KR20050083941A - 말라리아 예방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 말라리아에 대해 피험자를 예방하는 신규한 방법을 포함한다. 본 발명의 방법은 감독된 종충을 사용한, 특히 제한은 없지만 피하, 근육내, 피내, 점막, 점막하, 및 피부 투여에 의한 접종을 포함한다.

Description

말라리아 예방법{METHOD FOR THE PREVENTION OF MALARIA}

관련 출원의 교차 참조

본 출원은 2002년 1월 20일자 제출된 미국 임시 출원 S.N. 60/427,911에 기초하며 이 출원의 이익을 주장한다. 이 임시 출원의 전체 명세서가 신뢰되며 본원에 참고자료로 포함된다.

본 출원은 백신을 투여하여 말라리아를 예방하는 것에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 사람이나 동물에게 감독된 종충을 투여하는 것을 포함하는 말라리아 감염에 대한 백신에 관한 것이다.

말라리아는 매년 3-5억명의 사람을 감염시키고 1백만 내지 3백만명의 사람을 사망시키는 질환으로서, 개발도상국의 사람들, 특히 사하라 이남 아프리카의 사람들에게 막대한 경제적 충격을 주고 있다[1,2]. Plasmodium falciparum이 세계에서 말라리아로 인한 사망의 대부분을 차지한다. 세계보건기구는 2000년 전세계에서 기록된 7억명의 해외여행자 중, 대략 9백만명이 서부, 중부 또는 동부 아프리카에, 3700만명이 동서아시아에, 6백만명이 서아시아에, 그리고 1000만명이 오세아니아에 입국했다고 보고했다[3]. 북아메리카, 유럽 및 일본으로부터 10,000명 이상의 여행객들이 매년 말라리아에 접촉된다고 추정된다. 100년 이상 동안 말라리아가 전염되었던 수행된 모든 군사작전 중에, 미군은 적의 포화보다도 말라리아로 인해 더 많은 사상자를 내었다. 제2차 세계대전 동안 매일 12,000,000명의 사람이 말라리아로 인해 목숨을 잃은 것으로 추정되었으며 베트남 전쟁 중에는 1200만명의 사람이 말라이라와 싸워야 했다[4].

Plasmodium 기생충(말라리아를 일으키는 원생 기생충)의 전염은 해질 무렵부터 새벽까지 활동하는 감염된 암컷 아노펠레스 모기에게 물림으로써 발생한다. 종충은 혈류에 의해 물린 부위에서 간으로 이동하여 간세포에서 증식하게 되는데, P. falciparum의 경우 감염된 세포 당 10,000~40,000의 자손을 생산한다. 이들 간 단계의 기생충은 종충에서는 발현되지 않는 항원 셋트를 발현한다. 이 새로운 세대의 기생충은 낭충으로서 혈류로 재진입하여 종충 및 초기 간 단계 동안 발현된 것들과는 상이한 항원 셋트를 발현하고 적혈구로 침입하는데, 이 경우 추가의 증식이 48시간마다 대략 10-20배까지 기생충의 수를 증가시킨다. 간에서 5일-10일간 성장하는 것은 병의 어떤 증상이나 징후도 유발하지 않지만, 치료되지 않은 혈액 단계 감염은 용혈반응, 오한전율, 고열 및 허탈을 일으킨다. 사람을 감염시키는 4가지 Plasmodium 종들 중 가장 위험한 P. falciparum의 경우, 질환은 미세순환 혈액 흐름의 중단 및 뇌, 신장 및 폐와 같은 생명유지기관에서의 대사 변화에 의해 악화되며, 긴급히 치료하지 않는다면 주로 사망에 이르게 된다.

P. falciparum에 대한 효과적인 백신은 의약 분야의 매우 큰 도전과제로 남아 있다. 100년 동안에 걸친 노력, 수십억 달러의 연구비, 의사와 과학자들이 바친 일생 동안의 희생, 그리고 많은 유망한 실험용 백신에도 불구하고, 인류의 많은 감염의 괴로움들 중 하나라도 완화할 수 있는 백신은 시판되고 있지 않다. 클로로퀸, DDT 및 벡터 제어 프로그램을 사용한 전세대 공중보건학의 시작은 falciparum 말라리아를 전세계적인 골칫거리로서 사소한 일로 만들 준비가 된 것처럼 보였다. 효과적인 백신의 부재는 이들 노력을 복잡하게 만들었지만 지속적인 제어를 곧 할 수 있을 것처럼 보였다.

금방일 것 같았던 성공의 약속은 짧게 지속되었으며 실패한 이유는 다른 원인 때문이었다. 기생충은 매우 효과적인 이용가능한 항-말라리아약에 내성을 가지며 점점 더 성장했고, 벡터 제어 측정은 효과가 없어졌으며, 이주, 전쟁 및 경제붕괴가 개발도상국의 풍토병 지역에서 점점 더 흔하게 되었다. 그 결과 falciparum 말라리아는 다시 부활했으며, 매년 250억명의 사람이 위험에 노출되고 3억 내지 9억명의 사람이 감염되고 1백만-3백만의 사람이 사망한다. 개발도상국을 괴롭히는 많은 사회 경제 환경 및 정치적 문제들 중, P. falciparum 말라리아는 이들 불공평한 사례들의 근본적인 원인이며 잔혹한 결과로서 점점 확인되고 있으며, 이들 복잡한 문제들을 해결하는데 있어서의 유일한 장애이다. 개발도상국에서 falciparum 말라리아의 제어는 효과적인 백신 없이도 가능할 수 있다. 실제 주어진 사회 정치 및 경제적 현실에서, 본 발명자들은 백신이 지속적인 제어 프로그램의 필수 구성요소일 수 있으며 세계적인 근절 캠페인을 위해 필요할 것임을 믿는다.

이런 배경에서 현대의 말라리아 백신 개발은 특히 좌절하고 있다. 1980년대 초반 이래로 분자생물학과 의학의 굉장한 기술적 진보가 있었다. 이들 진보는 단계-특이적 P. falciparum 단백질 및 에피토프와 숙주 면역 메카니즘 및 반응의 확인을 가속했다. 이런 지식은 광범위한 새로운 백신 후보제로 옮겨졌다[5,6]. 한 가지 점에서 이런 현대의 기간은 말라리아 백신 연구와 인체 시험의 황금시대였다. 그러나, 말라리아 연구자들의 초인적인 노력에도 불구하고, 이들 백신 대부분은 사람에게 어떤 예방적인 면역성을 제공하는데 실패했으며, 수용자 중 40%-70%에서 감염에 대한 재현가능한 단기적 예방만이 유일하게 증명되었다[7-9].

충분한 시간 및 자원이 주어진다면, 이들 백신 전략, 또는 아직 개발중인 다른 전략들은 궁극적으로 강력한 백신을 가져올 수 있다. 그러나, 최근 키스톤 미팅 "Malaria's Challenge: From Infants to Genomics to Vaccines"에서 참석자들은 말라리아 백신이 상업용 제품으로서 "발매"되어야 할 시기에 관해서 투표했다. 그곳에 있던 대부분은 최초 백신이 2016-2025년까지는 발매되지 않아야 한다고 생각하는 것으로 나타났다. 재조합 P. falciparum 포자소체(circumsporozoite) 단백질(PfCSP) 백신을 개발하려고 노력하고 있는 글락소 스미스 클라인(GSK)의 리더는 최대의 낙관론을 표명했다. 만일 모두 잘 진행된다면 이 단일 단백질 백신은 7-8년안에(2009-2010) 발매될 수 있을 것으로 나타났다. GSK와 미군이 1984년 PfCSP을 클로닝[10]한 이래로 재조합 단백질 PfCSP 백신에 대해 연구해 왔고, 많은 말라리아 학자들이 단일 단백질 백신이 지속적으로 말라리아를 제어하는데 적합할 것인지의 여부에 관해 관심을 나타낸 것을 생각하면, 단일 단백질 백신의 개발에 걸린 25년 이상의 시간은 정말로 이 질환의 부담을 줄이는 백신을 개발할 가능성에 대한 냉정한 현실적인 전망을 보여주고 있다.

방사선 감독된 종충으로 면역화한 후의 예방적 면역성

1967년 Nussenzweig는 방사선 감독된 P. berghei 종충을 A/J 마우스에게 정맥내 투여한 것이 감염성 P. berghei 종충을 사용한 시험감염에 대해 마우스를 예방했음을 보고했다[11]. 이들 설치류 연구는 인체 연구에 대한 자극을 제공했고, 1970년대 초반까지 두 그룹이 침샘에 P. falciparum을 지닌 조사된 모기에게 물리게 하여 사람 지원자를 면역화하는 것이 완전히 감염성인 P. falciparum 종충을 사용한 시험감염에 대해 지원자들을 예방할 수 있음을 확립했다[12-19]. 이들 연구는 무균의 예방적 면역성을 제공하는 말라리아 백신이 가능함을 증명했다. 그러나, 이 때에 종충을 생산하는 유일한 방식은 지원자를 P. falciparum로 감염시키고, 이 지원자를 클로로퀸으로 치료하여 기생충을 제거하지는 못하지만 이를 억제하고 생식모세포가 발생되도록 한 다음 이들 지원자에게 모기를 제공하는 것이었다. 이런 방법에 의해 충분한 수의 종충이 생산될 수 있다 해도, 이것은 조사된 종충 백신으로 사람을 면역화하는데 있어 임상적으로 기술적으로 그리고 논리적으로 비현실적이라고 생각되었다. 마우스를 사용하여 행했던 바에 따르면, 대부분 이것은 감염된 모기에게 물리든 정맥내 주사되든 종충이 살아 있는 채로 송달되었기 때문이다. 이 분야에서 활동했던 과학자들은, 그들의 시각으로부터 본질적으로 백신으로서 감독된 종충의 사용을 제외하고는, 다른 경로의 면역화가 정맥내 주사나 감염된 모기에 물리는 것에 의해서 면역화하는 것과 비교하여 충분한 또는 비교할 만한 예방을 제공하지 못할 것이라고 결론내렸다. 몇몇 그러한 과학자들의 발표된 견해가 아래 인용된다.

"이 관찰은 선행 보고서(Nussenzweig, Vanderberg 및 Most, 1967 및 1969)를 확증하는 것이며 그들의 발견을 확장하는 것이다. 다른 비경구 경로(근육내, 복강내 및 뇌내)에 의해 면역화된 마우스 그룹은 정맥내 면역화된 마우스보다 훨씬 낮은 전체적인 예방 수준을 나타냈다."[20]

"이들 연구는 종충-유발 말라리아에 대해 마우스를 예방적으로 면역화하는데 있어서 근육내 주사된 조사된 P. berghei 종충이 정맥내 주사된 것들보다 훨씬 덜 효과적임을 증명했던 선행 보고서를 확인했다. 인체 시험까지의 확장을 예방하는 최고 한계가 정맥내 면역화 과정의 요건이었으며, 이는 허용되지 않는 의학적 위험을 나타낸다."(이 인용에서 언급된 연구에서 근육내 경로에 의한 예방은 11% 내지 42% 범위였고 피하 경로에 의한 예방은 0%였다)[21].

"설치류에서의 백신접종 시도에서 사용된 다양한 면역화 경로(근육내, 정맥내, 피하, 경구 등) 중에서 정맥내 경로가 최고의 예방 및 가장 재현성 있는 결과를 제공했다. 유일한 다른 매우 효과적인 면역화 경로는 감염된, 조사된 모기에게 물리는 것이다."[22] 1980년의 리뷰인 "Use of Radiation-attenuated Sporozoites in the Immunoprophylaxis of Malaria,"에서 Dr. Nussenzweig는 종충 말라리아 백신을 개발할 가능성을 계속 논의하고 있으며, "결론적으로, 최근 발견은 우리가 이제 종충-유발 면역성의 메카니즘을 설명하고 예방적 항원을 분리할 수단을 제공하는 필수적인 강력한 도구를 가졌음을 나타내는 것이 분명하다. 이들 조건 하에서 말라리아 종충 백신의 개발에 대한 다양한 장애물들은 너무 멀지 않은 미래에 희망적으로 극복할 수 있음이 분명하다."라고 결론내린다. Dr. Nussenzweig는 종충 단계에 대한 면역성을 유발하는 백신의 성분을 제공하기 위한 종충의 사용만을 논의했을 뿐, 합리적인 대안으로서 전체 감독된 종충 백신을 이용하려는 생각은 논의하지 않았다.

조사된 종충 백신 모델에 대해 연구한지 거의 15년 후인 1980년대에 이 분야의 명백한 선두주자인 Dr. Nussenzweig에 의해서, 백신의 경로는 예방의 면역학적 메카니즘과 예방적 면역반응의 항원 표적을 이해하고, "서브유닛" 종충 백신을 구성하는 현대 과학을 통해서 준비된다는 결론이 내려졌다. 이후의 진행에서는 많은 이유 때문에 인체를 위한 실용적인 백신으로서 감독된 전체 기생충 종충 백신을 개발하려는 시도에 대한 언급이나 논의는 문헌상에 본질적으로 없었으며, 15년의 연구에도 불구하고 어떤 과학자도 정맥내 투여나 감염된 모기에 물리게 하는 것 이외의 다른 식으로 종충을 투여하는 것에 대한 합리적인 접근법을 전혀 발견하지 못했다.

또한, 투여 전에 무균 정제되고 적합하게 보존되어 복원된 무균 모기에서 종충이 상승했고, 그러한 처리 후 종충이 투여되었을 때도 여전히 예방적 면역반응을 도출할 수 있었기 때문에 감독된 종충 백신을 개발하려는 연구는 더 이상 없었다.

감독된 종충 백신을 개발하는 것과 관련된 것으로서 이 때에 인정되지는 않았지만 생산 문제들 중의 일부에 대한 가능한 해결책이 보고되었다. 1975년에 시험관내에서 P. falciparum을 배양하는 방법[23,24], 1982년에는 이들 배양물로부터 생식모세포를 생산하는 방법이 보고되었다[24]. 1986년에는 이들 시험관내 배양물을 공급한 모기에서 생성된 종충에 의해 사람이 감염될 수 있다는 것이 보고되었다[26]. 따라서, 인체에서 생식모세포를 생체내 생산하는 어려움 없이 종충을 생산하는 방식이 생겼다. 이런 개발만으로는 감독된 종충 백신 개발에 대한 모든 장애를 극복하는데 충분하지 않았다. 종충을 충분히 생산하거나 표준 규약을 만족하는 조건 하에서 종충을 생산하고 처리하는 방식은 없었다. 더욱이, 적합하게 생산되고 처리된 종충이 임상적으로 허용되는 실용적인 방식으로 성공적으로 투여될 수 있다는 것을 나타내는 데이타도 없었다.

따라서, 말라리아 학계가 높은 수준의 예방을 달성하는데 충분한 임상적으로 허용되는 실용적인 방식으로 감독된 종충을 송달하는 방법을 발견하는데 실패한 후 감독된 종충 백신은 임상적 고려사항에서 멀어졌고, Dr. Nussenzweig에 의해 예언된 대로, 학계는 백신을 개발하기를 기대하며 현대 분자과학을 채택했다. 몇 가지 유망한 개발이 말라리아 서브유닛 백신 개발의 현대 시대를 개시했다. 종충의 주요 표면 단백질인 포자소체 단백질(CSP)에 대한 모노클로날 항체가 생산되었고, 수동전달 실험에서 마우스를 예방하는 것으로 나타났다[27]. 추가로, PfCSP 단백질을 암호화하는 유전자가 클로닝되고 서열화되었다[10]. 동시에, 최초의 정제된 재조합 단백질 백신인 B형 간염 표면 항원 백신이 개발되어 시판되었다[28]. 백신 과학에서의 영향력 있는 증거와 경향은 말라리아 연구자들에게 인체용 말라리아 백신을 빨리 개발할 수 있는 로드맵을 제공한 것처럼 보였다. 종충 백신을 생산하고 투여하는 것이 비현실적이라고 생각했기 때문에 감독된 전체 기생충 백신으로의 복귀는 불필요하고 구식인 것처럼 보였고, 모든 후속 노력은 서브유닛 백신의 가망성에 집중되었다.

최초의 재조합 단백질[29] 및 합성 펩티드[30] 백신이 예상된 만큼 예방적이지 않은 것으로 증명된 1987년에, 생산 및 투여하는 것이 불가능하다고 생각되었던 감독된 종충 백신의 개발을 고려하는 대신에, 과학자들은 예방적 면역성을 가져오는 면역 메카니즘과 이들 예방적 면역반응의 항원 표적을 이해하고, 그러한 예방을 유발하는 서브유닛 백신과 백신 송달 시스템을 개발하는데 집중했다. 이런 기본적인 연구들은 대부분 P. berghei 및 P. yoelii 설치류 모델 시스템에서 수행되었다. 이 설치류 말라리아 연구는 조사된 종충 백신-유발 예방의 면역학적 메카니즘과 항원 표적에 중요한 통찰력을 제공했으며 많은 후보 백신의 개발을 가져왔다[31-33]. 밀레니엄의 마지막을 지나는 1984년 P. falciparum circumsporzoite 단백질(PfCSP)을 암호화하는 유전자의 클로닝 후 수행되었던 이들 연구 중 어느 것도, 어떤 연구자들도 실용적인 방식으로 그러한 백신을 생산하거나 투여하는 것이 가능하다고 생각하지 못했기 때문에, 인체용의 조사된 전체 종충 백신을 개발할 수 있는 가능성을 시사하지는 않았다. 흥미롭게도 서브유닛(재조합 단백질, 합성 펩티드, 재조합 바이러스, DNA 플라스미드) 백신 제제는 사람에서와 비교할 수는 없지만 마우스에서 훌륭한 예방 효과를 생성하는 것으로 알려졌다. 반면, 마우스에서 조사된 종충의 정맥내 투여에 의한 예방[11]은 인체 연구를 이끌었으며, 침샘에 P. falciparum 종충을 지닌 조사된 모기에게 물려 노출된 것이 예방을 유발했음을 증명했다[34].

1989년 서브유닛 PfCSP 백신에 대한 많은 기대에 어긋난 임상 시험 후, 침샘에 P. falciparum를 지닌 모기에게 물리게 하여 지원자를 면역화한 다음 감마선에 생체내 노출하여 감독시키는 것이 Naval Medical Research Institute later Naval Medical Research Center(NMRI later NMRC)와 Walter Reed Army Institute of Res-earch(WRAIR)에서 시작되었다. 이 연구의 목표는 조사된 종충 백신으로 인체를 예방하도록 이끈 임상적 특성 및 요건을 보다 잘 설명하고, 인체에서 도출된 예방적 면역반응을 평가하고, 인체에서 면역반응을 도출한 단백질에 대한 항원 및 에피토프를 확인하는 것이었다. 이것은 인체용 백신으로서 조사된 종충을 개발하는 것은 그러한 백신을 생산하는 것뿐만 아니라 그러한 백신을 투여하는 것이 완전히 비현실적이고 기술적으로 불가능하다고 생각했던 것에 따라 전혀 고려하지 않았다. 이들 연구로부터의 예비 임상 결과 및 확장된 면역학적 분석 결과가 공개되었다[35-41]. 이 과제에 대한 다른 연구들과 조합된 이들 면역학적 연구[42-48]는 방사선 감독된 P. falciparum 종충으로 면역화된 인체에서의 면역학적 반응에 대한 우리의 이해를 높였다. 그러나, 감독된 종충 백신을 개발하려는 시도에 대한 고려나 언급은 없었다.

이들 면역화 및 시험감염을 사용한 최초 10년의 임상 실험의 결과가 최근 보고되었고, 메릴랜드 대학(1970년대, 1980년대 후반 및 1990년대 초반)과 1970년대 시카고의 Rush-Presbyterian-St Luke's Medical Centre 및 Naval Medical Research Institute로부터의 조사된 Plasmodium 종충을 사용한 인체 면역화[34]에 대한 모든 공개된 임상 보고서와 취합되었다[12-19, 34]. 수행된 분석으로부터 많은 관찰이 있었다.

A). 5-14마리의 감염된 모기에게 물림으로써 시험감염된 지원자들 중에서 예방적 면역성에 관해 용량반응이 있었다. 마지막 1차 면역화 후 10주안에 시험감염되었을 때, 1000마리 이상의 감염된 조사된 모기에게 물림으로써 면역화된 14명의 지원자 중 13명(93%)이 혈액 단계 P. falciparum 감염의 발생에 대해 예방되었다. 마지막 1차 면역화 후 10주안에 시험감염되었을 때, 200마리 이상 1000마리 미만의 감염된 조사된 모기에게 물림으로써 면역화된 10명의 지원자 중에 4명(40%)이 혈액 단계 P. falciparum 감염의 발생에 대해 예방되었는데, 이는 1000마리를 초과하는 감염된 모기에게 물린 면역화된 지원자들의 예방적 면역성보다 상당히 낮은 수준이었다(p=0.000015, 피셔즈 이그잭트 테스트, 2-테일드).

B). 예방적 면역성은 적어도 42주(10.5개월) 동안 지속되었다. 마지막 1차 또는 2차 면역화 후 23주 내지 42주(23, 36, 39, 41 및 42주)에 시험감염되었을 때, 상기 14명의 지원자 중 6명중에 5명이 실험 시험감염에 대해 예방되었다. 마지막 면역화 후 5년이 지난 1명의 지원자에 대한 단일 시험감염을 제외하고(예방되지 않았음), 다른 시험감염은 예방적 면역성의 수명을 평가하지 않았다.

C). 예방은 균주 특이적이 아니었다. 4명의 지원자는 그들이 면역화된 분리주와는 상이한 P. falciparum의 분리주로 시험감염되었다. 이 4명의 지원자는 P. falciparum의 상이한 분리주를 사용한 그러한 시험감염 7번 모두에서 완벽히 예방되었다.

D). 면역학적 기억은 적어도 5년간 지속된다. 1601마리의 조사된 감염된 모기에게 물려 노출되고 마지막 노출 후 9주 및 4주에 시험감염되었을 때 예방된 지원자는 조사된 감염된 모기에 마지막 노출 후 5년 지나서 다시 시험감염되었을 때 예방되지 않았다. 그의 말라리아는 치료되었고, 147마리의 조사된 감염된 모기에 노출됨에 의해서 추가접종되었고, P. falciparum 종충에 감염된 5마리의 비-조사된 모기에 물림으로써 노출되어 다시 시험감염되었다. 이 지원자는 이 감염성 시험감염에 대해 예방되었으며[34], 이는 예방적 면역성이 조사된 종충에 한번 노출됨으로써 촉진될 수 있음을 증명한다.

따라서, 예방은 1000마리 이상의 모기에게 물린 후의 시험감염 실험 중 90% 이상에서 달성되었고 적어도 10.5개월간 지속되었으며 P. falciparum 분리주(균주) 특이적이 아니었다.

사람 피험자에서 이런 수준의 예방 효능을 나타내는 "서브유닛" 백신이 주요타개책으로 인정되었다. 예방이 실험용 조사된 종충 백신에 의한 결과임이 통상 관찰되었지만, 감독된 종충의 완전한 힘은 이 보고서를 공개하는데 필요한 주의깊은 분석이 완료된 후까지 여전히 인정되지 않았다. 흥미롭게도 2002년 3월의 키스톤 미팅 "Malaria's Challenge: From Infants to Genomics to Vaccines"에서 우리들(SLH) 중 하나에 의해 이들 결과가 발표되었을 때 이들은 흥미롭게 생각되었지만, 모두 이 백신을 생산하는 것은 비현실적이고 투여하는 것은 불가능하다고 생각했기 때문에, 청중들 중 누구도 이 접근법이 생육성 있는 말라리아 백신으로서 추구되어야 한다는 생각을 제기하지는 않았다. 이런 관점은 과학계에서 아직도 광범위하게 유지되고 있다. Nature 잡지(2003년 8월 2일)에서의 최근 발표에서, Naval Medical Research Center Malaria 프로그램의 임상 시험 감독은 "아무도 그것을 기꺼이 시도하려고 하지 않은 장벽들이 충분히 약해진 것 같다"라고 말했고, 영국 옥스퍼드 대학의 말라리아 백신 전문가는 "어려움이 무겁게 쌓이더라도 길게 보고 시도할 만한 가치가 있다"라고 말했다. 반면, 본 발명자는 cGMP 제조공정으로 나아가고 임상 시험하기 전에 대답해야할 몇 가지의 임상적 질문이 있지만 그러한 백신을 제조하는 것이 가능하다고 믿었다. 이들은 최근 발표에서 개략적으로 설명된다[50]. 가장 큰 임상적 질문 중 하나는 인체용 백신에 알맞은 실용적인 경로에 의해 감독된 종충을 투여할 수 있는지에 관한 것이었다.

발명의 개요

지금까지 감독된 Plasmodium 종들의 종충으로 사람을 면역화하는 것은, 사람 및 마우스를 각각 사용하여 이미 행해졌던 대로, 그리고 높은 수준의 예방적 면역성을 달성하는 유일한 방식으로서 학계에 의해 받아들여졌던 대로, 이 종충이 면역화를 위한 감염된 조사된 모기에게 물리는 것에 의해서, 또는 정맥내 주사에 의해서 송달되어야 하기 때문에 비현실적이라고 생각되었다.

적합하게 조사된 종충이 모기에게 물리거나 정맥내 주사에 의해서 송달될 때, 이들은 혈류를 통해 간으로 흘러가고 간세포에 침입하여 부분적으로 성장한 다음 성장을 정지하며, 파열되어 적혈구의 감염과 말라리아라고 알려진 질환을 일으키는 낭충을 방출하는 성숙한 간 분열체까지는 절대 성장하지 않는 것이 이론화되어 있다. 따라서 그들은 감독된다. 데이타는 충분한 예방적 면역반응을 도출하기 위해서 기생충이 간세포에 침입하여 부분적으로 성장하고 예방적 면역반응의 표적인 새로운 단백질, 특히 CD8 T 세포를 발현해야 한다는 것을 나타낸다.

본 발명자들은 조사되지 않은 종충 제조물의 감염성과 이들이 감독되었을 때 예방적 면역성을 도출하는 이들의 능력 사이의 직접적인 상관성/관련성을 이론화했다. 더욱이, 우리는 특정한 방법에 의해 투여되었을 때 조사되지 않은 종충의 감염성과 이 방법에 의해 조사되고 송달되었을 때 예방적 면역성을 도출하는 이들 종충의 능력 사이의 직접적인 상관성/관련성을 이론화했다.

여기 설명된 본 발명은, 인체용 백신에 알맞은 실용적인 경로에 의해 감독된 종충을 투여할 수 있는가? 라는 질문에 대한 답으로서 개발되었다.

이 질문은 상기 인용된 모든 보고서들에서 이미 연구되었던 P. berghei 설치류 말라리아 기생충이 아니라 P. yoelii 설치류 말라리아 기생충을 사용하여 다루어졌다(11, 20-22). P. berghei 모델 시스템을 사용하여 조사된 종충이 A/J 마우스를 예방한다는 것을 확립했으며, 이것은 조사된 P. falciparum 감염된 모기에의 노출이 인체를 예방한다는 것을 증명하는 인체 연구를 이끌었다. 또, P. berghei 시스템을 사용하여 조사된 종충의 근육내, 피하 및 다른 비-정맥내 투여 경로가 마우스에서 충분히 예방적이지 못함을 학계에 증명했다(20-22). 사실 방사선 감독된 종충의 피하 투여 후 예방 효과는 0%였다[21]. A/J 마우스에서 주로 행해진 이들 연구는 조사된 종충을 실용적인 임상적으로 적합한 인체용 말라리아 백신으로서 개발하는 것이 가능하지 않다는 결론을 가져왔다. 1980년대 초반에서 중반에 Naval Medical Research Institute 실험실은 A/J 마우스에서 P. berghei를 사용한 연구를 BALB/c 마우스에서 P. yoelii를 사용한 연구로 전환했다. 이것은 Naval Medical Research Institute의 과학자들이, BALB/c 마우스에서 정맥내 투여된 P. yoelii가 정맥내 투여된 P. berghei보다 인체에서의 P. falciparum 감염에 대한 더 나은 전조가 된다고 믿었기 때문이었다. 이것은 대부분 정맥내 투여된 P. yoelii 종충이 정맥내 투여된 P. berghei 종충보다 마우스에 대해 어느 정도 더 감염성이기 때문이다. BALB/c 마우스에 정맥내 투여된 P. yoelii의 마우스에 대한 50% 감염 용량은 BALB/c 마우스에서 P. berghei의 50% 감염 용량보다 대략 100-1000배 더 낮고, P. berghei보다 원숭이의 P. knowlesi 및 사람의 P. falciparum과 같이, 영장류에서의 Plasmodium 종 기생충의 50% 감염 용량과 거의 확실히 더 비슷하다. Navy 그룹이 P. berghei 대신 P. yoelii를 사용하여 연구를 시작한지 대략 10년 후인 1990년대 초반에, Navy 그룹 과학자의 논문을 읽고 발표를 들은 후 Dr. Nussenzweig는 본 발명자들(SLH) 중 한명에게 Navy 실험실에서 사용된 P. yoelii 기생충을 요청했으며, 설치류 말라리아에 대한 뉴욕 대학에 있는 그녀의 그룹의 연구를 P. yoelii 모델 시스템으로 본질적으로 전환했고, 주로 BALB/c 마우스를 사용하여 연구했다.

P. yoelii을 사용한 모든 연구가 거의 확실히 상기 설명된 P. berghei 모델 시스템을 사용한 선행 연구 때문에 정맥내 주사나 모기에 물리는 것에 의한 투여에 집중되었다는 것에 주목하는 것이 중요하다[11, 20-22]. 더욱이, P. berghei에서의 연구 때문에, 아무도 P. yoelii 시스템에서 감독된 전체 종충 백신을 개발하기 위한 모델로서 이것을 사용하려는 시도를 실험하지 않았다. P. yoelii 설치류 말라리아 시스템에서 조사된 종충을 사용한 면역화는 Nussenzweig[22]에 의해 1980년에 설명된 것과 동일한 과학적 목적을 위해, 즉 예방적 면역성의 면역 메카니즘과 이들 예방적 면역반응의 기생충에 대한 항원 표적을 확인하기 위해서 과학자들에 의해 사용되었다. 이런 이유로, 종충의 정맥내 투여나 모기에 물리는 것만이 조사된 종충을 아주 효과적으로 만들어 100% 예방적 면역성을 제공한다고 25년 이상 알려져 왔기 때문에 이들이 이 시스템으로 연구한 과학자들에 의해 사용된 투여 경로였다. 조사된 종충을 임상적으로 실용적이고 허용되도록 만들 필요가 있는 다른 경로(예를 들어, 피하, 근육내, 피내 및 기타)는 사용되지 않았다.

본 발명자들은 비교적 단시간안에 감독된 종충으로 다수의 피험자의 백신접종을 허용하고, 감염된 모기에게 물리게 하는 이전 방법의 비현실성과 잠재적 위험성을 피하고, 이들 선행 방법들에 의해 달성된 것과 비슷한 예방을 제공하는, 말라리아에 대해 피험자를 면역화하는 방법을 발견했다.

더 구체적으로, 우리는 말라리아에 대한 효과적인 예방이, 제한은 없지만 피하, 근육내, 피내, 점막, 점막하, 표피 및 피부 경로를 포함하는 정맥내 주사 이외의 다른 경로에 의해 감독된 종충의 투약량을 피험자에게 비경구적으로 투여함으로써 얻어질 수 있음을 발견했다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 감독된 종충이 사람, 포유동물, 조류 및 다른 관련 종들에서 말라리아를 예방하는 백신으로서 사용되도록 그것을 실용적으로 만드는 감독된 Plasmo-dium 종 종충을 투여하는 새로운 임상적으로 적합하고 허용되는 방법을 제공한다.

이전의 표준 투여 방법인 감독된 종충의 정맥내 주사나 감염된 모기에게 물리게 하여 투여하는 것을 능가하는 본 발명의 중요한 개선점은 이전의 표준 방법과 비슷한 예방을 제공하는 임상적으로 실용적이고 안전한 백신 투여 방법을 허용한다는 것이다. 감염된 모기에게 물리게 하여 투여하는 것은 명백한 이유 때문에 백신으로서 절대 사용될 수 없으며, 정맥내 주사에 의한 투여는 특히 어린 아이들에서 기술적으로 어려운 투여 방법이고 혈류에 직접 주사하기 때문에 잠재적으로 위험하기 때문에 어떤 백신에 대해서도 일반적으로 사용되지 않는 방법이다.

본 발명에서, 비경구 투여는 피부(경피, 표피, 피내), 피하 조직(피하), 근육(근육내), 점막을 통해, 또는 점막하 조직에 투여될 수 있다. 바람직하게, 투여는 피하, 피내 또는 근육내 투여이다.

감독의 목표는 기생충을 약화시켜서 이들이 숙주 세포에 침입하여 새로운 단백질을 생산할 수 있을 만큼 충분히 생육할 수는 있지만 질환을 일으키는 복제하는 무성 혈액 단계 감염을 야기할 수는 없도록 하는 것이다. 감독은 다수의 방식으로 발생할 수 있다. 예를 들어, 이것은 기생충을 감독함으로써 발생할 수 있으며, 이로써 접종된 종충은 숙주 세포로 칩입하고 이들 세포에서 부분적으로 성장하고 파열되어 적혈구에 침입하여 질환을 일으키는 낭충을 방출할 수 있는 성숙한 간 단계 기생충과 비슷한 단계에 도달하기 전에 성장을 정지할 수 있다. 이런 종류의 감독된 기생충은 대사적으로 활성인 비-복제 기생충으로 명명될 수 있다. 또한, 감독은 숙주 세포에 침입하여 성숙한 간 단계 기생충과 비슷한 단계까지 정상적으로 성장하고 숙주 세포로부터 파열될 수 있지만, 질환을 일으키는데 필요한 지점까지 적혈구에서는 성장할 수 없는 기생충을 생산함으로써 발생할 수 있다. 이것은 또 숙주 세포에 침입하여 성숙한 간 단계 기생충과 비슷한 단계까지 정상적으로 성장하고 숙주 세포로부터 파열될 수 있지만, 유의한 질환을 일으키는데 필요한 지점까지 적혈구에서 성장할 수 없도록 기생충을 감독함으로써 발생할 수 있다. 이것은 또 종충이 부분적으로 성장하고 새로운 단백질을 생산하지만, 파열하여 적혈구에 침입하여 질환을 일으키는 낭충을 방출할 수 있는 성숙한 간 단계 기생충과 비슷한 단계에 도달하기 전에 성장을 정지하도록 기생충을 감독함으로써 발생할 수 있다.

수 많은 감독법이 사용될 수 있지만, 우리는 조사에 의한 감독이 현재 대사 활성인 비-복제 기생충을 생산하는데 바람직하다는 것을 발견했다. 종충의 감독은 다수의 용량 섭생을 사용하여 다수의 방식으로 달성될 수 있다. 감독은 종충이 여전히 모기에 있는 채로, 종충이 모기로부터 분리된 후 냉동보존과 같은 개입을 하기 전에, 또는 종충이 모기로부터 분리된 후 냉동보존과 같은 개입을 한 후에 달성될 수 있다. 이전 실험에 기초한 현재 조사 용량은 Plasmodium falciparum 종충에 대해 일반적으로 12,000Rads(cGy) 이상 23,000Rads(cGy) 미만이며, 가장 흔히 사용되는 것은 15,000Rads(cGy)이다. 당업자는 이 용량이 종에 따라 또는 균주에 따라 또는 종충을 조사하는데 사용된 장치 및 기술에 따라 변할 수 있음을 인정할 것이다. 당업자는, 제한은 없지만 감마선, x-선, 자외선 또는 전자, 양자와 같은 다른 서브아톰 입자를 포함하는 다수의 방법을 사용하여 또는 이들 방법의 조합을 사용하여 조사가 달성될 수 있음을 인정할 것이다.

앞으로 상기 문단에서 설명된 감독은 기생충을 백신 수용자에게 도입하기 전에 기생충을 유전조작함에 의해 달성될 수 있다.

또한, 감독은 기생충의 성장을 방지하여 이들이 간세포에서 복제할 수 있도록 하는 약물을 사용하여 종충에 노출되기 전 또는 후에 개체를 치료함으로써 달성될 수 있다.

또한, 감독은 기생충의 성장을 방지하여 이들이 적혈구에서 복제할 수 있도록 하는 약물을 사용하여 종충에 노출되기 전 또는 후에 개체를 치료함으로써 달성될 수 있다.

또한, 감독은 기생충을 감독하는 화학약품으로 종충을 처리함으로써 달성될 수 있다.

투여 수단은 모기에게 물리게 하거나 정맥내 투여하는 것 이외의 다른 어떤 접종 방법일 수 있으며, 제한은 없지만, 예를 들어 하나의 바늘과 주사기를 사용한 주사, 복수의 바늘과 주사기의 어레이, 하나 내지는 수백 수천개의 기공을 가진 마이크로니들, 탄도 기술에 의한 무바늘 주사 등이 있다. 또한, 감독된 종충은 경피 패치에 의해 또는 미립자 재료, 예를 들어 골드 비드 상에서 송달될 수 있다. 1회 접종으로도 어떤 수준의 예방을 달성하는 것이 가능하지만, 일련의 2회 이상의 접종이나 노출을 행하는 것이 바람직하다.

바람직한 접종물은 말라리아 면역화 유효량의 감독된 P. falciparum 또는 다른 Plasmodium 종 종충이다. 인체의 접종 당 용량은 약 1,000 내지 10,000,000 범위일 수 있으며, 이것은 의사의 평가나 감독된 종충 제조물의 면역원성/효능에 따라 변할 수 있다.

어떤 Plasmodium 종 기생충도, 심지어 유전적으로 변형된 것도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 기생충은 P. falciparum이다. 다른 구체예에서, 기생충은 예를 들어 P. vivax, P. ovale 또는 P. malariae이다. 다른 구체예에서는 이들 기생충의 혼합물일 수 있다. 다른 구체예에서, 이것은 Plasmodiium knowlesi, P. yoelii 또는 다른 Plasmodium 종 기생충일 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명은 주사기와 같은 송달 기구에 감독된 종충을 포함하는 제약 키트를 제공한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 바이알과 같은 용기 및 주사기와 바늘 같은 실제 송달 장치를 포함하는 키트를 제공하며, 제한은 없지만 바이알은 냉동된 감독된 종충을 함유하고, 바이알과 같은 용기는 감독된 종충을 희석할 수 있는 유체를 함유한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 바이알과 같은 용기 및 주사기와 바늘 같은 실제 송달 장치를 포함하는 키트를 제공하며, 제한은 없지만 바이알은 냉동건조(동결건조)된 감독된 종충을 함유하고, 바이알과 같은 용기는 감독된 종충을 희석할 수 있는 유체를 함유한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 바이알과 같은 용기 및 주사기와 바늘 같은 실제 송달 장치를 포함하는 키트를 제공하며, 제한은 없지만 바이알은 보존된 감독된 종충을 함유하고, 바이알과 같은 용기는 감독된 종충을 희석할 수 있는 유체를 함유한다.

더 이상으로, 본 발명은 중증 말라리아의 예방이나 감소를 위한 백신의 투여에서 여기 설명된 감독된 Plasmodium 종 종충의 비경구 투여의 사용을 제공한다.

본 발명은 말라리아-유발 병원균에 이전에 노출된 적이 없거나 또는 노출되었던 사람의 부분적, 증진된 또는 충분한 예방을 제공하지만 완전히 예방하지는 못한다. 또한, 본 발명은 말라리아 감염 발생 기회의 감소, 감염되었을 때 병이 될 기회의 감소, 감염되었을 때 열과 같은 병의 증상의 감소, 감염된 사람에서 기생충 농도의 감소, 또는 말라리아 기생충에 노출되었을 때 말라리아로 인한 사망률의 감소를 위해 사용될 수 있다. 많은 경우에는 부분적인 예방조차 유리하다. 예를 들어, 집단 중 약 30%에게 이들 이점 중 어느 것을 가져오는 백신 치료 전략은 공중의 건강과 공중에 속하는 개인의 건강에 상당한 충격을 줄 수 있다.

"백신"은 감염원 또는 그 성분을 함유하는 제조물을 포함하는 물질의 조성물이며, 이것은 면역반응을 자극하여 이 감염원으로 인한 병으로부터 사람을 예방하도록 투여된다. 치료용 백신은 감염된 후에 제공되며, 질환 진행의 감소 또는 정지를 의도한다. 예방용 백신은 초기 감염의 예방을 의도한다. 백신에 사용된 감염원은 전부 죽이거나(비활성) 살아 있는 채로 감독되거나(약화) 또는 인공적으로 제조될 수 있다. 더 이상으로, 백신은 희석제, 보조제, 담체, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 쉽게 이해될 것이다.

백신은 개별 성분으로 이루어질 수 있다. 본원에 사용된 "개별 성분"은 용어 백신이 실제로 피험자에게 개별 투여되는 2개의 분리된 백신을 포함하는 상황을 말한다. 이런 의미에서, 개별 성분으로 이루어진 백신은 개별 백신 성분을 포함하는 키트나 패키지로서 간주될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 문맥에서, 패키지는 감독된 종충 성분과 재조합 서브유닛 백신 성분을 포함하며, 이것은 제한은 없지만 재조합 단백질, 재조합 바이러스, 재조합 박테리아, 재조합 기생충, DNA 백신 또는 RNA 백신을 포함한다.

"효과적인" 면역화 용량은 1000 내지 10,000,000마리의 종충 범위일 수 있지만, 백신의 면역원성/효능이 증가된다면 감소될 수 있다. 백신은 여러번 투여될 수 있다. "효과적인" 접종 수는 1년에 1 내지 6회 범위일 수 있고, 다음 해에 "추가접종"될 수 있다.

전술한 일반적인 설명 및 그 다음의 상세한 설명은 모두 본 발명을 예시하고 설명하는 것일 뿐이며 청구된 본 발명을 제한하지 않는다. 더욱이, 본 발명은 설명된 특정한 구체예에 제한되지 않으며 그것은 물론 변할 수 있다. 더 나아가, 특정한 구체예를 설명하기 위해 사용된 용어는 본 발명을 제한하지 않으며 본 발명의 범위는 청구항에 의해서만 제한될 것이다.

수치 범위에 관해서, 특별한 언급이 없다면 본 발명은 하한 단위의 1/10까지 수치 범위의 상한과 하한 사이의 각 사이값을 포함한다. 더욱이, 본 발명은 어떤 다른 서술된 사이값을 포함한다. 더욱이, 서술된 범위로부터 특별히 제외되지 않는다면 본 발명은 또한 수치 범위의 상한과 하한 중 어느 것이나 둘 모두를 제외한 범위를 포함한다.

다른 정의가 없다면 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어의 의미는 본 발명이 속한 분야의 당업자에게 통상 이해되는 의미이다. 또한, 당업자는 여기 설명된 것들과 유사하거나 동등한 어떤 방법과 재료도 본 발명을 실시하거나 시험하는데 사용될 수 있음을 인정할 것이다. 더욱이, 여기 언급된 모든 간행물은 참고자료로 포함된다.

여기 설명되고 첨부된 청구항에 설명된 대로 단수 형태 "하나", "또는" 및 "그"는 다른 언급이 없다면 복수의 의미를 포함함을 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "감독된 종충 백신"에 대한 언급은 복수의 종충을 포함하며, "감염원"에 대한 언급은 하나 이상의 감염원 및 당업자에게 공지된 그의 동등물 등에 대한 언급을 포함한다.

더욱이, 명세서와 청구항에서 사용된 성분, 반응 조건, % 순도 등의 양을 표현하는 모든 숫자는 다른 언급이 없다면 용어 "약"에 의해 수식된다. 따라서, 명세서와 청구항에 제시된 수치 파라미터는 본 발명의 바람직한 특성에 따라 변할 수 있는 근사값이다. 적어도 청구항의 범위와 동등물에 대한 학설의 적용을 제한하려고 시도하지 않은 것처럼, 각 수치 파라미터는 통상의 라운딩 기술을 적용하여 적어도 보고된 유의한 숫자들에 속한 수에 비추어 구성되어야 한다. 그럼에도 불구하고, 특정한 실시예에서 제시된 수치 범위는 가능한 정확하게 보고된다. 그러나, 어떤 수치 범위도 원래는 실험 측정치의 표준편차로 인한 어떤 오차를 함유한다.

분명히 본 발명의 많은 변형 및 변화가 상기 교시에 비추어 가능하다. 따라서, 첨부된 청구항의 범위 내에서 본 발명은 구체적으로 설명된 것과는 다른 방식으로도 실시될 수 있음이 이해되어야 한다. 이들은 단지 본 발명을 예시하는 것이며 본 발명의 어떤 구체예의 다양한 유리한 특성을 개시하고 있다. 이들 실시예는 본 발명을 제한하지 않아야 한다.

실시예 1

종충의 피내, 근육내, 피하 및 정맥내 주사의 상대적 감염성

피내(ID), 근육내(IM), 피하(SQ) 또는 정맥내(IV) 송달된 새로 절제된 종충의 상대적 감염성을 조사하기 위한 연구를 수행했다. IV 투여가 감염을 달성하기 위한 가장 신뢰할 만한 방법으로 고려된 것을 주목한다.

방법: BALB/c 마우스를 ID, IM, SQ 또는 IV 투여에 의해 침샘으로부터 손으로 절제된 Plasmodium yoelii 종충으로 감염시켰다. 투여 후 1일에서 14일까지 두꺼운 혈액막을 평가함으로써 감염 수준을 측정했다. 결과를 표 I에 나타낸다.

이들 데이타는 피부, 근육 또는 피하 조직으로의 종충의 송달에 의해 BALB/c 마우스를 통상적으로 감염시키는 것이 가능함을 증명한다.

실시예 2

피내, 근육내, 피하 또는 정맥내 투여된 복수 용량 종충의 상대적 감염성

실시예 1에서 사용된 것보다 더 적은 수의 새로 절제된 종충을 가지고 상대적 감염성을 조사하기 위한 연구를 수행했다.

방법: BALB/c 마우스를 복수 경로[피내(ID), 근육내(IM), 피하(SQ) 또는 정맥내(IV)]에 의해 침샘으로부터 손으로 절제된 Plasmodium yoelii 종충으로 감염시켰다. 투여 후 14일까지 두꺼운 혈액막을 평가함으로써 감염을 측정했다. 결과를 표 II에 나타낸다.

이들 데이타는 ID, IM, 또는 SQ 경로에 의한 침샘으로부터 손으로 절제된 적은 수의 Plasmodium yoelii 종충의 투여가 IV 경로에 의한 것과 거의 동일한 효능으로 마우스를 감염시켰음을 나타낸다. 우리는 특정한 방법에 의해 투여되었을 때 조사되지 않은 종충의 감염성과 그 방법에 의해 조사되고 송달되었을 때 예방적 면역성을 도출하는 이들 종충의 능력간의 직접적인 상관성/관련성을 이론화했기 때문에, 이들 데이타는 표준 IV 경로 뿐만 아니라 ID, IM 및 SQ 경로에 의해 성공적으로 면역화하는 것이 가능함을 시사한다.

실시예 3

피내, 근육내 또는 정맥내 경로에 의해 투여된 조사된 종충의 단일 용량 예방 효과

단일 투약된 150,000마리의 방사선 감독된 종충을 사용한 면역화에 의해 제공된 상대적 예방을 조사하기 위한 연구를 수행했다.

방법: BALB/c 마우스를 ID, IM 또는 IV 경로에 의해 단일 용량의 150,000마리의 방사선 감독된(10,000Rads/cGy) P. yoelii 종충으로 접종했다. 면역화를 위한 종충은 밀도 구배 원심분리에 의해 얻었다. 접종된 마우스를 10일 후에 침샘으로부터 손으로 절제된 100마리의 Plasmodium yoelii 종충을 주사하여 시험감염시켰다. 두꺼운 혈액 도말표본으로 시험감염 후 14일까지 감염을 평가했다. 1+(거의 검출할 수 없음)에서 4+(심한 감염)의 규모로 감염 수준을 평가했다. 대조군은 면역화 접종을 받지 않았다. 결과를 표 III에 나타낸다.

이들 데이타는 ID 및 IM 경로에 의한 조사된 종충의 단일 용량의 투여가 IV 경로에 의한 조사된 종충의 단일 용량 투여 후에 보여진 예방과 비슷한 종충 시험감염에 대한 예방을 제공하는 예방적 면역반응을 도출했음을 증명한다. 이 발견은 상기 실시예 1과 2에서 증명된 감염성에 의해 예측된다. IM 및 ID 방법이 많은 수의 사람들 및 많은 수의 투여에 더 사용하기 쉬우므로, 본 발명은 지금까지 증명된 것보다 더 용이한 방식으로 감독된 종충을 사용한 상당한 집단의 효과적인 면역화를 가능하게 할 것이다. 사실 이것은 처음으로 실용적인 감독된 종충 백신을 착안하는 것을 가능하게 한다. 단일 용량의 조사된 종충의 투여는 시험감염된 마우스에서 기생충 부담의 극적인 감소를 가져왔고, 많은 말라리아 백신학자들에 의해 생각된 효과는 수용자들에서 말라리아의 질병률 및 사망률을 상당히 감소시키는데 잠재적으로 충분했다. 그러나, 이것은 감염을 완전히 예방하지는 못했다.

실시예 4

피하 또는 정맥내 경로에 의해 투여된 조사된 종충의 3회 용량 예방 효과

ID 또는 IV 경로에 의한 방사선 감독된 Plasmodium yoelii 종충의 3회 용량의 표준 섭생을 사용한 면역화에 의해 제공된 상대적 예방을 조사하기 위한 연구를 수행했다: 이 섭생은 종충 시험감염의 완벽한 예방을 도출할 것으로 기대된다.

방법: 50,000마리의 방사선 감독된(10,000Rads/cGy) Plasmodium yoelii의 제 1 용량을 SQ 또는 IV 경로에 의해 BALB/c 마우스를 접종했다. 이 마우스는 30,000마리의 조사된 종충으로 2회의 추가접종되었다(3회 용량으로 나눠진 총 110,000마리의 종충). 면역화를 위한 종충은 밀도 구배 원심분리에 의해 얻었다. 마지막 추가접종하고 14일 후에 침샘으로부터 손으로 절제된 100마리의 Plasmodium yoelii 종충으로 접종된 마우스를 시험감염시켰다. 시험감염 후 14일까지 두꺼운 혈액 도말표본으로 감염을 평가했다. 결과를 표 IV에 나타낸다.

표 IV의 데이타는 종충의 피하 투여(SQ)에 의해 감염에 대한 100% 예방을 달성할 수 있음을 명백히 증명한다. 이 실험에서 최초로 증명되었지만 이들 결과는 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3에 나타낸 연구의 결과에 의해 예측된 것이었다. SQ, ID 및 IM 경로에 의한 감염성에서의 상대성을 본다면(실시예 2), 이들 경로에 의한 종충의 투여가 비슷한 예방을 제공하는 것이 분명한 것 같다. 실시예 4에 보고된 100% 예방은 이전에 보고된 방사선 조사된 P. berghei 종충을 사용한 A/J 마우스의 피하 면역화에서의 0% 예방과 뚜렷이 대조된다[21]. 상기 서술된 대로, 우리는 우리의 발견이, P. yoelii-BALB/c 모델이 P. berghei-A/J 마우스 모델 시스템보다 사람에서의 P. falciparum에 더 적합하다는 우리의 인식에 의해서 가능했음을 믿는다.

실시예 5

정맥내 경로에 의해 투여되었을 때 침샘의 손 절제에 의한 것과 비교하여 밀도 구배 원심분리에 의해 분리된 종충의 감염성

실시예 3 및 4에서 마우스는 밀도 구배 원심분리에 의해 분리된 조사된 종충의 투여에 의해 면역화되었다. 우리는 모기의 머리와 흉강의 밀도 구배 원심분리에 의해 분리된 종충이 침샘으로부터 손으로 절제된 종충보다 덜 감염성일 거라고 가정했다. 만일 이 경우 종충의 감염성과 상기 서술된 대로 예방적 면역성을 도출하는 이들의 능력 사이에 직접적인 관련성이 있다면, 예방적 면역성을 달성하기 위해서 밀도 구배 원심분리에 의해 분리된 종충보다 침샘으로부터 손으로 절제된 종충이 훨씬 더 적게 필요할 것이다. 따라서, 본 발명자들은 밀도 구배 원심분리에 의해 분리된 P. yoelii 종충과 침샘의 손 절제에 의해 분리된 종충의 감염성을 비교하는 실험을 최초로 수행했다.

방법: P. yoelii 종충을 Anopheles stephensi 모기로부터 밀도 구배 원심분리 또는 침샘의 손 절제에 의해 분리했다. 종충의 수를 다르게 하면서 정맥내 주사에 의해 BALB/c 마우스를 접종했다. 두꺼운 혈액 도말표본으로 시험감염 후 14일까지 감염을 평가했다. 감염은 존재하거나 부재하는 것으로 평가되었다. 결과를 표 V에 나타낸다.

표 V의 데이타는 침샘으로부터 손으로 절제된 종충이 밀도 구배 원심분리에 의해 분리된 종충보다 더 감염성임을 분명이 증명한다. 50% 감염 용량은 밀도 구배 원심분리에 의해 분리된 종충이 80배 이상 더 크다. 만일 많은 수의 감독된 종충의 예방 효과가 이들이 감독되기 전의 그 수의 종충의 감염성과 직접 관련된다는 가설이 정확하다면, 이들 데이타는 예방을 달성하는데 필요한 감독된 종충의 수는, P. yoelii-BALB/c 모델 시스템에서 면역화 연구를 위해 종충을 분리하는 표준 방식인 밀도 구배 원심분리에 의해 분리된 종충과 비교하여 침샘의 손 절제에 의해 분리된 종충이 실질적으로 더 적다는 것을 나타낸다.

실시예 6

정맥내 경로에 의해 투여되었을 때 손 절제에 의한 것과 비교하여 밀도 구배 원심분리에 의해 분리된 종충의 예방 효과

실시예 5의 감염성 실험 결과에 기초하여 예방 효과 실험을 설계했다. 이전의 경험을 토대로 90%의 예방 효과를 제공한다고 알려진 밀도 구배 원심분리에 의해 분리된 조사된 종충의 어떤 섭생의 예방 효과를, 침샘의 손 절제에 의해 분리된 훨씬 더 적은 용량의 종충이 예방적 면역성을 도출하는 능력과 비교했다.

방법: P. yoelii로 감염된 Anopheles stephensi 모기를 10,000Rads/cGy로 조사했다. 종충은 밀도 구배 원심분리 또는 침샘의 손 절제에 의해 분리되었다. 3회 용량의 조사된 P. yoelii를 2주 간격으로 정맥내 주사에 의해 BALB/c 마우스를 접종했다. 1번 그룹은 밀도 구배 원심분리에 의해 분리된 조사된 종충을 받았다(1회, 2회 및 3회 용량은 각각 24,000, 8,000 및 8,000). 2번에서 5번 그룹은 침샘의 손 절제에 의해 분리된 종충을 받았다. 6번 그룹은 면역화되지 않았다. 1번에서 6번 그룹의 마우스를 3번째 면역화 투약 14일 후에 침샘의 손 절제에 의해 분리된 100마리의 P. yoelii 종충으로 시험감염시켰다. 두꺼운 혈액 도말표본으로 시험감염 후 14일까지 감염을 평가했다. 감염은 존재하거나 부재하는 것으로 평가되었다. 결과를 표 VI에 나타낸다.

표 VI의 데이타는 밀도 구배 원심분리에 의해 분리된 총 40,000마리의 조사된 P. yoelii 종충(24,000, 8,000, 8,000)으로 면역화된 마우스가 90%의 예방 효과를 가졌음을 증명한다. 침샘의 손 절제에 의해 분리된 총 7500마리의 조사된 종충(4500, 1500, 1500)으로 면역화된 마우스는 100% 예방효과를 가졌다. 실시예 5의 데이타와 취합하여 보면 이들 데이타는 종충 제조물의 감염성과 이들이 도출할 수 있는 예방 효과 사이에 직접적인 관련성이 있음을 나타낸다. 사실 어째서 조사된 손 절제된 종충의 용량이 더 적을 수 있는지, 그리고 90%-100%의 예방 효과를 달성할 수 있는지는 아직 분명하지 않다. 이들 데이타는 IV, ID, IM, 또는 SQ 경로에 상관 없이 적은 용량의 조사된 종충을 사용한 면역화가 예방 효과를 가져올 것임을 나타낸다.

또한, 이들 데이타는 일부는 P. yoelii 시스템에서 종충의 감염성이 훨씬 더 높다는 이유 때문에 P. berghei-A/J 마우스 모델 시스템보다 P. yoelii-BALB/c 모델 시스템이 P. falciparum을 가진 사람에서 어떤 일이 일어날지를 더 가깝게 예측한다는 가설을 지지한다. 사람은 1000마리의 조사된 P. falciparum 감염된 모기에게 물림으로써 충분히 면역화될 수 있다[34]. 모기는 공급되었을 때 10마리 이하의 종충을 접종할 것으로 생각된다[51]. 만일 이 경우라면 충분히 면역화되고 예방된 사람은 아마 10,000마리의 종충으로 접종될 것이다[50]. 반면, P. berghei-A/J 마우스 모델 시스템에서는 정맥내 투여에 의한 예방을 달성하기 위해 손 절제된 침샘으로부터 분리된 100,000마리 이상의 종충이 사용되었으며, 이 면역화 용량 섭생은 피하 투여되었을 때는 예방을 제공하지 않는다. 실시예 6에서는 침샘의 손 절제에 의해 분리된 7500마리의 P. yoelii 종충의 BALB/c 마우스에의 투여가 100% 예방을 제공했음이 증명된다. 감독된 P. yoelii 종충으로 면역화된 BALB/c 마우스와 감독된 P. falciparum 종충으로 면역화된 사람은 유사한 수의 감독된 종충에 노출된 후 예방되고, P. berghei 종충으로 면역화된 A/J 마우스는 10배 이상의 종충으로 면역화된다는 사실은, P. berghei-A/J 모델 시스템보다 P. yoelii-BALB/c 모델이 사람에서 어떤 일이 일어나는지 더 잘 예측할 것이라는 우리의 가설을 지지한다.

결론

P. falciparum과 같은 감염에 대한 효과적이고 지속가능한 백신을 개발하는 과정은 예상했던 것보다 더 느리고 더 어렵고 복잡한 것으로 증명되었다. 아직 인가된 말라리아 백신은 없지만, 이제 1000마리 이상의 감염된 모기에게 물리게 함으로써 방사선 감독된 P. falciparum 종충으로 면역화하는 것이, 전세계로부터의 P. falciparum의 복수의 분리주에 대해 면역화된 개체의 90% 이상에서 적어도 10.5개월 동안 무균의 예방적 면역성을 제공한다는 것을 알게 되었다. 이 면역화 섭생을 인체용 백신으로 만드는데 있어서 주요 장애물 중 하나는 감염된 모기에게 물리게 하는 것에 의해서는 다수의 개체에 맞는 조절된 백신을 제공하는 것이 가능하지 않다는 사실이었다. 더욱이, 많은 과학자들에 의한 연구는, 표준 투여 방법보다 기술적으로 어렵고 잠재적으로 더 위험하기 때문에 백신에서는 일반적으로 사용되지 않는 투여 방법인 감독된 종충의 정맥내 투여에 의해서 마우스 모델 시스템에서만 우수한 예방이 달성될 수 있음을 나타냈다. 피하 및 근육내 접종과 같은 사람에서 면역화를 위해 종래에 사용되던 투여 방법이 이 마우스 모델 시스템에서는 충분한 예방적 면역성을 가져오지 않았기 때문에, 인체용 감독된 종충 백신을 개발하는 것이 가능하다는 것은 지금까지 고려되지 않았다. 이전 연구자들에 의해 사용된 것과는 다른 모델 시스템을 이용하여 우리는 높은 수준의 예방을 가져오며 실용적이고 안전하며 허용되는 종충 투여 방법을 발견했다. 이 발견은 실용적이고 다량으로 송달되며 감독된 종충 말라리아 백신을 개발하고 제공하기 위한 감독된 종충을 투여하는 이 방법의 이용을 용이하게 할 것이다.

다음의 간행물들 및 본 출원에서 언급된 것들이 참고자료로서 구체적으로 본원에 포함된다.

여기 개시된 명세서와 본 발명의 실시를 고려하면 본 발명의 다른 구체예들이 당업자에게 자명할 것이다. 명세서 및 실시예는 단지 예로서만 고려되도록 의도되며, 본 발명의 실제 정신 및 범위는 다음의 청구항에 의해 나타낸다.

Claims (3)

1. 감독된 종충의 초기 백신을 투여함으로써 사람 또는 동물에서 면역반응을 개시하여 감염성 Plasmodium 종 기생충에 대한 완전한 또는 부분적인 예방적 면역성을 제공하는 것을 포함하는 하나 이상의 말라리아-유발 병원균에 대한 사람 및 동물의 면역화 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 면역반응은 감독된 종충의 1회 이상의 추가 백신 용량을 후속 투여하여 수용자에게 감염성 Plasmodium 종 기생충에 대한 증진된 또는 연장된 예방적 면역반응을 제공함으로써 촉진되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 감독된 종충의 시동 용량 및 추가접종 용량(들)은 수용자의 피하, 진피, 근육, 표피, 점막, 점막하 또는 피부 조직 안으로 또는 위로 송달되는 것을 특징으로 하는 방법.