HUT56882A - Process for producing malaria vaccine - Google Patents
Process for producing malaria vaccine Download PDFInfo
- Publication number
- HUT56882A HUT56882A HU908128A HU812890A HUT56882A HU T56882 A HUT56882 A HU T56882A HU 908128 A HU908128 A HU 908128A HU 812890 A HU812890 A HU 812890A HU T56882 A HUT56882 A HU T56882A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- asn
- asp
- lys
- pro
- gly
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 229940124735 malaria vaccine Drugs 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 108
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 95
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 77
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 60
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 claims abstract description 38
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 claims abstract 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 22
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 claims description 22
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 20
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 19
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 19
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 10
- 206010029897 Obsessive thoughts Diseases 0.000 claims description 9
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 claims description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 6
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 6
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 claims 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 claims 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 abstract description 9
- 244000045947 parasite Species 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 107
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 77
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 77
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 43
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 35
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 31
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 28
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 22
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 101001111984 Homo sapiens N-acylneuraminate-9-phosphatase Proteins 0.000 description 14
- 102100023906 N-acylneuraminate-9-phosphatase Human genes 0.000 description 14
- KQPKMEYBZUPZGK-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-azido-2-nitroanilino)methyl]-5-(hydroxymethyl)-2-methylpyridin-3-ol Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CNC=2C(=CC(=CC=2)N=[N+]=[N-])[N+]([O-])=O)=C1O KQPKMEYBZUPZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 description 10
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 10
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 101100447653 Caenorhabditis elegans phg-1 gene Proteins 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 6
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 5
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 5
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]propanoyl]amino]prop-2-enoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 4
- KWZYQHQNOWRQRG-UHFFFAOYSA-N 3beta-hydroxytremetone Natural products C1=C(C(C)=O)C=C2C(O)C(C(=C)C)OC2=C1 KWZYQHQNOWRQRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710117490 Circumsporozoite protein Proteins 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 4
- KWZYQHQNOWRQRG-OLZOCXBDSA-N Toxol Chemical compound C1=C(C(C)=O)C=C2[C@@H](O)[C@H](C(=C)C)OC2=C1 KWZYQHQNOWRQRG-OLZOCXBDSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 206010035500 Plasmodium falciparum infection Diseases 0.000 description 3
- 241000223821 Plasmodium malariae Species 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 3
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 108010026901 peptide 106 Proteins 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 229940118768 plasmodium malariae Drugs 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 3
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 2
- 101100245267 Caenorhabditis elegans pas-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 239000006391 Luria-Bertani Medium Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 241001505293 Plasmodium ovale Species 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 2
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 2
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N (2s)-2-azanyl-5-[bis(azanyl)methylideneamino]pentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N.OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N OIXLLKLZKCBCPS-RZVRUWJTSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- YVOOPGWEIRIUOX-UHFFFAOYSA-N 2-azanyl-3-sulfanyl-propanoic acid Chemical compound SCC(N)C(O)=O.SCC(N)C(O)=O YVOOPGWEIRIUOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MZCACYLMMMXSKC-UHFFFAOYSA-N 32 amino acid peptide Chemical compound C=1C=CC=CC=1CC(C(=O)NC(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCCNC(N)=N)NC(=O)C(CCCNC(N)=N)NC(=O)C(CCSC)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(O)=O)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1N(CCC1)C(=O)C1NCCC1)C(C)O)CC1=CC=CC=C1 MZCACYLMMMXSKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 101150030352 Arsi gene Proteins 0.000 description 1
- KHCNTVRVAYCPQE-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KHCNTVRVAYCPQE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N Asp-His Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HICVMZCGVFKTPM-BQBZGAKWSA-N Asp-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O HICVMZCGVFKTPM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- 108010037936 CCCGGG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101150052200 CS gene Proteins 0.000 description 1
- 108010089921 CTCGAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100037633 Centrin-3 Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N Gly-Asn-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000880522 Homo sapiens Centrin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000820585 Homo sapiens SUN domain-containing ossification factor Proteins 0.000 description 1
- 101000673946 Homo sapiens Synaptotagmin-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000187708 Micromonospora Species 0.000 description 1
- 101100408778 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pns-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010086950 Phosphoribosylanthranilate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101100012910 Plasmodium falciparum (isolate FC27 / Papua New Guinea) FIRA gene Proteins 0.000 description 1
- 101000726057 Plasmodium falciparum Circumsporozoite protein Proteins 0.000 description 1
- 241000223980 Plasmodium falciparum NF54 Species 0.000 description 1
- 241000223801 Plasmodium knowlesi Species 0.000 description 1
- 241000223810 Plasmodium vivax Species 0.000 description 1
- 101900284417 Plasmodium vivax Circumsporozoite protein Proteins 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005482 Protozoan circumsporozoite Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102100021651 SUN domain-containing ossification factor Human genes 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 108010019965 Spectrin Proteins 0.000 description 1
- 102000005890 Spectrin Human genes 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002467 anti-pepsin effect Effects 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 230000002567 autonomic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 238000012248 genetic selection Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002766 immunoenhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical group 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 101150089906 resA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A találmány tárgyai a Plasmodium nembe tartozó paraziták okozta fertőzés elleni vakcinák, részletesebben, a malária paraziták okozta fertőzés gátlására alkalmas gyógyászati készítményekként használható polipeptldek, azzal jellemezve, hogy a polípeptídek a Plasmodium felületi fehérjének egy központi régiót határoló szakaszaiból származó immunogén determinánsokat, valamint az ismétlődő szakaszból származó, de nem az összes immunogén determinánst tartalmazzák; valamint eljárás embereknek malária fertőzés elleni kezelésére.
A találmány tárgya általában polipeptid, azzal Jellemezve, hogy a Plasmodium felületi fehérje központi ismétlődő egységének első határoló régiójából származó egy vagy több immunogén determinánst, az ismétlődő régió második határoló régiójából származó egy vagy több immunogén determinánst és a központi ismétlődő dómén immunogén determinánsai közül az összesnél kevesebbet, vagy egyet sem tartalmaz.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti polipeptid a Plasmodium felületi fehérje ismétlődő szakasza ismétlődő immunogén determinánsai közül legalább egyet, de az összesnél kevesebbet tartalmaz, valamint a Plasmodium felületi fehérje ismétlődő egységét határoló régiókból egy vagy több Immunogén determinánst tartalmaz.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti polipeptid a központi ismétlődő domént határoló régiókból lényegében az összes
-3immunogén determinánst tartalmazza, és nem tartalmaz immunogén determinánst a Központi ismétlődő doménből. Egy másik megvalósítási mőd szerint a határoló régiókból lényegében az összes immunogén determinánst tartalmazó fehérje emellett tartalmaz a központi ismétlődő doménből legalább egy, de az összesnél kevesebb immunogén determinánst.
A Jelen találmány szerinti polipeptidekben Jól használható immunogén determinánsok Közé tartoznak előnyösen a a Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax,
Plasmodium malariae és a
Plasmodium ovale felületi fehérjéiben található immunogén determinánsok.
A találmánynak egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a polipeptidet genetikailag f üzionáltatjuk egy hordozó fehérjével, előnyösen egy olyan hordozó fehérjével, amely vagy javítja a polipeptid expresszlóját, vagy megnöveli a polipeptid immunogén hatását, vagy mindkettőt egyszerre.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti polipeptidek egy immunogén hordozó fehérjét tartalmaznak, például az influenza vírus 1-es nem-szerkezeti fehérjéjének 61 N-terminálls aminosavát (NSlgi) egy szintetikus linkeren Keresztül a Plasmodium cirkumsporozoita (CS) fehérjéje első határoló szakaszához f üzionáltatva, amely a CS fehérje második határoló régiójához van füzionáltatva.
Az ilyen polipeptidek tartalmazhatnak továbbá egynél több, de az összesnél kevesebb Immunogén determinánst a CS • · • « · « · • · · ···»·· ·· • · · · · · ·· ·· · · ·«·
-4fehérje központi ismétlődő doménjéből, például az ismétlődő egységből származó immunogén determinánst, amely az (Asn-X-Y-Pro) aminosav-szekvenciával rendelkező polipeptid, amelyben X Jelentése Alá vagy Val, Y Jelentése Asn vagy Asp. A központi ismétlődő doménből származó immunogén determinánsokat elhelyezhetjük például a a hordozó fehérje és az első határoló régió közé, vagy az első határoló régió és a második határoló régió közé.
A Jelen találmány vonatkozik még a polipeptldeket kódoló vektorokra, a polipeptldeket tartalmazó vakcinákra, a polipeptidek tisztítási módszereire, valamint az emberek malária fertőzés elleni megvédésére a peptidek felhasználásával.
A Jelen találmány részleteit, valamint előnyeit az alábbi részletes leírásban közöljük.
A találmány leírásában az alábbi aminosav-rövidítéseket használjuk:
| Alá | Alanin |
| Arg | Arginin |
| Asn | Aszparagin |
| Asp | Aszparaglnsav |
| Cys | Cisztein |
| Glu | Glutaminsav |
| Gin | Glutamln |
| Gly | Gllcln |
| Hls | Hisztidin |
| Ile | Izoleucin |
| Leu | Leucln |
| Lys | Llzln |
| Met | Metlonln |
| Phe | Fenllalanin |
| Pro | Prolin |
| Ser | Szerln |
| Thr | Treonln |
| Trp | Trlptofán |
| Tyr | Tlrozin |
| Val | Valin |
A Plasmodlum nevű protozoa malária parazita számos fejlődési-állapot specifikus fehérjét tartalmaz a külső sejtfelszinén. Ezek a felületi fehérjék a felismerések szerint három közös régiót tartalmaznak, nevezetesen a központi ismétlődő epitop régiót vagy domént és a páros határoló régiókat. A párhoz tartozó első határoló régió a központi ismétlődő dómén karboxi terminálisához van kapcsolva, a második határoló régió a párból a központi ismétlődő dómén amino terminálisához van kapcsolva.
A Jelen találmány szerinti pollpeptidek a Plasmodlum felületi fehérjéje egy részéből származnak, amelyek az első és második határoló régió közötti központi ismétlődő egységből az összesnél kevesebb immunogén determinánst tartalmazzák, vagy egyet sem, és elegendő mennyiségben expresszálódnak ahhoz, hogy terápiás anyagként legyenek felhasználhatók a malária paraziták okozta fertőzés ·« ·· · · ···* * · · · ♦ ··· ···»·· ·· • · · · · » ·· · · ·· ··· meggátlásában.
Hásszóval a találmány szerinti polipeptldek kevesebb Ismétlődő egységet tartalmaznak az első és a második határoló réglő között, mint ahány a vad típusú ismétlődő régiókban előfordul. Tehát, az embert a Plasmodium falclparum fertőzés ellen védő pollpeptld esetében a pollpeptid tartalmazhatja a teljes első határoló régiót, azaz a Plasmodium falclparum clrkumsporozolta fehérje (PfCSP) N-termlnális határoló régióját, a teljes második határoló régiót, azaz a PfCSP-ből származó C-termlnálls határoló régiót, és az első és második határoló régió között kevesebb mint 41 egymásután levő ismétlődő szakaszt, azaz kevesebb mint 41 Asn-X-Y-Pro képletű tetrapeptldet, amelyben X Jelentése Alá vagy Val, Y Jelentése Asp vagy Asn.
Egy vad típusú Plasmodium felületi fehérjében az ismétlődő régió az immunodomlnáns. A jelen találmány szerinti polipeptidekben az egymásutáni Ismétlődő szakaszok számát és pozícióját úgy választjuk meg, hogy ne fedje el az első és második határoló régióra adott Immunválaszt. A találmány szerinti polipeptidekben az ismétlődések száma nem több mint fele a vad típusú fehérjében Jelenlevő ismétlődések számának. Hég előnyösebben a találmány szerinti polipeptidekben az ismétlődések száma nem több mint egynegyede a vad típusú fehérjében Jelenlevő ismétlődések számának.
Négy Plasmodium fajról ismert, hogy embereket fertőz, a leggyakoribb a Plasmodium falclparum, ezt követi a Plasmodium vlvax, és kisebb mértékben a Plasmodium malariae • « • · · ·
-7A Plasmodium falciparum sporozoita állapotú • · · · • · · • · · ··· • · · ·· ·· és a Plasmodium ovale.
cirkumsporozoita (CS) fehérjéjének központi ismétlődő doménje 41 egymás után
Ismétlődő tetrapeptidet tartalmaz, amelyek közül harmincegy aminosav szekvanclája a
Kővetkező:
(Aszparagin (Asn-Alanin (Ala)-Asn-Prolin (Pro), négynek szekvenciája (Asn-Valln (Val)-Aszpartát (Asp)-Pro).
központi ismétlődő régió
Két oldalán található az I-es éS
II-es határoló régió, a CS fehérje két régiója, amelyeknek aminosav-szekvenciája csaknem azonos az összes
Plasmodium fajban, például a Plasmodium knowlesi (egy majom malária)
CS fehérjéjében [Dame et al.,
Sclence,
225, 593 (1964)].
A Plasmodium falciparum vérben élő állapotának különböző felszíni fehérjéi is rendelkeznek ismétlődő epitopokkal, például az
S antigén (Pro-Ala-Lys-Ala-Ser-Gln-Gly-Gly-Leu-Glu-Asp); RESA antigén (Glu-Glu-Asn-Val-Glu-His-Asp-Ala);
FIRA antigén (Val-Thr-Thr-Gln-Glu-Pro); és a
PF-11 antigén (Glu-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Val-Val-Pro).
A Plasmodium vivax cirkumsporozoita fehérjéje a (Gly-Asp-Arg-Ala-Asp-Gly-Gln-Pro-Ala) ismétlődő epitopot, a Plasmodium malariae az (Asn-Asp-Ala-Gly) és az (Asn-Ala-Ala-Gly) ismétlődő epitopot tartalmazza.
A találmány szerinti polipeptidek a Plasmodium felületi fehérje Központi ismétlődő egységének első határoló régiójából származó egy vagy több immunogén determinánst, az ismétlődő régió második határoló régiójából származó egy vagy több immunogén determinánst és a központi ismétlődő
-6·· · · «· ··«· ♦ · · « · ·«« ♦··*·· ·· • · · · ♦ r • · ·· ·· · · ♦ dómén Immunogén determinánsai Közül az összesnél Kevesebbet, vagy egyet sem tartalmaznaK.
Az immunogén determlnánsoK olyan aminosav szeKvencláK, amelyeK a B seJteK vagy a T seJteK válaszát váltJáK Ki. Az Immunogén determlnánsoK általában legalább 6 amlnosavat tartalmaznaK. Az Immunogén determlnánsoK pontos loKallzálását egy fehérjén belül standard technlKáKKal végezhetJüK, beleértve e monoKlonálls térKépezést és/vagy az amlnosavaK deléclóját, majd aKtivltásuK vizsgálatát. A Jelen találmány szerinti pollpeptldeK előnyösen legalább 15 amlnosavat tartalmaznaK mind az első mind a másodlK határoló régiéből; még előnyösebben legalább 3O-at; és legelőnyösebben a teljes első és másodlK határoló régiót, a szignál szeKvencia nélKül.
Egy megvalósítási mód szerint a találmány szerinti pollpeptldeK legalább egy, de az összesnél Kevesebb Immunogén determinánst tartalmaznaK a Plasmodlum felületi fehérje Központi ismétlődő doménjéből és egy vagy több Immunogén determinánst az ismétlődő régiót határoló felületi fehérjéből.
Egy másiK megvalósítási mód szerint a Jelen találmány szerinti pollpeptldeK lényegében az összes immunogén determinánst tartalmazzáK a Központi ismétlődő régiót határoló doménből és menteseK a Központi Ismétlődő doménban levő immunogén determinánsoKtól, vagy egy másiK módszer szerint a Központi ismétlődő doménnaK legalább egy, de az összesnél Kevesebb immunogén determinánsát tartalmazzáK. A lényegében az összes Kifejezés alatt azt értjük, hogy
4 • 4 · ·
-9• ·· lényegében a teljes első és második határoló régiót használjuk a szignál-szekvencia nélkül, előnyösen nem több mint körülbelül 20 aminosav hiányzik mindegyik régióból, és még előnyösebben a teljes első és második határoló régiót használjuk a szignál-szekvenciák nélkül.
A találmány egy másik megvalósítási módja olyan pollpeptldre irányul, determinánst tartalmaz amely egy vagy több immunogén a Plasmodium felületi fehérje első határoló régiójából, egy vagy több immunogén determinánst tartalmaz a Plasmodium felületi fehérje második immunogén determinánsából, és az összesnél kevesebbet, vagy egyet sem a kettő között levő ismétlődő dómén ismétlődő immunogén determinánsából; az első határoló régióból legalább az egyik említett immunogén determinánst a következő aminosav-szekvencia kódolja:
Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;
Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys; vagy
Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;
vagy ezeknek egy funkcionális megfelelője.
A találmány egy további megvalósítási módja olyan pollpeptldre irányul, amely egy vagy több Immunogén determinánst tartalmaz a Plasmodium felületi fehérje első határoló régiójából, egy vagy több Immunogén determinánst tartalmaz a Plasmodium felületi fehérje második immunogén determinánsából, és az összesnél kevesebbet, vagy egyet sem a kettő között levő ismétlődő dómén ismétlődő immunogén
-10·♦ ·· ·· · ··· • · · · ♦ ··· ·«·«*·« ·· • · · · · · ·· ·· ·· ··· determinánsából; a második határoló régióból legalább az egyik említett immunogén determinánst a következő amlnosav-szekvencla kódol:
Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala vagy
Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;
vagy ezeknek funkcionális megfelelője.
A találmány egy újabb megvalósítási módja olyan pollpeptldre irányul, determinánst tartalmaz amely egy vagy több Immunogén a Plasmodlum felületi fehérje első határoló régiójából, egy vagy több Immunogén determinánst tartalmaz a Plasmodlum felületi fehérje második immunogén determinánsából, és az összesnél kevesebbet, vagy egyet sem a kettő között levő ismétlődő dómén ismétlődő immunogén determinánsából; az első határoló régióból legalább az egyik említett immunogén determinánst a következő aminosav-szekvencia kódolja:
Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;
Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys; vagy Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;
és a második határoló régióból legalább az egyik immunogén determinánst a következő aminosav-szekvencia kódolja: Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala; vagy Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;
vagy ezeknek funkcionális megfelelője.
A találmány egy újabb megvalósítási módja olyan pollpeptldre irányul, amely az összesnél kevesebbet, vagy ··*·
-11··· ······ ·· • · · · · · »· ·· · · ··· egyet sem tartalmaz a Plasmodium felületi fehérje ismétlődő doménjéből, és legalább az egyik peptidet a következő aminosav-szekvencia kódolja:
Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;
Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys; vagy Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;
Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala; vagy Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;
vagy ezeknek funkcionális megfelelője.
A találmány egy további megvalósítási módja olyan, embereket a Plasmodium sporozoiták megvédő vakcinára vonatkozik, amely fertőzésével szemben a találmány szerinti polipeptidből immunológiai védelmet nyújtó mennyiséget tartalmaz, valamint egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot.
A Jelen találmány egy,
Plasmodium sporozoiták okozta fertőzés elleni védelemre szoruló ember immunizálására alkalmas módszerre is vonatkozik, azzal Jellemezve, hogy az embernek az említett vakcinából hatékony, nem toxikus mennyiséget adunk be.
A jelen találmány szerinti polipeptid előnyösen egy hibrid polipeptid, azaz egy olyan polipeptid, amely a Plasmodium felületi fehérjéje és egy hordozó fehérje közötti genetikai vagy kémiai fúzió eredményeként jött létre.
Még előnyösebbek azok a hibrid polipeptldek, amelyek egy hordozó fehérjét tartalmaznak genetikailag fúzionáltatva a Plasmodium falclparum cirkumsporozoita (CS) fehérje egy részéhez, amely az összesnél kevesebbet tartalmaz az a központi ismétlődő domént alkotó ismétlődő
-12»· ·4 ·4 *··4 • · ♦ · · • •«9 ··· ··«·· • « · · ·Λ ·· ·· »·»11 tetapeptldekből, vagy egyet sem.
Különösen előnyösek azok a Hibrid polipeptidek, amelyekben a kémiailag fúzlonáltatott hordozó fehérje egy immunológiai fokozó makromolekula, azaz nem korlátozó Jelentőséggel például az elpusztított Bordetella, tetanusz toxold, diftéria toxln és kolera B toxin.
Szintén különösen előnyösek azok a hibrid polipeptidek, amelyekben a genetikailag fúzlonáltatott hordozó fehérje nemcsak fokozza a hordozott fehérje immunogén tulajdonságait, hanem fokozni is képes a transzformánsban a polipeptid expresszióját. Az ilyen hordozó fehérje egyéb előnyös tulajdonságai közé tartozik a polipeptid egyszerűbb tisztítása, vagy jobb formulálhatósága. Az ilyen hordozó fehérjék közé tartozik például a Hepatitisz B vírus felületi antigénje (HBsAg).az NSlgj (az A/PR/8/34 influenza vírus nem struktúrális 1-es fehérjéje 61 N-terminálls aminosava) [Baez et al., Nucleic Acids Research, 8, 5845 (1980)]; az R32 ([(Asn-Ala-Asn-Pro)15-(Asn-Val-Asp-ProJJg) [Young et al., Science, 228, 958 (1985)]; és a galK.
Az ismertetett leírás alapján a találmány szerinti polipeptldeket a szakterületen Jártas szakember elő tudja állítani szokványos génsebészeti technikák, vagy szokványos peptid-szlntézis technikák alkalmazásával.
A jelen találmány szerinti polipeptidek konkrét megvalósítására az alábbi példákat adjuk meg:
NSlQi-RLf9, egy fúziós polipeptid, amely az influenzavírus nem-struktúrálls 1-es fehérjéjéből 81
-13*· ·<· 9« ·*«« * · · · ♦ ··· ··· ··» ·· • * · V · * *· ·« ·· «·«
N-terminális aminosavat tartalmaz (NSlei); a Plasmodlum falclparum CS fehérje I-es régiót tartalmazó határoló régiója a szignál szekvencia nélkül (16 N-termlnálls aminosav), valamint a ΙΙ-es régiót tartalmazó határoló régió, az első kilenc N-termlnális aminosava nélkül (RLf9). Az NSlgi-nek az RLf9-hez való fúzióját egy Asp-Hls-Met-Leu-Thr-Asp- szekvenciát kódoló szintetikus DNS linkeren keresztül lehet elérni;
NSlgj-RLf Auth, egy fúziós poiipeptld, amely az NSlgj-et tartalmazza; a Plasmodlum falclparum CS fehérje I-es régiót tartalmazó határoló régiója a szignál szekvencia nélkül, valamint a teljes ΙΙ-es régiót tartalmazó határoló régió (RLfAuth);
NSigi-íAsn-X-Y-ProJn-RLf Auth, egy NSlgj-et tartalmazó fúziós poiipeptld; RLfAuth és (Asn-X-Y-Pro), ahol X jelentése Alá vagy Val, Y jelentése Asn vagy Asp, n jelentése egész szám, értéke egy és maximum 100 között változik, előnyösen 50-nél kevesebb; továbbá az (Asn-X-Y-Pro) csoport az NSlei és az RLfAuth között helyezkedik el;
NSlgjRLf Auth+(Asn-X-Y-Pro)n, egy NSlei-et tartalmazó fúziós poiipeptld; RLfAuth; és (Asn-X-Y-Pro), amelyben X és Y jelentése megegyezik a fentiekben meghatározottal, és n értéke kisebb 41-nél; továbbá az (Asn-X-Y-Pro) csoport a Plasmodlum falclparum CS fehérje I-es régióját tartalmazó határoló régió és a ΙΙ-es régiót tartalmazó határoló régió Között helyezkedik el, azaz azon a helyen, amelyet korábban a központi Ismétlődő dómén foglalt el; és
-14A kővetkező, a találmány szerinti peptidek, amelyeket a Plasmodlum falclparum sporozoita semlegesítő epitopjalként azonosítottak:
Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys; Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys; vagy Leu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn; Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala; Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;
Azonban ezek a polipeptidek csak illusztratív jellegűek. Az alábbiakban Ismertetett leírás alapján a szakterületen Jártas szakember tudja, Hogyan kell a találmány oltalmi körébe tartozó más polipeptideket készíteni és levizsgálni, például olyan polipeptideket, amelyek felületi fehérjékből származó szekvenciákat tartalmaznak, beleértve a Plasmodium f alciparumtól eltérő malária parazitákból származó fehérjéket, a felületi fehérjéknél több vagy kevesebb amlnosavat tartalmazó polipeptideket, kémiailag módosított polipeptideket, valamint más aminosav vagy fehérjeszekvenciához fúzionált polipeptideket. Az ilyen polipeptideket könnyen elő lehet állítani a génsebészet önmagában ismét módszereivel és/vagy fehérjeszintézissel, és állati modellekben levlzsgálhatők lényegében az alábbiak szerint. A találmány szerinti fehérje tartalmazhat a felületi fehérje határoló régiókból származó aminosav szekvenciákat, például a teljes, a központi ismétlődő dómén nélküli clrkumsporozoita fehérjét, a Hepatitisz B vírus felületi antigénjéhez (HBsAg) fúzionáltatva egy olyan fúziós fehérjében, amely képes hibrid HBsAg részecskéket képezni,
-15amint az megtalálható az 1968. augusztus 17-én publikált EP 278 940 sorszámú Európai szabadalmi bejelentésben.
A felületi fehérje határoló régióit, a tetrapeptldeket, szintetikus DNS linker szekvenciákat és hordozó fehérjéket kódoló szekvenciát egy szakember könnyen elő tudja állítani ismert módszerekkel. Ezek közé tartozik a kémiai szintézis, előnyösen a messenger RNS reverz transzkripciója vagy a teljes gének klónozása a genomiálís DNS-ből, valamint speiflkus szekvenciák előállítása szokványos PCR (pollmeráz láncreakció) technikával. A Plasmodium falclparum messenger RNS reverz transzkripcióját Ellls és munkatársai írják le [Natúré, 302, 536 (1963)]. A teljes gének klónozását
Plasmodium falclparum genomiálís DNS-ből Dame és munkatársai írják le [Dame et al., Science, 225, 593 (1984)]. Az ismétlődést tartalmazó polipeptldek klónozását és expresszálását az 1990. február 3-án benyújtott 66870014.7 számú Európai szabadalmi bejelentésben írták le, amely bejelentésben levő leírásra a továbbiakban hivatkozunk.
A teljes Plasmodium DNS-t, vagy annak egy részét megklónozva, annak a felületi fehérjét, vagy annak fragmentjelt kódoló fragmenteket ismert módszerekkel elő lehet állítani.
A DNS-szlntézis módszerei Jól ismertek, és a kereskedelmi forgalomban kapható DNS szintetizátorokkal hajthatók végre.
A polipeptldeket kódoló szekvenciákat Escherichia coli expressziós vektorokba lehet beépíteni, ezek közül számos ismert és Könnyen hozzáférhető. A Jelen találmány szerinti
-16eljárást Escherichia coli-ban végrehajtva, a Jelen találmány szerinti pollpeptidet kódoló DNS szekvenciát operatíve egy szabályozó szakaszhoz kapcsoljuk a DNS vektoron belül, majd Escherichia coli-t transzformálunk vele. Számos, ilyen szabályozó szakaszt tartalmazó Gram negatív baktériumban működő expressziós vektor Hozzáférhető. A szabályozó rész tartalmaz egy promotert, amely befolyásolja az RNS polimeráz kötődését és a transzkripciót. A szabályozható, azaz indukálható vagy derepresszálható promoterek az előnyösek. Számos hasznos, Escherichia coli-ban heterológ polipeptidek expresszálására alkalmas promoter áll rendelkezésre. Ezek közé tartozik a a trp promoter és a lambda PL promoter [pl. a 4 578 355 sorszámú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás, valamint Courtney et al., Natúré, 313, 149 (1985)]. Amint azt az alábbiakban részletesebben leírjuk, azt találtuk, hogy a Jelen találmány szerinti polipeptideket kódoló szekvenciák különösen Jól expresszálódnak a pHG-1 Escherichia coll expressziós vektort alkalmazva. A pMG-1 származékok, amelyek az NSlgj-től eltérő hordozó fehérjéket kódolnak, például az R32-t és a galK-t, szintén előnyösen alkalmazhatók.
A jelen találmány szerinti eljárást Streptomyces törzsekben végrehajtva, a Jelen találmány szerinti pollpeptidet kódoló DNS kódoló szekvenciát operatíven hozzákapcsoljuk egy Streptomyces transzformálására alkalmas DNS vektorban levő szabályozó elemhez. A szabályozó elem tartalmaz egy promotert, amely az RNS polimeráz kötődését és a transzkripciót eredményezi. A szabályozható, azaz • · • · · · • · · · · ··· ··· ··* ·· • · · · · ·
-17indukálható vagy derepresszálható promotert részesítjük előnyben. Számos Hasznos, heterológ pelipeptidek Streptomyces-ben való expresszálására alkalmas promoter férhető hozzá. A példák közé tartozik a Streptomyoes galaktőz operon galaktőz-indukált promotere [Fornwald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2130 (1987)], a
Streptomyoes llvidans β-galaktozidáz promotere [Eckhardt et al., J.Bacterlol., 169, 4249 (1987); Brawner et al., 4 717
666 számú Amerikai Egyesült Allamok-bell szabadalmi leírás], és a Streptomyoes longisporus trlpszln inhibitor génje (67 307260.7 számú Európai szabadalmi bejelentés) konstitutív promotere, vagy egy időben szabályozott promoter, mint például a Micromonospora echlnospursa [Baum et al., J.Bacterlol, 170, 71 (1966)]. A transzkripció leállítását végző terminációs régiók a Streptomycesekben bizonyos Streptomyoes gének 3' végéről származnak, például a Streptomyoes galaktóz operon végén levő terminációs szignál, vagy az, amely a Streptomyoes fradiae neomlcln-foszfotranszferáz végén található [Thompson and Gray, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 5190 (1983)]. A Streptomycesekben a fehérjéknek a külvilágba való szállítását végző szekvenciák közé tartozik például a Streptomyoes llvidans β-galaktozldáz génből, a Streptomyoes llvidans LEP-10 génből (67 307 260.7 számú Európai szabadalmi bejelentés), valamint a Streptomyoes longisporus tripszin inhibitor génből Izolált szekvencia.
A jelen találmány szerinti polipeptidet kódoló gént egy nagyobb DNS molekulába építjük be, amely egy genetikai ···
-15szelekciós rendszert bármelyik az Ismert a szelekciós bélyeg tartalmaz. A szelekciós rendszer lehet rendszerek közül, úgymint az, amelyikben szelektálható új fenotípust biztosit transzformált sejteknek. Steptomyces antibiotikum tlostrepton rezisztenciát
A példák közé tartoznak a rezisztencia gének, például a biztosító riboszómális metiláz [Thompson et al., Gene, 20, 51 (1982)], a neomicin-foszfotranszferáz [Thompson et al., Gene, 20, 51 (1952)] , valamint az eritromicln rezisztenciát biztosító riboszómális metiláz [Thompson et al., Gene, 20, 51 (1952)]. A DNS molekula tartalmazhat egy olyan szekvenciát, amely autonóm replikációt biztosit Streptomycesekben, ilyenek például a pIJlOl származékok [Keiser et al., Mól. Gén. Génét., 155,
223 (1952)], vagy egy SLP1 eredetű vektor [Bibb et al„ Mól.
Gén. Génét., 154, 230 (1951)]. A DNS-molekula tartalmazhat egy olyan szakaszt, a sokszorozását. Ilyen, sokszorozására használt spektinomlcln rezisztencia 159, 2360 (1957)], vala [Altenbuchner et al., Mól.
A Jelen találmány ely lehetővé teszi a gének a Streptomycesekben gének genetikai bélyeg például a [Hornemann et al., J. Bacteriol., int az arginin auxotrófia
Gén. Génét., 195, 134 (1954)].
szerinti eljárást élesztőben végrehajtva, a jelen találmány szerinti pollpeptidet kódoló
DNS szekvenciát operatíven hozzákapcsoljuk egy élesztő transzformálására alkalmas DNS vektorban levő szabályozó elemhez. Bármely olyan élesztő gazdaszervezet használható, amelyekhez a transzformációs, klónozási és expressziős rendszerek ki vannak dolgozva. Az egyes példák Közé ·· * · ·· ···· • · · · · • · · ······ ·· • · · · · · ·· ·· ·· ♦ · ♦
-19tartoznak a Hansenula, Pichia, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Candlda és Saccharomyces nembe tartozó élesztők. Az előnyben részesített gazdaszervezet a Saccharomyces cerevísiae.
A szabályozó elem egy olyan promotert tartalmaz, amely befolyásolja az RNS pollmeráz kötődését és a transzkripciót. A szabályozható, azaz indukálható vagy derepresszálható promotert részesítjük előnyben. Számos hasznos, heterológ pellpeptldek élesztőben való expresszálására alkalmas promoter férhető hozzá. A példák közé tartozik a rézzel indukálható metallotionein (CUP1) gén promotere, valamint a gliceraldehld-3-foszfát-dehidrogenáz (TDH3) és az alkohol-dehidrogenáz (ADH) glikolltikus gének konstitutív promoterei. A transzkripció leállítására használt terminátor szekvenciák bizonyos élesztő gének, például az izo-1-cltokróm C (CYC1) gén 3' végéről származnak.
A Jelen találmány szerinti polípeptidet kódoló gént egy nagyobb DNS molekulába építjük be, amely egy genetikai szelekciós rendszert tartalmaz. A szelekciós rendszer lehet bármelyik az ismert rendszerek közül, úgymint az, amelyikben a szelekciós bélyeg szelektálható új fenotípust biztosít a transzformált sejteknek. A példák közé tartoznak az élesztő bioszintetikus enzimjeinek génjei, úgymint a foszforibozil-antranilát-izomeráz (TRP1), vagy az orotidln-5'-foszfát-dekarboxlláz (URA3), illetve a heterológ antibiotikum rezisztencia gének, úgymint a G418 rezisztencia vagy benomll-antranilát-izomeráz (TRP1), vagy benomll rezisztencia (BÉNI) gén. A DNS molekula tartalmazhat egy • · ·· *· · · · · • · · · · ·· · ···»·· · · • · · · · « ·· ·· ·· ··*
-20szekvenciát, amely biztosítja autonóm replikációJát élesztőben, úgymint az élesztő 2 mikronos plazmidjánk őri régiója, vagy egy kromoszómális autonóm repllkáclót biztosító szekvencia (ARS), úgymint az arsi, és egy élesztő centroméra (CEN), úgymint a CEN3, amely lehetővé teszi a plazmid autonóm repllkáclóját.
Egyéb expressziós rendszerek is ismertek és könnyen hozzáférhetők. Például különböző rovarsejtek és hozzájuk való, heterológ fehérjék expresszálására alkalmas expressziós rendszerek könnyen hozzáférhetők, például a baculovlrus expressziós rendszer, amely Lepldoptera rendszerekben teszi lehetővé heterológ fehérjék expresszálását. Ahol szükséges eukarlóta expressziós rendszerekben az expresszió befolyásolása, ott szükséges lehet a felületi fehérje C-termínális horgonyzó régiójának eltávolítása. A példa kedvéért, a 392-412-es aminosavak, amelyek a Plasmodlum falclparum C-termlnális horgonyzó régióját alkotják, eltávolítása válhat szükségessé.
Egy másik példa az expressziós rendszerekre egy Salmonella baktérium törzs, amelyet egy Escherichla coll promoter szekvenciához operatívan hozzákapcsolt, szelektált heterológ génnel transzformáltunk, a transzformánsok képesek konstltutíven expresszálni a heterológ gén termékét.
Az Így expresszált polipeptideket standard fehérje izolálás! technikákkal, amelyek közül számos Jól Ismert a szakirodalomból, izoláljuk és tisztítjuk a termelő sejttenyészetből. Egy példaként megadható hasznos tisztítási séma a következő lépéseket tartalmazza:
·· ·· 44 > · · · • · · ··· ··· • · 4 · · • · 4 · 4 · ···· • ♦
1) a baktérium sejtek feltárása
2) a sejttörmelék eltávolítása
3) a Jelen találmány szerinti polipeptidek elválasztása más, a megtisztított sejtextraktumban levő fehérjéktől, és
4) végső tisztítás a szennyeződések eltávolítására, beleértve a maradék polipeptideket, szénhidrátokat, nukleinsavakat, lipopollszacharidokat és endotoxinokat.
A találmány szerinti vakcinában a polipeptldnek egy vizes oldatát használjuk közvetlenül, előnyösen fiziológiás pH-ra pufferelve. Egy másik módszer szerint a polipeptideket bármelyik ismert adjuvánssal elegyíthetjük, vagy adszorbeálhatjuk rá. Az ilyen adjuvánsok közé tartozik
Például az aluminium-hldroxid, muramll-dlpeptid, és a szaponinok, úgymint a Qull A. Egy másik példa szerint a polipeptldet mikrorészecskékbe, például liposzómákba kapszulázhatjuk. Egy még újabb alternatíva szerint, a Jelen találmány szerinti polipeptideket konjugálhatjuk (kémiailag f úzionáltat Juk) ismert módszerekkel egy immun-fokozó makromolekulához, úgymint elpusztított Bordetella vagy tetanusz toxoidhoz, diftéria vagy kolera B toxinhoz.
A vakcina készítményeket általában a következő kiadványban ismertetik: New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al., Szerk., University Park Press, Baltimore, MD, USA (197ő). A llposzómába kapszulázást például a Fullerton féle 4 235 677 számú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalomban ismertetik. A fehérjéknek ··
-22makromolekulákhoz való Konjugálását a Likhite féle 4 372 945 számú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalomban, valamint az Armor et al. féle 4 474 757 számú Amerikai Egyesült
Allamok-beli szabadalomban ismertetik. A Qull A Használatát például Dalsgaard és munkatársai írják le [Acta Vet. Scand., 18, 349 (1977)].
Az egyes vakcina dózisokban található polipeptld mennyisége az a mennyiség, amely egy immunológiai védő választ Indukál, anélkül hogy Káros mellékhatásai lennének. Ez a mennyiség változik, attól függően hogy melyik polipeptidet alkalmazzuk, és hogy a vakcina tartalmaz-e adjuvánst vagy sem. Általában az egyes dózisok várhatóan 1-1000 pg polipetidet tartalmaznak, előnyösen 10-200 pg-ot. Egy adott vakcina optimális mennyiségét standard vizsgálatokkal lehet beállítani, beleértve az antitest titerek és az alanyok más reakcióinak megfigyelését. Egy Indító vakcinálást követően az alanyok előnyösen körülbelül négy héten belül kapnak egy fokozó adagot, ezt további fokozók követik hat hónaponként, mindaddig, amíg a fertőzés veszélye fennáll.
Általában az intramuszkuláris, szubkután vagy intravénás beadási módok az előnyösek, bár néhány esetben más utak lehetnek hasznosak. Például, ahol rekombináns Salmonella törzseket használnak, ott a beadás előnyös útja a szájon át való beadás lehet.
A következő példák csak illusztratívek, és nem korlátozzák a találmány oltalmi körét. A CS fehérjét kódoló szekvenciát James Weber bocsátotta rendelkezésünkre (Walter »·» •♦ ·· ♦···
4« · ··· ··· ·· • 4 4 · · « ♦ ♦ ·4 »4 ·4-<4
-23Reed Army Instltute fór Research) egy 2337 bázispár méretű, XmPFl-ből származó EcoRI fragment formájában [Dame et al., Sclence, 225, 593 (19Ö4)] a pUC6 standard Escherlchla coll vektor EcoRI helyére klónozva (hozzáférhető például a Bethesda Research Laboratories-tól, Galthersburg, HD, USA). A keletkező pUC6 származék neve 1-es pUC ö klón.
1. Példa
A pNSÍ81RLf9 előállítása
Röviden összefoglalva, a pNSlgiRLf9 plazmidot a következőképpen állítjuk elő. A pCSP (leírása az alábbiakban következik), ami egy E.coli expressziós vektor, egy olyan 1216 bázispár méretű fragmentet tartalmaz, amely az első lő aminosav kivételével a teljes Plasmodium falclparum clrkumsporozolta (CS) fehérjét kódolja, első alikvotját Fok I restrikciós enzimmel emésztjük, a végeket feltöltjük (Klenow f ragmenttel), majd BamHI restrikciós enzimmel emésztjük. A kapott 31ö bázispár méretű fragmentet, amely a CS fehérjének a 19. (Leu) és 123. (Pro) aminosav közötti részét kódolja, elektroelücióval kinyerjük.
A pCSP egy második alikvot részét Tthlll I enzimmel emésztjük, a végeit feltöltjük, majd Sáli restrikciós enzimmel emésztjük. A kapott 655 bázispár méretű fragmentet, amely a CS fehérje 297. (Gly) és 412. (Asn) aminosav közötti részét kódolja, elektroelücióval Izoláljuk. (Ebből a szekvenciából hiányzik a ΙΙ-es régiót tartalmazó határoló régió 9 N-termlnálls amlnosava, a 2ββ. (Pro) és a 296. (Gin)
-24közöttl rész.)
A CS fehérjét kódoló 318 bázispár méretű és 655 bázispár méretű gén-f ragmenteket E. coll expresszlós vektorba ligáljuk (leírása az alábbiakban), amelyet előzőleg BamHI és Sáli restrikciós enzimekkel emésztettünk. A kapott vektor
Jele pUCRLf9.
A pUCRLf9 vektort BamHI restrikciós endonukleázzal emésztjük, végeit feltöltjük, majd Sáli restrikciós endonukleázzal emésztjük. A kapott 1035 bázispár méretű fragmentet, amely a CS fehérje 19.
és 123. amlnosava közötti részt, valamint a 297.
és 412.
amlnosava közötti részt kódolja, elektroelűcióval nyerjük ki.
A pHG-1 expresszlós vektort (leírása az alábbiakban), amely az influenza vírus nem strukturális
1-es fehérjéjének
N-terminálls aminosavait az 1. (Hét) és a
81.
(Hét) kódoló
DNS fragmentet tartalmazza, valamint egy szintetikus DNS linkért, ÉcoRV és Xhol endonukleázokkal emésztjük. Az előzőleg a pUCRLf9 vektorból izolált 1035 bázispár méretű fragmentet ezután a pHG-1 vektorba ligáljuk. A kapott expressziős vektor, a pNSiQiRLf9 a következő aminosav sorrendű fehérjét kódolja:
NSlei-Asp-Hls-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CSi9_i23-CS297-412
A pNS1qiRLí9 vektor előállítását az alábbiakban részletezzük.
A. A pCSP plazmid előálítása • · • · • ·
pg tisztított pUC 1-es klón plazmid DNS-t emésztünk Stul és Rsal restrikciós endonukleázokkal (mindegyik enzimből 100 egységet használunk) 400 pl közepes pufferben (összetétele 50 mmól TRIS, 50 mmól NaCl, 1 mmól dltiotreitol (DTT) és 10 mmól Hgcig, PH=7.5) 1.5 órán át 37‘C-on A kapott 1216 bázispár méretű fragmentet, amely az első 16 aminosav kivételével (amelyekről ügy gondolják, hogy a CS fehérje szignál szekvenciáját kódolják) a teljes cirkumsporozoita (CS) fehérjét kódolja, elektroforézissel izoláljuk 6Z-os poliakrilamid gélből (PAGE), majd elektroelücióval kinyerjük.
A pASl expressziós vektorból (ATCC 39262, részletesebb leírása megtalálható a Rosenberg féle 4,576,355 sorszámú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírásban) tíz mikrogramot 25 egység BamHI restrikciós endonukleázzal emésztünk 200 pl, az előzőkben ismertetett összetételű közepes erősségű pufferben 1.5 órán át 37‘C-on. Az emésztett plazmidot ezután 15 percig 25*c-on a DNS polimeráz I nagy fragmentjével kezeljük (5 egység Klenow fragment 20 mmól TRIS-HC1 PH=7.5, 7 mmól MgClg, 60 mmól NaCl, 6 mmól
2-merkapto-etanol és 0.25 mmól mind a négy dezoxinukleotid trifoszfátből) a BamHI vég feltöltésére.
A cirkumsporozoita fehérje gén-fragmentet (1 pg) ezután 100 ng fenti vektorba ligálunk 30 pl ngáz pufferben (összetétele 50 mmól TRIS, 1 mmól DTT, 10 mmól HgClg, 100 pmól rATP, pH=7.5) egy egység T4 DNS ligázzal 16 órán át 4‘C-on.
A ligáló elegyet E.coli HH294CI+ törzsbe
-26transzformálJuK. Amplclllin rezisztens telepeket kapunk, ezeket levizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a pASl vektorba építve a CS gén-f ragmentet. Egy megfelelő szerkezetű plazmidot (pCSP) azonosítunk.
B. A PUCRLÍ9 készítése
100 pg tisztított pCSP plazmid DNS-t emésztünk 100 egység Fok I endonukleázzal 400 pl közepes erősségű pufferben (összetételét lásd előzőkben) 3 órán át 37’C-on. Ezt követően a plazmidot a DNS pollmeráz I nagy fragmentjével kezeljük (lásd fent) a Fok I vég feltöltésére. A plazmidot ezután 100 egység BamHI restrikciós endonukleázzal emésztjük 400 pl közepes erősségű pufferben (összetételét lásd az előzőkben) 3 órán át 37’C-on. A kapott 318 bázispár méretű fragmentet, amely a CS fehrje 19-293. aminosavait kódolja, 6Z-os pollakrllamld gélen (PAGE) végzett elektrof orézissel izoláljuk, majd elektroelúcióval kinyerjük.
A pCSP egy további alikvot részét (100 pg) 100 egység Tthin I restrikciós endonukleázzal emésztjük 400 pl közepes erősségű pufferben (összetételét lásd fent) 3 órán át 65’C-on. Ezt követően a plazmidot a DNS pollmeráz I nagy fragmentjével Kezeljük (lásd fent) a Tthlll I vég feltöltésére. A plazmidot ezután 100 egység Sál I restrikciós endonukleázzal kezeljük 400 pl közepes erősségű pufferben 3 órán át 37’C-on, és a keletkező 655 bázispár méretű fragmentet, amely a CS fehérje 297-412. aminosavait Kódolja, 6Z-os pollaKrilamid gélen f uttatJuK, majd
-27elektroelúcióval kinyerjük.
Tíz mikrogram pUClö expressziós vektort [Yanish-Perron et al., Gene, 33, 103 (1985)], egy standard E.coli expressziós vektort (beszerezhető például a Bethesda Research Laboratories, Inc.-tői, Galthersburg, MD) 20-20 egység BamHI és Sáli restrikciós endonukleázzal 200 pl közepes erősségű pufferben (összetételét lásd fent) emésztünk 2 órán át 37*C-on. A 318 bázispár méretű Bamhl végfeltöltéses /Fok I fragmentet (1 pg) és a 655 bázispár méretű Tthlll I végfeltöltéses /Sáli fragmentet (1 pg) eztán pUC16 vektorba ligáljuk 30 pl ligáz pufferben (összetételét lásd fent) egy egység T4 T4 DNS ligázzal 16 órán át 4‘C-on. A megfelelő szerkezetű plazmidot (pUCRLf9) azonosítjuk.
C. A pHG-1 plazmid készítése
A PMG27N- expressziós vektorból tiz mikrogramot [H. Gross et al., Hol. Cell. Bioi., 5, 1015 (1985)] 50-50 egység
BamHI és Sac I restrikciós endonukleázzal emésztünk 200 pl közepes ionerősségű pufferben (lásd fent) 3 órán át 37‘C-on.
A PAPR601 expressziós vektorból [Young et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 6105 (1983)], amely az influenza vírus (A/PR/8/34) nem-strukturális 1-es fehérjéjét (NSí) Kódoló régiót tartalmaz [Baez et al., Nucleic Acids Research, 6, 5645 (1980)] tiz mikrogramot emésztünk 20-20 egység Ncol és BamHI restrikciós enzimmel 200 pl magas sótartalmú pufferben (50 mmól TRIS-HC1, 1 mmól DTT, 10 mmól HgClg és 100 mmól NaCl, pH=7.5) két órán át 37’C-on. A keletkező 230 bázispár méretű fragment, amely az NS1 első 61
-26• · · ·»«··· * · • · · · ·
N-termlnális aminosavát kódolja, 6'/.-os poliakrllamid gélen (PAGE) elektroforetizáljuk, majd elektroelúcióval izoláljuk.
A BamHI/ SacI enzimekkel hasított pHG27N- (leírása a fentiekben) vektorból negyven nanogramot ligálunk 60 ng 230 bázispár méretű NcoI/BamHI NSlQj-et kódoló fragmenttel és 80 ng szintetikus linkerrel, melynek szekvenciája a kővetkező:
AspHisMetLeuThrAsp 5'CATGGGATCATATGTTAACAGATATCAAGGCCTGACTGACTGAGAGCT 3' BamHI 3' CTAGTATACAATTGTCTATAGTTCCGGACTGACTGACTC 5' SacI
A keletkező pMG-1 plazmidot azonosítjuk annak a BamHI helynek az alapján amely akkor keletkezik, amikor az NSlei kódoló szekvenciát a PHG27N- BamHI helyére ligáljuk; annak az Ncol helynek az alapján, amely akkor keletkezik, amikor az NSlgi kódoló szekvenciát az Ncol végénél a szintetikus linker Ncol helyére ligáljuk; valamint annak a SacI helynek az alapján, ami akkor keletkezik, ha a szintetikus linkért a SacI végénél a pMG27N- vektor SacI helyére klónozunk. Ez a vektor egyedülálló restrikciós felismerési helyeket tartalmaz, amelyek lehetővé teszik, hogy DNS fragmenteket a három leolvasási keret bármelyikében beépíthessünk a vektorba, a TGA terminációs kodont mind a három leolvasási keretben tartalmazza a cll riboszőmális kötőhely ATG inicláclős kodonjátől 3' irányban, ennek eredményeképpen expresszió esetén mindhárom leolvasási keretben kapunk NSlgi
-29• · · • « · · · · · • · · • · · · · fúziós fehérjéket. Ha a pHG-1 plazmidot Ndel restrikciós endonukleázzal emésztjük, ezt követően a vektort a fentiek szerint ligáljuk, így nem-fúziós fehérjéket expresszálunk (azaz, nem fúzlonálódnak az NSlej-hez).
D. A pNSlgj_RLf9 előállítása
100 pg pUCRLf expressziós vektort 100 egység BamHI restrikciós endonukleázzal emésztünk 400 pl magas sótartalmú pufferben 3 órán át 37’C-on, Az emésztett plazmidot ezt követően a DNS polimeráz I nagy fragmentjével kezeljük (lásd fent), a BamHI hasítási hely feltöltése céljából. A plazmidot ezután 20 egység Sáli restrikciós enzimmel emésztjük közepes ionerősségű pufferben (összetételét lásd fent) 3 órán át 37'C-on. A keletkező 1035 bázispár méretű f ragmentet 5Z-os poliakrllamid gélen (PAGE) elektroforetizáljuk, majd elektroelúcióval kinyerjük.
A pMG-1 expressziós vektorból 10 pg-ot 25-25 egység EcoRV és Xhol restrikciós enzimmel emésztünk közepes ionerősségű pufferben (összetételét lásd fent) 3 órán át 37’C-on. Ezután a pUCRLf vektor 1035 bázispár méretű BamHIvégfeltöltéses/SalI fragmentjét a fenti vektor 100 ng-Jával ligáljuk 30 pl llgáz pufferben (összetételét lásd fent) egy egység T4 DNS ligázzal 16 órán át 4’C-on.
A ligáié elegyet E.coli HH294C1+ törzsbe transzformáljuk. A kapott ampicillin rezlsztens telepeket átvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e megfelelő orientációban a beépített gént. A megfelelő szerkezetű plazmidot azonosítjuk (pNSleiRLf 9), E.coli (CIts857) törzsbe
AR58 • · ♦ ·
-30♦ · · · · • * * ······ »· • · · · · fr transzformáljuk, és vizsgáljuk, hogy expresszálódik-e a következő összetételű cirkumsporozoita fehérje géntermék: hiányzik belőle az első lő N-terminális aminosav (CSi_i6), benne van a központi ismétlődő dómén és a 9 N-termlnális aminosav a határoló régiót tartalmazó ΙΙ-es régióból (CSg^-ggg), amely a pHGi expresszlós vektorba ligáit szintetikus linker által kódolt 6 aminosavon keresztül (Asp-His-Het-Leu-Thr-Asp) kapcsolódik az influenza nem szerkezeti 1-es fehérjéje első 61 aminosavához, az NSlgi~hez. Az NSlg2RLf9 szekvenciája a következő:
NSlgi-Asp-HiS-Met-Leu-Thr-Asp-Fro-CS-ig_i23 CS297-412
Az Asp-t (a szintetikus linker C-termlnálisáról) az
RLf9 (CSi9_i23~CS297-4i2)“tűl elválasztó Pro amely akkor keletkezik, amikor a pCSP fragmentjének BamHI végét feltöltjük.
A sejteket Luria-Bertani táptalajon (LB) műtermék,
BamHI/FokI növesztjük
32‘C-on addig, amíg a 650 nm-en mért abszorbanciája (A55Q) a
0.6-os értéket eléri, majd majd a tenyészet hőmérsékletét
42'C-ra emeljük, ezzel indukáljuk az expressziós plazmid PL promoterének transzkripcióját, majd az NSl^i CS fehérje-származék transzlációját. A sejtekből 1 ml-es mintákat veszünk, ülepítjük, llzls pufferben szuszpendáljuk, (lommól TRIS-HC1 PH=7.Ő, 25 tfZ glicerin, 2Z 2-merkapto-etanol, 2Z nátrlum-dodecil-szulfát (SDS), 0.1Z brómfenolkék), majd egy 105'C-os hevítő blokkban 5 percig inkubáljuk.
A fehérjéket SDS-pollakrllamid gélelektroforézissel
-31• · · · · * · · 4 · • · · · · • · ♦ · · · »«· · · • · · · · (SDS-PAGE) választjuk szét (13Z akrllamid, 30:0.8 akrllamid: blsz-akrilamld arány) A fehérjéket nitrocellulóz membránra visszük, és az E. coli által termelt NS1qjRLí9 fehérjét Western Biot módszerrel detektáljuk, a CS fehérje I-es Régló-Jával reagáló poliklonális antitestet használva erre a célra [Dame et al., Science,225, 593 (1984)], valamint az
NSIqi fehérjével reagáló poliklonális antitestet, az E.coli által termelt NSlgiRLf9 fehérjéről kiderült, hogy nem reagál 5 olyan monoklonális antitest keverékével, amelyek a Plasmodlum falciparum CS fehérjéje ismétlődő tetrapeptld doménje ellen irányulnak.
2. Példa
A pNSlgjRLf Auth plazmid előállítása
A pCSP E.coli expressziós vektort (lásd fent) közepes ionerősségü pufferben BamHI és Fok I restrikciós endonukleázzal emésztjük. A kapott DNS fragmentet, amely az I-es régiót tartalmazó határoló szakaszt tartalmazza az első 18 N-termlnális aminosav kivételével, elektroelúcióval nyerjük ki.
A pCSP egy másik részét Tthlll 1 és Sál I restrikciós endonukleázzal emésztjük Közepes ionerősségű pufferben. A kapott DNS fragmentet, amely az első 9 Ν-terminális aminosav kivételével a Il-es Régiót tartalmazó határoló szakaszt tartalmazza, elektroelúcióval kinyerjük.
A pUCie E.coli expressziós vektort (lásd fent) BamHI és ♦ ·· · • · ·
-32Sal I restrikciós endonukleázokkal emésztjük közepes ionerősségü pufferben.
A ΙΙ-es régió, amely a CS fehérje központi ismétlődő doménjét tartalmazza, 9 N-termlnális amlnosavának (CSg68_296) helyreállítására, amely aminosavak a pCSP Tthlll 1 restrikciós endonukleázzal való emésztésekor vesztek el, egy Fok I és Tthlll 1 véggel rendelkező szintetikus linkért állítunk elő, amely a következő szekvenciával rendelkezik:
Asp Pro Gly Asn Lys Asn Asn Cin Gly Asn Gly Gin
5' ATCCCGGGAATAAAAACAACCAAGGTAATGGACA 3'
FOk I 3' GCCCTTATTTTTGTTGGTTCCATTACCTGTT 5' Tthlll 1
A BamHI/Fok I fragmentet, a Tthlll 1/Sal I fragmentet és a szintetikus fragmentet a BamHI/ Sál I restrikciós endonukleázokkal emésztett pUClő vektorba ligáljuk.
A keletkező plazmidot, jele puCRLfAuth, BamHI restrikciós endonukleázzal emésztjük közepes ionerősségü pufferben, a végeit feltöltjük, majd Sál I restrikciós endonukleázzal emésztjük. A keletkező DNS fragmentet, amely a helyes cirkumsporozoita fehérjét tartalmazza az első 18 N-terminális aminosav és a központi ismétlődő dómén kivételével, elektroelúcióval kinyerjük.
Az izolált BamHI-végfeltöltéses/Sal I fragmentet ezután az NSlöl-et kódoló E.coli expresszlós vektorba, a pMG-l-be ligáljuk (lásd fent), amelyet előzőleg EcoRV és Xhol • ···
-33restrlkciós endonukleázokkal emésztettünk. A keletkező expressziós vektor, a pNSlgjRLf Auth a kővetkező szekvenciájú fehérjét expresszálja:
NSlgi-Asp-Hls-Het-Leu-Thr-Asp-Pro-CSig_i23-Gly-CS2Qö-4i2 (Az I-es Régiét s ΙΙ-es Régiét tartalmazó CS határoló szakaszokat <CS19-123 és cs266-41£) elválasztó glicln a szintetikus Fokl/Tthlll 1 DNS llnker szekvencia műterméke.
Az NSlgiRLfAuth teljes nukleotld és aminosav szekvenciája a közzétett 90304720.7 számú, 1990. május 1-én benyújtott Európai szabadalmi bejelentésben található, amelynek a teljes leírására hivatkozunk a továbbiakban. 3. Példa
A pNSlölRLf Auth+(NANP)2 előállítása
Az előzőkben említett pNSlölRLf Auth plasmidot Smal restrikciós endonukleázzal emésztjük közepes ionerősségű pufferben (leírása az előzőkben, plusz KCl-ot tartalmaz) 25‘C-on 3 órán át.
A Smal restrikciós endonukleázzal emésztett pNSlg|RLf Auth plazmldba egy szintetikus DNS linkért ligálunk. Szekvenciája a következő:
AsnAlaAsnProAsnAlaAsnPro
5' AACGCAAACCCAAATGCAAACCCC 3'
3' TTGCCTTTGGGTTTACGTTTGGGG 5'
A szintetikus DNS llnker a (NANP)g-t kódolja (egybetűs kódok az amlnosavak Jelzésére, N=aszparagln (Asn); A=alanln (Alá); P=prolln (Pro)), a tetrapeptld a CS fehérje immunodomináns • fc • · · · • · · · · *·· ······ ·· • ♦ · · · ·
-34ismétlődő egységének úgynevezett konszenzus szekvenciáját kódolja. A pNSleiRLf Auth Smal restrikciós endonukleázzal való emésztése lehetővé teszi, hogy tetszőleges számú, szintetikus DNS llnker által kódolt ismétlődő tetrapeptidet építsünk a CS fehérjének erre a helyére, amelyet korábban az immunodomináns Ismétlődő dómén foglalt el. További tetrapeptidet kódoló DNS fragmentek llgálhatók ilymódon a vektorba. A kapott plazmid, a pNSieiRLf Auth+(NANP)g a következő szekvenciával rendelkező peptidet kódolja:
NSlöi-Asp-HiS-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CSi9_i23-(NANP)2-Gly-CS26ö-412
4. Példa
A pNSl81(NANP)4.RLf Auth plazmid előállítása
Az előzők szerint előállított pUCRLfAuth expressziós vektort BamHI restrikciós endonukleázzal emésztjük.
Egy szintetikus, (NANP)4~et kódoló DNS fragmentet ligálunk a BamHI restrikciós endonukleázzal emésztett pUCRLf vektorba. A szintetikus DNS fragment szekvenciája a következő:
ProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnPro 5'GATCCCAATGCAAACCCAAATGCAAACCCAAACGCTAACCCCAACGCTAACCCC 3' GGTTACGTTTGGGTTTACGTTTGGGTTTGCGATTGGGGTTGCGATTGGGGCTAG
-35«· · · ·· ··· · • ♦ · · · *·· ··«··· ·· » · · · * ·
A keletkező plazmid Jelzése pUC18(NANP)4RLf Auth.
A pUC16(NANP)4RLf Auth expressziós vektort BamHl restrikciós endonukleázzal emésztjük, végeit feltöltjük (Klenow fragment), Sáli restrikciós endonukleázzal emésztjük, majd a keletkező DNS fragmentet elektroelücióval kinyerjük.
A BamHl végf eltöltéses/Sall fragmentet az NSl81-et kódoló pHGl expresszlós vektorba (leírása az előzőkben) ligáljuk, amelyet előzőleg EcoRV és Xhol restrikciós endonukleázzal emésztünk. A keletkező plazmid Jelzése pNSl8i(NANP)4RLf Auth, és egy olyan fehérjét kódol, amelyben a szintetikus DNS fragment által kódolt ismétlődő tetrapeptid az NSlgi 81. amlnosava (Hét) és az NcoI/SacI szintetikus DNS linker N-terminális Asp-je közé van illesztve:
NSi81-(NANP)4-Asp-His-Met-Leu-Thr-Asp-Pro-CS1g_123-Gly-CS268-412
5. Példa
A pNSl81(NVDP)4RLf Auth plazmid előállítása
A pNSiei(NVDP)RLf Auth plazmidot ugyanúgy állítjuk elő mint a pNSlöl(NANP)4RLfAuth plazmidot, azzal a különbséggel, hogy az (NVDP)4-et (a CS fehérje központi ismétlődő doménjének egy variáns tetrapeptid szekvenciája) kódoló szintetikus DNS linker szekvenciája a következő:
• · ·
-36AsnValAspProAsnValAspProAsnValAspProAsnVal
5' GATCCCAATGTAGACCCCAACGTTGATCCGAACGTAGACCCGAATGTA 3’ 3' GGTTACATCTGGGGTTGCAACTAGGCTTGCATCTGGGCTTACAT 5'
A keletkező plazmid a következő szekvenciájú fehérjét Kódolja:
NSl81(NVDP)4-Asp-Hls-Het-Leu-Thr-Asp-Pro-CS19_123-Gly-CSg88_4i2
6. Példa
AZ NSleiRLf9 izolálása E.coliból
Az NSl8jRLf9 szintézisének indukálása után hőmérséklet érzékeny lambda lizogénben (CItsö57) a baktérlumsejteket centrif ugálással összegyűjtjük, és a kapott csapadékot -70'C-on tároljuk. A koncentrált, lefagyasztott sejtből körülbelül 12g-ot megolvasztunk olymódon, hogy 120 ml lizáló pufferoldatba tesszük (összetétele: 50 mmól TRIS pH:ő, 10 mmól EDTA, 5 z glicerin és 10 mmól ditiotreitol (DTT)). Llzozimet (Slgma Chemical Co., St. Louis, HO) adunk hozzá 0.2 mg/ml végkoncentrációban, és az oldatot 30 percig 4‘C-on kevertetjük. A sejteket Branson ultrahangos feltáróval feltárjuk, egészen addig, amíg az oldat elfolyósodottnak tűnik. lOZ-os dezoxlkolát oldatot adunk hozzá 0.1 tfz koncentrációban, és az oldatot 15600 x g-vel centrifugáljuk 30 percig 4’C-on Sorvall RC 5B centrifugával (DuPont).
• · 4 · · ·
-37A felülúszót elöntjük, és a megmaradó fehérje-tartalmú üledéket 100 ml pufferben szuszpendáljuk (összetétele 50 mmól gllcln, 2 mmól EDTA, 5Z glicerin, pH = 10), A szuszpenziót a fentiek szerint feltárjuk, és Triton Χ-100-at (Slgma) adunk hozzá 1 tf'Z végkoncentrációban. A feltárt oldatot 30 percig kevertetjük 4*C-on és a fentiek szerint centrifugáljuk.
A fehérje-tartalmú felülúszóhoz karbamldot adunk 8 mól végkoncentrációban, és az oldat pH-Ját 50Z-os ecetsav oldattal 5.5-re állítjuk. Az oldatot 25 ml-es QAE Sepharose Fást Flow (Pharmacla) oszlopon kromatografáljuk, amelyet előzőleg egy pufferoldattal hoztunk egyensúlyba (összetétele 20 mmól nátrlum-acetát, 1 z Triton X-100 és 8 mól karbamid, pH:5.5), 300 cm/óra áramlási sebességgel. A fehérjét abban a frakcióban találjuk, amely nem kötődik, majd 10 ml-es Sp Sepharose Fást Flow (Pharmacla) oszlopra visszük, amelyet előzőleg egy pufferoldattal hoztunk egyensúlyba (összetétele 20 mmól nátrlum-acetát, 8 mól karbamid, pH:5.5), 120 cm/óra áramlási sebességgel. Az elfolyó oldatot 280 nm-en monitorozzuk. A fehérjét erről az oszlopról 100 mmól TRIS, 8 mól karbamid, pH=8 összetételű pufferrel oldjuk le,
A kapott termék SDS-PAGE analízise egy körülbelül 40000 kD látszólagos molekulasúlyú fö csíkot mutat, ennek tisztasága körülbelül ÖOZ. A tisztítási eljárással 12 mg olyan fehérjét kapunk amelynek aktivitása körülbelül 14 endotoxin egység/mg fehérje.
7. Példa • 4 • ··· • 4 • · * 4 4 4 ·· 44 44 »4«
-38Az NSlölRLf9 izolálása E.coliból
Az NSIqi szntézlséneK hőmérséklet érzékeny lambda lizogénben való indukálása után a baktérium-sejteket centrifugálással kinyerjük és a kapott csapadékot -70’C-on tároljuk. A töményített, fagyasztott sejtekből körülbelül 636 g-ot megolvasztunk 2200 ml puffer oldatban (60 mmól TRIS, 12 mmól EDTA, 6Z glicerin, 12 mmól ditiotreitol (DTT), pH=8.0). A megolvasztott sejteket egy Manton Gaulin homogenizátoron bocsátjuk Keresztül Kétszer egymás után 6000-7000 psi nyomással. 10 Z-os dezoxiKolát oldatot adunk hozzá 0.1 tfz végKoncentrációban, a lizátumot 30 percig 4’C-on KevertetJüK, majd 10000 x g-vel centrif ugáljuK Sorvall RC 5B centrifugával (Du Pont) 60 percig 4‘C-on.
Az üledéKet elöntjük, és 25 pl 1050 vagy 2100 Biocryl gyöngykeveréket (Supelco) adunk a fehérje tartalmú felülúszó minden egyes milliliteréhez. Az oldatot kevertetjük majd a fentiek szerint centrifugáljuk.
Az üledéket eldobjuk, és a megmaradó fehérje tartalmú felülúszóhoz 20Z telítettségig szilárd ammónium-szulfátot adunk öt percre.
A szuszpenziót a fentiek szerint kevertetjük és centrifugáljuk. Az üledéket 400 ml puffer oldatban szuszpendáljuk (összetétele 20 mmól mátrlum-acetát, 1 Z Triton X-100 és 6 mól Karbamid, pH=5.5) Ezt a szuszpenziót centrifugáljuk és a felülúszót dlalizáljuk egy puffer oldattal szemben (összetétele 100 mmól TRIS, 8 mól Karbamid, ·
4» 4··4 * · · 4· • ·♦···* ·« • · · Λ ·4 • 4 ♦* 4«4·4
-39ρΗ=5.5). A visszamaradó oldat pH-Ját 5.5-re állítjuk, és egy 100 ml-es SP Sepharose Fást Flow oszlopon (Pharmacia) kromatográf áljuk, amelyet előzőleg egy puffer oldattal hozunk egyensúlyba (összetétele 20 mmól nátrlum-acetát, 1 Z Triton X-100, ö mól karbamld, pH=5.5), 10 ml/perc áramlási sebesség mellett. Az oszlopot az egyensúlyba hozó pufferrel mossuk, majd egy másik pufferre, amelynek összetétele 0.1 mól TRIS és ő mól karbamld, pH=ő. Az oszlopot 500 ml, 0.0-0.5 mól közötti lineáris nátrlum-klorid gradienssel mossuk, amely 0.1 mól TRlS-t és 6 mól karbamidot tartalmaz, pH=8).
A fehérje 0.3 mól nátrium-klorid koncentrációnál eluálódik. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és egy Amicon kevert cellában töményítjük, YH 10 membránt alkalmazva és egy puffer oldattal szemben dializálva, amelynek összetétele 20 mmól TRIS, pH=6.0), majd foszfáttal puffereit sóoldattal szemben puffereljük (pH=7.0).
A kapott termék SDS-PAGE elemzése szerint egy erős esik található benne 40000 kD látszólagos molekulasúlynál, valamint számos minor komponens. A tisztítási eljárás után 25 mg fehérjét kapunk, ennek aktivitása 144 endotoxln egység/mg fehérje.
6. Példa
Az R16CSP izolálása E.collból
Az E.collban expresszált R16 CSP-t úgy állítjuk elő hogy a pUCö 1-es klőnból (lásd fent) egy XhoII fragmentet pCSP-be
-40·« *« ·»···>· · 4 4·
4·· «·4 ··»·« • · ♦ * · « (lásd fent) ligálunk, amelyet előzőleg BamHI restrikciós endonukleázzal emésztettünk. Az R16CSP-t, amelyet ELISA befogó antigénként alkalmazunk a 9. példában, a következőképpen tisztítjuk.
Az R16CSP szintézisének E.coliban való indukálása után a baktériumsejteket centrlfugálással kinyerjük, és a kapott üledéket -20‘C-on lefagyasztjuk. Körülbelül 373 g töményített, lefagyasztott sejtet megolvasztunk 1.43 liter pufferben (összetétele 50 mmól TRIS, 10 mmól EDTA, 5Z glicerin, 10 mól dltiotreltol, pH=3.0). 10 Z.-os dezoxikolát oldatból annyit adunk hozzá, hogy a végkoncentráció 0.1 tfZ legyen, ezután a sejteket kétszer átbocsátjuk egy Hanton-Gaulin homogenizátoron 7000 psl nyomással. Polietilén-imin (BRL) 0.5 mól TRIS (pH=8.0) pufferben készült 10, vz-os oldatát adjuk a homogenizátumhoz, hogy a végkoncentráció 0.5Z legyen. Az oldatot 1 órán át 4’C-on kevertetjük, majd 13000 x g-vel centrifugáljuk Sorvall RC 2B centrifugában (DuPont) 45 percig 4'C-on.
Az üledéket eldobjuk, majd szilárd ammónium-szulfátot adunk 35Z telítési értékben a felülúszóhoz 5 percre. Az oldatot az előzők szerint kevertetjük és centrifugáljuk.
Az üledéket 300 ml pufferbe szuszpendáljuk, melynek összetétele 20 mmől TRIS, 10 mmól EDTA, pH=ö.O. 300 ml ő mól karbamldot, majd 2.7 liter 10 mmól nátrium-acetátot és 4 mól karbamldot tartalmazó oldatot adunk hozzá, majd a pH-t azonnal 4.0-ra állítjuk. Az oldatot az előzők szerint centrifugáljuk.
— A felülúszót 50 ml-es SP-sepharose, Fást Flow ··«« ·· ··· ·· ··99
99 9
999 999 999 • · · 9♦ «· ·· «»
-41(Pharmacia) oszlopra visszük, amelyet előzőleg 20 mmől nátrium-acetátot és 4 mól karbamidot tartalmazó (pH=4.0) pufferrel hoztunk egyensúlyba. az oszlopot 250 mmólos nátrium-acetát pufferrel (pH=5.0) mossuk, majd 250 ml olyan lineáris nátrium-klorid gradienssel mossuk, amely 0.0-1.0 mól NaCl-t tartalmaz a mosópufferben. A termék körülbelül 0.3 mól nátrium-klorid koncentrációnál eluálódlk.
Az ioncserélt termék 50 ml-es alikvotjának a pH-ját 2.3-ra állítjuk 10 tfZ-os trif luor-ecetsavval (TFA) és C4 reverz fázisú oszlopon kromatografáljuk (Vydac, 1 x 25 cm), amelyet előzőleg 0.1 z TFA-val hoztunk egyensúlyba. 0-60 z acetonitrll (ACN) 0.1 z TFA-ban készült lineáris gradiensét futtatjuk 45 percig, a termék körülbelül 60Z ACN koncentrációnál eluálódlk. A fordított fázisról lejött terméket 25 pl/ml 1 mólos ammónlum-hidrogén-karbonát hozzáadásával semlegesítjük.
A fordított fázisról lejött termékből kb. 45 ml-t pufferrel szemben dlalizálunk, amelynek összetétele 2 mól guanldin-hidroklorld (pH=5.0), majd 20 ml-re töményítünk YH 30 membránon (Amicon). Egy 10 ml-es alikvot részt 2.5 x 50 cm-es Superose 12 (Pharmacla) oszlopon kromatografálunk, amelyet pH=5.0-ás 2 mólos guanldin-hldroklorlddal hoztunk egyensúlyba. Az eluálódott fehérjét (látszólagos molekulasúlya 358 kD) 20 mmólos nátrium-acetát pufferrel szemben (pH=4.5) dlalizálunk.
A Superose termék Coomassie-val festett SDS-PAGE-Ja Két fő csíkot mutat, ezeknek látszólagos molekulasúlya 72 KD
-42« · · * · ··· ··· ··· ·· • « · · « · •· ·· ·· ··« illetve 70 kD. A végtermék aminosav-analízise és
N-termlnálls szekvenálása a várt érték 15X-án belül volt.
9. Példa
Egerek antitest válasza NSlg1RLf9-re
Immunogenitásának meghatározása céljából a tisztított NSlgfRLf9 antigént három egértörzsbe oltjuk be, a C57BL/6(H-2b); a BALB/C(H-2d); és a C3H/HEN(H-2K) törzsekbe. Az már korábban kiderült, hogy csak H-2b haplotlpusü egerek termelnek antitesteket a Plasmodlum falciparum clrkumsporozolta fehérjéje ismétlődő epitopjával szemben. Az antigént Freund féle adjuvánssal injektáljuk be, és az Immunizált állatokból vett szérum-mintákat enzimmel kapcsolt immunadszorbens esszével (ELISA) vizsgáljuk. A kontroll állatokat R32tet32-vel immunizáljuk, egy olyan antigénnel, amely a cs fehérje ismétlődő tetrapeptldjeit tartalmazza. Mindhárom egértörzsnek KSleiRLf9-cel való inokulálása olyan antitest termelődését eredményezte, amely a cirkumsporozoita fehérje nem Ismétlődő (határoló) régiójával reagál. Az immunogenitási vizsgálatok részleteit és eredményeit az alábbiakban Közöljük.
Mindhárom egértörzset két csoportra osztjuk, mindegyik csoport 4-5 állatot tartalmaz.
Az állatok első csoportját
NSlgiRLf 9-cel, a második csoportot
R32tet32-vel immunizáljuk [J.Young et al., Science, 223, 95Θ (1985)].
AZ
R32tet32 két Xho II fragmentet tartalmaz, mindegyik fragment az [(Asn-Ala-Asn-Pro)i5(Asn-Val-Asp-Pro))2 szekvenciát
-43kódolja. A tetjg egy 32 aminosavból álló pepiid amelyet a tetraciklin rezisztencia gén kódol, nincs leolvasási fázisban.
A 6. példa szerint tisztított NSígjRLf9 antigént komplett Freund adjuvánssal keverjük el közvetlenül a beadás előtt, 6-δ hetes egereket Immunizálunk bőr alá adott 50 pg antigénnel, 200 pl, a Jobb hátsó részbe adott dózisban. Az egereket kétszer immunizáljuk, először egy egyszeri 200 pl-es dózissal, amely 50 pg antigént tartalmaz komplett Freund adjuvánsban. Erősítő injekciókat négy héttel később adunk ugyanezzel e kísérleti elrendezéssel, azzal a különbséggel, hogy az antigént inkomplett Freund adjuvánsban szuszpendáljuk.
Az állatokat a második immunizálás után 7 nappal kivéreztetjük. Az egy csoportban levő állatok összes vérét egyesítjük, hagyjuk összecsapzódni éjszakán át 4‘C-on, majd a szérum elválasztására lecentrifugáljuk, utána -70‘C-on tároljuk. ELISA-t használunk az egyesített szérumokban R32tet3g, NSÍQiRLf9 vagy R16CSP ellen termelődött antitestek kimutatására. (Az R16CSP-t a fentiek szerint tisztítjuk és állítjuk elő.)
A szendvics” ELISA befogó antigénként a mikrotiter lemez lukainak falára adszorbeálva Κ32ίβί32~ίι R16CSP-t és NSlgiRLf9-et tartalmaz.
A befogó antigént úgy adszorbeáljuk a mikrotiter lemez lukainak falára, hogy mindegyik lukhoz 50 pl olyan PBS oldatot adunk, amely 0.75 pg befogó antigént és 0.2 pg forralt kazeint tartalmaz. Ezt az oldatot úgy állítjuk elő, • · ·
hogy β pl (3.76 pg) befogó antigént adunk 2.5 ml olyan oldathoz, amelyben 4 pl 0.5 z-os forralt kazein oldatot tartalmaz (összetételét lásd az előzőkben) 5 ml Dulbecco féle foszfáttal puffereit sóoldat (PBS) (egy vizes oldat, amelynek összetétele O.őZ NaCl, O.217Z Na2HP04 x 7 H2O, 0.02Z KH2P04 és 0.02Z KC1, pH=7.4).
Miután éjszakán át lnkubáltuk szobahőmérsékleten, a lukak tartalmát leszívjuk, és a megmaradó aktív helyeket 0.5 Z-os forralt kazein oldattal blokkoljuk (5 g/1 kazein (J.T.Baker Chemical Co), 0.1 g/1 Thimersol (Sigma Chemical
Co.), 0.02 g/1 fenolvörös (Sigma Chemical Co.), 900 ml PBS pH=7.4 és 100 ml 0.1 normál NaOH), amelyet 99:1 arányban hígítunk 1 Z-os Tween 20-szal (polloxietllén-szorbitán-monolaurát, Sigma Chemical Co.).
Az egérszérumokat 1:100, 1:1 000, 1:10 000, 1:100 000 és
1:1 000 000 arányban hígítjuk 0.025 Z Tween 20-at tartalmazó 0.5/,-os forralt kazein oldatban. A vizsgált szérumot ezután hozzáadjuk a lukhoz majd kétórás inkubálás után a szérumot eltávolítjuk és a lukakat kétszer mossuk 0.05Z Tween 20-at tartalmazó PBS oldattal. Egy peroxidázhoz konjugált antl-egér IgG Ab-t adunk a lukhoz, amelyet 1:2000 arányban hígítunk a szérumhoz használt higítószerrel. Egyórás inkubálás után a lukak tartalmát leszívjuk, háromszor mossuk 0.05 Z Tween 20-at tartalmazó PBS oldattal, majd tiszta peroxidáz szubsztrát oldatot adunk hozzá (Kirkegaard and Perry, készítése az előállító utasítása szerint). A peroxidáz és a szubsztrát reakciója egy sötétzöld terméket eredményez, a szín intenzitása arányos a szérum mintában
-45Jelenlevö antitest mennyiségével. Az eredményeket 15 perc elteltével 405-414 nanométeren olvassuk le ELISA leolvasóval, és optikai egységben (OD) Jegyezzük fel.
Mindhárom egértörzs (C3H/HEN (H-2K), BALB/c (H-2d) és C3H/HEN (H-2b) NSleiRLf9 antigénnel való beoltása olyan antitesteket eredményez, amelyek erősen reagálnak a clrkumsporozoita fehérje ismétlődés nélküli régiójával. Az NSlgjRLf9 befogó antigénre való reakció kicsit erősebb mint az R16CSP-re. (Az R16CSP befogó antigén csak a CS fehérje Ismétlődés mentes része elleni antitesteket detektálja, míg az NSlgiRLf9 befogó antigén lehetővé teszi mind az antl-NSlgi mind az anti-RLf9 elleni antitestek detektálását.) Amint az várható volt a C3H/HEN egerek nem adtak antitest választ az R32tet32-re, mig a C57B1/6 egerek igen. Jóllehet lényegesen gyengébb, (1 nagyságrenddel kisebb) mint a C57BL/HEN egerekben megfigyelt antitest válasz, a BALB/C egerek R32tet32~re adott antitest válasza nem volt várható, és ellentétben áll azzal a negatív válasszal amelyet az irodalomban az ilyen haplotipusú egereknek (NANPJ^Q-re adott reakciójáról leírtak [Dél Giudice et al., J.Immunoi., 137, 2952 (1986)], a leírás szerint tizennégy egértörzset (kilenc különböző H-2 hapiotípusba tartoztak, beleértve a BALB/C (H-2d)-t is), (NANP)4Q-nel immunizáltak hordozó fehérje nélkül, és csak a H-2b egerek adtak antitest választ a (NANP)40 ellen. A 11-20 egerek (BALB/C) egyáltalán nem adtak választ. A BALB/C egereket fúrócsiga hemoclaninhoz mint hordozó fehérjéhez kötött (HAHP)4Q-nel immunizálva anti-(NANP)4Q antitesteket • *
-46kapunk.
10. Példa
A sporozoita invázió gátlása
Ebben a vizsgálatban NSÍ8iRLf9-cel immunizált nyulak szérumát vizsgáljuk, Hogy képesek-e meggátolni a P.falciparum sporozoiták belépését a májsejtekbe, ahol a sporozoiták kifejlődnek és az exo-eritrocta állapotba érnek.
Három egértörzs (BALB/C, C57BL/6, A/J), NSlgjRLf 9-cel immunizálva komplett Freund adjuvánsban vagy alumínium hidroxidban, magas antitest titert mutatnak a CS fehérje ismétlődés nélküli régiójával szemben. Azonban ezeknek az egereknek a széruma nem képes megakadályozni a sporozoiták behatolását a tenyésztett humán hepatóma sejtekbe (HepG2-A16), ha a Sporozoita Invázió Gátlása (ISI) teszttel
| vizsgáljuk [Hollingdale, | H.R. et | al., J.Immunol., 132, | 909 | |
| (1984)]. | ||||
| Ezzel ellentétben, az | UJ-Zélandi fehér | nyulak, 100 | pg | |
| NSigiRLf 9-cel immunizálva | komplett | Freund | adjuvaánsban | a |
0., 3. és 7. héten megemelkedett antitest titert adnak (Jóllehet alacsonyabbat mint az egerek) a cs fehérje ismétlődésmentes régiójára. Azonban az NSlgjRLf 9-cel immunizált nyulakból származó szérumról kiderült, hogy lényegesen gátolja a hepatóma sejtek sporozoita invázióját, a Hollingdale féle ISI módszerrel vizsgálva (98 z. egy állat esetében, az átlagos gátlás körülbelül 60Z).
Egy chloroquine rezisztens p.falciparum törzset (7G8 törzs) és egy chloroquine érzékeny P.falciparum törzset
-47• · ·· ·· · · · · « · * * · • · * ······ » · • · · · · » (NF54 törzs) is Jelentősen gátolta a hepatóma sejtekbe való belépésben az NS18iRLf9-cel immunizált nyulak széruma. A Plasmodlum falciparum 7G6 törzs sporozoitáinak hepatóma inváziójának gátlása jelentősebb az ISI módszerrel meghatározva (átlagban 65Z) mint az NF54 törzsé (átlagban 60Z).
Azokban az ISI vizsgálatokban, amelyekben a normál hepatocitákat humán hepatóma sejtekkel helyettesítjük, a P.falciparum NF54 sejtek sporozoitáit gátolják a hepatocitákba való belépésben az NSlaiRLf9-cel immunizált egerekből származó szérumok (egy nyúlnál ő9Z-os gátlás, az átlagos gátlás körülbelül 45Z)
Ezek a vizsgálatok azt sugallják, hogy az NSleiRLf9 antigénen sporozoita neutralizáló epitopok vannak.
11. példa
A sporozoita neutralizáló epitopok azonosítása
Röviden, három egértörzset (BALB/C, C57BL/6 és A/J) immunizálunk NSieiRL9-cel, amelyet vagy komplett Freund féle adjuvánssal, vagy alumínlum-hidroxiddal adunk be, és ezek az egerek magas antitest titert mutatnak a CS fehérje ismétlődésmentes régiójával szemben. Azonban ezeknek az egereknek a szérumai képtelenek a sporozoiták humán hepatóma sejtekbe (HepG2-A16) való invázióját meggátolni, ha a Hollingdale és munkatársai által leírt [J.Immunol., 132(7). 909 (1964)] Sporozoita Invázló-gátlási (ISI) teszttel vizsgáljuk.
-46··* ·· ·· «··· • · · · ··« · ·· * · • · 4 ·
Az egér- és nyúlszérumokat tovább vizsgáljuk a Geysen és munkatársai [Strategles fór Epitope Analysis Using Peptide Synthesis, J.Immunoi.Hethods, 102, 259-274 (1967)] által leírt pepscan analízis módszerrel. Röviden, olyan átlapoló hexapeptidek teljes készletét állítjuk elő szintetikusan, amelyek homológok a teljes Plasmodium falciparum CS fehérje szekvenciájával, és mindegyik hexapeptidet egy polipropilén pálcához kapcsoljuk. A 9. példa szerint RLf9-cel immunizált egerekből és nyulakból származó szérumokat 1:500 arányban hígítunk, majd 4'C-on éjszakán át együtt inkubáljuk a pálcákkal. A pálcákat Ismételten mossuk, majd a megkötött antitesteket faj-elleni antitestekhez kötött alkalikus foszfatázzal mutatjuk ki. Néhány mosás után a pálcákat érintkrzésbe hozzuk néhány órára a szubsztrátummal. Az abszorbanciát 414 nanométeren olvassuk le, és az eredményeket a megfelelő pálcának, illetve a hozzákapcsolt szekvenciának megfelelően ábrázoljuk. A hexapeptid analízis válaszai tették lehetővé az alábbiakban ismertetett öt sporozoita neutralizáló epitop azonosítását.
A következő, a találmány szerinti peptideket azonosítottuk, a fentiekben Ismertetett módszerekkel, mint a Plasmodium falciparum neutralizáló epitopjait.
1. peptid
Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;
2. peptid
Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys; vagy
3. peptid
Leu-Lys-Gin-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;
• · ·· ···« • · · · · ··· ······ · · ♦ · · ♦ · · • · · · ·· ···
4. peptid
Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala; vagy
5. peptid
Asn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;
Az 1-5 peptidek bármelyikét előállíthatjuk szokásos szintetikus módszerekkel, a Jelen találmány tanításait felhasználva.
Az 1-5 peptidek bármelyikét hozzákapcsolhatjuk egy lmmunfokoző makromolekulához, úgymint például, nem korlátozó módon tetanusz toxoidhoz, dlftérla toxinhoz és kolera B toxinhoz. A kapcsolást előnyösen egy aminosav-csoporton keresztül hajthatjuk végre, amely segíti a peptldeknek a hordozó fehérjéhez való kapcsolását, úgymint például nem korlátozó módon ciszteln, tirozln és lizin aminosavon keresztül. A kapcsolást továbbá előnyösen hajthatjuk végre egy kapcsoló ágensen keresztül, azaz egy olyan ágensen keresztül, amely hidat képez a peptid és a hordozó fehérje között. A használható kapcsoó ágensek közé tartozik, nem korlátozó módon, a glutáraldehid. Hég előnyösebben a kapcsolást egy könnyítő és egy kapcsló ágens felhasználásával hajtjuk végre.
Például a 4-es peptidet az N-terminállsán egy cisztein-csoporttal szintetizáljuk, és a kapott szekvenciát az N-terminális ciszteinen keresztül tetanusz toxoidhoz kötjük, kapcsoló ágensként glutáraldehldhez használva (a kapott hibrid fehérjét ezután 101-es peptldnek nevezzük). A 4-es peptidet is úgy szintetizáljuk meg, hogy mind az K-ter minálison, mind a c-ter minál lson ciszteint • ··
-50• · · « ··· ·· • · · tartalmazzon, majd a kapott szekvenciát a végein levő cisztein csoportokon keresztül glutáraldehid felhasználásával tetanusz toxoldhoz kapcsoljuk (a kapott hibrid fehérjét a továbbiakban 106-os peptldnek nevezzük).
Például a 4-es peptidet (amely mind a c-terminállsán, mind az N-terminálisán ciszteint tartalmaz) PBS-ben szuszpendáljuk (pH=7.4) 1 mg/ml koncentrációban. A tetanusz toxoidot olyan mennyiségben adjuk hozzá, hogy a végkoncentrációja 1 mg/ml legyen. A peptid és a fehérje folyamatos kevertetése közben glutáraldehidet adunk az oldathoz 37. végkoncentrációban. A reakciót 1 órán át hagyjuk végbemenni szobahőmérsékleten. A kapott hibrid fehérjét (106-os peptid) PBS-sel szemben diallzáljuk, hogy a szabad peptidet és a glutáraldehidet eltávolítjuk.
A keletkező kapcsolt peptideket (azaz a 101-es és 106-os peptideket) használjuk nyulak immunizálására, Freund féle komplett és inkomplett adjuvánst használva, majd a szérumokat isi-vei vizsgáljuk. Az eredményeket az alábbiakban mutatjuk be.
SZÉRUM
7. ISI
Antipeptid 101
Antipeptid 106
99.2 • · ·· ·· ···· • · · · · ··· ·«···· * · • · · · · ♦ • · ·· ·· ···
-51Az ISI a sporozoita Inváziónak a teszt szérumokkal való százalékos csökkenése, a prelmmunlzácló, vagy nem-immun szérum jelenlétében mutatott százalékos csökkenéshez viszonyítva. Amint az a fenti eredményekből látható, mind a 101-es, mind a 106-os peptid tisztán mutatta az ISI aktivitást. A 106-os peptid különösen aktiv.
Hasonló módon, az 1-5 peptldek közül bármelyiket, vagy az összesét bármely sorrendben összekapcsolhatjuk és/vagy ezeknek bármely kombinációját előállíthatjuk szokványos módszerekkel, majd hozzáköthetjük egy Immunfokozó makromolekulához (például a tetanusz toxoldhoz), előnyösen egy aminosav csoport útján (például clsztelnen keresztül) a kapott N-terminállson és/vagy c-termlnálison keresztül egy kapcsoló ágenst alkalmazva (például glutáraldehldet). A keletkező hibrid polipeptid Jól használható a találmány szerinti vakcinában.
Azt is fontos megjegyezni, hogy az 1-5 peptldek bármelyikének aminosav-sorrendjé vei leírható fehérjét előállíthatjuk szokványos rekombináns DNS technikával, monomer vagy polimer formájában. Azt is fontos megjeyeznl, hogy az 1-5 peptldekből előállított hibrid peptldek közül bármelyiket elő lehet állítani szokványos rekombináns DNS technikával, ezt a szekvenciát genetikailag fúzionáltathatjuk egy immunfokozót kódoló szekvenciához (például tetanusz toxoldhoz), és/vagy egy expressziót fokozó szekvenciához szokványos technikákkal, majd a keletkező hibrid fehérjét kódoló szekvenciát expresszálhatjuk szokványos rekombináns DNS technikákkal.
·· *··«
-52Tehát egyes megvalósítási módokban a Jelen találmány szerinti pollpeptid egyet vagy többet tartalmaz a fentiekben azonosított immunogén determinánsokból. Megfontolandó, hogy a fentiekben listázott peptidek funkcionális megfelelőit, azaz a sporozoita neutralizáló aktivitással rendelkező származék molekulákat elő lehet állítani a szakirodalomban jól ismert szokványos technikákkal. Ezek az ekvivalensek tartalmazhatnak egyszeres vagy többszörös aminosav deléciót, szubsztitúciót ús/vagy addíciót az azonosított aminosav szekvenciához hasonlítva, miközben megtartják sporozoita neutralizáló aktivitásukat.
Claims (10)
- SZABADALHI IGÉNYPONTOK1. A Plasmodium felületi fehérjéje első határoló szakaszából egy vagy több immunogén determinánst tartalmazó, a Plasmodium felületi fehérjéje második határoló szakaszából egy vagy több immunogén determinánst tartalmazó, a kettő közötti ismétlődő dómén immunogén determinánsai közül az összesnél kevesebbet, vagy egyet sem tartalmazó polipeptld, azzal Jellemezve, hogy az említett, az első határoló régióból származó immunogén determinánsok aminosav-szekvenciája a következő:Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys; vagyLeu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;vagy ezeknek egy funkcionális megfelelője.
- 2. A Plasmodium felületi fehérjéje első határoló szakaszából egy vagy több immunogén determinánst tartalmazó, a Plasmodium felületi fehérjéje második határoló szakaszából egy vagy több immunogén determinánst tartalmazó, a kettő közötti ismétlődő dómén immunogén determinánsai közül az összesnél kevesebbet, vagy egyet sem tartalmazó polipeptld, azzal jellemezve, hogy az említett, a második határoló régióból származó immunogén determinánsok aminosav-szekvenciája akövetkező:• · · • ·-54Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala; vagyAsn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp; vagy ezeknek funkcionális megfelelője.
- 3. A Plasmodium felületi fehérjéje első határoló szakaszából egy vagy több immunogén determinánst tartalmazó, a Plasmodium felületi fehérjéje második határoló szakaszából egy vagy több immunogén determinánst tartalmazó, a kettő közötti ismétlődő dómén immunogén determinánsai közül az összesnél kevesebbet, vagy egyet sem tartalmazó pollpeptid, azzal Jellemezve, hogy az emlitett, az első határoló régióból származó immunogén determinánsok közül legalább egynek az aminosav-szekvenciáJa a következő:Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys; vagyLeu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;és az említett, a második határoló régióból származó immunogén determinánsok közül legalább egynek az aminosav-szekvenciája a következő:Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala; vagyAsn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp; vagy ezeknek funkcionális megfelelője.
- 4. Pollpeptid, azzal Jellemezve, hogy a Plasmodium felületi fehérjéje ismétlődő doménjében levő ismétlődő immunogén determinánsok közül az összesnél kevesebbet vagy egyet sem tartalmaz, és legalább az egyik pepiidnek a következő a szekvenciája:* ν *« · Λ ···· * · · * · «·« ·«···· · * • * · · · ·-55Gly-Asp-Asn-Gly-Arg-Glu-Gly-Lys;Glu-Lys-Leu-Arg-Lys-Pro-Lys; vagyLeu-Lys-Gln-Pro-Gly-Asp-Gly-Asn;Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala; vagyAsn-Lys-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu-Asp;vagy ezeknek funkcionális megfelelője.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid,
azzal Jellemezve, hogy hibrid polipeptid. 5. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal Jellemezve, hogy a peptid és egy hordozó fehérje kémiai fúziójának eredménye. 7. A 6. igénypont szerinti polipeptid, azzal Jellemezve, hogy a hordozó fehérje tetanusz toxoid, diftéria toxin vagy kolera B toxin. Ö. A 7. igénypont szerinti polipeptid, azzal Jellemezve, hogy a kémiai fúziót glutáraldehiddel mint kapcsoló ágenssel hajtjuk végre. 9. A 7. igénypont szerinti polipeptid, azzal Jellemezve, hogy a tetanusz toxoidhoz való fúzionáltatást a peptid N-terminálisán levő cisztein csoporton keresztül hajtjuk végre. - 10. A 7. igénypont szerinti polipeptid, azzal Jellemezve, hogy a tetanusz toxoidhoz való fúzionáltatást a peptid N-termlnállsán levő cisztein csoporton, valamint a C-terminálisán levő cisztein csoporton keresztül hajtjuk végre.
- 11. A 10. igénypont szerinti polipeptid, azzal Jellemezve, hogy a •9 ··*·-56Cys-Pro-Asn-Asp-Pro-Asn-Arg-Asn-Val-Asp-Glu-Asn-Ala-Cys aminosav szekvenciát tetanusz toxoidhoz kapcsoljuk, kapcsoló ágensként glutáraldehidet alkalmazva.
- 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerint polipeptidet kódoló expressziós vektor.
- 13. Embereket Plasmodium sporozoitákkal való fertőzés ellen védő vakcina, azzal jellemezve, hogy az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti pollpeptidből immunológiai védelemhez elegendő mennyiséget tartalmaz, valamint egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot.
- 14. Eljárás Plasmodium sporozoiták által okozott fertőzés elleni védelemre szoruló ember immunizálására, azzal Jellemezve, hogy az embernek a 13. igénypont szerinti vakcina hatásos, nem toxikus mennyiségét adjuk be.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44774689A | 1989-12-08 | 1989-12-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU908128D0 HU908128D0 (en) | 1991-06-28 |
| HUT56882A true HUT56882A (en) | 1991-10-28 |
Family
ID=23777585
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU908128A HUT56882A (en) | 1989-12-08 | 1990-12-07 | Process for producing malaria vaccine |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0432965A1 (hu) |
| JP (1) | JPH0673097A (hu) |
| KR (1) | KR910011897A (hu) |
| CN (1) | CN1053814A (hu) |
| AU (1) | AU634837B2 (hu) |
| CA (1) | CA2031468A1 (hu) |
| FI (1) | FI906051A (hu) |
| HU (1) | HUT56882A (hu) |
| IE (1) | IE904412A1 (hu) |
| IL (1) | IL96579A0 (hu) |
| MA (1) | MA22097A1 (hu) |
| MY (1) | MY105313A (hu) |
| NO (1) | NO905301L (hu) |
| NZ (1) | NZ236357A (hu) |
| PL (1) | PL288140A1 (hu) |
| PT (1) | PT96132A (hu) |
| ZA (1) | ZA909838B (hu) |
| ZW (1) | ZW19090A1 (hu) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ233255A (en) * | 1989-04-11 | 1993-02-25 | Chiron Corp | Plasmodium cs protein analogues lacking one or more of the repeat epitopes, and containing at least one nonrepeat flanking epitope |
| US5972351A (en) * | 1992-04-03 | 1999-10-26 | Isis Innovation Limited | Plasmodium falciparum MHC class I-restricted CTL epitopes derived from pre-erythrocytic stage antigens |
| CA2141427C (en) * | 1992-07-31 | 2008-07-22 | Mohammed Anjam Khan | Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria |
| EP0712442B1 (en) * | 1993-07-30 | 2002-03-27 | Medeva Holdings B.V. | Vaccine compositions |
| GB9401787D0 (en) | 1994-01-31 | 1994-03-23 | Medeva Holdings Bv | Vaccine compositions |
| WO1995007094A1 (en) * | 1993-09-10 | 1995-03-16 | New York University | Compositions and methods for inhibiting hepatocyte invasion by malarial sporozoites |
| GB9401795D0 (en) * | 1994-01-31 | 1994-03-23 | Medeva Holdings Bv | Vaccines |
| GB2295394B (en) * | 1994-01-31 | 1997-09-24 | Medeva Holdings Bv | DNA encoding a fusion protein comprising the C fragment of tetanus toxin |
| KR20050083941A (ko) * | 2002-11-20 | 2005-08-26 | 사나리아 인코퍼레이티드 | 말라리아 예방법 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN86100979A (zh) * | 1985-02-07 | 1986-12-17 | 史密丝克莱恩贝克曼公司 | 疟疾疫苗的制备方法 |
| IT1196501B (it) * | 1986-07-16 | 1988-11-16 | Eniricerche Spa | Polipeptide utile per la preparazione di vaccini per la malaria e di kits diagnostici per la determinazione di affezioni malariche |
| HUT51332A (en) * | 1987-01-30 | 1990-04-28 | Smithkline Biolog | Process for expressing p.falciparum cirkumsporozoita protein by yeast |
| NZ233494A (en) * | 1989-05-03 | 1993-08-26 | Smithkline Beecham Corp | Polypeptides comprising plasmodium surface protein with a reduced number of repeating immunogenic determinants fused to a carrier protein; vectors coding therefor and vaccines |
-
1990
- 1990-12-04 CA CA002031468A patent/CA2031468A1/en not_active Abandoned
- 1990-12-05 AU AU67774/90A patent/AU634837B2/en not_active Ceased
- 1990-12-05 NZ NZ236357A patent/NZ236357A/xx unknown
- 1990-12-05 MA MA22284A patent/MA22097A1/fr unknown
- 1990-12-05 ZW ZW190/90A patent/ZW19090A1/xx unknown
- 1990-12-06 EP EP90313257A patent/EP0432965A1/en not_active Withdrawn
- 1990-12-06 IE IE441290A patent/IE904412A1/en unknown
- 1990-12-06 IL IL96579A patent/IL96579A0/xx unknown
- 1990-12-07 JP JP2409778A patent/JPH0673097A/ja active Pending
- 1990-12-07 FI FI906051A patent/FI906051A/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-12-07 NO NO90905301A patent/NO905301L/no unknown
- 1990-12-07 ZA ZA909838A patent/ZA909838B/xx unknown
- 1990-12-07 PL PL28814090A patent/PL288140A1/xx unknown
- 1990-12-07 HU HU908128A patent/HUT56882A/hu unknown
- 1990-12-07 PT PT96132A patent/PT96132A/pt not_active Application Discontinuation
- 1990-12-08 KR KR1019900020293A patent/KR910011897A/ko not_active Application Discontinuation
- 1990-12-08 MY MYPI90002154A patent/MY105313A/en unknown
- 1990-12-08 CN CN90110121A patent/CN1053814A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU908128D0 (en) | 1991-06-28 |
| KR910011897A (ko) | 1991-08-07 |
| AU634837B2 (en) | 1993-03-04 |
| PT96132A (pt) | 1991-09-30 |
| MA22097A1 (fr) | 1991-12-31 |
| CN1053814A (zh) | 1991-08-14 |
| NO905301L (no) | 1991-06-10 |
| PL288140A1 (en) | 1991-10-21 |
| MY105313A (en) | 1994-09-30 |
| IE904412A1 (en) | 1991-06-19 |
| CA2031468A1 (en) | 1991-06-09 |
| EP0432965A1 (en) | 1991-06-19 |
| NO905301D0 (no) | 1990-12-07 |
| AU6777490A (en) | 1991-06-13 |
| IL96579A0 (en) | 1991-09-16 |
| ZW19090A1 (en) | 1991-04-10 |
| JPH0673097A (ja) | 1994-03-15 |
| FI906051A0 (fi) | 1990-12-07 |
| NZ236357A (en) | 1993-01-27 |
| FI906051A (fi) | 1991-06-09 |
| ZA909838B (en) | 1992-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5726292A (en) | Immuno-potentiating systems for preparation of immunogenic materials | |
| KR100619350B1 (ko) | 변형 면역성 뉴멀리신 백신조성물 | |
| CN107266582B (zh) | 牙龈卟啉单胞菌感染的预防、治疗和诊断 | |
| AU2011326338A1 (en) | Treatment and prevention of malaria | |
| CA2505724C (en) | Malaria vaccine | |
| DK167817B1 (da) | Fusionspolypeptid og vaccine indeholdende polypeptidet samt anvendelse af polypeptidet til fremstilling af et farmaceutisk praeparat mod malaria | |
| EP0191748B1 (en) | Malaria vaccine | |
| HUT56882A (en) | Process for producing malaria vaccine | |
| Skwarczynski et al. | M-protein-derived conformational peptide epitope vaccine candidate against Group A Streptococcus | |
| Woollard et al. | Synthetic peptides induce antibody against a host-protective antigen of Echinococcus granulosus | |
| Sjölander et al. | High antibody responses in rabbits immunized with influenza virus ISCOMs containing a repeated sequence of the Plasmodium falciparum antigen Pf155/RESA | |
| WO1991007979A1 (en) | Chimeric proteins | |
| JPH06511154A (ja) | 組換えＢｏｒｒｅｌｉａタンパクの製造法 | |
| AU635737B2 (en) | Malaria vaccine | |
| EP1688428A1 (en) | Method of antigen incorporation into neisseria bacterial outer membrane vesicles and resulting vaccine formulations | |
| PT100757A (pt) | Polipeptidos aptos para induzir "in vivo"anticorpos capazes de inibir a invasao de globulos vermelhos por merozoitos de "p.falciparum", produtos aparentados e sua aplicacao na producao de composicoes de vacinacao | |
| AU2013203249A1 (en) | Prevention, treatment and diagnosis of P.gingivalis infection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |