NO175782B - Fremgangsmåte til fremstilling og rensing av amfifile proteiner i aggregatform produsert i celler og deres anvendelse - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til isolering og rensing av oppløselige, amfifile proteiner som er fremstilt i celler og deres anvendelse.

Alle fysiologisk aktive celler produserer proteiner som de trenger for opprettholdelse av sine livsfunksjoner. De syntetiserte proteiner har forskjellige oppgaver. Noen virker som enzymer, dvs. de katalyserer stoffskiftereaksjonen i cellen. Andre tjener til å avstemme livsløpet av den organisme som cellen tilhører, og atter andre danner cellestrukturen. Proteiner som fremstilles i disse celler, kan likevel ha antigene virkninger på andre organismer, dvs. de induserer immunreaksjoner i disse organismer. Også vira er levende vesener som f.eks. i sin kapsel inneholder proteiner som kan virke som antigener.

Anvisningene for proteinsyntesen befinner seg i cellenes gener, som også kan anses som arvestoffets funksjonelle enheter. Det er idag en godt behersket teknikk å forandre den genetiske utrustning av en celle, f.eks. en bakterie, idet man overfører et gen f.eks. fra en dyre- eller menneske-celle til en annen celle, fortrinnsvis en bakteriecelle. Bakterien syntetiserer da også det protein som det fremmede, innføyde gen koder for. Et av de mest kjente eksempler er det i den menneskelige bukspytt-kjertel produserte insulin, hvis genetiske informasjon ble overført til bakterien Escherichia coli.

Både de naturlige proteiner og de proteiner som fremstilles ved geneteknisk manipulering av celler, blir enten ført ut av cellen gjennom et overløp eller hoper seg opp i cellen og blir deretter ved kjente metoder isolert og eventuelt oppløst etter at cellen er brutt opp. For disse fremgangsmåter blir der som regel etter bestemte fraksjonerings- og renseforbehandlings-trinn anvendt detergenter, som må avstemmes meget spesifikt for isolering og rensing av de enkelte proteiner. Det er nå som før et problem i henhold til teknikkens stand å finne de riktige detergenter for isolering og rensing av de ønskede proteiner. Det var derfor en hensikt med oppfinnelsen å tilveiebringe fremgangsmåter ved hvis hjelp proteiner fremstilt i fysiologisk aktive celler kan isoleres og renses, og herunder opprettholde eller forbedre proteinenes biologiske aktivitet.

Denne hensikt ble oppnådd ved at der ble skaffet proteiner som foreligger i en første, tilnærmet kuleformet, eventuelt elektronoptisk synlig, aggregert, elektroforetisk ikke-mobil form I i fravær av detergenter, i en annen, løs, eventuelt elektronoptisk synlig, aggregert, elektroforetisk ikke-mobil form II i nærvær av en første, ikke-denaturerende detergent, og i en elektronoptisk ikke-synlig, elektroforetisk mobil form III i nærvær av en annen, ikke-denaturerende detergent, og at de nevnte former I,II og III er reversibelt overførbare i hverandre avhengig av nærværet eller fraværet av de nevnte detergenter.

Ved isoleringsfremgangsmåter for proteiner har det overraskende vist seg at amfifile proteiner ved anvendelse av ikke-denaturerende detergenter ikke foreligger i sin monomere form, men i aggregerte former, som helt overraskende oppviser fordelaktige egenskaper. I fravær av en ikke-denaturerende detergent oppviser de aggregerte former en kompakt struktur som her skal betegnes som aggregert form I. I denne form er partikkelen best egnet til fjerning av forurensninger som setter seg på overflaten av disse partikler. Den kompakte form av partiklene sikrer herunder en viss beskyttelse mot denaturering av de aktive sentra, det være seg enzymatisk aktive sentra eller epitoper som forårsaker immunreaksjoner. Likevel er også de kompakte partikler bioaktive i den aggregerte form I, men ikke elektroforetisk mobile.

I nærvær av en ikke-denaturerende detergent lar den kompakte kuleformede form I av det aggregerte protein seg overføre i en mer eller mindre luftig form, som under en isolerings- og renseprosess oppviser den fordel at forurensninger som gjennom overgangen av form I til form II blir lettere tilgjengelig, kan fjernes. I form II av de aggregerte proteiner blir overraskende proteinenes biologiske aktivitet forsterket. Det viser seg for eksempel at immunogenisiteten av det isolerte protein øker, når den biologiske egenskap av de isolerte proteiner ligger i proteinenes immuniserende antigenisitet. De biologisk aktive proteiner eller eventuelt også deler av disse proteiner, som oppviser en biologisk aktivitet, er således aktive, særlig i den utvidede form, og egner seg i denne skylignende form av de ovenfor angitte grunner særlig godt til rensing av proteinet for bestanddeler som er innesluttet i den aggregerte form.

Proteinet i den aggregerte form II er likeledes elektroforetisk ikke-mobilt.

Det spesielt overraskende ved de partikkelformede aggregerte proteiner som fås fremstilt ifølge oppfinnelsen, er det forhold at de aggregerte former I og II er reversibelt overførbare i hverandre, avhengig av fraværet eller nærværet av en første ikke-denaturerende detergent. Med de beskrevne partikkelformede aggregerte proteiner blir således et meget godt egnet kompleks gjort tilgjengelig, som på grunn av reversibiliteten av overføringen av de forskjellige former I og II av disse aggregater i hverandre i betraktning av en enklere renseprosess, en forbedret lagringsmulighet så vel som en øket virksomhet av den biologiske aktivitet av de isolerte proteiner oppviser enorme fordeler.

Når en annen ikke-denaturerende detergent tilsettes kontrollert, kan proteinet overføres fra den aggregerte form II til den monomere form III av proteinene, samtidig som også denne tilstand fullstendig uventet er reversibel når den annen, ikke-denaturerende detergent fjernes. Avhengig av henholdsvis fraværet eller nærværet av de ikke-denaturerende detergenter kan proteiner som skal isoleres fra fysiologisk aktive celler, kontrollert og manipulerbart reversibelt overføres til en hvilken som helst ønsket form som er optimal for det tilsiktede fremgangsmåtetrinn resp. anvendelsesmåte.

For lagringen resp. en dosert, eventuelt ønsket, redusert biologisk aktivitet av de isolerte proteiner foretrekkes en aggregert form I med tilnærmet kuleformet struktur. Kuleformen beskytter videre eventuelt i rengjøringstrinn mulige sensitive aktive sentre mot mulige denaturerende behandlingstrinn.

Den aggregerte form II vil alt etter behandlingens varighet og konsentrasjonen av en ikke-denaturerende detergent oppvise en tilnærmet skylignende (luftig) struktur. Alt etter ut-foldingsgraden kan proteinet underkastes ytterligere rensetrinn for fjerning av slike forurensninger som kan stamme fra f.eks. de vertsceller og vektorsystemer som anvendes ved fremstillingen av proteinene. Den biologiske aktivitet av proteinene blir økt.

Så vel den kuleformede aggregerte form I som den skylignende aggregerte form II kan gjøres elektronoptisk synlig når det produserte enkeltprotein oppviser en molekylvekt som utgjør minst 10 000 Dalton. Når det imidlertid f.eks. ved genetisk manipulasjon, bare blir uttrykt bestemte antigen-determinanter som utgjør proteiner med få aminosyrer, kan også de aggregerte, mer proteinholdige former I og II ligge under hva som er elektronoptisk synlig.

Fortrinnsvis foreligger de i form I og II aggregerte, elektroforetisk ikke-mobile proteiner i en renhet på 8 0%, fortrinnsvis 98%, dvs. at de aggregerte former I og II inneholder de ønskede proteiner i forholdsmessig homogen ansamling.

Aggregeringen av proteinene inne i cellene finner fortrinnsvis sted når proteinene er ekspresjonsprodukter av genetisk manipulerte celler og særlig når produktene overproduseres i disse celler med kjente metoder. Overproduksjonen kan finne sted ved at enten flere vektorer som inneholder det gen som uttrykker det ønskede protein, foreligger, eller ved at særlig sterke promotorer er koblet foran de tilsvarende gener. Når det med hensyn til de uttrykte proteiner dreier seg om slike som er oppløselige i cellen, agglomererer disse til de beskrevne kuleformede partikler.

De proteiner som uttrykkes av de genetisk manipulerte vertsceller, oppviser fortrinnsvis en antigenfunksjon. Disse proteiner er foretrukne prosjekter for den genmanipulerte ekspresjon av proteiner når levende vaksiner skal tilveiebringes resp. en tilsvarende aktiv immunisering via antigenene er tilsiktet. Det dreier seg herunder særlig om kappeproteiner hos patogene vira, det være seg humanpatogene eller dyrepatogene vira.

Fortrinnsvis dreier det seg med hensyn til de isolerte proteiner om glykoproteiner, f.eks. glykoproteinet GP 160 av HIV eller et overflateantigen av hepatitt-B-viruset. Genene for ekspresjon av de respektive proteiner kan f.eks. uttrykkes gjennom en Vaccinia-virusvektor i et pattedyrcellesystem. Fremgangsmåten til innsetting av spesifike gener i Vaccinia-virusvektorer er beskrevet av Mackett et al. (J. Virol, 49, s. 857-846, 1984). På en måte som er i og for seg kjent, blir det fremmede gen først satt inn i en plasmidvektor på nedstrømsiden av et Vaccinia-transkripsjonskontrollelement (7,5 K-promotor). Dette kimære gen i det rekombinante plasmid flankeres av Vaccinia-sekvenser som koder for det virale tymidinkinasegen (TK). Plasmidet blir deretter innført i celler, som tidligere var blitt infisert med en vill-type-Vaccinia-virus (stamme WR). Rekombinasjonen finner deretter sted i TK-området, som er homologt for såvel det virale DNA som plasmidet og tillater innsetning av det kimære gen i Vaccinia-virusets genom. Det rekombinante virus som fås på denne måte, oppviser fenotypen TK~. Det er således ikke lenger i stand til å produsere thymidinkinase og vokser i selektivmedium som inneholder 5-bromdeoksyuridin. På denne måte kan en fremstille rekombinante Vaccinia-virus som hver for seg bærer gener som produserer proteinene, eventuelt i over-produksjon, som deretter i de beskrevne pattedyrceller agglomererer til de beskrevne aggregerte former som inneholder en rekke av de enkelte proteiner. Liknende ekspresjonssystemer er kjent for andre antigene proteiner. F.eks. er der blitt konstruert enkelte Vaccinia-virus-rekombinanter som koder for overflateantigenene av hepatitt-B-virus. For dette formål ble hepatitt-B-virus-overflateantigenene uttrykt under de regulato-riske mekanismer av Vaccinia-viruset, idet der ble anvendt et antall Vaccinia-spesifikke promotorer med det mål å øke ekspresjonsnivået for de fremmede gener. Man har videre fremstilt Vaccinia-virus-rekombinanter som uttrykker mer enn et hepatitt-B-virusgen.

Generelt skal der på dette punkt, med hensyn til fremstilling av rekombinante ekspresjonssystemer for geneteknisk fremstilling av ønskede proteiner, henvises til Winnacker, E.L. (Gene und Klone, eine Einfuhrung in die Gentechnologie, VCH-Ver-lagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1984).

Den biologiske funksjon av de proteiner som er uttrykt i de nevnte celler, og som kan foreligge i aggregerte former som kan inneholde mange proteiner, kan fortrinnsvis være en enzymatisk funksjon. Særlig i den aggregerte form II blir der observert en forsterket enzymatisk funksjon, som kan henge sammen med at de enzymatisk aktive sentre i den luftige, aggregerte form II ligger fritt, men at der likevel foreligger en romlig sammenheng mellom alle enzymatisk aktive proteiner, slik at sannsyneligheten for sammentreff mellom de produkter som skal omsettes ved den enzymatiske aktivitet av proteinene med de enzymatisk aktive områder økes.

Funksjonen til ovennevnte protein kan belyses ved det enzymatiske protein for blodkoaguleringsfaktor VIII. Den genetekniske fremstilling av F VIII er beskrevet flere ganger i teknikkens stand. De i partikkelform agglomererte proteiner kan fortrinnsvis bindes til en ytterligere substans, særlig et høymolekylært protein, ved konjugasjon, hvorved en forbedring med hensyn til stabilitet, aktivitet, in-vivo-gjenvinning og biologisk halveringstid for proteinet oppnås. Et eksempel på en slik konjugasjon mellom ønskede proteiner og ytterligere høymolekylære substanser er fremstillingen av blodkoaguleringsfaktor VIII med den fra Willebrands faktor.

De i partikkelform aggregerte proteiner foreligger fortrinnsvis

i eukaryote celler, særlig dyreceller eller menneskeceller.

I denne forbindelse er det særlig foretrukket å uttrykke de ønskede proteiner i primære cellekulturer eller Veroceller utvunnet fra cellelinjer, CHO-celler eller primære kylling-embryoblastceller. De nevnte vertsceller foretrekkes som ekspresjonssystemer, da her allerede de modifikasjoner som finner sted etter translasjonen, foreligger på den måte som er ønskelig i sluttproduktet, f.eks. glykosyleringen av de uttrykte proteiner. Disse glykosylerte proteiner klumper seg deretter sammen til partikkelform som kan anta den beskrevne sfæriske form I resp. den luftige form II etter behandling med en første, ikke-denaturerende detergent og etter behandling med en annen ikke-denaturerende detergent kan overføres i en tredje aggregert form III.

Veroceller er særlig foretrukket til fremstilling av glykoprotein 160 av HIV, slik det er beskrevet ovenfor. Dette cellesystem ble valgt, da det har en forholdsvis hurtig vekstrate og er særlig godt tilpasset fremstillingen av menneskelige vaksiner. Infeksjonen av Verocellene med et rekombinant Vaccinia-virus, som inneholder et gen som uttrykker det ønskede protein som skal isoleres i henhold til fremgangsmåten, resulterer i normal syntese av det ønskede protein, glykosylering av dette samt eventuelle viderebehandlingstrinn. Ved anvendelse av et dobbelt-infeksjonssystem med to rekombinanter kan mengden av det ønskede protein økes betraktelig. Dette system inneholder en rekombinant som uttrykker polymera-sen av fag T7 under styring av p7.5-promotoren av Vaccinia. Denne rekombinant blir infisert sammen med en rekombinant som inneholder T7-promotoren og glykoprotein-160-genet av HIV. T7-promotoren er en meget sterk promotor og sikrer et høyt ekspresjonsnivå, f.eks. en ca. 10-dobbelt mengde av det ønskede protein.

En alminnelig oversikt over de tallrike muligheter for å anvende bestemte vektorer for rekombinasjonen av de ønskede gener og formere disse vektorer i ønskede celler og fremstille de av fremmedgenene uttrykte proteiner, finnes eksempelvis i Genetic Engineering, 3, Academic Press, redigert av Robert Williamson, (1982) eller i Spektrum der Wissenschaft, Industrielle Mikrobiologie (1985).

De ikke-denaturerende detergenter, hvis fravær eller nærvær i vesentlig grad virker inn på forekomsten av de fra de fysologiske aktive celler isolerte proteiner i innbyrdes forskjellige aggregerte former eller i monomer form, er fortrinnsvis en bestemt ionisk, ikke-ionisk eller zwitterionisk detergent. Det er innen proteinkjemien resp. ved proteinrense-metoder et kjent problem at valget av detergent for gjenvinnin-gen av det ønskede protein i på den ene side meget ren form og på den andre side i biologisk aktiv tilstand, hver gang represenrere en utfordring. Det har nå overraskende vist seg at de ovennevnte krav til en proteinrensemetode kan tilfredsstil-les fullt ut ved anvendelse av ikke-denaturerende detergenter av bestemt ionisk, ikke-ionisk eller zwitterionisk art, samtidig som dessuten den uventede konfigurasjonsendring av de sammenhopede proteiner som foreligger i disse proteinproduse-rende celler, i forbløffende grad optimalt oppfyller de nevnte krav. Som tidligere nevnt blir særlig i den aggregerte form II, det vil si den luftige eller fnokklignende konfigurasjon, den i det enkelte protein iboende biologiske aktivitet enten denne er av enzymatisk eller antigen natur, tydelig forsterket.

En foretrukket, ikke-ionisk detergent er oktylglykosid eller et av derivatene av denne detergent, fortrinnsvis i konsentrasjoner på 0,25-5%, særlig 1%.

Likeså foretrukket er anvendelse av en detergent av saltet av gallesyre samt et av dens derivater, fortrinnsvis detergenten deoksycholat (DOC), som er særlig egnet i sammenheng med isoleringen og rensingen av den kuleformede konfigurasjon av mange proteiner av glykoprotein 160 av HIV, både når dette renses under anvendelse av det ovenfor angitte detergent i konsentrasjoner på 0,25-5%, fortrinnsvis 1%, og også når deoksycholatet benyttes ved anvendelse av GP 160, f.eks. i

forbindelse med aluminiumhydroksid.

Det ikke-denaturerende detergent som det foretrekkes å anvende for overføringen av de aggregerte proteiner fra form II til den monomere form III, er en zwitterionisk detergent fra ZWITTERGENT-rekken, likeledes i konsentrasjoner på 0,25-5%, fortrinnsvis 1%. ZWITTERGENT<R->detergenter er syntetiske zwitterioniske detergenter som er blitt kjent som sulfobetainer og har følgende generelle strukturformel:

Proteinene i den aggregerte form I egner seg, som tidligere angitt, særlig godt for den stabile lagring av proteinene. De kan imidlertid også anvendes for de ønskede biokjemiske omsetninger eller reaksjoner, da også de sammenhopede proteiner i den aggregerte form I oppviser biologisk aktivitet.

Anvendelsen av proteinene i den aggregerte form II finner fortrinnsvis sted for å forsterke proteinets biologiske funksjon.

En hvilken som helst aggregert form av proteinene egner seg for en terapeutisk, profylaktisk eller diagnostisk anvendelse, både i de beskrevne kuleformede, fnokkaktige eller monomere former og i de ovenfor beskrevne konjugerte former med ytterligere høymolekylære proteiner.

En anvendelse av det aggregerte protein ligger i å oppnå

stoffer til kvalitativ påvisning og kvantitativ bestemmelse av slike stoffer i kroppsvæsker.

Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til isolering og rensing av en rekke proteiner bestående partikler, som i avhengighet av nærvær eller fravær av en ikke-denaturerende detergent foreligger i morfologisk forskjellige konfigura-sjoner, som de kan overføres reversibelt mellom, som produseres i celler, fortrinnsvis genetisk manipulerte celler, idet de på overflaten forekommende forurensninger av de proteiner som foreligger i den første aggregerte form I, i et første rensetrinn fjernes, proteinene deretter ved anvendelse av et ikke-denaturerende detergent overføres i en annen aggregert form II, de i denne aggregerte form II tilgjengelig forurensninger fjernes i et annet rensetrinn, proteinene ved tilsetning av en annen, ikke-denaturerende detergent gjøres overførbare i en monomer form III og proteinene ved fjerning av de ikke-denaturerende detergenter igjen blir reversibelt overførbare i de aggregerte former I og II.

De enorme fordeler ved denne fremgangsmåte er i det vesentlige drøftet ovenfor og ligger i den reversible overførbarhet av de forskjellige aggregerte former av proteinet i hverandre.

Den tilnærmet kuleformede form I tillater som følge av den kompakte anordning av proteinene for eksempel en lettere første rensing av for eksempel mediebestanddeler fra overflaten av de tilnærmet kuleformede proteinagglomerater. Når deretter det annet rensetrinn på forurensninger som i den aggregerte form I er særdeles lett tilgjengelige som følge av utvidelser, er avsluttet, kan man igjen reversibelt fremstille den aggregerte form I ved uttrekning av den ikke-denaturerende detergent. I denne form ligger de f.eks. aktive sentre av proteinene spesielt godt beskyttet i det indre av de kuleformede proteinagglomerater, slik at en særdeles god lagring av proteinene i den aggregerte form I er mulig. Som allerede nevnt har den aggregerte form II foruten fordelene med hensyn til lettere rensing av cellebestanddeler av vertscellen, som proteinene uttrykkes i, resp. av vektorene, som rekombinativt inneholder genet for de isolerte proteiner, den ytterligere fordel at den biologiske aktivitet av proteinene kan forsterkes vesentlig som følge av den romlige nærhet av mange aktive sentre i den spesielle aggregerte tilstand av proteinet.

Alt etter forsøksarrangement blir celler eller cellemembraner avsentrifugert og ekstrahert med en bufferoppløsning som inneholder en ikke-denaturerende detergent samt et proteasehindrende system, eller (når den nevnte høymolekylære substans avgis fra cellene i overløpet) overløpet blandet med det ikke-denaturerende detergent og det proteasehindrende system, idet den ikke-denaturerende detergent, f.eks. deoksycholat (DOC), foreligger i konsentrasjoner på 0,25-5%, fortrinnsvis 1%.

Når det dreier seg om rensing og isolering, blir de således oppnådde oppløsninger oppkonsentrert og skilt fra ikke-hydrokarbonholdige forurensninger av et glykoprotein ved hjelp av lektiner som er koblet til en faststoffgrunnmasse. Den brukte, ikke-denaturerende detergent har ved dette skritt i tillegg til den egenskap å overføre stoffet i form II, evnen til å hindre en uspesifik adsorpsjon. Elueringen utføres med glykosider.

Et ytterligere vesentlig rensetrinn kan oppnås ved spesiell binding av den for-rensede høymolekylære substans til en immunadsorpsjonskolonne. Etter tilstrekkelig vasking med en buffer blir der eluert med et chaotropt middel, f.eks. urea eller KSCN (2-8 M, fortrinnsvis 3M). Ved direkte etterfølgende dialyse mot en buffer blir stoffet overført i partikkelform I. Dersom det er nødvendig, blir den høymolekylære substans overført i den monomere form II ved hjelp av en bestemt zwitterionisk detergent og renset ved ionevekslerkromatografi. Ved dialyse mot en detergentfri buffer blir de aggregerte former II eller I igjen fremstilt fra den monomere form III. De forskjellige aggregerte former i de beskrevne celle-produserte proteiner kan gjøres elektronmikroskopisk synlige.

Oppfinnelsen skal illustreres i detalj ved hjelp av de følgende

figurer og eksempler.

Fig. 1 viser et elektronmikroskopisk fotografi av glykoproteinet 160 i Tris-buffer ved 278 640 gangers forstørrelse.

Proteinene foreligger i den kompakte, aggregerte kuleform I.

Fig. 2 viser et elektronmikroskopisk fotografi av glykoproteinet 160 fra HIV i en buffer som inneholder 1% DOC.

Proteinene foreligger i den luftige, fnokkaktige aggregerte form II.

Eksempel 1

Isolering og rensing av glykoprotein 160 fra HIV.

Isoleringen og rensingen av glykoprotein 160 fra HIV fant sted etter følgende skjema: 1. Genteknisk manipulerte Veroceller, som produserer glyprotein 160 av HIV, ble sentrifugert ved en ønsket densitet. 2. Den pellet som ble utvunnet ved sentrifugering, ble resuspendert i TBS pH 7,4 pluss 1 mM CuS04 + 0,5 mM ZnCl2. 3. Den resuspenderte pellet ble underkastet en ekstraksjon med 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 1% DOC og 1 mM CuS04 + 0,5 mM ZnCl2. Suspensjonen ble karet ved sentrifugering i 30 min. ved 25°C. 4. Den ovenpåflytende væske ble underkastet lentil/lektin kromatografi, hvor man adsorberte de ønskede proteiner på en søyle og vasket med DOC-buffer. Proteinene ble eluert med 5% metylglykosid i en vaskebuffer. 5. Eluatet fra lektinkolonnen ble fortynnet i en Tween-buffer. Deretter fulgte en adsorpsjon på en immunaffinitets-kromatografikolonne, som ble vasket med TBS-Tween og TBS. En DNA- og RNA-behandling fulgte. Der ble eluert med 3M KSCN og dialysert mot detergentfrie buffere. 6. Det dialyserte eluat ble justert med 1% Zwittergent og 5% betain og deretter adsorbert på en mono-Q-grunnmasse som ioneveksler og deretter eluert med en KSCN-gradient og dialysert mot en buffer. 7. En annen lentil/lektin-kromatografi med adsorpsjon og vasking med detergentfri buffer ble utført. Elueringen ble utført med 5% metylglykosid, fulgt av en dialyse mot TBS. Ved dette fremgangsmåtetrinn fant der sted en konsentre-ring av proteinet.

Eksempel 2

Med glykoproteiner (GP) 160 av HIV renset ved den fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel 1, ble der utført en virkningsprøve som viser den immunogene virkning av glykoprotein 160 i kompakt, kuleform I samt i luftig, fnokkaktig form II.

For hver vaksine ble der fremstilt 5 fortynninger med henholdsvis lOjug, 2,5/ig, 0,625/zg, 0,158/ng og 0,04 /xg GP 160 pr. ml. 10 BALBc-mus ble subkutant immunisert med hver fortynning. For hver vaksineart trengtes det derfor 50 dyr. I det foreliggende forsøk ble fire forskjellige adsorpsjonsmetoder utprøvet. 1. GP 160 + 0,2% A1(0H)3 2. [GP 160 + 0,25% DOC] + 0,2% A1(0H)3 3. [GP 160 + 0,25% DOC] + [0,2% A1(0H)3 + 0,25% DOC]

4. [GP 160 + 0,25% DOC] + [0,2% Al(OH)3) vasket]

Alle dyrene ble immunisert subkutant med 1 ml, og etter seks uker ble hvert dyr tappet for blod. Serumet fra hvert dyr ble undersøkt med anti-HIV ELISA (SORIN) for nærvær av antistoffer mot GP 160, idet den effektive dose 50 av GP 160 for hver vaksineart ble beregnet ved hjelp av de reagerende dyr ved den kjente Spearman-Kaerber metode.

Resultater

1. I-V 10 ug GP 160/ml + 0,2% Al(OH)3 s.c.

2. VI-X 10 /ig GP 160/ml + DOC + 0,2% Al (OH) 3 s.c.

ED50: 3,3 /ug/ml GP 160

3. XI-XV 10 /zg GP 160/ml + DOC + DOC-Al(OH)3 s.c.

ED50: 1,09 ng/ ial GP 160

4. XVI-XX 10 ixg GP 160/ml + DOC + Al(OH)3 vasket s.c.

Resultatet av forsøket med virkningen av glykoprotein 160 av HIV viser den forskjellige immunogenitet overfor glykoprotein 160 avhengig av den aggregerte form. ED50-verdien, som betegner den mengde av den anvendte substans hvor 50% av de vaksinerte dyr serokonverterer, reduseres betraktelig når detergenten DOC foreligger. I nærvær av detergenten DOC foreligger glykoproteinet 160 i den aggregerte form II, hvor den antigene epitop på den ene side ligger fritt og på den andre side henger sammen i rommet, slik at en forsterket immunrespons fås.

Oppfinnelsen er vist med hensyn til glykoprotein 160 av HIV som et eksempel. Den er imidlertid på ingen måte begrenset til dette protein.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte til isolering og rensing av glykoprotein GP 160 av HIV produsert i celler, karakterisert ved at de forurensninger som befinner seg på overflaten, i et første rensetrinn fjernes fra GP 160 som foreligger i en første aggregert form I, at GP 160 under anvendelse av en ikke-denaturerende detergent valgt fra bestemte ikke-ioniske eller zwitterioniske detergenter deretter blir overført til en andre aggregert form II, og at i denne aggregerte form II blir tilgjengelige forurensninger fjernet i et andre rensetrinn og eventuelt at ved tilsetning av en andre, ikke-denaturerende detergent blir GP 160 overført til en monomer form III, og at dette ved fjerning av den ikke-denaturerende detergent igjen er reversibelt overførbart til den aggregerte form I eller II.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at der som den første, ikke-ioniske detergent anvendes oktylglukosid eller et derivat av dette, fortrinnsvis i en konsentrasjon på 0,25-5 %, særlig 1 %, og at der som den andre zwitterioniske detergent anvendes en fra rekken ZWITTERGENT, fortrinnsvis i en konsentrasjon på 0,25-5 %, særlig 1 %.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav l, karakterisert ved at der som detergent anvendes et salt av gallesyre eller et derivat av dette, fortrinnsvis deoksycholat (DOC), fortrinnsvis i en konsentrasjon på 0,25-5 %, særlig 1 %.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den reversible overføring av de aggregerte former I, II og III blir gjen-nomført flere ganger for renseformål.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at GP 160 er et ekspre-sjonsprodukt av genteknisk manipulerte celler, særlig slike som overproduserer proteinene.

6. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 eller 5, karakterisert ved at cellene er eukaryote, fortrinnsvis dyreceller eller humane celler.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at cellene fås fra primære cellekulturer eller fra cellelinjer, særlig Veroceller, CHO-celler eller primære kyllingembryo-fibroblastceller.

8. Anvendelse av glykoprotein GP 160 fra HIV i form II for å oppnå stoffer til kvalitativ påvisning eller kvantitativ bestemmelse in vitro av de nevnte stoffer i kroppsvæsker.