JP2000516444A

JP2000516444A - 組換え非脂質化Ｏｓｐタンパクを回収及び精製する方法

Info

Publication number: JP2000516444A
Application number: JP10501944A
Authority: JP
Inventors: ミッテラー，アルトゥール; タウアー，クリスタ; リヴィー，イアン; ドルナー，フリードリッヒ
Original assignee: Immuno AG
Current assignee: Oesterreichisches Institut fuer Haemoderivate
Priority date: 1996-06-21
Filing date: 1997-06-19
Publication date: 2000-12-12
Also published as: NO985902L; ATA110696A; CA2259636A1; NO985902D0; WO1997049812A2; CZ425398A3; EP0973909A2; WO1997049812A3; AT405940B

Abstract

(57)【要約】脂質化されていない組換えＯｓｐＣ、Ｏｓｐタンパクの製造方法、及びこれらの組換えタンパクを含有するワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】組換え非脂質化Ｏｓｐタンパクを回収及び精製する方法技術分野本発明はＯｓｐタンパク、特に組換えＯｓｐＣ、を回収及び精製する方法、ならびに組換え、非脂質化ＯｓｐＣに関する。さらに、本発明は組換え、非脂質化ＯｓｐＣを含有するワクチン、ならびにワクチンの脊椎動物の免疫化における使用に関する。背景技術ライム病ボレリアはダニによって媒介され、スピロヘータ、ボレリア・ブルグドルフェリセンスラト(Borrelia burgdorferi sensu lato)が引き金となって起こる脊椎動物の感染症である。温帯地方（北アメリカ、中央ヨーロッパ）ではライム病ボレリアはダニによって媒介される最も頻繁におこる感染性疾患である。ある地域でのダニの高い感染率（６０％に達する）によりライム病ボレリアが最近の疫学的な問題となってきた。ライム病ボレリアの最も頻繁な症候は部分的に重篤な皮膚、神経径、心臓及び関節の疾患症状である。ライム病ボレリアは一般に抗生物質で治療されており、その治療は感染の初期に効果が高い。しかしながら、様々なボレリア株が存在することから、ボレリア感染の初期に認定することが非常に困難である。疾患が慢性段階に至ると、抗生物質療法は一層困難であり，必ずしも成功しない。感染が長く続けば続くほど、重篤な後期の影響に苦しむ確率が高くなる。このように、有効なライム病ボレリアに対する予防的なワクチンが大いに望まれる。本明細書中、「ボレリア(Borrelia)」なる語句は、ボレリア・ブルグドルフェリセンスラト(Borrelia burgdorferi sensu lato)に対応し、ライム病ボレリアの病原体を含有しているものであり、例えば、Ｂ．ブルグドルフェリセンススツリクト(B．burgdorferi sensu stricto)、Ｂ．ガリニイ sp．nov.(B． garinii sp．nov.)及びＢ．アフゼリイ(B．afzelii)が例示される。ボレリアの表面リポタンパクＯｓｐＡ及びＯｓｐＣに関しては、それらが動物試験でボレリア感染を阻止したと記載された。従って、ＯｓｐＡ及びＯｓｐＣは、ライム病ボレリアに対するワクチン接種における抗原の好ましい候補であると考えられた（EP418,827;Fikrig et al．(1990)，Science 250:553-6;Preac-Murs ic et al．(1992)，Infection 20:342-9)。ＯｓｐＡ及びＯｓｐＣはいずれもプラスミドにコードされているタンパクであり（Barbouretal．(1987)Science237: 409-11;Marconi et al．(1993)，J．Bacteriol．175:926-32)、そのＮ-末端には翻訳後プロセスによって脂質部分が付加されている。この脂質部分が「膜アンカー」として作用し、該リポタンパクを細菌外膜に固定する。Ｏｓｐタンパクの膜内に固定化されていない部分は細胞表面に露出して存在している(Howe et al.(1 985),Science 227:645-6;Bergstrom et al.(1989)，Mol．Microbiol．3:479-86) 。ＯｓｐＡ及びＯｓｐＣをコードする遺伝子はほぼ全てのボレリア株に存在しており、両者の表面タンパクは多くの血清学的に異なる形で見出されている（Wils ke et al．(1989)，Ann．New York．Acad．Sci．539:126-43;Livey et al．(199 5)，Mol．Microbiol．18:257-69)。「血清学的に異なる形」とは、異なるボレリア株中に個々の表面タンパク（例、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ，ＯｓｐＣ）に関して様々な変異体が存在することを意味し、その違いは抗体との交差反応性の不在及び異なるＲＦＬＰパターン（ＲＦＬＰ＝restriction fragment length polymorphi sm制限断片長の多形性）によって表される。Liveyら((1995)，Mol．Microbiol． 18:257-69)は３５の異なるＲＦＬＰ型のＯｓｐＣについて記載した：これらは本明細書で記載するＯｓｐＣの血清学的変異体に対応する。多種の血清学的に異なる形が存在することが、これらのリポタンパクに基くワクチンの開発を困難にしている。すなわち、例えばFikrigら（1992，J．Immunol ．148:2256-60)は、ＯｓｐＡの１つの血清学的な変異体で免疫化することによっては他のＯｓｐＡ変異体を有する株による感染を防止できないことを示した。この理由から、文献では、血清学的に異なる形の抗原の混合物を含有するワクチンを開発し、できるだけ多くの異なるボレリア株に対するワクチンによる保護を提供することが必要であるとの意見が代表的である。効率的な再現性のある製造には、あらゆる変異体に一律に適用し得る回収及び精製法が必要である。ライム病ボレリアに対するワクチンの開発において、これまでは、７つの異なる血清型が記載されているリポタンパクＯｓｐＡに主たる興味が集まっていた。自然感染においてリポタンパクＯｓｐＣも免疫原であり動物試験での同種攻撃（チャレンジ）(homologous challenge)で防御（保護）した（WO94/25596，Prober t et al．(1994)，Infect．Immun．62:1920-26)。本明細書中、「同種(homologous)」及び「異種(heterologous)」という語句は、ワクチン防御（保護）及び「攻撃(challenge)」（毒性病原体で哺乳動物を感染させること）との関係で用いる。この文脈で「同種」は「病原体と同じ血清学変異体に源を発する」ということ、そして「異種」は「病原体と同じ血清学変異体に源を発しない」ということを意味する。同種防御(homologous protection) とは、ワクチン接種の抗原が、ワクチン接種抗原と同じ血清学的変異体に属する抗原を有する病原体から保護することを意味する。異種保護(heterologous prot ection)とは、ワクチン接種の抗原が交差保護（cross protection）をも与えること、すなわち、異なる血清学的変異体に属する抗原を有する病原体から保護する活性をも有することを意味する。従来は、Ｏｓｐリポタンパク（ボレリアのＯｓｐＡ，ＯｓｐＢ，ＯｓｐＣ）の製造には以下の方法がとられてきた:一方でボレリアの細胞膜から直接野生型Ｏｓｐリポタンパクを単離し、他方でE.coli又は酵母Pichia pastoris中でＯｓｐリポタンパクをコードする遺伝子を組換え法で発現させた。さらに、様々な組換え融合タンパクをE.coli中で発現させた。野生型Ｏｓｐリポタンパク類はその膜アンカーによってボレリアの細胞壁に統合されている。それらを単離するために、まず膜断片を調製し、次いでＯｓｐリポタンパクを膜から抽出しなければならない。この作業は、（中性）洗剤又は洗剤と同様の作用をする物質を用いてのみ効率的に行うことができる（例、EP 522 560， WO94/25596，WO93/08299，Belisle et al(1994)，J.Bacteriol．176:2151-57)。洗剤はリポタンパクと結合しかくしてリポタンパクを囲んでいる膜からそれらを溶かし出す。しかしながら、そのリポタンパクからの分離には非常な困難と莫大な生成物の損失を伴う。しかし、ヒトへの適用のためには、洗剤を完全に分離する必要がある。しかも、その低溶解性のゆえにリポタンパクは洗剤不在下では非常に取扱い難い。洗剤不在下ではリポタンパクは凝集物を形成し易く、例えば、滅菌ろ過及び正確な投薬が、困難になる。効率的なワクチン生産においてはこのように洗剤の使用は多くの困難を伴う。 Gondolfら(1990，J．Chromatography 521:325-34)、及びMa及びWeis（1993，I nfect．Immun．61:3843-53)は洗剤を使わずに、リポタンパクＯｓｐＡ及びＯｓｐＢをn-ブタノールを用いて抽出した。その場合、ｎ−ブタノールは洗剤様機能を満たしたが、真の洗剤ではない。そこでは、ボレリアを音波処理したのちn-ブタノール抽出した。次いで遠心するとブタノール相、中間相及び水相の3つの相が形成された。ＯｓｐＡ及びＯｓｐＢは水相に分かれておりそこから透析後、クロマトグラフ的手法で精製された。 E．coliは、組換えタンパクの製造のための遺伝子組換え技術に最も頻繁に用いられる宿主生物である。E．coliは培養が容易で、通常極め高収率を達成する。E．coliは翻訳後修飾が必要でないか、又はそれがE．coliによってもなされる場合には、あらゆる場合で機能的なタンパクを得るために宿主生物として利用可能である。ボレリアのＯｓｐタンパクは天然では脂質化されている。すなわち、翻訳後に脂質部分がタンパクのＮ−末端に付加される。多くの著者が、ボレリアのＯｓｐリポタンパクの免疫原性には脂質化が必須であると指摘している（WO93/08299， Erdile et al．(1993)，Infect．Immun．61:81-90;Belisle et al (1994)，J．B acteriol．176:2151-57;Weis et al．(1994)，Infect．Immun．62:4632-36)。E ．coliが組換えＯｓｐタンパクを正しく脂質化するという発見により、ボレリアＯｓｐタンパクのE．coli内での発現が、多く場合、ボレリアからのＯｓｐタンパクの直接抽出の替りとなるとの結論がなされた（WO93/08299，Weis et al．(1 994)，Infect．Immun．62:4632-36)。ボレリア中でと同様、E．coli内では脂質化されたＯｓｐタンパクは細胞膜に結合している。ボレリアの場合と同様、Ｏｓｐタンパクを洗剤を用いて細胞膜から抽出しなければならない。このように、E．coli内での組換えＯｓｐタンパクの発現は、上記の洗剤を加えることに関連する問題の解決にはならない。しかしながら、Ｏｓｐタンパクの発現におけるE．coliの使用で、組換え遺伝子又はタンパクそれぞれに修飾を導入することが可能になる。Ｎ−末端が切断されもはや脂質化されないＯｓｐＡの変異体は、もはや細胞膜に固定されない。Dunnら(1990，Prot．Expr．Purif．1:159-68)はE．coli中で野生型の最初の１７アミノ酸を欠く組換えＯｓｐＡを発現させた。Ｎ−末端が切断されたこのＯｓｐＡは脂質化されず、従って洗剤不在下で可溶性であった。この非-脂質化ＯｓｐＡ構築物はライム病ボレリアの患者の血清で検出可能であった。このことは、患者の体内で免疫反応を引起すボレリアエピトープの少なくともあるものはＮ−末端が切断された、非脂質化ＯｓｐＡ中に存在することを示している。他の野生型の最初のアミノ酸を欠失した組換え、非脂質化ＯｓｐＡは動物試験で非免疫原性であることが分かった（Erdile et al．(1993)，Infect．Immu n．61:81-90）。実験では、Erdileらは、脂質化部分の喪失に対する明確な免疫原性の喪失をつきとめた。Ｎ−末端が切断されたE．coliからの非-脂質化ＯｓｐＡタンパクは、このようにワクチンに用いるには免疫原性が不充分である。従来技術によると、融合タンパクはE．coli内でＯｓｐタンパクを発現させるための他の方法である。ＯｓｐＡとＮＳ−１（インフルエンザの非一構造タンパク:Gern et al.(1994)，Immunol．Lett．39:249-58;Telford III et al.(1995)J ．Infect．Dis．171:1368-70)、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣとグルタチオン- Ｓ-トランスフェラーゼ（Padula et al．(1993) Infect．Immun．61:5097-105;T elford III et al.(1993)，J．Exp．Med．178:755-58）、及びＯｓｐＣとマルトース結合タンパク（Probert et al．(1994)，Infect．Immun．62:1920-26）の融合タンパクが既に記載されている。これらの場合、融合しているタンパクでＮ− 末端がブロックされているために、それぞれのＯｓｐタンパクは脂質化されていない。従来技術で言及された融合のパートナーは免疫系に刺激的な作用を有するか、融合タンパクの発現又は精製を容易にするものである。このように、融合タンパクの思想には、Ｏｓｐタンパクの製造においてさらに２つの課題を解決する必要がある：非−脂質化Ｏｓｐタンパクの免疫原性の甚大な減少、及びヒトへの適用が可能なワクチンのためのＯｓｐリポタンパクの精製の困難さ。融合タンパクは脂質化されていないので、細胞膜と結合していず、したがって個々のＯｓｐ融合タンパクの単離に洗剤は必要でない。グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ及びマルトースー結合タンパクとの融合により、融合している個々のタンパクに特異的な親和性を介して融合タンパクを精製することができる。８１アミノ酸長のＮＳ−１のＮ−末端とＯｓｐＡとの融合に関しては、E．col i内でのかなり高い発現率を得ることができること、そして融合タンパクが同種免疫血清と反応することが示された(WO 93/04175)。同種免疫血清との反応から、著者らはこの融合タンパクは悪性Ｂ．ブルグドルフェリによる感染に対する防御能力を有すると結論した。しかしながら、WO 93/04175中では、この仮説は実験データによって実証されていない。ＯｓｐタンパクのＮ−末端をブロックする融合では、融合産物は脂質化されないと推測されている。これらの非脂質化Ｏｓｐ融合タンパクの免疫原性は、１つに、それに融合しているタンパク又はタンパク部分の免疫刺激作用の結果かもしれず、他方では非常な高用量のアジュバントに帰すとの文献の記載もある（WO93 /08299)。さらには、そのような融合タンパクは、免疫原中にＯｓｐ−タンパク特異抗原のみが存在する訳でないという不都合がある。もしもワクチン接種の抗原の免疫原性が低い場合、高用量のアジュバントを用いる必要がある。高用量アジュバントは副作用を有するワクチンの危険性を大きく増大するので、高用量アジュバントが必要なワクチン接種免疫原をヒトに使用するのは不適当である(Gup ta et al．(1995)，Vaccine 13:1263-76)。また、WO 93/08299はアジュバント- 不含ワクチンが望ましいと明瞭に指摘している。これが、WO 93/08299の発明者らがワクチンの開発に、脂質化されていないものよりも、天然の、すなわち、脂質化されたＯｓｐタンパクを好ましいとする理由である。 Probertら（１９９４）は、主に精製の問題解決を示す異なる方法を記載している。彼らはＯｓｐＣ−ＭＢＰ（マルト-ス-結合タンパク）融合タンパクをE．c oli内で発現させ、ＭＢＰのアミロースへの親和性を利用して融合タンパクをアミロース含有担体に結合させ、融合タンパクを特異的に濃縮した。融合タンパクの特異的な単離に際して、ＭＢＰ部分は融合タンパクから開裂除去され最終生成物中にＯｓｐＣのみが存在する。天然のＯｓｐＣとは対照的にこのようにして調製された最終生成物はＮ−末端システィンを欠く。ＤＮＡレベルでは、factor X aのための開裂部位をＭＢＰとＯｓｐＣとの間に挿入し２つのタンパクがfactor Xa活性によって開裂されるようにする。この方法の欠点は、余分な工程、すなわちfactor Xaによる開裂反応が必要であること、後のfactor Xaの分離及びＭＢＰ部分の開裂除去が必要な点である。ワクチン中に2つの物質の両方又は一方の痕跡の危険性が、そのような余分な開裂反応の使用に対する反論である。しかしながら、プロテアーゼの使用は、他の余分な開裂部位がＯｓｐタンパク自身に存在しうるという点でも問題である。そのような場合、プロテアーゼ反応は最終生成物を破壊してしまうかもしれない。 WO 94/25596には組換えＯｓｐＣの酵母Pichia pastorisによる製造が記載されている。このようにして得られるＯｓｐＣは免疫原性を有し動物試験で同種攻撃から防御することが分かった。PichiaからのＯｓｐＣの調製は洗剤を用いずに行われた。細胞を等張住緩衝液中で機械的に粉砕し、ろ過し、遠心した。次いで上清に存在するＯｓｐＣを数工程のクロマトグラフ精製で濃縮した。この方法の欠点は遠心がＯｓｐＣ特異性でないという事実に帰される。そのために、宿主細胞及び培地に由来するタンパクの部分も上清に存在する。これらのタンパクは望ましくないので数回の連続的なクロマトグラフ工程で生成物から分離しなければならない。しかしながら、各クロマトグラフ工程には高い生成物の損失が伴う。しかも、汚染性のタンパク又は他の物質、例えば脂質、核酸、及び炭水化物などの痕跡が最終産物中に存在しないことについてまったく疑いがないことを保証することはできない。 WO 95/21928ではメチル栄養性(methyltrophic)酵母、なかんずくpichia中での異種タンパクの発現について記載されている。異種タンパクの例として、就中ＯｓｐＡが記載されている。WO 95/21928は主として高収率に関連しており、ＯｓｐＡの場合、彼らは細胞を「French press」で破砕したのちＥＬＩＳＡで測定している。ＯｓｐＡは具体的には精製されておらず具体的に特性化もされていない。発明の開示従来、ワクチンの製造方法は既知であるが、ヒトに躊躇なく適用でき様々なライム病ボレリア株に対して広範なワクチン防御を与えるライム病ボレリアに対する高純度のワクチンに対する要求は依然として存在している。本発明の目的は改良されたＯｓｐタンパク、特に組換えＯｓｐＣタンパクを回収及び精製する方法であって、免疫学的に活性な組換えＯｓｐの簡単で効率的な精製を可能にする方法を提供することである。本発明は、真核性宿主細胞、好ましくは酵母細胞からボレリア-Ｏｓｐ由来のＯｓｐを精製及び回収する方法を提供する。本発明方法は、宿主細胞を溶解し、溶解物（リゼイト）を、細胞性（細胞質）タンパクが実質上完全に沈殿し、組換えＯｓｐタンパクが選択的に溶液中に残存する条件下で有機溶媒と混合し、Ｏｓｐタンパクを該溶液から精製し、回収することを特徴とする。組換えＯｓｐタンパク、特にＯｓｐＣの他のタンパクとは大きく異なる異常な（並外れた）溶解挙動の故にこの工程が高度に選択的なものとなる。本発明の方法に用いられる有機溶媒はタンパク沈殿物質として知られているものである：アルコール類、短鎖ケトン類、スルホキシド類及びニトリル類、好ましくはメタノール、プロパノール異性体類、ブタノール異性体類、ＤＭＳＯ、アセトニトリル、ジオキサン、アセトン、そして特に好ましくはエタノールである。タンパク沈殿性有機溶媒は一般に溶液からタンパク類を沈殿させ、それらを溶液中に維持しないために用いられる。この場合、有機溶媒は夾雑物質の効率的な沈殿剤として用いうる。本発明方法に従った条件下で殆どのタンパク質が沈殿する：それらがタンパク質と連携しているという理由で核酸もまた９９．９９％沈殿する。このように、本発明の方法は最初の沈殿段階で既に高度に選択的である。溶液中に、組換えＯｓｐタンパク、特に組換えＯｓｐＣが高度に豊富化され、夾雑性物質が著しく除去されるので、以後に必要な精製工程の数が減少され、さらなる精製コースでのPichiaによる発現の高い収率の減少を最小限にすることができ、さらなる精製に要する費用も最低に維持することができる。有機溶媒の添加は夾雑タンパクと核酸の大部分を沈殿させる。本発明に従って、沈殿した物質の、例えば組換えＯｓｐＣを含有する溶液からの分離は、沈降又はろ過により行うことができる。沈降は好ましくは遠心により促進されるが、より長期間靜置することでも行うことができ、沈殿した物質は溶液の入った容器の底に地球の重力によって集まる。沈降後、組換えＯｓｐＣ含有溶液を沈殿した沈殿物から分離する。組換えＯｓｐＣ含有溶液をフィルターでろ過し沈殿物質から分離する。ろ過には例えば滅菌フィルターを用いる。好ましくは、ろ過は2段階で行う。比較的粗い孔径、例えば１μｍの滅菌フィルターのような比較的粗いフィルターを予備ろ過に用いる。次いで、より細かい孔径、例えば０．２μｍの滅菌フィルターのような比較的細かいフィルターを主ろ過に用いる。有機溶媒と沈降による沈殿又はろ過の後も、組換えＯｓｐＣ含有溶液は宿主細胞由来のりん脂質、着色剤（物質）及び少量のタンパク及び核酸を含有している。沈殿前の溶液と比較して、沈殿後の溶液中には宿主細胞及び培地由来のタンパク質は約１０％、核酸約０．００１％、及び脂質約５％が残っている。好ましくは、次いで逆相クロマトグラフィーにより、非常に効率的にこれらを組換えＯｓｐタンパク，特にＯｓｐＣから分離することができる。本発明の別の側面では、逆相クロマトグラフィーを、Ｏｓｐ含有出発物質の精製のために有機溶媒で（前記のように）夾雑タンパク又は核酸を沈殿させるというような、先立つ精製工程なしに用いる。このように、本発明はまたＯｓｐタンパクをＯｓｐ含有出発物質から精製する方法であって、逆相クロマトグラフィーに適した固体担体にＯｓｐタンパクを選択的に結合させ、所望により洗浄し、溶出する方法を包含する。適当な物質はシリケート（ケイ酸塩）、好ましくはSphe risorb 5C18、又は合成ポリマー、好ましくはSource PR15^TM(Pharmacia) 逆相クロマトグラフィーの原理は分子が、それらの特異的な親和性に応じて固体、疎水性相及び液体、親水性相に分布するという事実に基いている。本発明のＯｓｐタンパク、特にＯｓｐＣは固体、疎水性担体、に高い親和性を有するが、夾雑性物質−宿主細胞及び培地由来の残りのタンパク、核酸、りん脂質及び着色物質−は液体、親水性相にとどまりＯｓｐタンパクが結合している固体担体から分離される。一般に、固体担体をカラムマトリックスに固定化し夾雑物質を含有する液相がカラムを通して流れるようにする。もしも担体がゆるい（自由な）形で存在している場合は担体粒子を液相から分離し小さい溶離能を有する溶離剤で洗浄する。これらの条件下、Ｏｓｐタンパクは溶液よりも担体に対してより高い親和性を有する。本発明方法によればこの工程は宿主細胞又は培地由来の望ましくないタンパク質、核酸、りん脂質、及び着色物質を除去するのに特に効率的であり、この除去は有機溶媒による沈殿では完全には達成できない。逆相クロマトグラフィーは本発明によって得られる組換えＯｓｐタンパク、とりわけＯｓｐＣの有機溶媒中での特殊な溶解挙動を利用している。逆相クロマトグラフィーの間、本発明に従って、有機溶媒をＯｓｐタンパクの溶離のために用いる。まず、例えば、組換えＯｓｐＣタンパクを含有する溶液を水性緩衝液で希釈し固体担体と接触させる。条件は、Ｏｓｐタンパクが選択的に担体に結合するように調節する。本発明に従ってＯｓｐタンパクが担体に結合するために、Ｏｓｐタンパク含有溶液を有機溶媒で希釈し溶離能が低い溶媒濃度にする。このような条件下、本発明に従って調製したＯｓｐタンパクは、溶液よりも担体により高い親和性を有する。担体としては、シリケート（ケイ酸塩）、好ましくはSpherisorb 5C18、又は合 (Tosohaas)が好ましい。担体をカラムに詰め込んでも良いが、溶液と混合して遊離状態で用いても良い。希釈した溶液中に存在する組換えＯｓｐタンパクは選択的に担体に結合し、混在するりん脂質、着色性物質、タンパク及び核酸は結合しないであろう。ここにおける選択性は用いた有機溶媒の濃度勾配及びタイプに基づく。本発明の好ましい実施態様では溶媒として、エタノールを、好ましくは濃度４５％付近で用いる。担体材料が低溶離能の溶離剤、例えば３５％、４０％又は４５％エタノールの生理学的緩衝液で、フラッシュ洗浄されている場合、Ｏｓｐタンパク、特にＯｓｐＣは高濃度又は高溶離能の有機溶媒、それぞれにより選択的にカラムから溶出される。高溶離能の溶媒は担体に結合したＯｓｐタンパク、特にＯｓｐＣを担体から取り外し溶媒に溶解させる。本発明のさらなる態様では、エタノールを濃度５０％〜６０％、好ましくは５２％〜５７％の間、特に好ましくは５５％で用いる。溶離に用いる有機溶媒は第１工程で用いた沈殿に用いた溶媒と同じ溶媒であってもよいが、異なる有機溶媒であっても良い。溶媒を選択した濃度で、又は２つの異なる濃度のグラディエントとして用いることができる。それぞれの場合で濃度は、１０％〜９０％、好ましくは２０％〜７０％、特に好ましくは４０％〜６０％の範囲である。有機溶媒は所望の濃度に従って、水性緩衝液で希釈されるであろう。水性緩衝液は、-例えばリン酸(phosphate)緩衝化塩化ナトリウム溶液、Trisバッファー又はクエン酸塩バッファーであってよい。本発明の範囲内における好ましい有機溶媒は、タンパク沈殿物質、特に一価又は多価アルコール類、短鎖ケトン類、スルホキシド類又はニトリル類、好ましくはメタノール、n-プロパノール、２−プロパノール及び他のプロパノールの異性体、ｔ−ブタノール、２−ブタノール及び他のブタノールの異性体、ＤＭＳＯ、アセトニトリル、ジオキサン、又はアセトン、特に好ましくはエタノールからなる群から選択される。水性の緩衝液中に、単一の有機溶媒、又は異なる有機溶媒の混合物を用いることができる。本発明方法に従った種々の精製工程で用いる有機溶媒は、全工程で同一の有機溶媒であって良いが、異なる段階における１つの精製法に異なる有機溶媒を用いることもできる。既述のごとく、ライム病ボレリアに対して効率的な防御を与えるワクチンは、あらゆる血清学的サブタイプのLyme Borrelia対して防御すべきである。このように、広い活性スペクトルを有する多価混合ワクチンを提供することは有意義である。本明細書中、「多価混合ワクチン」とは、ワクチンが、Ｏｓｐタンパク、特にＯｓｐＣの様々な血清学的サブタイプを含有していることを意味する。そのような多価ワクチンの大量生産のためには様々な成分に対して一律に用いることができる回収及び精製法が望ましい。しかしながら、従来の利用可能なクロマトグラフ的手法では個々のＯｓｐタンパクを夾雑物質から分離するために、各Ｏｓｐ変異体に対して極めて特殊な（具体的な）調節を行わねばならなかった。Ｏｓｐタンパクの種々の血清学的変異体に存在するような極めてわずかなアミノ酸配列の変化でさえ、高度に特異的なクロマトグラフィー工程ではタンパクの挙動を変化させ精製効率に悪影響を与えうる。従来知られているクロマトグラフィー的手法の多くは、古典的なタンパク精製法に用いられる担体材料に、それらがイオン交換体及び疎水性相互作用ゲルに用いられる場合のように、Ｏｓｐ，特にＯｓｐＣが結合しないか、極く弱い結合しかしないという事実に基づいている。このように、この精製法はいわゆる「ネガティブクロマトグラフィー」、つまり除去されるべき物質は様々な担体に結合することによりＯｓｐ（ＯｓｐＣ）含有溶液から除去されるが、Ｏｓｐ（ＯｓｐＣ）は溶出液中に常に見出される、という方法で行われる。そのような一連の工程ののち、Ｏｓｐ（ＯｓｐＣ）は精製された状態で存在するはずである。この方法は多くの作業を要する上、溶出液中に夾雑性物質が「混入する（引きずり込まれる）」可能性が極めて高い。「ネガティブクロマトグラフィー」は必ずそれぞれのＯｓｐ変異体に適合させなければならないが、Ｏｓｐタンパクにはそのような方法が適用できないことがわかっている。それぞれのＯｓｐ変異体に適合させねばならない方法は多くの労力を要し、費用がかかり、これらの理由によりそれらは大量生産には不向きである。各ステップの方法を、夾雑タンパク除去活性に関してチェックし確認しなければならない。多くの連続的な方法工程は、各段階でのある程度の損失を考慮に入れる必要があることから、生成物の大きい損失を招くことになる。組換えＯｓｐ、特にＯｓｐＣの回収及び精製のための本発明方法は最少の方法工程により最大の選択性があるので、生成物の損失が減少される。本発明方法はＯｓｐ、特にＯｓｐＣのあらゆる血清型に適用可能であり、大量の工業規模で実現することができる。さらに方法工程が最少になることで汚染の可能性も最小になる。WO 94/25596記載の方法で精製したＯｓｐ（ＯｓｐＣ）は２０％に上るフラグメントと分解産物を含有している。要する工程が少ないために、本発明の方法によれば最大でも５％のフラグメントと分解産物が含まれる。本発明の特別の態様によれば、本発明の組換えＯｓｐＣを発現する酵母細胞、好ましくはPichia pastorisをトリスバッファー(Tris buffer、ｐＨ７.５)に懸濁しManton-Gaulinホモジナイザーで粉砕する。遠心し、細胞の固体成分を溶液から分離する。最終濃度５０％まで、エタノールを溶液に加える。室温で１時間インキュベーションし、形成された上清を遠心により溶液から分離する。溶液をトリスバッファー（ｐＨ7.5）で４５％エタノールになるよう希釈し、Source PR 15^TM(Pharmacia)を充填したクロマトグラフカラムに適用する。ＯｓｐＣを４５％〜７０％の間のエタノールグラディエントでカラムから溶離し、溶出液のＵＶ吸収を連続的に測定する。これらの条件下、組換えＯｓｐＣはエタノール濃度５２％〜５７％の間で溶出する。ＯｓｐＣ含有画分を合し、生理学的に両立しうる緩衝液、例えばりン酸緩衝液で、ゲルろ過、例えばSephadex G25を介して再度緩衝剤処理する。次いで排除サイズ５０００Ｄａのメンブラン、例えばOmega 5K (Filtron)を用いて、限外ろ過することにより濃縮する。本発明の他の側面では、脂質化されておらず、単にＢ.ブルグドルフェリＯｓｐＣリポタンパクのタンパク部分のみからなることを特徴とする組換えＯｓｐＣを提供する。この脂質化されていないＯｓｐＣタンパクはＯｓｐＣアポタンパク質(複合タンパク質)、即ちリポタンパクの構成要素であり、それは完全に脂質部分を欠いている。本発明のこの態様のＯｓｐＣは完全な、非融合ＯｓｐＣである。驚いたことに、Pichia pastoris由来の本発明の組換えＯｓｐＣは非−脂質化でありかつ高い免疫原性を有する。これは、非脂質化ＯｓｐＡに関し、その免疫原性が脂質化ＯｓｐＡに比べて大きく低下していることがわかっている(Weis et al．(1994)，Infect．Immun．62:4632-36)ことから、特に驚くべきことである。本発明のＯｓｐＣはまた、タンパク沈殿活性を有する有機溶媒、例えば５０％エタノールに可溶性であることを特徴とする。本発明の範囲内で非−短縮化ＯｓｐＣをコードする遺伝子を酵母、好ましくは Pichia pastoris内で発現させると、驚くべきことに脂質部分を欠くＯｓｐＣが得られることが示された。「非−短縮化」とはアミノ酸レベルで組換えＯｓｐＣがプロセスされた天然ＯｓｐＣに対応しＮ−末端システインが存在することを意味する。脂質部分が喪失される理由は、Pichia pastorisが、細菌（Borrelia，E .coli)内で起こるように、このＯｓｐＣの翻訳後修飾のための酵素を欠いていることになる。脂質部分の喪失の結果、本発明のＯｓｐＣタンパクは宿主細胞の膜と結合せず、宿主細胞のサイトソル(cytosol)中に存在する。本発明に従って用いる溶媒は通常、タンパクを溶液から沈殿させるよう作用する。さらに驚くべきことに、本発明の組換えＯｓｐＣは、有機溶媒を加えたとき、例えば細胞性（細胞質）タンパク又は培地の構成タンパクなどの他のタンパクと一緒に沈殿せず有機溶媒中に溶解する。これまで、ＯｓｐＣにはこのような特別の（異常な）性質はなかった。ＯｓｐＣの新規な精製法の開発には、この異常な溶解形態が非常に重要である。その上、ワクチンの製造において、この性質はこれまで試験したあらゆる血清型ＯｓｐＣ変異体に適用されるという点でさらに重要ある。本発明によって精製される組換えＯｓｐＣは、同質攻撃に対して高度に効率的なワクチン防御を与え、さらに驚くべきことに異質攻撃に対して高いワクチン防御を与える。この本発明に従って精製された組換え、非脂質化ＯｓｐＣの免疫原性は、既存の文献には、ボレリアのＯｓｐタンパクはそれらが脂質部分を有する場合に限って免疫原性であると記載されていることから、一層驚異的である。その上本発明に従って精製された組換えＯｓｐＣは高純度でありヒトにとって危険なあらゆる汚染物質、例えば宿主細胞由来のタンパク、栄養培地由来のタンパク、核酸、発熱性及び毒性物質及び脂質など、を含有しない。本発明の組換えＯｓｐＣの回収及び精製法の故に、本発明の組換えＯｓｐＣは洗剤を１００％含有していない。ＵＳＰ(米国薬局方)に従って、動物テストにより本発明方法で精製されたＯｓｐＣは完全に発熱性物質を含有しないことが示された。さらに、ＵＳＰに従った(異常)病的毒性試験及びＵＳＰに従った皮膚反応性試験において、その耐性も証明された。このものは何らの危険性を伴わずにヒトに使用されるワクチン製品に含有させることができる。その高い免疫原性の故に本発明のＯｓｐＣは極く少量のアジュバントの添加が必要とされるにすぎない。本発明のさらなる側面では本発明の精製法によって得ることができるＯｓｐＣ製品に関する。本発に従って組換えＯｓｐＣを製造するには、ＯｓｐＣをコードするポリヌクレオチド分子を適当なベクター内で宿主細胞に導入した。以下、ＯｓｐＣをコードするポリヌクレオチド分子を「ＯｓｐＣ遺伝子」と呼ぶ。ＯｓｐＣ遺伝子は当業者に既知の方法でボレリアから調製し、ベクター分子に導入することができる（ＰＣＲ、“Screening”of gene libraries，cloning；e .g.:Maniatis et al.，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL;Cold Spring H arbor Laboratories(1982)）。しかしながら、ＯｓｐＣ遺伝子はいわゆるgene a ssemblerを用いて合成しても良い。ＯｓｐＣ遺伝子を発現−制御配列類（プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位）のそばで、ベクター分子に挿入する。発現制御配列類は対応する遺伝子の転写及び翻訳を引き起こすものであり、それらは転写又は翻訳を促進するよう作用することもある。発現制御配列は、選択した宿主細胞内で高い生産率を与えるよう、当業者既知の基準に従って選択される。本発に従って生産率は０.１ｍｇ／ｇ（湿細胞重量（ＭＣＭ））〜１００ｍｇ／ｇＭＣＭまでの範囲であり、好ましくは１ｍｇ／ｇＭＣＭである。本発方法で用いる宿主細胞は真核性細胞であり、好ましくは酵母細胞である。酵母細胞は、好ましくは、Hansenula sp.，Saccharomyces cerevisiae，Schizos accharomyces pombe、特に好ましくはPichia pastorisからなる群から選択される。本発に従い、発現制御配列は、それらが組換えＯｓｐタンパク、特にＯｓｐＣの酵母内での発現に適するよう選択される。発現のためには構成的かつ誘導可能なプロモーター類を選択しうる。誘導可能なプロモーターは誘導質分子を付加した場合のみ活性であり製造のために意図的に「スイッチオン」しうる。誘導可能なプロモーターは、例えばＡＤＨ２，ＡＯＸ，イソチトクロームＣ、アジ化ホスファターゼ(azide phosphatase)、窒素代謝に関連した酵素、メタロチオナイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ及びガラクトース及びマルトースの代謝に活性な酵素のプロモーターである。重要なプロモーターは、例えばＰＧＫ１及びＡＤＨ１プロモーター、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及び例えば、エノラーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、及びグルコキナーゼなどの他の解糖酵素のプロモーターである。Ｏｓｐ（ＯｓｐＣ）の発現のためのベクター分子は酵母細胞中の細胞質内、例えば、ＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＣｐ又はＹＡＣに存在し得るか、酵母細胞のゲノムに、例えばＹＩｐとして組み込まれる。さらには、酵母細胞と細菌（例、E．coli）内で増殖しうるいわゆる「シャトルベクター」が適する。「シャトルベクター」の一例として Pichia pastoris及びE．coli内で増殖可能なｐHIL-A1(Philips Petroleum)がある(WO 94/25596)。ＯｓｐＣ遺伝子は野生型ボレリア変異体と同じＯｓｐＣ分子をコードしているか、それに由来する（導かれる）。本明細書中、由来する（導かれる）とは、遺伝子が元の変異体と、該元の変異体に対する抗体が組換えＯｓｐＣを認識する程度に一致する組換えＯｓｐＣタンパクをコードしていることを意味する。遺伝子は遺伝子工学的に修飾されていても良く、それが遺伝子工学的に導入された突然変異を含んでいても良く、また５’及び３’領域内に所望のやり方での発現に影響する配列を含有していても良い。宿主細胞がPichia pastorisであれば、遺伝子は例えばPichiaに特異的なプロモーター、例えばメタノールで誘導可能なＡＯＸ−１プロモーターの制御（コントロール）下におくことができる。形質転換のために、そして、要すれば、また宿主細胞内での発現のために、遺伝子をベクター内に含有させる。ここで、ベクターのタイプは主として宿主細胞に依存し、適正なベクターの選択は当業者既知の判断基準に従って行われる。本発明に従って用いられるベクターは長期間にわたって効率的な発現を可能にするものである。宿主細胞がPichia pastorisであれば、ベクターはＰＨＩＬ−Ａ１（Phillips Pe troleum）であり、ＯｓｐＣ遺伝子はメタノールで誘導可能なＡＯＸ−１プロモーターの制御下におくことが好ましい。１つの具体的な実施態様では、ＰＨＩＬ −Ａ１構築物は例えば、WO 94/25596のｐＰＣ−ＰＰ４のようにして構築される。WO 94/25596に記載のごとく挿入されたＯｓｐＣ遺伝子はＢ．ブルグドルフェリの株Ｂ３１、ＰＫＯ，ＺＳ７，ＫＬ１０又はＥ６１を起源とするが、Liveyら( 1995，Mol．Microbiol．18: 257-69)が記載したように任意の他のタイプのＲＦＬＰ型を起源とするか、それに由来（それから導かれる）ものであってよい。本発明はボレリアＯｓｐＣ由来の組換えＯｓｐＣタンパクを回収し精製する新規な方法を提供する。由来する（導かれる）とは本発明の組換えＯｓｐＣがボレリアの天然のＯｓｐＣと非常に類似しているので、なおも哺乳動物内でライム病ボレリアに対する防御的な抗体の産生を引起すか、あるいはライム病ボレリアの同種病原体に対して哺乳動物により産生された抗体となお反応することを意味する。本発明のＯｓｐＣはボレリアＯｓｐＣの任意のサブタイプに由来して良い。本発明に従い、ボレリアとは、ライム病ボレリアの病原体、好ましくはＢ．ブルグドルフェリセンススツリクト(B．burgdorferi sensu stricto)、Ｂ．ガリニイ sp．nov.(B．gariniisp．nov.)及びＢ．アフゼリイ(B．afzelii)を意味する。本発明は、脂質化されていないことを特徴とする新規な、組換えボレリアＯｓｐＣ由来タンパクを提供する。「脂質化されていない」とはＯｓｐＣのＮ−末端システインに脂質部分が共有結合していないことを意味する。本発明の組換えＯｓｐＣはボレリアＯｓｐＣの任意の血清学的変異体でありうるが、血清学的変異体から導かれたＯｓｐＣであってもよい。本発明の組換えＯｓｐＣはさらに夾雑タンパク及びタンパク結合核酸が沈殿する条件下、有機溶媒に可溶性であることを特徴とする。本発明に従って、有機溶媒は、タンパク沈殿物質、特に一価又は多価アルコール類、短鎖ケトン類、スルホキシド類又はニトリル類からなる群から選択される。有機溶媒は、好ましくはメタノール、n-プロパノール、２−プロパノール又は他のプロパノールの異性体、ｔ−ブタノール、２−ブタノール又は他のブタノールの異性体、ＤＭＳＯ、アセトニトリル、ジオキサン、又はアセトンであり、特に好ましくはエタノールである。有機溶媒は水性緩衝液中に存在する。水性の緩衝液中に、単一の有機溶媒、又は異なる有機溶媒の混合物を用いることができる。水性緩衝液は、例えばリン酸(phosphate)緩衝化塩化ナトリウム溶液、Trisバッファー又はクエン酸塩バッファーであってよい。本発明に従って、有機溶媒は水性緩衝液中に、濃度１０％から９０％、好ましくは２０％から７０％、特に好ましくは４０％から６０％の範囲で存在する。水性緩衝液は、リン酸(phosphate)緩衝化塩化ナトリウム溶液、Trisバッファー又はクエン酸塩バッファーであってよい。好ましい実施態様では、有機溶媒は一価又は多価アルコールであり、特にエタノールが好ましい。エタノールは水性緩衝液中に濃度４０％〜６０％、好ましくは４５％〜５５％の範囲で存在する。本発明の組換えＯｓｐＣは本発明のＯｓｐの回収及び精製法で調製されることが好ましい。それは細胞質タンパク、発熱性及び毒性物質、核酸及び脂質を含まない。本発明の組換えＯｓｐＣは洗剤を添加せずに調製されるので、１００％洗剤不含である。本発明に従って調製される組換えＯｓｐＣは極めて高純度である。その純度は少なくとも９０％、好ましくは９５％、特に好ましくは９８％である。純度は一般的な生化学的方法（ＨＰＬＣ，電気泳動及び質量分析（マススペクトロスコピー））によって証明された。（実施例３参照）本発明に従って、組換えＯｓｐＣは単独の血清学的変異体でありうるが、数種の異なる変異体からなるＯｓｐＣ混合物であってもよい。一般に、本発明に従い、様々な血清学的変異体を別々に調製する。本方法はＯｓｐＣのあらゆる血清学的変異体に一様に適用可能であるので、異なる変異体を同時に精製することも可能である。この点における本発明方法の利点は、該方法をそれぞれの血清型に適合（順応）させる必要がないのみならず異なる変異体を調製の前又は後に混合しても何ら問題がないという点である。このことは、とりわけライム病ボレリアの予防には必要な多価ワクチンの効率的かつ均質な製造に非常に好適である。機能的な研究では本発明の組換えＯｓｐＣが高度に免疫原性であることを示すことができた。本発明の組換えＯｓｐＣはマウス内で抗体の形成を誘発する。さらに脂質化されていない本発明のＯｓｐＣは同種攻撃からマウスを１００％防御する。その上、それは異種攻撃に対しても驚異的に高い防御を与える。すなわち、それはワクチン中に含有されていないＯｓｐＣ変異体を有するボレリア株に対する防御を与える。個々のＯｓｐＣ変異体がワクチン接種の抗原として用いると７０％にいたる防御が観察された（実施例５参照）。３つの異なるＯｓｐＣ変異体の混合物をワクチン接種の抗原として投与すると異種防御は８０％であった（実施例６参照）。これらの結果は、ライム病ボレリアを効率的に防御するワクチンは、好ましくは幾つかの異なるＯｓｐＣ変異体を含有すべきであることを示唆している。その広範な適用可能性の故に本発明のＯｓｐＣ精製法はそのような多価混合ワクチンの製造に特に適する。しかも実施例５及び６で示された本発明の脂質化されていないＯｓｐＣの高い免疫原性は、従来技術で広く流布されている仮説、ボレリアのＯｓｐタンパクは脂質部分を有する場合にのみ効果的に免疫原性を発揮するという仮説と対照的である（WO 93/08299;Weis et al．(1994)，In fect．Immun．62:4632-36;Erdile et al．(1993)，Infect．Immun．61:81-90)。本発明方法によれば、本発明の組換えＯｓｐＣは極めて高純度に、かつヒトにとって危険なあらゆる汚染物質、例えば宿主細胞由来のタンパク、栄養培地由来のタンパク、核酸、発熱性及び毒性物質、脂質及び洗剤などを含有しないで調製することができた。動物試験（発熱物質試験、異常な毒性試験、皮膚反応性）により耐用性も証明された。本発明の組換えＯｓｐＣは何らの危険性を伴わずにヒトに使用されるワクチン製品に含有させることができる。それは製薬的な用途に非常によく適している。この文脈で製薬的用途とは、それが添加可能な物質と共に適当な生理学的担体中で哺乳動物、特にヒトに投与可能であり、予防又は治療効果を示すことを意味する。ＯｓｐＣの予防又は治療効果はその免疫原性によりワクチン接種の抗原となることにある。ワクチン接種の抗原とは哺乳動物内で特異的な免疫応答を引起す抗原である。この免疫応答は体液性及び／又は細胞性免疫に至る。免疫(immunity)とは、哺乳動物がボレリア感染から保護されるか、ボレリア感染の重篤度が非免疫哺乳動物におけるそれよりも低いことを意味する。予防的効果は健常な哺乳動物を免疫するときに認められる。この場合、ＯｓｐＣは健常哺乳動物にライム病ボレリアに対する免疫学的防御を賦与するワクチン中に含有される。治療作用は哺乳動物が既にボレリア感染している場合に認められ、ワクチン中に含有さっれるＯｓｐＣはボレリアに対する免疫反応を高めることにより治癒の進行を支持する。高純度であるために本発明のＯｓｐＣはまた、子供たちの免疫化にも非常に適する。本発明の組換えＯｓｐＣは抗血清又は抗体それぞれの製造における免疫原として適当な方法で用いることができる。このためには従来技術で既知の方法により試験対象を免疫学的に有効な量のワクチン接種の抗原で免疫化し、免疫グロブリンを単離し精製することができる。さらに、組換えＯｓｐＣに対する抗体を検出することによりワクチン接種の成功を評価することができる。通常、リン酸バッファーやクエン酸バッファー等の生理学的緩衝液を、生理学的担体として用いる。添加し得る物質には、アジュバント、例えば水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムなどのアルミニウム化合物、フロインドのアジュバント、又はその他鉱物油又は植物油乳剤、リポ多糖類、脂質Ａ，サポニン、Qu ilA、QS21及びISCOMS等がある。好ましいアジュバントは水酸化アルミニウムである。アジュバント以外に「担体」もワクチンに加えうる。典型的な担体としてリポソーム、ラテックス粒子、又はベントナイトがある。ワクチンの免疫原性を高めるために、さらに、インターロイキン類、例えばＩＬ−１又はＩＬ−２などの免疫刺激物質をも加えて良い。さらに、添加することができる物質に加えて、他のボレリア抗原又はウイルス抗原などの他の抗原も加えることができる。他のボレリア抗原は、例えばＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＥ若しくはＯｓｐＦ(Nguyen et al．(1994);Infect．Immu n．62:2079-84)、又はその誘導体である。ウイルス性抗原とは、例えばＴＢＥウイルスの抗原である。ＴＢＥウイルス及びボレリアのいずれもダニによって伝染されるので、そのような組み合わせは、それ自身、ダニ棲息地域に住む人々のためのワクチンとなる。さらに、いわゆる「担体物質」をワクチンに加えても良い。「担体物質」は、例えばTuberculin PPD、血清アルブミン、オボアルブミン又はKeyhole-Limpetヘモシアニンである。ワクチン接種抗原以外のワクチン中に含有される全ての物質は無毒で非アレルギー誘発性であることが好ましい。ワクチンの形成は当業者にとって既知である。本発明のワクチン接種抗原は凍結乾燥形で存在しており、使用に際してのみ生理学的に許容される緩衝液に溶解されるものであってよい。生理食塩水又は他の生理学的溶液は緩衝液として適する。ワクチン接種抗原を生理学的緩衝液と混合し所望の濃度のワクチン接種抗原を得る。所望の濃度とは免疫学的に活性な濃度であり、用量あたり、それぞれのワクチン接種抗原について１μｇから１００μgの範囲、好ましくは１０μｇから５０μgの範囲である。所望により、子供に対しては、ワクチン接種抗原の用量を、例えば、１用量について５〜３０μgの範囲に減少してもよい。最後に、本発明は、独創的な、組換えの、脂質化されていないＯｓｐＣを含有するワクチンを提供する。このワクチンは哺乳動物特にヒトへの投与に適する。その範囲及びワクチン防御の所望の範囲に応じて、ワクチンは本発明のＯｓｐＣの１又は数個の血清学的に異なる変異体を含有する。血清学的変異体は、Livey ら(1995，Mol．Microbiol．18:257-69)が記載した３５のＲＦＬＰタイプに対応する。しかしながら、ワクチン組成物は、様々なＯｓｐＣ変異体を含有しWO 94/ 25596に記載されている地域特異的組成物に対応していてもよい。１つの実施態様では、ワクチンは本発明の異なるＯｓｐＣ血清学的変異体を３〜８個含有しておりある地域で発生しているボレリア血清型に対する広範な異種保護を付与する。特別の態様では、ワクチンはＯｓｐＣの異なる３つの血清学的変異体を含有しており、例えば、ＲＦＬＰ変異体Orth、ＰＫＯ及びＥ６１の組成物、又はＲＦＬＰ変異体ＺＳ７、ＰＫＯ及びＥ６１の組成物である。しかしながら、Liveyら(1995，Mol．Microbiol．18:257-69)の記載に従って２又はそれ以上のＲＦＬＰ変異体を含有する任意の組成物も可能である。以下に実施例及び図面に従い本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら、本発明はこれらに限定されない。図１〜３は沈殿の最適化を示す。図４は溶離最適化を示す。図５〜８は従来法又は本発明方法それぞれに従って得られたＯｓｐＣタンパクの純度分析を示す。実施例：実施例１：組換えＯｓｐＣ（ｒＯｓｐＣ）のPichia pastoris内での発現 Pichia pastoris株GS115 NRRL-Y 11430（Cregg et al．(1985);Mol．Cell．Bi ol．5:3376-85)をDohmenら(1991;Yeast 7:691-92)の方法に従って、Borrelia bu rgdorferi株Orth、株ACAl、又は株ZS7のＯｓｐＣ遺伝子を含有するベクターpPC- pp4（WO 94/25596に記載）を用いて形質転換した。形質転換体をＭＤ培地中で光学的密度（ＯＤ６００）が２-１０になるまで３０℃で増殖させた。ＯｓｐＣ発現の誘導及び分析はWO 94/25596に記載されている。実施例２：ｒＯｓｐＣのPichia pastorisからの精製（出願人は、本発明を実施する上でのベストモードは実施例２であると考えている）形質転換されたｒＯｓｐＣ(株Orth又はZS27)を発現するPichia pastoris細胞（細胞の湿重量５００ｇ）をトリス緩衝液(Tris buffer)（２０mM Tris-HCl，p H9.0)５００mlに懸濁しManto Gaulin ホモジナイザーで粉砕した。遠心（10,0 00gで15min）により懸濁液から、酵母細胞の固形成分を除去した。攪拌下95％エタノールを、最終濃度が５０％エタノールになるまで加えた。 4℃で1時間インキュベーションしたのち、形成された沈殿を遠心（20,000gで15m in）により除去した。澄明な無細胞(cell free)上清をTris buffer（２０ｍＭ Tris-HCl，pH9.0)でエタノールの濃度が４５％になるまで希釈したのち、 Source PR15^TM(Pharmacia)を充填したクロマトグラフ用カラムに適用した。カラムをリン酸緩衝化塩化ナトリウム溶液中４５％エタノールで洗浄した。リン酸緩衝化塩化ナトリウム溶液中４５％〜７０％のエタノールグラディエントによってカラムからｒＯｓｐＣを溶離した。溶出液のＵＶ吸収を波長214nmで連続的に測定した。ｒＯｓｐＣはエタノール濃度５５％付近で溶出した。ｒＯｓｐＣ陽性画分を合した。Sephadex G25によるゲルろ過によって流したバッファーをTris-HCl+0.9% NaClバッファー(pH7.4)で置換した。次いで、溶液を、Omega 5 Kメンブラン(Filtron)による限外ろ過で濃縮した。実施例３：実施例2に従って精製したｒＯｓｐＣの分析実施例2に従って精製したｒＯｓｐＣの収率と純度をBCA法、HPLC、SDS−PAGE 、Limulus amebocyte lyste法、ガスクロマトグラフイー、及びフェノール／Ｈ₂ ＳＯ₄法よって決定した。結果を表１（Orth株）及び表２（ZS7株）にまとめた。本実施例は本発明方法によれば、非常に異なるサブタイプ（Orth，ZS7:相同性＝ 69.2%）のｒＯｓｐＣが効率的に精製されることを示している。表に記載の数値はそれぞれのｒＯｓｐＣが高純度であることを示している。表１実施例２に従って精製したOrth株のｒＯｓｐＣの分析表２実施例２に従って精製したＺＳ７株のｒＯｓｐＣの分析実施例４：Pichia pastoris からのｒＯｓｐＣの精製における様々な有機溶媒の比較実施例２に従って破砕したOrth株のｒＯｓｐＣを発現した酵母細胞の懸濁液１ mlをそれぞれ異なる有機溶媒を用いて表３に記載の濃度にした。４℃で１時間インキュベートしたのち、形成された沈殿を遠心(20,000g，15min)で除去した。上清の一部をSDS-PAGEによるタンパク分析に付した。ｒＯｓｐＣの収率は、SDS- PAGEゲルをCoomassie Blueで染色し、デンシトメーターにより評価した。ここで、収率はエタノールによる沈殿の値に基く。本実施例はエタノール以外に他の有機溶媒、例えばt-ブタノール、2-ブタノール、アセトニトリル及びジオキサンも夾雑物質の沈殿化剤として用いることができ、ｒＯｓｐＣの大部分を沈殿の上清中に可溶性タンパクとして得ることができることを示している。表３実施例５：ｒＯｓｐＣによるマウスの免疫化 1用量３μｇのｒＯｓｐＣ（Al(OH)₃中の製剤（0.2％））によりC3H/HeJ実験マウスを２回免疫した。免疫した抗原に対する抗体の力価をボレリアＯｓｐＣを用いるELISAで決定した。第２回目の免疫から２週間後哺乳動物を、同種又は異種の株（チャレンジ）の用量１０⁴感染性ボレリア(10i.d．50)で攻撃（チャレンジ）した。さらに１週間後、感染を診断するために血液及び幾つかの器官（心臓、膀胱、腎臓、脾臓）をマウスから取り出した。結果を表４にまとめた。表４の結果は実施例２に従って精製したｒＯｓｐＣにより同種チャレンジに対して高い防御効果が得られることを示している。試験した３つのｒＯｓｐＣ抗原(Orth,ZS27 及びACAl株の抗原）の全てが、同種攻撃に対して１００％の保護をもたらした。表４はさらに異種攻撃においても７０％に上る部分的保護効果が達成されうることをも示している。表４実施例６：異なる組換えＯｓｐＣの混合物によるマウスの免疫実施例５に示したようにしてC3Hマウスを免疫した。しかし、この試験では個々のｒＯｓｐＣ変異体３μｇを投与する代わりに異なるｒＯｓｐＣ変異体の混合物を投与した。種々の混合物の組成物を表５に示した。全ての場合、抗原の総用量は９μｇであった。ここで、攻撃は種々のボレリア株（同種及び異種の株）を用いて行った。この実験の結果を表５に示した。この結果は、３つの異なるｒＯｓｐＣ変異体からなる混合ワクチンは、ワクチン中に含有されるｒＯｓｐＣ変異体を有するボレリア株に対して保護するのみならず、異種のボレリア株に対しても予想外に高い率（80％）で保護することを示している。表５実施例７： rＯｓｐＣのための沈殿の最適化最適沈殿条件は、主に混合する溶媒の量に関しては溶媒毎に異なる。本発明に従って、個々の有機溶媒の最適濃度として、その濃度で細胞質タンパクは実質上完全に沈殿するが、Ｏｓｐタンパクは依然として沈殿しないか極く低い程度にしか沈殿しないような濃度を選択する。様々な有機溶媒の最適沈殿濃度を決定するためには、出発物質としての、組換え法で製造されたｒＯｓｐＣの培養液を溶媒としてのメタノール、２−プロパノール、ｔ−ブタノール、DMSO、アセトニトリル及びジオキサンの様々な濃度（１０％、２０％、４０％及び５０％）で処理し、結果をゲル電気泳動でチェックした（図１及び２参照）。Ｏｓｐタンパクからの随伴タンパクの最適な分離は、括弧内の濃度のメタノール（４０％）、２−プロパノール（５０％）、ｔ−ブタノール（５０％）、DMSO （４０％）、アセトニトリル（４０％）及びジオキサン（５０％）による沈殿で行えることが分かった。実施例８：エタノールのための沈殿の最適化組換えＯｓｐＣを含有する１つの実施態様の溶液を３０％、４０％、４５％及び５０％のエタノールで処理し、得られた溶液をＳＤＳゲル電気泳動及びウエスタンブロット分析によってチェックした。結果を図３に示す。図３は、rＯｓｐＣに関し、４０％〜５０％の間のエタノールで最適な沈殿化が達成されることを示している。実施例９：吸着処理の最適化吸着処理を最適化するために、固体担体に吸着したＯｓｐタンパクの溶離を線状エタノールグラディエント（４５％〜７０％）によって分析した。結果を図４並びに以下の表に示す。表６実施例１０： WO 94/25596との比較試験 WO 94/25596に従って得たＯｓｐ製品と本発明方法で得たものとを比較するためにOrth/F17株の組換えＯｓｐＣとACAl株の組換えＯｓｐＣとをWO 94/25596の「従来法」と本発明の方法のそれぞれにより精製した。結果を図５、６及び表７、８（WO 94/25596に従った方法について）、及び図７及び８、並びに表９及び１０（本発明に従った方法について）に、それぞれ示す。従来法によれば、様々な純度のＯｓｐＣ生成物が得られ、純度は５６％から８０％の間で変動することがわかった。すなわち、WO 94/25596の方法に従って、O rth/F17株の組換えＯｓｐＣは純度８０％、ACAl株の組換えＯｓｐＣは純度５６％で得られた。これとは対照的に本発明の精製法によれば、明確に改善された純度の組換え非脂質化OsPC製品を得ることができ、それは少なくとも９５％に達し、９９％にも至ることがある（図８及び表１０参照）。その上、本発明の精製法は従来知られているあらゆるＯｓｐＣ変異体に適用可能であり、かくしてあらゆる変異体に関して抗原を一様な程度に精製することができ、それは本発明以前に開示された方法では不可能であった。一様に高度な純度で様々なＯｓｐＣ変異体を回収することにより、少なくとも９０％の純度の製品を製造することがはじめて可能になり、とりわけ少なくとも３つの異なる血清学的ＯｓｐＣ変異体を混合することにより、異種ボレリア株の攻撃（チャレンジ）に対しても保護するワクチン製品を製造することができる。このことにより、広範な保護スペクトルを有するボレリアワクチンの生産における重大な発見（突破口）が達成されたのである。これとは対照的に、WO 94/25596によれば、比較研究で酵母から回収されたＯｓｐＣ製品は同種株による感染に対してのみ保護するにすぎないことが見出された。表７表８表９表１０

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 1/16 Ｃ０７Ｋ 1/16 14/195 14/195 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者ドルナー，フリードリッヒオーストリア、アー―1230ヴィーン、ペーターリニガッセ17番

Claims

【特許請求の範囲】１．ボレリア菌(Borrelia)の表面リポタンパク由来の、組換えＯｓｐタンパクを真核性宿主細胞から回収及び精製する方法であって、宿主細胞溶解物を、細胞質タンパクが実質上完全に沈殿し、組換えＯｓｐタンパクが選択的に溶液中に残存する条件下でタンパク沈殿性有機溶媒と混合すること、及びＯｓｐタンパクを該溶液から精製及び回収することを特徴とする方法。２．沈殿した細胞質タンパクを組換えＯｓｐタンパクから沈降により分離し、組換えＯｓｐタンパクが溶液に残存することを特徴とする請求項1記載の方法。３．Ｏｓｐタンパク含有溶液を、固体担体とＯｓｐタンパクが選択的に該担体に結合する条件下で接触させ、次いで有機溶媒でそれを溶離することを特徴とする方法。４．Ｏｓｐ含有出発物質からＯｓｐタンパクを精製する方法であって、Ｏｓｐタンパクを逆相クロマトグラフィーに適した固体担体に選択的に結合させ、所望により洗浄し溶離させることを特徴とする方法。５．固体担体がケイ酸塩、好ましくはSpherisorb 5C18、又は合成ポリマー、好記載の方法。６．溶離を、有機溶媒のグラディエントで行うことを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の方法。７．有機溶媒がタンパク沈殿物質、特に一価又は多価アルコール類、短鎖ケトン類、スルホキシド類又はニトリル類、好ましくはメタノール、n-プロパノール、２−プロパノール及び他のプロパノールの異性体、ｔ−ブタノール、２−ブタノール及び他のブタノールの異性体、ＤＭＳＯ、アセトニトリル、ジオキサン、又はアセトン、特に好ましくはエタノールからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。８．異なる有機溶媒の混合物を用いることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。９. 有機溶媒を水性緩衝液中に、１０％から９０％、好ましくは２０％から７Ｏ％、特に好ましくは４０％から６０％の濃度で用いることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。 10．酵母、好ましくはHansenula sp.，Saccharomyces cerevisiae，Schizosac charomyces pombe及び特に好ましくはPichia pastorisからなる群から選択される真核性宿主細胞を用いることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。 11．ＯｓｐタンパクとしてＯｓｐＣを回収することを特徴とする請求項1〜10 のいずれかに記載の方法。 12．単にＢ.ブルグドルフェリＯｓｐＣタンパクのタンパク部分のみからなることを特徴とする脂質化されていない組換えＯｓｐＣ。 13．脂質化されていず、細胞質タンパク、発熱性及び毒性物質、核酸及び脂質を含まず、タンパク沈殿性有機溶媒に可溶性であることを特徴とする組換えＯｓｐＣ。 14．タンパク沈殿性有機溶媒が一価又は多価アルコール類、好ましくはエタノールであることを特徴とする請求項１３記載の組換えＯｓｐＣ。１５．エタノールが水性緩衝液中に、４０％から６０％、好ましくは４５％から５５％の濃度で存在することを特徴とする請求項１４記載の組換えＯｓｐＣ。１６．少なくとも９０％、好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の純度を有することを特徴する請求項１２〜１５のいずれかに記載の組換えＯｓｐＣ。１７．製薬に使用されるものである請求１２〜１６のいずれかに記載の組換えＯｓｐＣ。１８．組換え非脂質化ＯｓｐＣと、所望により生理学的に許容される担体とを含有することを特徴とするワクチン。１９．さらに、Ｂ.ブルグドルフェリ抗原ＯｓｐＡ，ＯｓｐＢ，ＯｓｐＤ，ＯｓｐＥ若しくはＯｓｐＦ、又はＴＢＥウイルスの抗原からなる群から選択される抗原をも含有している請求項１８記載のワクチン。２０．請求項１２〜１７のいずれかに記載の組換え非脂質化ＯｓｐＣと、所望により生理学的に許容される担体とを含有することを特徴とするワクチン。２１．ライム病ボレリアに対して哺乳動物を免疫するためのワクチンの製造における組換え非脂質化ＯｓｐＣの使用。２２．請求項1〜１１のいずれかに記載の方法によって得ることができるＯｓｐＣ製品。