PT96132A - Processo de preparacao de polipeptidos de vectores e de vacinas contra a malaria - Google Patents

Description

SBC 14445

MEMóRIft DESCRITIVA

que compreendem determinantes imunogénicas das regiSes de

de repetição central e menos do que a totalidade das deterríi.iri-,n_. tes imunoqénicas de repetição do domínio de repetição e a método·-* para o tratamento de humanos contra a infecção da malária.

SUMARIO DA INVENÇÃO

De um modo geral, o presente invento refere-se ao processo de preparação de um polipéptido compreendendo uma ou mais determinantes imunogénicas de uma primeira região flanqueando um domínio de repetição central de uma proteína de superfície de Plasmori-ium.. uma ou mais determinantes imunogénicas de uma segunda região flanqueando o domínio de repetição, e menos do que a totalidade, ou nenhuma, das determinantes imunogénicas de repetição do domínio de repetição central.

Numa sua concretização, o presente inventa refere-se ao processo de preparação de um polipéptido compreendendo pelo menos uma mas menos do que a totalidade das determinantes imunogénicas de repetição de um domínio de repetição da proteína de superfície de Plasmodium e uma ou mais determinantes imunogénicas de regiSes de uma proteína de superfície de Plasmodium flanqueando o domínio de repetição.

Numa outra concretização da invenção, o polipéptido compreende, substancialmente, todas as determinantes imunogénicas das regiffes flanqueando o domínio de repetição central e está desprovido de determinantes imunogénicas do domínio de repetição central. Alternativamente, o polipéptido compreendendo, substancialmente, todas as determinantes imunogénicas das regiffes de

i J.anqueamento, compreenot, sdii-ionaImsnte, peiu menus uma, ms.s menos do que a totalidade, das determinantes imunogénicas do dominio de repetição central.

Determinantes imunogénicas úteis nos polipéptidos do presente invento incluem, preferivelmente, as que estão presentes nas proteínas de superfície de Plasmodium falciparuni, P. viva;·;. P. malariae e P. ovale..

Ainda numa outra concretização do presente invento, o polipéptido é geneticamente fundido com uma proteína transportadora, preferivelmente com uma proteína transportadora que melhora, quer a expressão do polipéptido,, quer a imunogenicidade do polipéptido, ou ambos»

Numa concretização preferida,, os polipéptidos do presente invento compreendem uma proteína transportadora imunogénica, por exemplo, os 81 aminoácidos do terminal N da proteína 1 não estrutural do vírus da gripe (NSIqj), fundida, através de um ligante sintético, com uma primeira região de flanqueamento de uma proteína de circumesporozoíto (CS) de Plasmodium, que está, ela própria, fundida com ume. segunda região de flanqueamento de. proteína de CS.

Estes polipéptidos podem compreender, adicionalmente, mais do que uma, mas menos do que a totalidade das determinantes imunogénicas do domínio de repetição central da proteína de CS, por exemplo, a determinante imunogénica do domínio de repetição compreendendo um tetrapéptido com a sequência de aminoácidos (Asn-X-Y-Pro), na qual X é Ala ou Vai e Y e Asn ou Asp. As determinantes imunogénicas do domínio de repetição central podem estar localizadas, por exemplo, entre a proteína transportadora e a primeira região de flanqueamento ou entre a primeira região de flanqueamento e a segunda região de flanqueamento„

Outro aspecto do presente invento inclui o processo de preparação de vectores de expressão codificando os polipéptidos, de vacinas compreendendo os polipéptidos; métodos para purificar os polipéptidos; e métodos para o tratamento de humanos, contra a

71 92te SBC 14445-2 -4- infecçâo da malária.» asando os péptidos.

Na descrição detalhada que se seque descrevem-se outras aspectos e vantagens do presente invento.

DESCRIÇgQ DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

No presente pedido de patente usam-se as abreviaturas de aminoácidos sequintess

Ala Alanina . Arg Arginina Asn Asparagina Asp Acido Aspártico Cys Cisteína 61 u Acido GlutSmico 61 n Glutamina Gly G1icina H.is Histidina Ile Isoleucina Leu Leucina Lys Lisina Met Metionina Phe Fenilalanina Pr o Prolina Ser Serina Thr T reonina Trp Triptofano Tvr T irosina Vai Valina 0 parasita da malária protozoário, um certo número de proteínas, específicas de determinados estados, presentes na sua superfície celular exterior. Verificou-se que estas proteínas de superfície possuem tr'ê's regiSes em comum, nomeadamente, uma região ou domínio, de epítopo repetido, central e um par de regiEfes de flanqueamento. A primeira região de flan-queamento do par está fundida com o terminal carboxilo do domínio de repetição central e a segunda região de flanqueamento do par está fundida com o terminal amino do domínio de repetição central, SBC 1444 5~2 yfag -5-

Os polipéptidos do presente invento são derivados de uma porção de uma proteína de superfície de Plasmodium que contem menos do que a totalidade, ou nenhuma,das determinantes imunoge-nicas do domínio ds repetição central entre a primeira e a segunda regiSes de flanqueamento e são e;·;pressas em quantidades suficientes para uso como agentes terapêuticos para inibir a in-fecção provocada por parasitas da malária.

Por outras palavras,, os polipéptidos da invenção possuem menos repetiçSes em tandem entre a primeira e a segunda regiSes De flanqueamento do que as que estão presentes nas regiSes de repetição do tipo selvagem. Assim, no caso de,um polipéptido para a protecção de um humana contra a infecção provocada por P. fal-ciparum. o polipéptido pode compreender toda a primeira região de flanqueamento, isto é, a região de flanqueamento do terminal IM da proteína de circumesporozoíto de P. falcioarum (PfCSP), toda a segundei região de flanqueamento, isto é, a região de flanqueamento do terminal C da PfCSP e, entre a primeira e a segunda regiSes de flanqueamento, menos do que 41 repetiçSes em tandem da PfCSP, isto é, menos do que 41 tetrapéptidos de fórmula Asn-X-Y-Pro, na. qual X é Ala ou Vai e Y e Asp ou Asn.

Numa proteína de superfície de Plasmodium do tipo selvagem, a região de repetição é imunodominante» Nos polipéptidos do presente invento, o número e a localização das repetiçSes em tandem, ou das unidades de repetição, são seleccionados de modo a não mascarar a imuno-resposta em relação â primeira e à segunda região de flanqueamento. Preferivelmente, o número de repetiçSes nos polipéptidos de invenção é não mais do que metade do número de repetiçSes presentes na proteína do tipo selvagem. Mais preferivelmente, o número de repetiçSes nos polipéptidos da invenção é não superior a cerca de um quarto do número de repetiçSes presente na proteína do tipo selvagem.

Conhecem-se quatro espécies de Plasmodium que infectam o homem, sendo a mais importante o P. falcioarum seguido do P. viva;·; e, num menor grau, do P. malariae e do P. ovale. 0 domínio de repetição central da proteína de circumesporo- 71 92t-SBC 14445-2 —6—

zoí t.o CCS) de Pias constituído por 41 CÍ O S Cf U 3. j.. S C ô ίΤΐ 3 S 0 Cj (A1a)-Asn-Pro1ina modium faleiparuiu no estada de esoorozaíto é tetrapéptidos repetidos em tandem5 trinta e um ufncia de aminoácidos Asparagina (Asn}-Alanina (Pro) s quatro dos quais tem a sequência Asn- -Valina (Vai 5-Aspartato (Asp)-Pro. Em ambos os lados do domínio de repetição central existem as rsqiSes de flanqueamento contendo a RegiSo I e a Região II, duas regi cies da proteína de CS poeticamente icJtnticas,, na sequência de aminoácidos, às regiões correspondentes de todas as espécies de plasmótíio tais como a proteína de CS de P. knowlesi (uma malária do macaco) (Dame et al . , Science„ 225s 59-3 (1984)). Várias proteínas de superfície de P. falciparum na fase sanguínea possuem também epítopos repetidos, por exemplo, o antigénio S (Pra-Ala-Lys-Ala-Ser-Gln-Gly-Gly—Leu-61u-Asp)ç o an~ tigénio RESA (Glu—Glu-Asn—Val-Glu—His—Asp~Ala); o antigénio FIRA (Val-Thr-Thr-Gln-Glu-Pro); e o antigénio PF-11 (Glu-Glu-Val-Val--GIu-G1u-Va1-Va1-Pro). A proteína de circumesporozoíto do F. vivax contem o epítopo repetido (Gly-Asp-Arg-Ala-Asp-Gly-Gln—Pro—Ala) e a proteína de circumesporozoíto da P. malariae cantem o epítopo repetido (Asn--Asp-Ala-Gly) e (Asn-Ala-Ala-Gly).

Os polipéptidos do presente inventa compreendem uma ou mais determinantes imunogénicas de uma. primeira região de flanqugamen-to do domínio de repetição central de umai proteína de superfície d® PlasiTiodium, uma ou mais determinantes imunogénicas de uma segunda região de flanqueamento do domínio de repetição e menos do que a totalidade, ou nenhuma, das determinantes imunogénicas de repetição do domínio de repetição central.

As determinantes imunogénicas são sequências de aminQécidos que induzem uma resposta de células B ou de células T. Geralmente, as determinantes imunogénicas comprendem, pelo menos, 6 aminoácidos. A identificaição precisa de determinantes imunogénicas numa proteína pode ser efectuada por técnicas convencionais envolvendo a localização com anticorpos monoclonais e/ou a de-lecção de aminoácidos seguida por ensaios de actividade» Preferi- 71 BBC 14445

de 30s e, muito preferivelmente,, toda a primeira e segunda regiSes de flanqueamento menos a sequência de sinal.

Numa concretização, os polipéptidos do presente invento compreendem pela menos uma, mas menos do que a totalidade, das deter- minant.es imunogénicas de um domínio de repetição central de uma

domínio de repetição.

Numa outra concretização, os polipéptidos do presente invento compreendem, substancialmente, todas as determinantes imunogénicas das regiães flanqueando o domínio de repetição central e estão desprovidos de determinantes imunogénicas do domínio de repetição central ou, alternativamente, contêm pelo menos uma, mas menos do que a totalidade, das determinantes imunogénicas do domínio de repetição central. Por "substancial-mente todas" entende-se que são utilizadas substancialmente toda a primeira região de flanqueamento e toda a segunda região de f lanqueamen to, menos a sequência de sinal.? preferivelmente, a cada região não faltam mais do que cerca de 20 aminoécidas e, mais preferivelmente, utilizam-se toda a primeira região de flart-queamento e toda a segunda região de flanqueamento, menos a sequência de sinal.

Outra concretização do presente invento é dirigida a um polipéptido compreendendo uma ou mais determinantes imunogénicas da primeira região de flanqueamento de uma proteína de superfície de Flasmodium, uma ou mais determinantes imunogénicas da segunda região de flanqueamento de uma proteína de superfície de Plasmo-dium, e menos do que a totalidade ou nenhuma das determinantes imunogénicas de repetição do domínio de repetição compreendido entre as referidas primeira e segunda regiffes de flanqueamento, no qual pelo menos uma das referidas determinantes imunogénicas da primeira região de flanqueamento é codificada pela sequência de 71 92è SBC 14445-2 S~

am i πoãci d as B1 v-As p-Asn-G 1 y-A rçj -G1 u-G 1 y-Lys ? G1u-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys? ou Leu-Lys-G1n-Pra-G1y-Asp-G1y-Asn5 ou por um seu equivalente funcional.

Ainda uma outra concretização do presente invento é dirigida a um polipéptido compreendendo uma ou mais determinantes imunogé-nicas da primeira região de flanqueamento de uma proteína tíe superfície de Plasmodiurnuma ou mais determinantes imunogénicas da segunda região de flanqueamento de uma proteína de superfície de Plasmodiurn e menos do que a totalidade ou nenhuma das determinantes imunogénicas de repetição do domínio de repetição compreendido entre as referidas primeira e segunda regiSes de flanqueamento, no qual pelo menos uma das referidas determinantes imunogénicas da segunda região de flanqueamento é codificado pela sequência de amino ácidos

Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala; ou

Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Slu-Leu-Asp; ou por um seu equivalente funcional.

Ainda uma outra concretização do presente invento é dirigida a um polipéptido compreendendo uma ou mais determinantes imunogénicas da primeira região de flanqueamento de uma proteína de superfície de Plasmodiurn, uma ou mais determinantes imunogénicas da segunda região de flanqueamento de uma proteína de superfície de Plasmodiurn e menos do que a totalidade ou nenhuma das determinantes imunogénicas de repetição do domínio de repetição compreendido entre as referidas primeira e segunda regiães de flanqueamento, no qual pelo menos uma das referidas determinantes imunogénicas da primeira região de flanqueamento é codificado pela sequência de aminoácidos G1y-Asp-Asn-G1y-Arg-Glu-Gly-Lys; G1u-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys; ou

Leu-Lys-G1n-Pro-G1y-Asp~G1y-Asn; 71 SBC 14445

a mi η o á c i ci o s

Pro-Asn-Asp-Pro-Asn—Arg—Asn—Va1-Asp~B1u-Asn—Ala; ou

Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu—Asp; qu pelas seus equivalentes funcionais.

Uma concretização adicional do presente invento é dirigida a um polipéptido compreendendo menos do que a total idade ou nenhuma das determinantes imunogénicas do domínio de repetição de urna proteína de superfície de Plasmodium e pelo menos um péptido codificado pela sequência de aminoácidos G1y-Asp-Asn-G1y—Arg-Glu—G1y-Lys; G1u-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro—Lys;

Leu-Lys-61n-Pro-G1y-Asp-Gly-Asn;

Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala; ou

Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp; ou por um seu derivado funcional.

Um aspecto adicional do presente invento refere-se ao processo de preparação de uma vacina para a protecção de humanos contra a infecção provocada por esporazaitos de Plasmodium compreendendo uma quantidade imuno-protectora do polipéptido da invenção e um transportador farmaceuticamente aeitável. 0 pre sente invento refere-se também a um método parai imunizar um humano necessitado de protecção contra a infecção provocada por esporozoítos de Plasmodium compreendendo a administração a esse humano de uma quantidade eficaz, não tóxica dessa vacina.

Preferivelmemnte, o polipéptido do presente invento é um polipéptido hibrido, isto é, uma proteína constituída pela fusão genética ou química entre uma porção de uma proteína de superfície de Plasmodium e uma proteína transportadora.

Mais preferidos são os polipéptidos hibridos que incluem uma. proteína transportadora fundida, geneticamente, com uma porção da proteína de circumesporozoíto (CS) de Plasmodium falciparum

7i 92o oBC 1444 5 “_2 -10- cantenao menos ao que a totalidade ou desprovida dos tetrapepti-oqs as repetição que constituem o domínio de repetição central.

Particularmente preferidos são os polipéotidos híbridos nos auaxs a molécula transportadora fundida quimicamente é uma macro-molécula imunopotenciadora, tal como, mas não limitada a, Boroetel la morta, toxóide do tétano,, toxina da difteria e toxina da cólera B.

Também particularmente preferidos são aqueles polipéptidos nxbriaos nos quais a proteína transportadora fundida geneticamente, melhora não apenas a imunoqenicidade do polipéptido transportado mas também potência a expressão do polxpéptido por um transformante. Outras propriedades desejáveis destas proteínas transportadoras incluem a melhoria da purificação ou da formulação do polipéptido» Exemplos destas proteínas transportadoras incluem, o antigénio de superfície do vírus da Hepatite B tAgSHB), NSlgi (81 aminoácidos do terminal N da proteína 1 não estrutural do vírus da gripe (A/PR/8/34) (Baez et a_l. , Mucleic Acids Research, 8s5845 (1980)); o R32 ([Asn—Ala-Asn-Pro>^5- -(Asn-Val-Asp-Pro) 32^ (Young et aJU, Science. 228:958 (.1985)); e o galk.

Com base na descrição aqui apresentada, os polipéptidos do presente invento podem ser preparados por um perito na arte usando técnicas de engenharia genética convencionais ou técnicas de síntese de péptidos convencionais.

Concretizações específicas dos tipos de polipéptidos do presente invento aqui exemplificadas incluem: o WSlgjL-RLfA9, que é um polipéptido de fusão compreendendo 81 aminoácidos do terminal N da proteína 1, não estrutural, do vírus da gripe (NSlgj_); a região de flanqueamento contendo a Região I da proteína de CS de P. falciparum menos a sequência de sinal (18 aminoácidos do terminal 14) e a região de flanqueamento contendo a Região II menos os seus primeiros 9 aminoácidos do terminal N (RLf A?) . A· fusão do NSlgj[ com o (RLfΔ'?) é facilitada através de uma sequência ligante de ADN sintética codificando -Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-; /i 5BC 14445—2 iSHr -li- d NSlgi-RLfAuth, que é um polipéptido de fusão compreendendo o NSlg^s a região de flanqueamento contendo a Região I da proteína de CS de P. falcioarum menos a sequência de sinal e toda a região cie flanqueamento contendo a Região 11 (RLfAuth); o IMSlgj_-(Asn-X-Y-Pro)n-RLfAuth, que é um polipéptido de fusão compreendendo IMSlgjj RLfAuth e (Asn-X-Y-Pro), onde X é Ala ou Vai e Y é Asn ou Asp, e n é um inteiro maior ou igual a um e menor ou igual a 100,, preferivelmente, menor do que 50; e, aoicionalmente, no qual o (Asn-X-Y-Pro) está posicionado entre o NSlgj[ e o RLfAuth; o NSlgiRLfAuth+(Asn-X-Y-Pro)n, que é um polipéptido de fusão compreendendo o NSlgj_; o RLfAuth; e (Asn-X-Y-Pro) onde X e Y são definidos como anteriormente e n é <41; e, adicionalmente, no qual o (Asn-X-Y-Pro) está localizado entre a região de flanqueamento contenda a Região I da proteína de CS de P. falciparum e a região de flanqueamento contendo a Região II, isto é, na região anteriormente ocupada pelo domínio de repetição central; e os peptidos seguintes da invenção foram identificados como epítopos neutralizantes do esporozoíto de P. falciparums 6Iy-Asp-Asn-B1y-Arg-B1u-Gly-Lys G1u-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys

Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn

Pro-Asri-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Va 1 -Asp-G 1 u-Asn-A 1 a

Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp

Estes polipéptidos são porém apenas ilustrativos. Com base na descrição aqui apresentada, um perito na arte saberá como construir e testar outras polipéptidos no campo da invenção, por exemplo, polipéptidos compreendendo sequências de proteínas de superfície, incluindo a proteína de circumesporozoíto dos vários parasitas da malária que não o P. falciparum. polipéptidos compreendendo mais ou menos aminoácidos das proteínas de superfície, polipéptidos que são modificados quimicamente e polipéptidos que estão fundidos com outros ou com sequências de aminoácidos ou de

proteínas adicionais,, Estes polipéptidas são construídos facii-iiiente por técnicas convencionais de engenharia genética e/ou de síntese de proteínas e podem ser testados em modelos animais, substancialmente como aqui a seguir se descreve» Por exemplo, uma proteína cia invenção pode compreender sequências de aminoéeidos das regií!íes de flanqueamento da proteína de superfície, tais como substancialmente toda a proteína de circumesporozoíto, desprovida ao domínio de repetição central, fundida com o antigénio de superfície do Vírus da Hepatite B (AgsHB) numa proteína de fusão que pode formar partículas de AgsHB híbridas, tal como se descreve no Pedido de Patente Europeia, número de publicação EP 278.940, publicado em 17 de Agosto de 1988»

Uma sequência genética de codificação das regiêes de flanqueamento da proteína de superfície, dos tetrapéptidos, das sequências ligantes de ADN sintéticas e das proteínas transportadoras, pode ser, facilmente, obtida por um perito na arte usando técnicas conhecidas. Estas incluem a síntese, e , preferivelmente, por transcrição inversa de ARN mensageiro ou por clonação directa de genes intactos de ADN genómico, bem como geração de sequências específicas por tecnologia convencional de reacção em cadeia com polimerase (PCR). A transcrição inversa de ARN mensageiro de P. falciparum é descrita em Ellis et al., Nature, 302.5536 (1963). A clonação directa de genes intactos de ADN genómico de P. falcioarum é descrita em Dame ejh al.-, (citado anteriormente). A clonação e a expressão de polipéptidas contenda repetiçSes está descrita no Pedido de Patente Europeia publicado n9 86870014.7, depositado em 3 de Fevereiro de 1990, cuja descrição é aqui incorporada como referência.

Após a clonação de todo ou de uma. porção do ADN de Plasmodium. os seus fragmentos, codificando toda ou uma porção da proteína de superfície, podem ser preparados por técnicas conhecidas.

As técnicas para a síntese de ADIM são bem conhecidas e podem ser postas em prática usando sintetizadores de ADN comercialmente disponíveis. 7l 92fc SBC 14445-2 -13-

ser

As sequências de codificação dos polipéptidos podem inseridas em vectores de expressão de E» Co 11 « muitos dos; quais são conhecidos e estão facilmente disponíveis. Quando se realiza o presente invento em E. coli. a sequência de ADN que codifica o polipéptido do presente invento é ligada operativamente a um elemento regulador num vector de ADN para transformação em E« col i · Estão disponíveis numerosos vectores de expressão de bactérias gram-negativas compreendendo estes elementos reguladores. 0 elemento regulador compreende um promotor que efectua a ligação a ARN-polimerase e a transcrição. Preferem-se os promotores reguláveis, isto é induzíveis ou desreprimiveis „ Para a expressão de polipéptidos heterólogos em E. coli estão disponíveis uma variedade de promotores úteis. Estes incluem o promotor trp e o promotor PL lambda (p.e., Patente dos E.U.A. riS 4 578 355 e

Courtney et al_., Nature. 3135149 (1985). Tal como aqui depois se descreve com mais detalhe, verificou-se que as sequência? codificação codificando os polipéptidos do presente invento são particularmente bem expressas pelo vector de expressão de E. coli pMG-l. Podem-se também usar com vantagem derivados de pNS-l codificando outras proteínas transportadoras que não a NSlgj_, por exemplo a R32 e a galk.

Quando se realiza o presente invento em Streptomvces. uma sequência de codificação de ADN que codifica o polipéptido do presente invento é ligada, operativamente, a um elemento regulador num vector de ADN para a transformação de Streptomvces. 0 elemento regulador compreende um promotor que efectua a ligação a ARN polimerase e a transcrição. Preferem-se os promotores-reguláveis, isto é, induzíveis ou desreprimiveis ... Para expressão de polipéptidos heterólogos em Streptomyces estão disponíveis uma variedade de promotores úteis. Exemplos incluem o’ promotor, induzível por galactose, do operão de galactose de Streptomvces (Fornwald, et a_l_. , Proc Natl. Acad. Sei.. USA 84s2130 (1987)), o promotor constitutivo do gene da β-galactosidase de S. lividans (Eckhardt, et al. J. Bacteriol. 169:4249 (1987); Brawner, et. al. . Patente dos E.U.A. nQ 4 717 666) e o gene de inibidor da tripsina de lonqisporus (Pedido de Patente Europeia n° 87 307 260.7), 7i 92c SBC 1444 5" -14-

ou um Dramotor regulável temporalmente. tal como o eme foi nati-ciaao no rí„ echinosporsa (Baum, et al_., J, Bacteriol 170s71 (1988)>. As regiões para terminação da transcrição em Streoto-mvces são derivadas do terminal 3" de vários genes de Stripto-mveespor exemplo, o sinal de terminação na extremidade do operão de galactose de Streotomvces ou o que se encontra na extremidade do gene da neomicina-fosfotransferase de S. fradias lThompson e Gray, Proc. Natl. Acad. Sei USA 80:5190 (1983)). As sequências para a exportação de proteína em Streptomyces incluem aquelas isoladas a partir do gene da p-galactosidase de S. lividans. do gene LEP-10 de S. lividans (Pedido de Patente Europeia n9 87 307 260.7) e o gene de inibidor de tripsina de S« longisporus. 0 gene codificando o polipéptido do presente invento é incorporado numa molécula de ADN maior que compreende um sistema marcador de selecção genética. 0 sistema marcador de selecção pode ser qualquer um de um número de sistemas marcadores conhecidos, tais como um gene marcador, que confere â célula transformada um novo fenótipo seleccionável. Exemplos incluem genes de resistência a drogas de Streptomyces tais como o gene da metilase ribossómica de resistência a tiostreptona (Thompson, et al.. Gene 20;51 (1982)) o gene da neomicina-fosfotransferase (Thompson, et al_., supra) e o gene da metilase ribossomica de resistência á eritromicina (Thompson, et al,. , supra) . A molécula de ADN pode, também, conter uma sequência para replicaçSo autonoma em Striptomyces. tais como os derivados de pIJlOl (Keiser, et, al_., Mol. Gen. Genet. 185 s 223 (1982)) ou um vector derivado de SLP1 (Bibb, et al., Mol. Gen Genet. 184:230 (1981)). A molécula de ADN pode, também, conter um marcador que permite a amplificação do gene. Estes marcadores que servem para amplificar o número de cópias de gene em Streptomyces incluem o gene de resistência a espectinomicina (Hornemann, et al_., J. Bacteriol 169:2360 (1987)) e de auxotrofia de arginina (Altenbuchner, et al.. Mol. Gen. Genet. 195:154 (1984)).

Quando se realiza o presente invento em levedura, uma sequência de codificação de ADN que codifica os polipéptidos do presente invento é ligada, operativamente, a um elemento regulador num vector de ADN para transformação de levedura. Pode--se usar qualquer hospedeiro de levedura para o qual estão disponíveis sistemas de transformação, clonação e expressão. Exemplos particulares incluem leveduras dos géneros Hansenula. Pichia. Kluveromvces. Schizosaccharomvces. Candida e Saccharomy-ces. 0 hospedeiro de levedura preferido é o Saccharomvces cerivi- S 1. £^0 n Q elemento regulador compreende um promotor que efectua a ligação da ARN-polimerase e a transcrição. Preferem-se os promotores reguláveis, isto é, induzíveis ou desreprimiveis , Para expressão de polipéptidos heterólogos em levedura estão disponíveis uma variedade de promotores úteis. Estes incluem o promotor do gene da metalotionina induzível por cobre (CUPi) e o promotor constitutivo dos genes glicolíticos da qliceraldeído-3-fosfato--desidrogenase (TDH3) e da álcool-desidrogenase (ADH). As regiões para terminação da transcrição em levedura são derivadas do terminal 3' de quaisquer dos vários genes de levedura, pospor exemplo, o gene do iso-l-citocromo C (CYC1). 0 gene codificando o polipéptido do presente invento é incorporado numa molécula de ADN maior que compreende um sistema marcador de selecção, genético. 0 sistema marcador de selecção pode ser qualquer um de um número de sistemas marcadores conhecidos, tais como o gene marcador que confere, á célula transformada, um novo fenótipo seleccionável. Exemplos incluem genes de levedura para enzimas biossintéticas, tais como o gene da fosforribosilantranilato-isomerase (TRP1) ou o gene da orotidina-5'-fosfato-descarboxilase (URA3) ou genes heterólogos de resistência a drogas, tais como o gene de resistência a S418 ou o gene da benomilantranilato-isomerase (TRP1) ou o gene de resistência ao benomilo (BEN1). A molécula de ADN pode também conter uma sequência para replicação autónoma em levedura, tal como a região "2-micron-circle" ori de levedura, ou uma região cromossómica de replicação autónoma (ARS) tal como a ARS1, e um centrómero de levedura (CEN), tal como o CEN3, para\ permitir a replicação autónoma do plasmídeo. /1 92e> SBC 14445-2 —ió—

São ainda conhecidos e estão facilmente disponíveis outros sistemas de expressão. Por exemplo, para expressão de proteínas nereróloqas estão disponíveis uma variedade de células de insecto e seus sistemas de expressão, tais como um sistema de expressão de baculovírus para uso na expressão de proteínas heterólogas em células de Lepidoptera. Onde necessário para efectuar a expressão em sistemas de expressão eucarióticas, pode ser necessário deleccionar a região de "ancoragem" da terminal carboxilo da proteína de superfície. Como exemplo, pode ser necessária a delecção dos aminoácidos 392-412, a sequência englobando a região de ancoragem do terminal carboxilo de P. faleloarum.

Outro exemplo de um sistema de expressão refere-se a uma estirpe bacteriana de Salmonella transformada com um gene heterô-logo seleccionado, ligado operativamente a uma sequência de promotor de E. coli, sendo o transformante capaz de exprimir constitutivamente o produto do gene heterólogo.

Os polipéptidos assim expressos são isolados e purificados a partir da cultura de células produtoras usando técnicas convencionais de isolamento de proteínas, muitas das quais são bem conhecidas na arte. Um exemplo de um esquema de purificação útil compreende (1) a disrupçSo das células bacterianas, (2) a clarificação dos restos celulares, (3) a separação dos polipépti-dos do presente invento dos outros polipéptidos presentes no ex-tracto de células clarificado e (4) a purificação final para remover os contaminantes residuais, incluindo polipéptidos residuais, carba-hidratos, ácidos nucleicos, lipopolissacáridos e en-dotoxinas.

Na vacina da invenção pode-se usar directamente uma solução aquosa do polipéptido, preferivelmente, tamponada ao valor do pH fisiológico. Alternativamente, os polipéptidos podem ser misturados ou absorvidos com qualquer um de um número de adjuvantes conhecidos. Estes adjuvantes incluem, por exemplo, o hidróxido de alumínio, o dipéptido de muramilo e sabães tais como o Quil A. Como exemplo adicional, o polipéptido pode ser encapsulado em micropartículas tais como lipossomas. Ainda numa outra alternati- 71 9 2 ο SBC 1444 5 17-

va, os polipéptidos do presente invento podem ser conjugados (fundidos quimicamente), por técnicas convencionais,, com uma macromolécula imunopotenciadora, tal como Bordetella morta ou um toxóide do tétano, toxina da difteria ou toxina da cólera B.

As preparações de vacinas estão, geralmente descritas em New írends and Developments in Vaccines, Voller it.il.,,, Eds., Univer-sity Park Press, Baltimore, MD, E.U.A. (1978). A encapsulação em lipossomas é descrita, por exempla, na Patente dos E.U.A,, nS 4.235.877 de Fullerton. A conjugação de proteínas com macromolé-culas é descrita na Patente dos E.U.A. n2 4.372.945 de Likhite e na Patente dos E.U.A. nS 4.474.757 de Armar et. al« Q uso do Quil A é descrito, por exemplo, por Dalsgaard et. al_. , Ac ta Vet. Scand.. 18s349 (1977). A quantidade de polipéptido presente em cada dose de vacina é a quantidade que induz uma resposta imunoprotectora sem efeitos colaterais adversos significativos. Estas quantidades variarão de acordo com o polipéptido específico utilizado e dependerão de se usar ou não adjuvante na vacina. De um modo geral, será de esperar que cada dose compreenda 1 a 1000 pg de polipéptido, preferivelmente 10 a 200 pg. Uma quantidade óptima para uma vacina particular pode ser determinada por estudas convencionais envolvendo a observação de títulos de anticorpos, e outras respostas, em sujeitos. Após uma vacinação inicial, preferivelmente, os sujeitos receberão um reforça após cerca de quatro semanas, seguindo-se reforços adicionais, de seis em seis meses, enquanto subsistir o risco de infecção.

Geralmente, preferem-se as administrações intramuscular, subcutânea ou intravenosa, ainda que, em alguns casos possam ser úteis outras vias. Por exempla, quando se utiliza Salmonella recombinante, a via de administração preferida pode ser a via oral.

Os Exemplos seguintes são ilustrativos e não limitativos da invenção. A sequência de codificação de proteína de CS foi fornecida por James Weber, Walter Reed Army Institute for Research, na forma de um fragmento EcoR I de 2337 pares de bases 71 92<h SBC 14445-2 -18-

cie XmPFl (Dame et al_. , Science 225; 595 (1984) no sitio EcoR I de dUCB, um vector de clonacãa de E. coli convencional (disponível, por exemplo, nos Bethesda Research Laboratories, Inc„, Baithers-burg, MD). 0 derivado de pUCS resultante é designado por cloneíl do pUC8. EXEMPLO 1

Construção do pMSlg±RLfA9

Resumidamente a construção do pNSlg^RLfA'? foi realizada como se segue. Uma primeira alíquota de pCSP (que depois se descreve), um vector de expressão de E. coli contendo um fragmento de 1216 pares de bases codificando todos menos os primeiros 18 aminoácidos da proteína de circumesporozoíto (CS) de P« falciparum. foi digerida com endonuclease de restrição Fok I, preencheram-se as suas extremidades (fragmento (Klenow) e digeriu-se com endonuclease de restrição BamH I. 0 fragmento resultante de 318 pares de bases, codificando os aminoácidos 19 (Leu) a 123 (Pro) da proteína de CS, foi recuperado por electroeluiçao...

Uma segunda alíquota de pCSP foi digerida com endonuclease de restrição Tthlll I, preencheram-se as suas extremidades e digeriu-se com endonuclease de restrição Sal I. 0 fragmento resultante de 655 pares de bases, codificando os aminoácidos 297 (Gly) a 412 (Asn) da proteína de CS, foi recuperada por electro-eluição. (A esta sequência faltam 9 aminoácidos do terminal N, nQs 288 (Pro) a 296 (Sln), da região de flanqueamento contendo a Região II.)

Ligaram-se os fragmentos do gene da proteína de CS de 318 pares de bases e de 655 pares de bases no vector de expressão de I.» coli pUCIS (que depois se descreve) previamente digerido com as endonucleases de restrição BamH I e Sal I. 0 vector resultante foi designado por pUCRLfA?» 0 pUCRLfA9 foi digerido com a endonuclease de restrição BamH I, preencheram-se as suas extremidades, e digeriu-se com endonuclease de restrição Sal I. 0 fragmento de 1035 pares de bases resultante, codificando os aminoácidos 19 a 123 e 297 a 412 da / 1 ¥ZcSBC 1444 5~2 19—

Dror.ei.na de CS. foi recuperado por electroeiuição ΰ vector ae expressão pMS-1 (que depois s© descreve), contenao um fragmento de ADN codificando os aminoacidos do termi nai N» 1 (Met) a 81 (Met), da proteína 1 nlo estrutural do vírus oa gripe e uma sequência ligante de ADN sintético, foi digerido com as enoonucleases de restrição EcoR V e Xho I. 0 fragmento de 1035 pares de bases, previamente isolado a partir do pUCRLf&9, foi depois ligado no pMG-i. 0 vector de expressão resultante, pNSlgiRLf&9, codifica uma proteína com a sequênciaiMSÍQj[-Asp-His-lvlet“Leu-Thr-Asp-Pro-CS^9_j[23~C'®297-41 seguinte

Descreve-se seguidamente, em detalhe, a construção do pNSlgj[RLfA9. A, Construção do pCSP

Digeriu-se ADN de plasmídeo do clone 1 de pUC8 (40 pg) com as endonucleases de restrição Stu I e Rsa I (100 unidades de cada enzima) em 400 μΐ de tampão médio (compreendendo Tris 50 mM, MaCl 50 mlvl, ditiotreitol (DTT) 1 mM e MgCl2 10 mM, com um pH de 7,5) durante 1,5 horas a 37°C. 0 fragmento resultante de 1216 pares de bases, codificando todos menos os primeiros 18 aminoácidos (que se crê que codificam a sequência de sinal da proteína de CS) da proteína de circumesporozoíto (CS), foi isolado por electroforese num gel de 67. de pol iacri lamida (RASE) e recuperado por electraluição.

Digeriram-se 10 ug de vector de expressão pASl. (ATCC 39262, descrito mais detalhadamente na Patente dos E.U.A. nS 4.57S.355 de M. Rosenberg) com endonuclease de restrição BamH I (25 unidades) em 200 μΐ de tampão médio (descrito acima) durante 1,5 noras a 37°C,. 0 plasmídeo cortado foi depois tratada durante 15 minutos a 25°C com ADN-polimerase 1, Fragmento Grande (5 unidades de fragmento Klenow em Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, MgCl2 7 mM, MaCl 60 mM, 2-mercaptoetanol 6 mM e 0,25 mM de cada um dos quatro de-soxinucleotidotrifosfatos para preencher o sítio BamH I), 0 fragmenta do gene aa proteína de circumesporozoíta (1 μg) foi depois ligado a este vector (100 ng) em 30 μΐ de tampão de ligase (compreendendo Tris 50 mM, DTT i mM, MgCl-2 10 mM, rATF 100

71 92t>

SfciC 1444 5 ”2 pli, com um pH de 7,5), com uma unidade de ADN—ligase T4. durante lo noras a 4íjC„

Usou-se a mistura de ligação para transformar E» coli da estirpe MM294CI+. Dbtiveram-se colónias resistentes à ampicilina e pesquisaram-se quanta à inserção do fragmenta do gene de CS no pASl. Identificou-se um plasmiaeo com a construção carreta l pCsF) h B. Construção do pUCRLfW9

Digeriu-se ADM de plasmídeo, pCSF', purificada (100 p.g) com endonuclease de restrição Fok I (100 unidades) em 400 μΐ de tampão médio (descrito acima) durante 3 horas a 37°C. Subsequentemente, o plasmídeo foi tratado com ADN-polimerase 1, fragmento grande (descrito acima) para preencher o sitio Fok 1» 0 plasmídeo foi a seguir digerido com a endonuclease de restrição BamH 1 (100 unidades) em 400 μΐ de tampão médio (descrito acima) durante 3 horas a 37°C. 0 fragmento resultante de 318 pares de bases, codificando os aminoácidos 19-123 da proteína de CS, foi isolado por electroforese num gel de poliacrilamida a 6Y. (PAGE) e recuperado por electroeluição.

Digeriu-se uma alíquota adicional de pCSP (100 pg) com endonuclease de restrição Tthlll I (100 unidades) em 400 μΐ .de tampão médio (descrito acima) durante 3 horas a 65°C. Subsequentemente, tratou-se o plasmídeo com ADN-polimerase I, Fragmento Grande (descrito acima) para preencher o sítio Tthlll I. 0 plasmídeo foi a seguir digerido com endonuclease de restrição Sal I (100 unidades) em 400 μΐ de tampão média, durante 3 horas a 37°C, e o fragmento resultante de é>55 pares de bases, codificando os aminoácidos 297-412 da proteína de CS, foi isolado por electrofo-rese num gel de poliacrilamida a 6% e recuperado por electroelui-ção.

Digerirarn-se 10 pg de vector de expressão pUCiQ (Yanish- de -Perron et al_. , Gene, 33:103 ¢1985)), um vector de clonação/ E. coli, convencional, (disponível, por exempla, nos Bethesda Research Laboratories, Inc-, Gaithersburg, HD) com as endonucleases de restrição BamH I e Sal I (20 unidades de cada) em 200 pl de 71 926 SBC 14445- -21-

BamH I de extremidade preenchida/Fok I, de 318 pares de bases, (i pg) e o fragmente Tthlll I de extremidade preenchida/Sal I de 655 pares de bases (1 μα), foram depois ligados no pUC18 em 30 μΐ de tampão de ligase (descrita acima), com uma unidade de ADN--liga.se T4, durante 16 horas a 4°C. Identificou-se um plasmídeo com a cons trução correc ta (pUCRLfA9). C. Construção do pMG-1

Digeriram-se 10 pg do vector de expressão pMG2.7N- (M.Bross et al.. Mol. Cell. Biol., 5s1015 (1985)) com as endanucleases de restrição BamH I e Sac I (50 unidades de cada) em 200 μΐ de tampão médio (descrito acima) durante 3 h a 37°C.

Digeriram-se 10 pg do vector de expressão pAPRSOl (Young et. al.. Froc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80s6105 (1983) contenda a região de codificação da proteína 1 não estrutural (NS1) do vírus da gripe (A/PR/8/34) (Baez, et al_. , Nucleic Acids Research, 8:5845 (1980)) com as endonucleases de restrição Nco I e BamH I (20 unidades de cada) em 200 pl de tampão alto (Tris-HCl 50 mM, DTT 1 mM, MgCl? 10 mM, e NaCl 100 mM, pH 7,5) durante 2 horas a 370C.. 0 fragmento resultante de 230 pares de bases,codificando os primeiros 81 aminoâcidos do terminal Nda NS1, foi isolado por electroforese num gel de poliacrilamida a 6% (PAGE) e recuperado por electroeluição.

Ligaram-se 40 ng do fragmento de pMG27N-, cortado com BamH Ι/Sac I (descrito acima) com 80 ng do fragmenta Nca Ι/BamH I, codificando a NSlg^, de 230 pares de bases e 80 ng de um ligante sintético com a sequência seguinte: 5’CATGGATCATATGTTAACAGATATCAA66CCTSACTGACTGASAGCT 3* 3' CTAST AT ACAATTGTCTAT AGTTCCGGACTGACTGACTC 5* 0 plasmideo resultante, pMG-1, foi identificado com o sítio BamH I da sequência de codificação de NSlgj ligado ao sítio BamH I de pMB27N-p o sítio Nco I da sequência de codificação de NS181 ligado ao sítio Nco I do ligante sintético.? e o sítio Sac I do ligante sintético ao sítio Sac I de pMG27N-, Este vector introduz

/ 1 9.ic; SBC 14445 si.tios ae restrição únicos para facilitar a inserção de fragmentos cie ADN em qualquer das três cadeias de leitura, resulta na inserção de codSes de terminação TGA em todas as três cadeias de leitura a jusante do codão de iniciação ATG do sítio de ligação de ribossoma. dl, e auando expresso, resulta em proteínas cie fusão NSlgj a partir de todas as três cadeias de leitura. A digestão de pMS-l com a endonuclease de restrição Nde I e a ligação subsequente do vector, como anteriormente se descreve, resulta na expressão de uma proteína qu.e não de fusão (isto é, não fundida com a NSlg^). D. Construção de oNSlg±RLfA9

Digeriu-se o vector de expressão pUCRLf (100 pg) com endonuclease de restrição BamH I (100 unidades) em 400 μ1 de tampão alto (descrito acima) durante 3 horas a 37°C. Subsequentemente, o plasmídeo cortado foi tratado com ADN-polimerase I, Fragmento Grande, (descrito acima) para preencher o sítio BamH I, Q plasmídeo foi a seguir digerido com endonuclease de restrição Sal I (20 unidades) em 400 μΐ de tampão médio (descrito acima) durante 3 horas a 37°C. 0 fragmento resultante de 1035 pares de bases foi isolado por electroforese num gel de poliacrilamida a h"Â (PAGE) e recuperado por electroeluição.

Digeriu-se o vector de expressão pMG-l (10 pg) com as endonucleases de restrição EcoF: V e Xho I (25 unidades de cada) em 400 ul de tampão médio (descrito acima) durante 3 horas a 37°C„ 0 fragmento BamH I de extremidade preenchida/Sal 1, de 1035 pares de bases, do pUCRLf (400 pg) foi depois ligado a este vector (100 ng) em 30 μι 1 de tampão de ligase (descrito acima), com uma unidade de ADN-ligase T4, durante ló horas a 4oC.

Usou-se a mistura de ligação para transformar E. coli da estirpe MM294C1+. Obtiveram-se colónias resistentes à ampicilina e pesquisaram-se quanto à presença de clones contendo o gene inserido adequadamente orientado. Identificou-se um plasmídeo com a construção correcta (pNSlg^RLfA9') , usou-se este para transformar E. coli da estirpe AR5S (clts857) e testaram-se os transfor-mantes quanto à expressão do produto do gene da proteína tíe

7 1 9 2 ta SBC 14445" ao circuntesparozoito desprovida dos orimeiros IS smirtoácidos terminai N (CS^-jpg), do domínio de repetição central e dos 9 aminoácidos ao terminal N (0=240-296! ^a região de flanqueamento contendo a Região Π (RLfA9), fundida, através de 6 aminoácidos (Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp) obtidos a partir do ligante sintético ligado no vector de expressão pMG-i, com 81 aminoácidos do terminai N da proteína 1, não estrutural, da gripe, NSig^,, 0 NSlg^RLf 9 tem a sequência seguintes “Hír;P“ NSIqj-Asp-His-Met-Leu-Thr :‘ro“cs19--i23-CB297-412 A prolina separando a Asp (do terminal C do ligante sintético) do RLfA9 (CSj_9_i23~c^297-412) ^ um artefacto do sítio BamH I preenchido do fragmento BamH I/Fak I do pCSP»

As células foram cultivadas em caldo Luria-Bertani (LB) a 32°C até uma absorvãncia, a 650 nm (Ag50) de 0,6 e induzidas termicamente, a 42°C durante 3 horas, a iniciarem a transcrição do promotor F‘L do plasmídeo de expressão e tradução subsequente do derivado da proteína de CS de NSlgj! . As células foram recolhidas em alíquotas de 1 mi, sedimentadas, ressuspendidas em tampão de lise (Tris-HCl 10 mM, pH 7,8, 25% (vol/vol·) de glicerol, 2% de 2-mercaptoetanol, 2% de dodecilsuifato de sódio (SDS), 0,1% de azul de bromofenilo) e incubadas num bloco de aauecimento a 105°C durante 5 minutas.

As proteínas foram separadas por SDS-PAGE (13% de acrilami-da, razão acrilamida: bis-acrilamida 30:0,8). As proteínas foram transferidas para nitrocelulose e a proteína NSigj_RLf&9 produzida em §.* coli foi detectada por análise de mancha Western usando anticorpos policlonais reactivos com um domínio da proteína de CS designado por Região I (Dame et al_, Science 225:595 (1984)) bem como anticorpos policlonais reactivos com a proteína NSlg^. Verificou~se também que a proteína NSlg^RLf/i? produzida em E. coli era não reactiva com um conjunto de cinco anticorpos mo-noclonais dirigidos ao domínio de repetição de tetrapéptido da proteína de CS de P. falcxparum. *7 1 r* / X. "7 jL- SBC 14445 24

EXEMPLO 2

Construção do pNSlgRLfAuth

com as endonucleases de restrição BamH I e Fok I em tampão médio. 0 fragmento de ADN resultante, codificando a região de flanquea-mento contendo a Região I, menos os primeiros 18 aminoãcidos do terminal NI, foi recuperado por electroeluição

Digeriu-se uma segunda alíquota de pCSP com endonucleases de restrição Tthlll I e Sal I em tampão médio. 0 fragmenta de ADN resultante, codificando a região de flanqueamento contenda a Região II, menos os primeiros 9 aminoãcidos do terminal N, foi recuperado por electroeluição.

Digeriu-se o vector de expressão de E„ coli pLIClS (descrito acima) com as endonucleases de restrição BamH I e Sal I em tampão médio.

Para restaurar as 9 aminoáicidos do terminal N (CS2gg-296^ da região contenda a Região II, da região de flanqueamento do terminal C, do domínio de repetição central da proteína de CS, aminoãcidos estes que se perderam na digestão do pCSP com a endo-nuclease de restrição Tthlll I, preparou-se um fragmento de ADN sintético, contendo uma extremidade Fok I e uma extremidade Tthlll I, com a sequê‘ncia seguintes

AspProG1yAsnLysAsnAsnG1nG1yAsnG1yG1n Fokl 5* ATCCCGGGAATAAAAACAACCAAGGTAATGGACA 3* Tth 111 I 3* GCCCTTATTTTTGTTGGTTCCATTACCTGTT 51

Ligaram-se o fragmento BamH Ι/Fok I, o fragmento Tthlll I/Sal I e o fragmento sintético no pUCiS digerido com BamH I/Sal I. 0 plasmídeo resultante, pUCRLfAuth, foi digerido com endonuclease de restrição BamH I em tampão médio, preencheram-se as extremidades, e digeriu-se com endonuclease de restrição Sal I. 0 fragmento de ADN resultante, codificando a proteína de circumesporozoíto autêntica, sem os primeiros 18 aminoáciaos do 92c. õóC X4445—2

rerminal N e sem o domínio oe repetição centrai» foi recuceraao oor eisctroeiuiçáo. u fragmento isolado BamH I de extremidade preenchida/Sal I foi depois ligado ao vector de expressão de E. coii codificando a iNtoÍQj „ pMG-l (descrito acima), que tinha sido previamente digerido com as endonucleases de restrição EcoR V e Xho I.. 0 vector de expressão resultante, pNSlg^RLfAuth, exprime uma. proteína com a seauência: iMSlQi“Asp“His-Met“LeU“Thr-"Asp-Pro-CS19_jL23-Gly-CS2e8“4i2 (A glieina que separa as regimes de flanqueamento de CS, contendo a Região I e a Região II (CSj^-j^S e CS2SS~412’> é um artefacto da sequência ligante de ADN, Fok I/Tthlll I, sintética.)

As sequências de nucleótidos e de aminoácidos completas do NSigjRLfAuth estão disponíveis no Pedido de Patente Europeia, Duplicado, nQ 90304720.7, depositado em 1 de Maio de 1990, cuja descrição é aqui incorporada, na totalidade, como referência. EXEMPLO 3

Construção do oNSlg± RLfAuth+(NANP)g

Digeriu-se o pNSlg^RLfAuth (descrito acima) com a endonu-clease de restrição Bma I em tampão médio (descrito acima e contendo KC1) a 25°C durante 3 horas.

Ligou-se um ligante de ADN sintético com a sequência

AsnAlaAsnProAsnAlaAsnPro 5' AACGCAAACCCAAATGCAAACCCC 3' 3' TTGCCTTTGGGTTTACGTTTGGGG 5' no pNSlg^RLfAuth digerido com Sma I. 0 ligante de ADN sintético codifica (NANP)2 (símbolos de uma letra designando os aminoácidos, N = asparagina (Asn); A = alanina (Ala; e P = prolina (Pro)), o tetrapeptido compreendendo a, assim chamada, sequência de consenso do domínio de repetição imunodominante da proteína de CS. A digestão do pNSlg^RLfAuth com a endonuclease de restrição Sma I permite a ligação de qualquer número de tetrapeptidos de repetição, codificados por um ligante de ADN sintético, na região 71 92c SBC 14445

da oroteína de CS anterioraente ocupada pelo domínio de repetição ímunodominante. Deste modo. podem-se ligar no vector fragmentos adicionais de ADN codificando o tetrapéptido. □ plasmídeo resultante, pNSgiRL-fAuth+(NANP)2 codifica uma proteína com a sequência: NSlg^-Asp—His-Met~Leu-Thr-Asp-Pro-CS^9_jL23~ ( NANP) 2“G ly-CS288-4i2 EXEMPLO 4

Uonstruclío de pNSlg ^ (NANP) 4 RL-f Au th

Digeriu-se o vector de expressão pUCRLfAuth (descrito acima) com a endonuclease de restrição Bami-I I.

Ao pUCRLf digerido com BamH I ligou-se um fragmento de AE*N sintético codificando (NANP)*·).. 0 fragmenta de ADN sintético tinha a sequência seguinte:

ProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnPraAsnAlaAsnProAsnAlaAsnPro 5 * GATCCCAATGCAAACCCAAATGCAAACCCAAACGCTAACCCCAACGCTAACCCC 3' 3' GGTTACGTTTGGGTTTACGTTTGGGTTTGCGATTGGGGTTGCGATTGGGGCTAG 5 0 plasmídeo resultante foi designado por pUCiG(NANP)4RLfAuth

Digeriu-se o vector .de expressão pUC18(NANP)4RLfAuth com endonuclease de restrição BamH 1, preencheram-se as extremidades (fragmento Klenow), digeriu-se com endonuclease de restrição Sal I, e o fragmenta resultante de pares de bases de ADN foi recuperado por electroeluição.

Ligou-se o fragmento BamH I de extremidade preenchitía/Sal 1 no vector de expressão pMGl, codificando a NSlg^ (descrito acima) previamente digerido com as endonucleases de restrição EcoR V e Xho 1. 0 plasmídeo resultante foi designado por pNSlg^(NANP^RLf-Auth e codifica uma proteína na qual os tetrapéptidos repetidos, codificadas pelo fragmenta de ADN sintética, estão inseridos entre o aminoácido 81 (Met) da NSlgj. e a Asp do terminal N do liaante de ADN Nco I/Sac I, sintético: NSlg(NANP)4—Asp—His—Met—Leu—Thr—Asp—Pro—CS^9_ G1y—CSggg—412 71 9 2 is SBC 147145-2

EXEMPLO 5

Construção do pIMSlg j_ (Νν'ΡΡ) 4RLf ftuth A construção do pNSig·^ (iMVDP) 4RLf Auth foi a mesma que se descreveu anteriormente para o pNSlg^(NANP^RLfAuth com a excep-ç;So de o ligante de ADN sintético, codificando (NVDP)4 (a sequência variante de tetrapéptido do domínio de repetição central da proteína de CS) ter a sequência seguintes

AsnValAspProAsnValAspProAsnValAspProAsnVal 5' GATCCCAATGTABACCCCfiACGTTBATCCGAACSTABACCCGAATETA 3' 3' GGTTACATCTGG6GTT8CAACTAGGCTTGCATCTGGGCTTACAT 5' 0 olasmídeo resultante codifica uma proteína possuindo a sequências NSl81(NVDP)4-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19_123-Gly-CS28B-412 EXEMPLO 6

Isolamento do NSlgjRLffl? a partir de E. coli

Após a indução da síntese do NSlgiRLfZV9 num lisogénio lambda sensível á temperatura (cI857), as células bacterianas foram recolhidas por centrifugação e o sedimento resultante foi congelado a -70°C. Descongelaram-se, aproximadamente, 12 g das células concentradas e congeladas, por diluição em 120 ml de uma solução de tampão de lise (pH 8) contendo Tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) 50 mM, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 10 mM, 5% de glicerol e ditiotreitol (DTT) 10 mM. Adicionou-se "Lysocyme" tSigma Chemical Co., St. Louis, MO, E.U.A) até uma concentração final de 0,2 rng/ml de células diluídas e agitou-se a solução a 4o0 durante 30 minutos. Sonicaram-se as células usando um sonicador Branson até a solução parecer liquefeita. Adicionou-se uma solução de desoxicolato a 10%, até uma concentração final de 01% (v/v), e centrifugou-se a 15.600 x G, durante 30 minutas a 4°C, numa centrifugadora Sorvall RC 5B (Duoont).

Rejeitou—se o sobrenadante e o sedimento resultante contendo proteína foi suspenso em 100 ml de uma solução tampão (pH 10) contendo glicina 50 mM, EDTA 2 mM e 5% de glicerol. Sonicou-se a '71 sBC 1444 5" -28-

suspensão tal como anteriormente se descreve e adicianau-se Triton® X-100 (Sigma) até uma concentração final de 1% (v/v). Agitou-se a solução sonicada a 4°C durante 30 minutos e centrifu-gou-se como anteriormente se descreve.

Ao sobrenadante contendo proteína adicionou-se ureia até uma concentração final deuraia de 8 M e titulou-se a amostra até pH 5,5 com uma solução a 50¾ de ácido acético. A amostra foi croma— tografada numa coluna de 25 ml, QAE Sepharose Fast Flow (Pharmacia), previamente equilibrada numa solução tampão (pH 5,5) contendo acetato de sódio 20 mfl, 1% de Triton X-100 e ureia 8 M, com uma velocidade linear de 300 cm/h. A proteína estava ri a fracção não liqada e foi aplicada a uma coluna de 10 ml de SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia) previamente equilibrada numa solução tampão (pH 5,5) contenda acetato de sódio 20 mlv! e ureia 8M com uma velocidade linear de 120 cm. 0 efluente foi analisada continuamente pelo valor da absorvância a 280 nm. A proteína foi eluída a partir desta coluna com um tampão (pH 8) contendo Tris 100 mH e ureia 8 H« A SDS-PAGE do produto resultante revelou uma banda principal com um Hr aparente de 40000 kB e com uma pureza de, aproximada-mente, 80“/,. Do processo de purificação resultaram 12 mg de proteína contendo, aproximadamente, 14 unidades de endotoxina/mg de proteína. EXEMPLO 7

Isolamento de NSlp^RlfA? a partir de E. coli

Após a indução da sintese de NSlg^RLfA9 num lisogénio lambda sensível á temperatura, as células bacterianas foram recolhidas por centrifugação e o sedimento resultante foi congelado a -'70°C. Descongelaram-se, aproximadamente, 636 g das células concentradas e congeladas, por diluição em 2200 ml de uma solução tampão (pH 8,0) contendo Tris 60 mH, EDTA 12 mH, é>% de glicerol e ditiotrei-tol (DTT) 12 mH. Fizeram-se passar as células descongeladas através de um homogeneizador Manton Gaulin, duas vezes,a 4,1X104--4.8X104 kPa. Adicionou-se uma solução de desoxicolato a 10% até uma concentração final de 0,1% (v/v), agitou-se o lisatío a 4°C du-

71 92ο SBC 14445-2 -29- rante 30 minutos e centrifugou-se a 10000 x 5 numa centrifugadora Sorvai RC 5B (Dupont) a 4o0 durante 60 minutos.

Rejeitou-se o sedimento e, a cada. mi de sobrenadante contendo proteína,, adicionaram-se 25 i„il de uma mistura de pérolas de Biocryl 1050 ou 2100 (Supelco), ft solução foi agitada e centrifugada como anteriormente se descreveu.

Rejeitou-se o sedimenta e„ ao sobrenadante restante contendo proteína,, adicionou-se sulfato de amónio sólido, durante um período de 5 minutos, até 20% de saturação. A amostra foi agitada e centrifugada como se descreve acima. Suspendeu-se o sedimento em 400 ml de uma solução tampão (ph

5.5) contendo acetato de sódio 20 mM, 1% de Triton® X-100 e ureia 8 M, Esta suspensão foi centrifugada e o sobrenadante foi oialisado contra uma solução tampão (pH 8,0) contendo Tris 100 mlvl e ureia 8 M. 0 ".retido foi ajustado a pH 5,5 e submetido a cromatografia numa coluna de ΐυυ ml de SP Sepharose, Fast Fiow (Pharmacia) previamente equilibrada com uma solução tampão (pH 5.5) contendo acetato de sódio 20 mM, IV. de Triton X-100 e ureia 8 M com um caudal de 10 ml/minuto. A coluna foi lavada com tampão de equilíbrio, e depois com um tampão contenda Tris 0,1 M e ureia 8 M a pH 8,0.A coluna foi eluida com um gradiente linear de 500 ml de cloreto de sódio, de 0,0 a 0,5 M, preparada num tampão (pH 8) contendo Tris 0,1 M e ureia 8 M. A proteína foi eluida para uma concentração de cloreto de sódio 0,3 M. Reuniram-se as fracçfíes contendo o produto, concentraram-se numa célula agitada Amicon usando uma membrana YM 10 e dialisaram-se contra uma solução tampão (pH 8,0) contendo Tris 20 mM, a que se seguiu a diálise contra uma solução salina tamponada com fosfato (pH 7,0). A análise por SDS-PAGE do produto resultante revelou uma banda principal com um Mr aparente de 40000 kD e uma série de componentes pouco importantes. 0 processo de purificação rendeu 25 mg de proteína contendo 144 unidades de endotoxina/mg de proteína. 7 1 92c SBC 14445

0

EXEMPLO S

Isolamento de R16CSP a partir de E» col i 0 RlóCSP, expresso em E. col ι. foi preparado ligando u.m fragmento Xho II, isolado a partir do clone i de pUC 8 (descrito acima) no pCSF' (descrito acima) previamente digerido com a endonuclease de restrição BamH I. 0 R16CSP, usado como antigénio de captura de ELISA no Exemplo 9 seguinte, foi purificado como a seguir se descreve.

Aoós a indução da sintese de RlóCSP em E. coli„ as células bacterianas foram recolhidas por centrifugação e o sedimento resultante foi congelado a -20°C. Descongelaram-se, aproximada-mente, 373 g das células, concentradas e congeladas, em 1,43 1 de tampão (pH 3,0) contendo Tris 50 mM, EDTA 10 mH, 5% de glicerol e ditiotreitoi 10 mH. Adicionou-se uma solução de desoxicolato a 107. (p/v) até uma concentração final de 0,1% (v/v), após α que se fizeram passar as células, duas vezes, num homogeneizador Hanton-Gaulin a 4,8X10^ kPa. Ao homogeneizado adicionou-se uma solução a 107. de polietilenoimina (BRL) em tampão de Tris 0,5 H, (p/v), pH 8,0, até uma concentração final de 0,5%. A solução foi agitada a 4°C durante 1 hora e centrifugada a 13000 x g numa centrifugadora Sorvai1 RC 2B (Dupont) a 4°C durante 45 minutos .

Regeitou-se o sedimento e, ao sobrenadante adicionou-se sulfato de amónia sólido, durante 5 minutos, até uma saturação de 35%. A solução foi agitada e centrifugada como anteriormente se descreveu.

Suspendeu-se o sedimento num tampão (pH 8,0) contendo 300 mi de Tris 20 mM e EDTA 10 mM. Adicionou-se uma solução contendo 300 ml de ureia 8 M, 2,5 1 de acetato de sódio 10 mM, e ureia 4 M e o pH foi ajustado, imediatamente, a 4,0. A amostra foi centrifugada como anteriormente se descreveu.»

Aplicou-se o sobrenadante a uma coluna de 50 ml de SF--cepharose ,Fast Flow (Pharmacia) equilibrada num tampão (pH 4,0) contendo acetato de sódio 20 mM e ureia 4 Μ. A coluna foi lavada

71 92c òbC 1444 5 ""'2 com um tampão (pH 5,0 > contendo acetato cie sódio 20 mívi e eluiaa com 250 ml de um gradiente linear contendo de 0.0 a 1,0 H de cloreto de sódio em tampão de lavagem, 0 produto foi aluído para uma concentração de cloreto de sódio de, aproximadamente, 0,3 M,

Ajustou-se uma aliquota de 50 ml do produto de permuta, xónica a pH 2,3 com ácido trifluoroacético a 10% (TFA) (v/v) e cromatografou-se numa coluna de fase inversa C4 (Vydac, 1 κ 25 cm) equilibrada em TFA a 0,1%. Aplicou-se um gradiente de O a 60% de acetonitrilo (ACN) em TFA a 0,1%, durante 45 minutos, e o produto foi eluído para uma concentração de ACN de, aproximadamente, 60%. 0 produto da coluna de fase inversa foi neutralizada pela adição de 25 μΐ/ml de bicarbonato de amónio 1 M. Díalisaram-se, aproximadamente, 45 ml cio produto de fase inversa, contra um tampão (pH 5,0) contendo hidrocloreto de guanidina 2 M. e concentrou-se até 20 ml numa membrana YH 30 (Amicon). Cromatoqrafou-se uma aliquota de 10 ml numa coluna 2,5 X 50 cm de Superosev^12 (Pharmacia) equilibrada num tampão (pH 5,0) contendo hidrocloreto de guanidina 2,0 Μ. A proteína que foi eluida para um lir aparente de 358 kD foi dialisada contra um tampão (pH 4,5) contendo acetato de sódio 20 mH. A SDS-PAGE, manchada com Coomassie, do produto da Superose revelou duas bandas principais com um 14r aparente de 72 kD e de 70 kD. A análise de aminoácidos e a sequência a partir do terminal N do produto final estavam dentro dos valores esperadas a menos de 15%. EXEMPLO 9

Respostas de anticorpos de ratinhos ao NSlgiRLfΛ9

Para avaliar a sua imunogenecidade inoculou-se antigénio NSlg^RLfA9 purificado em três estirpes de ratinhos, C57BL/6 (H- -2b)s BALB/C (H-2^); e C3H/HEN (H-2^). Mostrou-se anteriormente que apenas os ratinhos do haplotipo H-2b produzem anticorpos contra o epítopo repetitiva da proteína de circumesporozoíto de P. falciparum. 0 antigénio foi injectado com adjuvante de Freund e analisaram-se amostras de soro dos animais imunizados num

71 9 21> SBC 14445-2 ensaio de imunoaosorvente ligado a enzima (ELISA)» Os animais de controlo foram imunizados com R32tet32, urn antigénio contendo tetrapéptidas de repetição da proteína de CS. A inoculação de todas as três estirpes de ratinho com IMSig^RLfA? resultou na produção de anticorpo reactivo com a região de não repetição (de flanaueamento) da proteína de circumesporozoíto. Apresentam-se depois os detalhes e os resultadas do ensaio de imunogenecidade.

Os ratinhos de cada uma das três estirpes foram separados em dois grupos compreendendo, cada grupo, quatro a cinco animais» 0 primeiro grupo de animais foi imunizado com NSlig^RLf Δ 9 e o segundo grupo foi imunizado com R32tet32 (J« Young et al« » Science. 228s958 (1985)). 0 R32tet32 contém dois fragmentos Xho II, cada fragmento codificando um péptido com a sequência [(Asn™ -Aia-Asn-Pro)jg (Asn-Val-Asp-Pro)^2- 0 tet32 é um péptido de 32 aminoácidos codificado pelo qene de resistência à tetraciclina, lido fora de cadeia. □ antigénio NSg^RLfA?, purificado de acordo com o Exemplo 6, foi misturado com adjuvante de Freund completo imediatamente antes da administração. Os ratinhos (ó a 8 semanas de idade) foram imunizados, cada um, subcutaneamente, com 50 μα de antigénio, administrados numa dose de 200 μΐ no quarto traseiro direito. Os ratinhos foram imunizados duas vezes, a primeira vez com uma única dose de 200 μΐ contendo 50 pg de antigénio em adjuvante de Freund completo. As injecçffes de reforço foram administradas quatro semanas mais tarde, de acordo com o mesmo protocolo que foi usado para as primeiras injecções com a excepção de o antigénio ter sido emulsionado em adjuvante de Freund incompleto. □s animais foram sangrados 7 dias apés a segunda imunização. Recolheu-se sangue inteiro de todos os animais do mesmo grupo, coagulou-se de um dia para o outro, a 4°C, e centrifugou-se para separar o soro que foi depois armazenado a -70°C. Usou-se um ELISA para testar os soros reunidos para determinar a presença de anticorpos contra o R32tet32, MSlg^RLfA9 ou R16CSP. (0 Rl&CSP foi preparada e purificada como anteriormente se descreveu.)

71 92& SBC 14445-2 A "sanduíche11 ELISA incorporou R32tet32. RlòwSP e NSlgiRLfAv como antiqénios de captura adsorvidos nas paredes das cavidades de uma placa de microtitulação. Q antigénio de captura foi adsorvido nas paredes das cavidades da placa de microtitulação adicionando , às cavidades, SOul de uma solução de F'BS contendo 0,75 |..ig de antigénio de captura e 0,2 pg de caseína fervida. Esta solução foi preparada adicionando 8 μΐ (3,76 μρ) de antigénio de captura a 2,5 ml de uma solução consistindo de 4 μΐ de uma solução de caseína fervida a 0,5% (que a seguir se descreve) a 5 ml de solução salina, tamponada com fosfato, de Dulbecco (PBS) (uma solução aquosa compreendendo 0,8% de NaCl; 0,217% N-a2ΗP04 - 7 H 2 0 ? 0,02% de KH2PQ4; e 0,02% de KC1, possuindo um pH de 7,4).

Apôs incubação de um dia para o outro à temperatura ambiente, os conteúdos das cavidades foram aspiradas e os sítios de ligação activos que permaneceram nas placas foram bloqueados com uma solução de caseína a 0,5% fervida (5 g/1 de caseína (J. Ί". Baker Chemical Co.); 0,1 g/1 de Thimersal (Sigma Chemical Co.); 0,02 g/1 de vermelho de fenol (Sigma Chemical Co.); 900 ml de PBS, pH 7,4; e 100 ml de NaQH 0,1 N) numa mistura (99:1) com 1% de Tween 20 (monolaurato de polioxietilenossorbitana, Sigma Chemical Co.) o

Diluiram-se as amostras de soros de ratinhos de 1:100; 1:1.000; 1:10.000; 1:100.000 e 1:1.000.000, numa solução de caseína fervida a 0,5% contendo 0,025% de Tween 20. 0 soro de teste foi depois adicionado à cavidade e após 2 horas de incubação, o soro foi removido e lavaram-se as cavidades, duas vezes, com uma solução de PBS contendo 0,05 de Tween 20. 4 cavidade adicionou-se, depois,um anticorpo IgG anti-ratinho conjugado com peroxidase diluido de 1:2.000 com o mesmo diluente usado para os soros. Após uma hora de incubação, aspiraram-se os conteúdos das cavidades, lavaram-se 3 vezes com solução de PBS contendo 0,05% de Tween 20 e adicionou-se uma solução límpida de substrato de peroxidase (Kirkegaard & Perry, preparada de acordo com as instruçães do fabricante). A reacção da peroxidase com

substrato resultou na formação de um produto verde-escuro. sendo a xntensiaaae da cór proporcional à quantidade de anticorpo presente na amostra de soro. Os resultados foram lidos após 15 minutas a 405 — 414 manometro, usando um leitor de placas ELISA, e registados em unidades de Densidade Óptica (D.O.) A inoculação de todas as três estirpes de ratinho C3H/HEN íH-2k), BALB/C (H~2d) e C3H/HEN <H-2b) com o antigénio NSiSiRLfA9 resultou na formação de anticorpos que reagiram fortemente com a região de não repetição da proteína de circumesporozoíto. A reactividade em relação ao antigénio de captura NSlg^RLfAP foi apenas ligeiramente superior à do R16CSP. ( o antigénio de captura R16CSP detectarã anticorpos apenas em relação à porção de não repetição da proteína de CS, enquanto que o antigénio de captura NSlg^RLf Δ 9 permite a detecção de ambos os anticorpos anti-NSlgi e anti-RLfA9). Como era de esperar os ratinhos C3H/HEN não desenvolveram uma resposta de anticorpos em relação ao R32tet32 enquanto que os ratinhos C57BI/6 desenvolveram. Embora significativamente mais fraca (diferença de 1 log) do que a resposta de anticorpos observada nos ratinhos C57BL/6, a resposta de anticorpos dos ratinhos BALB/C ao R32tet32 n^° era esperada e é contrária à resposta negativa referida na literatura, para ratinhos deste haplotipo, em relação ao (MANP)40(Del Giudice, et al., J. Immunol. 157;2952 (1986) referindo que, de catorze estirpes de ratinho com nove haplotipos H-2 diferentes, incluindo a BALB/C (H-2d), imunizadas com (NANP)4q sem uma proteína transportadora, apenas os ratinhos H~2b desenvolveram uma resposta de anticorpos contra o (NANP)4q. Os ratinhos H-2d (BALB/C) não responderam de modo nenhum. Os ratinhas BALB/C, imunizadas com (NANP^o acoplado a hemocianina de lapa Fissurala como proteína transportadora não desenvolveram anticorpos anti--CNANP)40, EXEMPLO 10

Inibição da Invasão de Esporozolto (ISI)

Neste estudo testou-se o soro de coelhos imunizados com NSlg^RLfA9 quanto à sua capacidade em inibir a entrada de esporo- 71 92to

soltos de P. falciparum nas células do fígado, o locai do desenvolvimento e da maturação do esporozoíto no estado exo---eritrocitxco.

Três estirpes de ratinho, BALB/C. C57BL/6 e A/J, imunizados com IMSIq·) RLf Δ9, administrado, quer em adjuvante de Freund completo quer em hidróxido de alumínio desenvolveram títulos de anticorpos elevados em relação à região de repetição da proteína de CS. Contudo, os soros destes ratinhos foram incapazes de bloquear a invasão pelos esporozoltos de células cultivadas de hepatoma humanas (HepG2-AÍ6) quando testados de acordo com o ensaia de Inibição da Invasão de Esporozoltos (ISI) descrito em Hollingdale, M.R. et al_„ J. Immunol „ 132(7):909 (1984).

Por contraste, coelhos brancos da Nova Zelândia, imunizados com 100 pg de N31giRLfA9, administrado em adjuvante de Freund completo na semana 0,3 e 7, desenvolveram títulos de anticorpos elevados (ainda que inferiores aos medidos em ratinhos) em relação à região de não repetição da proteína de CS. Contudo, demonstrou-se que o soro de coelhos imunizados com NSlg^RLfA 9 inibia significativamente (987. num animal, sendo a inibição média de cerca de 607.) a invasão das células de hepatoma pelas esporozoltos, quando testado de acordo com o ensaio ISI de Hol1inadale.

Os esporozoltos de uma estirpe de P. falciparum. resistente à cloroquina (estirpe 7G8), e de uma estirpe de P. falciparum, sensível á cloroquina (estirpe NF54), foram ambos, significativa-mente inibidos de entrarem nas células de hepatoma pelos soros dos coelhos imunizadas com NSlgj_RLfA9. A inibição da invasão de hepatoma pelos esporozoltos da estirpe 7G8 de P. falciparum foi superior (857. de média) ao valor de ISI determinado para a estirpe NF54 (607. de média).

Em estudos de ISI nos quais se substituíram as células de hepatoma humanas por hepatdcitos humanos normais, os esporozoltos de P. falciparum da estirpe NF54 foram inibidas (897. de inibição pelo soro de um coelho, sendo a inibição média de cerca de 457) de entrarem nos hepatócitos pelos soros de coelhos imunizadas com

-•Xtr 71 92έ· BBC j.<t445- NSiaiRi-ííp

Esties estudos suoerem a Dressnça ae epitopos neutranzantes ae esDorozoitos no antigénxo NSlgqftLfA9 EXEMPLO il

Identif xcacão da Ep£topos Neutral izantes de Esporo soí tos

Aesumxdamente, três estirpes de ratinho, BALB/C, C57BL/6 e A/J imunizadas com NSlgiRLf Δ. 9. administrado, quer em adjuvante completo ae Freund quer em hidróxido de alumínio, desenvolveram títulos de anticorpos elevados em relação á região de não repetição da proteína de CS. Contudo, as soros destes ratinhos era incapaz de bloquear a invasão pelos esporozoitos de células de nepatoma humanas (Hep62~Aiò) cultivadas, quando testados de acordo com o ensaio de Inibição da Invasão de Esporozoitos (ISI) descrito em Hol lingdale, M.R. et al_. J. Immunol, 132(7):909 (1984) . □s soros de ratinho e de coelho foram depois ainda analisados por análise de varrimento com péptidos de Geysen et al. , Ctrategies for Epitope Analysis Using Peptide Synthesis, 11J.. Immunol, Methods 102:259-274 (1987). Resumidamente, prepararam-se sinteticamente, um conjunto completa de hexapéptidos parcialmente sobrepostos, homólogos com uma sequência da sequência completa da proteína de CS de P. falciparum. estando cada hexapéptido acoplado a uma haste de polipropileno.. Os soros dos ratinhas e dos coelhos imunizados como se descreve no Exemplo 9, com RLf&9, foram diluídos 1:500 e incubados com as hastes, a 4o C, de um dia para o outro. As hastes foram lavadas, repetidamente, e os anticorpos ligados foram detectados por fosfatase alcalina conjugada com anticorpos anti-espécies. Após várias lavagens, as hastes foram expostas ao substrato durante uma hora. Leu-se a aosorvância a 414 nm e os resultados foram postas em gráfico na escala adequada com a sua sequência associada. A análise das respostas ae anticorpos permitiu a identificação dos cinco epítopos neutralxzantes de anticorpos que a seguir se descrevem.

Os péptidos seguintes da invenção foram identifiçados,

71 92&-c?BC 1.4445 neutral,..,. . A<‘«ntes usando os métodos descritos aairia, como epítopos os esporosoítos de P. falciparum. Péptido 1 G1 y-Asp-Asn-G 3. y-Arg-G 3. u~G 1 y-Lys Pédtido 2

GlU“Lvs-Leu~Arg~Lys-Pro-Lys PéptidO 3

Leu-L vs-G 3. n-Pro-B 1 y-Asp-G 1 y-Asn Péptido 4

Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arq-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala Péptido 5

Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Slu-Leu-Asp

Qualquer dos Péptidos 1-5 pode ser preparado por técnicas de síntese convencional usando as instruçffes apresentadas na presente descrição.

Qualquer dos Péptidos 1-5 pode ser acoplada a uma macromolé-cula imunopotenciadora, tal como, embora não limitada a, toxóide do tétano, toxina da difteria e toxina da cólera B. Preferivelmente, o acoplamento é mediado através de um resíduo de aminoãci™ ao que auxilia no acoplamento de péptidos a proteínas transporta— □oras, tais como, mas não limitados a, cisteína, tirosina e Usina. Preferivelmente, o acoplamento é também mediado por um agente de acoplamento, i.e., um agente que une o péptido com a proteína transportadora. Agentes de acoplamento úteis incluem, mas não estão limitados a, glutaraldeído. Muito preferivelmente, o acoplamento é mediado através de um "facilitador" e de um agente de acoplamento.

Por exemplo, o Péptido 4 foi sintetizado com uma. cisteína no seu terminal N e a sequfncia resultante foi acoplada, através de um resíduo cisteína no seu terminal N,ao toxóide do tétano usando glutaraldeído como agente de acoplamento (a proteína híbrida resultante é aqui depois designada por péptido 101). 0 péptido 4 foi também sintetizada com uma cisteína em ambos os seus 71 92ο SBC 1444 5 3b-

terminais N e C, e a sequência resultante foi acoplada, através ao resíduo cisteina no seu terminal N e do resídua cisteína no seu terminal C„ ao toxóide do tétano usando glutaraldeído como agente de acoplamento (a proteína híbrida resultante é aqui depois designada por péptido 106).

Por eiíemplo, suspendeu-se o Péptido 4 (contendo uma cisteina em ambos os seus terminais N e C) em PBS, pK 7,4, numa concentração de 1 mq/ml. Adicionou-se toxóide do tétano para se ter uma concentração final de 1 mg/ml . Adicionou-se glutaraldeído até u.ma· concentração final de 3¾ enquanto que se agitavam o péptido e a proteína, Deixou—se a reacção decorrer à temperatura ambiente ourante 1 hora. Dialisou-se a proteína híbrida resultante (péptido 106) contra PBS para remover o péptido livre e o glutaraldeído .

Os péptidos acoplados resultantes (i.e., péptidos 101 e 106) foram usados para imunizar coelhos usando adjuvante de Freund completo e incompleto, e os soros foram testadas pela teste ÍSI» Apresentam-se, a seguir, os resultados.

SORO % de ISI

Anti—péptido 101 71 50

Anti-péptido 106 99,2 89 0 valor de ISI foi a percentagem de redução na invasão de esporozoitos por soros de testes, em comparação com a percentagem de redução na presença de soros de pré-imunização ou não imunes. Como se pode observar pelos resultados anteriores, os péptidos 101 e 106 induziram claramente, ambos, actividade de ÍSI. 0 péptido 106 era especialmente activo.

De um modo similar, pode-se acoplar, qualquer um ou todos os Péptidos 1 a 5, conjuntamente, em qualquer sua combinação, por técnicas convencionais, e depois pode-se acoplar com uma macromo-lécula imunopotênciadora (tal coma o toxóide do tétano), preferivelmente, através de um resíduo aminoácido (tal como um resíauo

cistexna,i no terminal M e/ou no terminal C, resultantes, e usando um agente de acoplamento (tal como o glutaraIdeído)- 0 polipépti-do híbrido resultante é útil na preparação de urna vacina ca invenção» e também importante notar que qualquer proteína codificada pela sequência de aminoé.cidos de qualquer dos péptidos í a 5 pode ser produzida por tradução inversa do péptitío, por técnicas convencionais, de novo numa sequência de ADN, de modo a que a proteína possa ser expressa por técnicas recombinantes convencionais, como monómero ou corno polímero» é também importante notar aue se podem criar quaisquer péptidos híbridos desejados,, derivados dos péptidos 1 a 5, por tradução inversa do péptido, por. técnicas convencionais, de novo numa sequência de ADN, de modo a que uma vez traduzido de modo inverso, de novo numa sequência de ADN, esta sequência possa ser fundida geneticamente com sequências de codificação de imunopotenciação desejadas Cp.e», o to-xóide do tétano) e/ou com sequências melhoradoras da expressão, por técnicas convencionais e, depois, pode-se exprimir a sequência de codificação de aminoácidos, híbrida, resultante, por técnicas de ADN recombinante convencionais,,

Assim em certas concretizações, o polipéptido da invenção compreende um ou mais das determinantes imunogénicas acima identificadas» É contemplado que se possam preparar, por técnicas convencionais bem conhecidas na arte, equivalentes funcionais dos péptidos acima listados, isto é„ moléculas derivadas possuindo actividade neutralizante de esporozoítos. Por exemplo, estes equivalentes podem ter delecções de aminoácidos simples ou múltiplas, substituições e/ou adições em comparação com a sequência de aminoácidos identificada mantendo no entanto actividade neutrali~ zadora de esporozoíto»

Claims (1)

1. pode ser infecção lã. Processa de preparação de um polipéptido, que usado numa vacina para a protecção de humanos contrai a provocada por P1 asrnodiumcaracterisado por compreender; a) a inserção de uma sequência de codificação num vector tíe expressão, de modo a que a sequência de codificação fique ligada operativamente a um elemento regulador, contendo esta sequência de codificação uma ou mais determinantes imunogénicas da primeira região de flanqueamento de uma proteína de superfície de Plasmo-diurn„ uma ou mais determinantes imunogénicas da segunda região de f lanqueamen to de urna proteína de superfície de PI asrnod i um e menos do que a totalidade, ou nenhuma, das determinantes imunogénicas de repetição, do domínio de repetição compreendido entre as regiÔ'es de f lanqueamen to, sendo pelo menos uma das referidas determinantes imunogénicas da primeira região de flanqueamento codificada pela sequência de aminoácidos seguinte 01y-As p-Asn-61y~Arg-S1u-G1y~Lys ; Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pra-Lys? ou Leu-Lys-0.1 n-Pro-G 1 y-Asp-G 1 y-Asn ; ou por um seu equivalente funcional § b) a transformação de um microrganismo ou de uma célula com o vector ; c) a cultura do microrganismo ou da célula transfarmados de modo a produzir α polipéptido; e d) a recolha do polipéptido da cultura. 2§. Processo de preparação de um polipéptido, que pode ser usado numa vacina para a protecção de humanos contra a infecção provocada por PIasrnodium, caracterizado por compreender; a) a inserção de uma sequência de codificação num vector de expressão de modo a que a sequência de codificação fique ligada operativamente a um elemento regulador, contendo esta sequência de codificação uma ou mais determinantes imunogénicas da primeira região de flanqueamento de uma proteína de superfície de P1asma- 71 92ά SBC 14445-2 -41- tiiufTi. uma ou mais determinantes irnunoqénicas da segunda região de flanqueamento de uma proteína de superfície de Plasmodium e menos dcs que a totalidade;, ou nenhuma das determinantes imunogénicas de repetição do domínio de repetição compreendido entre as regiões de flanqueamento, sendo pelo menos uma dais referidas determinantes imunogénicas da segunda região de flanqueamento codificada pela sequência de aminoácidos seguinte Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Aiag ou Asn-Lys-Pro—Lys-Asp—Giu—Leu—Asps ou por um seu equivalente funcional 5 b) a transformação de um microrganismo ou de uma célula com o vector5 c) a cultura do microrganismo ou da célula transformados de modo a produzir o polipéptidoj e d) a recolha do polipéptido da cultura. 3ã Processo de preparação de um polipéptido, que pode ser usado numa vacina* para a protecção de humanos contra a infecção provocada por Plasmodium. caracterizado por campreenders J

   a) a inserção de uma sequência de codificação num vector de expressão de modo a que a sequência de codificação fique ligada operativamente a um elemento regulador., contendo esta sequência de codificação uma ou mais determinantes imunogénicas da primeira região de flanqueamento de uma proteína de superfície de P1asmo-dium. uma ou mais determinantes imunogénicas da segunda região de flanqueamento de uma proteína de superfície de Plasmodium e menos do que a totalidade, ou nenhuma, das determinantes imunogénicas de repetição do domínio de repetição compreendido entre as regiões de flanqueamento, sendo pelo menos uma das referidas determinantes imunogénicas da primeira região de flanqueamento codificada pela sequência de aminoácidos seguinte G1y-Asp-Asn-G1y-Arg-G1u-G1y-Lys; G1 u—Lys-Leu-Arg—l_ys-Pro-l_ys; ou Leu-Lys-G1n-Pro-G1y-Asp-G1y-Asn, e sendo pelo menos uma das referidas determinantes imunogénicas da segunda região de flanqueamento codificada pela sequência de aminoácidos seguinte Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Alaj ou Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-B1u-Leu-Asp5 ou por um seu equivalente funcional; b) a transformação de um microrganismo ou de uma célula com o vector; c) a cultura do microrganismo ou da célula transformados de modo a produzir o polipéptido; e d) a recolha do polipéptido da cultura» 4â. Processo de preparação de um polipéptido, que pode ser usado numa vacina para a protecção de humanos contra a infecção provocada por Plasmodium, caracterizado por compreender: a) a inserção de uma sequência de codificação num vector de expressão de modo a que a sequência de codificação fique ligada operativamente a um elemento regulador, contendo esta sequência de codificação menos do que a totalidade, ou nenhuma das determinantes imunogénicas de repetição do domínio de repetição de uma proteína de superfície de Plasmodium e pelo menos um péptido codificado pela sequência de aminoácidos: B1 y-Asp-· Asn-61 y-A rg -61 u-61 y-Ly s; Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys; Leu-Lys-G1η-Pro-G1y-Asp-61y-Asn; Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala; ou Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp; ou por um seu equivalente funcional; b) a transformação de um microrganismo ou de uma célula com o vector; c) a cultura do micoroganismo ou da célula transformadas de modo a produzir a polipéptido; e

   71 926 SBC 14445-2 -43- d) a recolha do polipéptido da cultura. 4, 5ã. Processo de caracterizado por acordo com qualquer das reivindicações o polipéptido ser um polipéptido híbrido 1 a 6â„ Processo de acorda com a reivindicação 5, caracterizado por compreender a fusão química do polipéptido com uma proteína transportadora. 7â. Processo de acordo com a reivindicação 6. caracterizado por a proteína transportadora ser o toK0i.de do tétano., a toxina da difteria ou a toxina B da cólera., Sã. Processo de acordo com a reivindicação 7P caracterizado por a fusão química ser mediada através do glutaraldeído como agente de acoplamento. 9â. Processo de acordo com a reivindicação 7,, caracterizado por a fusão com o toxóide do tétano ser mediada através de um resíduo cisteína no terminal N do péptido. iOê. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a fusão com o toxóide do tétano ser mediada através de um resíduo cisteína no terminal N e de um resíduo cisteína no terminal C do péptido. ilã. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o polipéptido ser o resultada da acoplamento da sequência de aminoácidos Cys-Fro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn--Ala-Cys ao toxoide tetânico através de glutaraldeído, como agente de acoplamento. 12ã. Processo de preparação de uma vacina para protecção de seres humanos contra a infecção provocada por esporozoítos de Plasmodium. caracterizado por compreender a associação de uma quantidade imunoprotectora do polipéptido preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1-11 com um transportador farmaceuti-camente aceitável. -44- * 71 926 SBC 14445-2 Lisboa, £P7 990 Por SMITHKLINE BEECHAM CORPORATION, THE UNITED STATES QF AMERICA representado pelo SECRETARY DF THE ARMY e BIOMEDI-CAL RESEARCH INSTITUTE J - O AGENTE OFICIAL -