M tris/HCl, pH 8,5, 6 M guanidin, 0,1 M DTE, 1 mM EDTA (90 minutter ved 25 °C, CProt. = 10 mg/ml) og dialysert etter innstilling av pH-verdien på 2,5 (HC1) mot 3 mol/l guanidin/HCl.
Dialysatet ble sentrifugert (SS34, 13 000 rpm) og innstilt etter konsentrering over YM 10 på Cprot. 36,9 mg/ml. En 1 liters reaksjonskolbe ble fylt med 0,1 M tris/HCl, pH 8,5,
1 mM EDTA, 1 mM GSH, 0,1 mM GSSG. Renatureringen ble utført ved 20 °C ved 16 tilsetninger av dialysat (600 fig protein/ml buffer) med et tidsmellomrom på 30
minutter.
Renatureringen ga 2,8 U/ml aktivt ETI.
Rensing av recETI
a) Ved hjelp av anionutbytter
recETI ble renaturert i 0,1 M tris/HCl, pH 8,5, 1 mM EDTA, 1 mM GSH,
0,1 mM GSSG. Renaturatet ble fortynnet 1:2 med H20, innstilt med HC1 til pH 8,0, dialysert mot 50 mM tris/HCl, pH 8,0, og applisert på en Q-"sepharose"-søyle (5 mg protein/ml gel) ekvilibrert med 50 mM tris/HCl, pH 8,0. Etter vask av søylen med ekvilibreringsbufferen og med 50 mM Na2HP04/H3P04, pH 8,0 (fem søylevolumer) ble elueringen utført med 50 mM ^HPCv^PCv, pH 8,0, 0,2 M NaCl.
b) Ved hjelp av kationutb<y>tter
Renaturert ETI ble innstilt på pH 4,0 ved tilsetning av HC1 og dialysert
mot 50 mM NaOAc/HCl (Cross Flow). Dialysatet ble sentrifugert (13 000 rpm, 30 minutter, SS34) og applisert på en TSK-SP-søyle (kationutbytter med sulfopropyl-sidegrupper, Merck, Tyskland, volum 15 ml) ekvilibrert med 50 mM NaOAc/HCl, pH 4,0. Etter vask av søylen med ekvilibreringsbuffer og 50 mM NaOAc/HCl, pH 4,0, 0,1 m NaCl, ble utføringen utført med 50 mM NaOAc/HCl, pH 4,0,0,2 M NaCl.
Renheten av eluatet ble kontrollert ved SDS-PAGE og RP-HPLC.
Resultat:
ETI ble under de anvendte betingelser bundet til TSK-SP-søylen og kan elueres med 0,2 M NaCl. SDS-PAGE- og RP-HPLC-analyse ga en renhet > 95 %.
Eksempel 3
Sammenligning mellom den spesifikke aktivitet av recETI og ETI av frø fra Er<y>thrina caffra
recETI og ETI, isolert av frø fra E. caffra, ble dialysert mot 50 mM Na2HP04/H3P04, pH 8,0, 0,2 M NaCl, og innstilt til en proteinkonsentrasjon på 0,8 mg/ml. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved måling av UV-absorpsjonen ved 280 nm (e = 1,46 cm<2>/mg).
Bestemmelse av ETI- aktivitet
Hemming av trypsin ved hjelp av ETI ble målt med N-oi-benzoyletylester (BAEE) som substrat. 40 fil av en trypsinløsning (0,13 mg/ml, 2 mM HC1) ble blandet i en kvartskyvette med 60 fil testbuffer (0,1 M tris/HCl, pH 8,0) og 100 fil ETI-løsning, og inkubert i 5 minutter ved 30 °C. Etter tilsetning av 800 fil BAEE-løsning (20 mg BAEE x HCl/100 ml testbuffer) ble ekstinksjonsøkningen/minutt bestemt ved 253 nm.
ETI-aktiviteten bestemmes etter følgende formel:
EProbe: Ekstinksjonsøkning/minutt for den hemmede probe E-nypsin: Ekstinksjonsøkning/minutt for det uhemmede trypsin Cnypsin: Trypsinkonsentrasjon i testblandingen
V: forhåndsfortynning av ETI-løsningen
Resultat:
Den spesifikke aktivitet for recETI er ca. 20 % høyere enn den spesifikke aktivitet av ETI isolert etter klassiske fremgangsmåter fra frøene fra E. caffra.
Ved ytterligere tilførsler av rekombinant ETI ble det som spesifikk aktivitet f.eks. funnet 1,2, 1,5 og 1,6 U/mg.
Eksempel 4
Kobling av recETI til CNBr-" Sepharose"
170 mg renset recETI ble dialysert mot 0,05 M H3B03/NaOH, pH 8,0, 0,5 M NaCl (koblingsbuffer), og blandet med 7,5 g CNBr-"Sepharose', (svellet over natten i 500 ml 1 mM HC1, deretter avsuget og suspendert i koblingsbuffer). Suspensjonen ble inkubert i 90 minutter ved romtemperatur, avsuget og omrørt over natten med 400 ml 0,1 M tris/HCl, pH 8,0. recETI-"Sepharose" ble avsuget og ekvilibrert med 0,7 M arginin/H3P04, pH 7,5.
Eksempel 5
Rensing av en rekombinant plasminogenaktivator
54 mg rekombinant plasminogenaktivator K2P (fremstilt etter WO 90/09437 eller USP 5 223 256) ble applisert på recETI-sepharose ekvilibrert med 0,7 M arginin/H3P04, pH 7,5. Etter vask med ekvilibreringsbufferen og med 0,3 M arginin/H3P04, pH 7,0 (fem søylevolumer) ble elueringen utført med 0,3 M arginin/H3P04, pH 4,5. Plasminogenaktivatorinnholdet i eluatet ble bestemt med S 2288 som substrat (Kohnert et al., Prot. Engineer. 5 (1992) 93-100).
Resultat:
Bindingskapasiteten av recETI-sepharose med hensyn til plasminogenaktivatoren oppgår til 1,2 mg (tilsvarende 0,63 MU) plasminogenaktivator/mlrecETI-sepharose.
Claims (19)
1. Fremgangsmåte for rensing av serinproteaser fra en proteinblanding, omfattende binding av serinproteasen til et immobilisert polypeptid med aktiviteten til en inhibitor DE-3 fra Erythrina caffra, fjerning av de ubundne komponenter fra proteinblandingen, løsning av serinproteasen fra inhibitoren, atskillelse av den immobiliserte inhibitor fra den løselige serinprotease og isolering av serinproteasen,
karakterisert ved at det som polypeptid anvendes et polypeptid som er produktet av en prokaryot eller eukaryot ekspresjon av en eksogen nukleinsyre og som renses kromatografisk ved hjelp av en anionutbytter, kationutbytter eller en nikkelchelatsøyle.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at serinproteasen er en plasminogenaktivator.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,
karakterisert ved at plasminogenaktivatoren er en vevsplasminogenaktivator eller et derivat derav.
4. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 3,
karakterisert ved at inhibitoren immobiliseres på en inert bærer.
5. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 4,
karakterisert ved at den eksogene nukleinsyre vesentlig tilsvarer sekvensen nukleotid 9 til 527 i SEKVENS.ID.nr.: 1, eller en nukleinsyre som koder for det samme polypeptid innen rammen for degenerasjonen av den genetiske kode.
6. Anvendelse av et polypeptid med aktiviteten til en inhibitor DE-3 fra Erythrina caffra som er produktet av en prokaryot eller eukaryot ekspresjon av en eksogen nukleinsyre og som renses kromatografisk ved hjelp av en anionutbytter, kationutbytter eller nikkelchelat, for affinitetskromatografisk rensing av serinproteaser.
7. Anvendelse ifølge krav 6,
karakterisert ved at serinproteasen er en plasminogenaktivator.
8. Anvendelse ifølge krav 7,
karakterisert ved at plasminogenaktivatoren er en
vevsplasminogenaktivator eller et derivat derav.
9. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid med samme aktivitet som en inhibitor DE-3 fra Erythrina caffra,
karakterisert ved dyrking av prokaryote eller eukaryote vertsceller som er transformert eller transfektert med en eksogen nukleinsyre som i alt vesentlig tilsvarer sekvensen nukleotid 9 til 527 i SEKVENS.ID.nr.: 1, eller en nukleinsyre som koder for det samme polypeptid innen rammen for degenerasjonen av den genetiske kode, på en måte som tillater vertscellene, under egnede næringsstoffbetingelser, å uttrykke polypeptidet, etterfulgt av isolering av det ønskede polypeptid som er kjennetegnet ved at det har en spesifikk inhibitorisk aktivitet på ca. 1,07 U/mg overfor trypsin.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 9,
karakterisert ved at det som nukleinsyre anvendes en nukleinsyre med sekvensnukleotid 9 til 527 i SEKVENS.ID.nr.: 1, eller en nukleinsyre som koder for det samme polypeptid innen rammen for degenerasjonen av den genetiske kode.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 9 eller 10,
karakterisert ved at vertscellene er E. cøft-celler.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 9 eller 10,
karakterisert ved at vertscellene er gjærceller eller CHO-celler.
13. Nukleinsyre med sekvensen nukleotid 9 til 527 i SEKVENS.ID.nr.: 1, karakterisert ved at den koder for et polypeptid med samme aktivitet som en inhibitor DE-3 fra Erythrina caffra.
14. Biologisk funksjonelt plasmid eller virus-DNA-vektor,
karakterisert ved at den inneholder en nukleinsyre ifølge krav 13.
15. Prokaryot eller eukaryot vertscelle,
karakterisert ved at den transformeres eller transfekteres stabilt med en DNA-vektor ifølge krav 14.
16. Polypeptid med samme aktivitet som en inhibitor DE-3 fra Erythrina caffra, karakterisert ved at det fremstilles ved dyrking av prokaryote eller eukaryote vertsceller som er transformert eller transfektert med en eksogen nukleinsyre som i alt vesentlig tilsvarer sekvensen nukleotid 9 til 527 i SEKVENS.ID.nr.: 1, eller en nukleinsyre som koder for det samme polypeptid innen rammen for degenerasjonen av den genetiske kode, på en måte som tillater at vertscellene, under egnede næringsstoffbetingelser, uttrykker polypeptidet, etterfulgt av isolering av det ønskede polypeptid som er kjennetegnet ved at det har en spesifikk inhibitorisk aktivitet på ca. 1,07 U/mg eller høyere overfor trypsin.
17. Polypeptid ifølge krav 16,
karakterisert ved at ekspresjonen utføres i prokaryote vertsceller og at polypeptidet har aminosyresekvensen SEKVENS.ID.nr.: 2.
18. Polypeptid ifølge krav 16,
karakterisert ved at ekspresjonen utføres i eukaryote vertsceller og at polypeptidet har aminosyresekvensen SEKVENS.ID.nr.: 2 uten det N-terminale metionin.
19. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant polypeptid med samme aktivitet som en inhibitor DE-3 fra Erythrina caffra,
karakterisert ved dyrkning av prokaryote eller eukaryote vertsceller som transformeres eller transfekteres med en eksogen nukleinsyre som i alt vesentlig tilsvarer sekvensen nukleotid 9 til 527 i SEKVENS.ID.nr.: 1, eller en nukleinsyre som koder for det samme polypeptid innen rammen for degenerasjonen av den genetiske kode, på en måte som tillater at vertscellen, under egnede næringsstoffbetingelser, uttrykker polypeptidet, etterfulgt av isolering av polypeptidet fra vertscellene og kromatografisk rensing av polypeptidet på en anionutbytter, kationutbytter eller en nikkelchelatsøyle.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4408939 | 1994-03-16 | ||
| DE4424171A DE4424171A1 (de) | 1994-03-16 | 1994-07-08 | Verwendung von rekombinantem Inhibitor aus Erythrina caffra zur Reinigung von Serinproteasen |
| PCT/EP1995/000926 WO1995025168A1 (de) | 1994-03-16 | 1995-03-13 | Verwendung von rekombinantem inhibitor aus erythrina caffra zur reinigung von serinproteasen |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO963849D0 NO963849D0 (no) | 1996-09-13 |
| NO963849L NO963849L (no) | 1996-11-15 |
| NO316704B1 true NO316704B1 (no) | 2004-04-13 |
Family
ID=25934769
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19963849A NO316704B1 (no) | 1994-03-16 | 1996-09-13 | Fremgangsmate for rensing av serinproteaser ved anvendelse av et immobilisert polypeptid med samme aktivitet som inhibitor DE-3 fra E. caffra, samt fremstilling og anvendelse av nevnte polypeptid |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5958722A (no) |
| EP (1) | EP0750667B1 (no) |
| JP (1) | JP2846961B2 (no) |
| AT (1) | ATE174962T1 (no) |
| AU (1) | AU691904B2 (no) |
| CA (1) | CA2185436C (no) |
| CZ (1) | CZ285502B6 (no) |
| ES (1) | ES2128721T3 (no) |
| IL (1) | IL112995A (no) |
| MX (1) | MX9603864A (no) |
| NO (1) | NO316704B1 (no) |
| NZ (1) | NZ282790A (no) |
| SK (1) | SK282430B6 (no) |
| WO (1) | WO1995025168A1 (no) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0112122B1 (en) * | 1982-12-14 | 1991-08-28 | South African Inventions Development Corporation | Plasminogen activator |
| AU597908B2 (en) * | 1985-10-04 | 1990-06-14 | Implico B.V. | A protein reagent having the ability to bind tissue plasminogen activator in its two chain form and/or its single chain form |
-
1995
- 1995-03-13 ES ES95913095T patent/ES2128721T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-13 JP JP7523832A patent/JP2846961B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-13 EP EP95913095A patent/EP0750667B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-13 AU AU20693/95A patent/AU691904B2/en not_active Expired
- 1995-03-13 WO PCT/EP1995/000926 patent/WO1995025168A1/de active IP Right Grant
- 1995-03-13 AT AT95913095T patent/ATE174962T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-03-13 CZ CZ962529A patent/CZ285502B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-03-13 MX MX9603864A patent/MX9603864A/es unknown
- 1995-03-13 CA CA002185436A patent/CA2185436C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-13 SK SK1142-96A patent/SK282430B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-03-13 US US08/702,703 patent/US5958722A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-13 NZ NZ282790A patent/NZ282790A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-03-14 IL IL11299595A patent/IL112995A/en not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-09-13 NO NO19963849A patent/NO316704B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2185436A1 (en) | 1995-09-21 |
| CA2185436C (en) | 2000-08-01 |
| AU2069395A (en) | 1995-10-03 |
| IL112995A (en) | 2004-07-25 |
| US5958722A (en) | 1999-09-28 |
| MX9603864A (es) | 1997-03-29 |
| EP0750667B1 (de) | 1998-12-23 |
| WO1995025168A1 (de) | 1995-09-21 |
| IL112995A0 (en) | 1995-06-29 |
| JP2846961B2 (ja) | 1999-01-13 |
| CZ252996A3 (en) | 1996-11-13 |
| SK114296A3 (en) | 1997-05-07 |
| JPH09503395A (ja) | 1997-04-08 |
| ES2128721T3 (es) | 1999-05-16 |
| NO963849D0 (no) | 1996-09-13 |
| CZ285502B6 (cs) | 1999-08-11 |
| ATE174962T1 (de) | 1999-01-15 |
| EP0750667A1 (de) | 1997-01-02 |
| SK282430B6 (sk) | 2002-02-05 |
| AU691904B2 (en) | 1998-05-28 |
| NZ282790A (en) | 1997-08-22 |
| NO963849L (no) | 1996-11-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4865974A (en) | Bacterial methionine N-terminal peptidase | |
| EP0302456B1 (en) | New tissue plasminogen activator | |
| CA2218880A1 (en) | Process for preparing anti-obesity protein | |
| JPH07147984A (ja) | ポリクリングルプラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子およびそれを含有するベクター | |
| US5013662A (en) | Bacterial methionine n-terminal peptidase | |
| EP0263172B1 (en) | Protein analogues of tissue plasminogen activator | |
| KR0167761B1 (ko) | 플라스미드, 이의 작제방법 및 플라스미노겐 활성자 제조에 있어서의 이의 용도 | |
| EP0797671A1 (en) | A process of producing extracellular proteins in bacteria | |
| Yabuta et al. | Hyperproduction of a recombinant fusion protein of Staphylococcus aureus V8 protease in Escherichia coli and its processing by OmpT protease to release an active V8 protease derivative | |
| WO1990004023A1 (en) | Production of human prourokinase | |
| NO316704B1 (no) | Fremgangsmate for rensing av serinproteaser ved anvendelse av et immobilisert polypeptid med samme aktivitet som inhibitor DE-3 fra E. caffra, samt fremstilling og anvendelse av nevnte polypeptid | |
| JP3061199B2 (ja) | エリトリナ・カッフラ型インヒビターの突然変異体及びセリンプロテアーゼを精製するための前記突然変異体の利用 | |
| KR100206731B1 (ko) | 에리트리나 카프라 유래 재조합 억제인자를 이용한 세린 프로테아제의 정제방법 | |
| NZ514657A (en) | Production of pancreatic procarboxy-peptidase B, isoforms and muteins thereof, and their use | |
| MXPA97007486A (en) | Mutant of the type erythrina caffra inhibitor and the use of said mutant to purify proteases of being | |
| US5700677A (en) | Protein analogues of tissue plasminogen activator | |
| MXPA01009979A (en) | Production of pancreatic procarboxy-peptidase b, isoforms and muteins thereof, and their use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |