JPH0556783A - 変換成長因子β２のクローニングおよび発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 電子出願以前の出願であるので 要約・選択図及び出願人の識別番号は存在しない。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、変換成長因子（Trasforming Growth Factor）−ベータ２のクローニングおよび発現に 関するものである。

〔従来の技術〕

変換成長因子−ベータ類（ＴＧＦ−β）は、最 近記述されている細胞分化および増殖を制御する ポリペプチド類の一群の一員である。この一群の 他のものは、Mullerの阻害物質（Cateらの、1986、 Cell 45:685-698）、インヒビン類(inhibins) (Masonらの、1985、Nature 318:659-663)および ドロソフィラ(Drosophila)の15倍(decapentaplegic) 遺伝子複合体の転写物から推定される蛋白質 (Padgettらの、1987、Nature 325:81-84)を含む。

変換成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）は、ジス ルフィド結合した２個の同等の112個のアミノ酸 のサブユニットからなる24,000kDの同種二量体で ある。ＴＧＦ−β１は、正常ラット腎臓繊維芽細 胞の固定源−非依存性(anchorage-independent) 成長を刺激する能力について最初に記述された (Robertsらの、1981、Proc.Natl.Acad.Sci.U. S.A.78:5339-5343)。それ以来、数種類のヒト腫 瘍細胞株(Robertsらの、1985、Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.82:119-123;Ranchalisらの、1987、 Biochem.Biophys.Res.Commun.148:783-789)、 マウスケラチノサイト(Coffeyらの、1988、Cancer Res.48:1596-1602;ReissおよびDibbleの、 1988、In Vitro Cell.Dev.Biol.24:537-544)、 ならびにＴおびＢリンバ球(Kehrlらの、1986、J. Exp.Med.163:1037-1050;1987、J.Immunol. 137:3855-3860;Kasidらの、1988、J.Immunol. 141:690-698;Wahlらの1988、J.Immunol.140: 3026-3032)の成長を阻害する等の多岐にわたる効 果を有する細胞成長および分化の多機能制御因子 であることが示されている（Spornらの、1986、 Ｓｃｉｅｃｅ ２３３：５３２−５３４）。それは、ま
た、初期造 血母細胞の増殖を阻害し（Goeyらの、１９８９、Ｊ． Immunol.143:877-880）、ラット筋肉間葉細胞の分 化誘導および引続く軟骨特異性マクロ分子の生成 を刺激し(Seyedinらの、1986、J.Biol.Chem.262: 1946-1949)、フィブロネクチンおよびコラーゲン の合成および分泌の増大を引起こし、（Ignotzお よびMassaque、1986、J.Biol.Chem.261:4337- 4345;Centrellaらの、1987、J.Biol.Chem. 262:2869-2874）、骨形成を刺激し(Nodaおよび Camilliere、1989、Endocrinology 124:2991-299 5)、ならびに切開傷のゆ着を促進する(Mustoeら の、1987、Science 237:1333-1335)。

ヒト(Derynckらの、1985、Nature 316:701-705)、 マウス(Derynckらの、1986、J.Biol.Chem.261: 4377-4379)およびサル(Sharplesらの、1987、DNA 6:239-244)のＴＧＦ−β１をコードするｃＤＮＡ は単離されている。これらのクローンのＤＮＡ配 列分析は、ＴＧＦ−β１が大きい前駆体ポリペプ チドとして合成され、そのカルボキシ末端が切断 されて成熟ＴＧＦ−β１単量体が産生されること を示す。上記のすべての供給源に由来するＴＧＦ −β１前駆体蛋白質にわたって、強い配列相同性 が見出された。

ＴＧＦ−β１は、ＣＨＯ細胞内で高水準で発現 されている(Gentryらの、1987、Mol.Cell.Biol. 7:3418-3427)。これらの細胞から分泌された蛋白 質の、部位−特異性抗−ペプチド抗血清を用いた イムノブロッティングによる分析は、ＨＰＬＣ精 製シアノゲンブロマイド断片の蛋白質配列決定と 共に、組換えＴＧＦ−β１γＴＧＦ−β１）が、 成熟およびプロー領域特異性配列からなる90-110 kDスルフィド結合複合体に非−共有的に結合する 成熟ＴＧＦ−β１から構成される高分子量の潜在 的複合体の部分として分泌されることを示した （Gentryらの、1987、Mol.Cell.Biol.7:3418- 3427;Gentryらの、1988、Mol.Cell.Biol.8: 4162-4168)。類似した構造が、ヒト293Ｓ細胞に より分泌されたｒＴＧＦ−β１について記述され ている(Wakefieldらの、1989、Growth Factors 1: 203-218)。

［^３Ｈ］−グリコサミンおよび［^３２Ｐ］−オルト リン酸により放射標識された組換えＣＨＯ細胞に より条件付けされた無血清および無細胞上澄の分 析は、該ＴＧＦ−β１前駆体のプロ−領域がリン 酸化され、かつグリコシル化されていることを示 している(Brunnerらの、1988、Mol.Cell.Biol. 8:2229-2232)。更なる分析は、リン酸がマンノー ス−６−リン酸（Ｍ−６−Ｐ）として取込まれ、 この修飾がプロ−領域内の３個のグリコシル化部 位中の２個で起きていることを示した(Purchioら の、1988、J.Biol.Chem.263:14211-14215)。

該ＴＧＦ−β１前駆体の、Ｍ−６−Ｐ受容体に対 する特異的結合が示されている（Purchioらの、 1988、J.Biol.Chem.263:14211-14215;Kovacina らの、1989、Biochem.Biophys.Res.Commun.160 :393-403)。

最近、変換成長因子−β２（ＴＧＦ−β２）と 称される第２の蛋白質が、脱無機質骨(Seyedinら の、1987、J.Biol.Chem.262:1946-1949)、ヒ ト前立腺癌細胞株(Ikedaらの、1987,Biochemistry 26:2406-2410)、ヒト神経膠芽細胞腫細胞(Wrann らの、1987、EMBO J.6:1633-1636)およびブタ血 小板（Cheifetzらの、1987、Cell 48:409-415)を 含む数種供給源から単離された。ＴＧＦ−β２の 完全なアミノ酸配列は、ＴＧＦ−β１と71％の相 同性を示し(Marquardtらの、1987、J.Biol.Chem. 262:1
2127-12131)、また、それはいくつかの機能 的類似性をＴＧＦ−β１と共用する(Ranchalisら の、1987、J.Biochem.Biophys.Res.Commun.148: 783-789;Seyedinらの、1987、J.Biol.Chem. 262:1946-1949;McPhersonらの、1989、Biochemi- stry 28:3442-3447)。これらの蛋白質は、ＴＧＦ −β３(Ten-Dijkeらの、1988、Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.85:4715-4719;Derynckらの、1988、 EMBO J.7:3737-3743;Jakowlewらの、1988a、 Mol.Endocrinol.2:747-755)、ＴＧＦ−β４ （Jakowlewらの、1988b、Mol.Endocrinol.2: 1064-1069)、ミュレリアン(Mullerian)阻害物質 (Cateらの、1988、Cell.45:685-698)およびイ ンヒビン(Masonらの、1985、Nature 318:659-663) を含め類縁成長調整蛋白質(ralated growth modu- latory protein)の一群の一員である。

〔発明の要約〕

本発明は、発現制御要素により調節されるＴＧ Ｆ−β２コード配列を含む組換えＤＮＡベクター によりトランスフェクト(transfect)された真核 性宿主細胞による大量のＴＧＦ−β２の製造に関 するものである。

特定の実施態様において、ヒトＴＧＦ−β２前 駆体をコードするｃＤＮＡクローンは、タモキシ フェン(tamoxifen)処理ヒト前立腺癌細胞株PC- ３から作成されたｃＤＮＡライブラリから得られ た。このようなクローンの一つのｃＤＮＡ配列は、 ＴＧＦ−β２が442個のアミノ酸のポリペプチド 前駆体として合成され、これから成熟型の112個 のアミノ酸のＴＧＦ−β２サブユニットが、蛋白 質分解的な切断によって誘導されることを予言し ている。このＴＧＦ−β２−442と称されるＴＧ Ｆ−β２前駆体は、ＴＧＦ−β１の前駆体と41％ の相同性を共有している。他の実施態様において、 サル（Simian）ＴＧＦ−β２前駆体をコードする ｃＤＮＡクローンが、アフリカミドリザルの腎細 胞BCS-40から作成されたｃＤＮＡライブラリから 得られた。このようなクローンの一つのｃＤＮＡ 配列は、ＴＧＦ−β２が414個のアミノ酸のポリ ペプチド前駆体として合成され、これから成熟型 の112個のアミノ酸のＴＧＦ−β２サブユニット が、蛋白質分解的な切断によって誘導されること を予言している。このＴＧＦ−β２−414と称さ れるＴＧＦ−β２前駆体は、414個のアミノ酸残 基のアミノ酸配列を有し、ヒトＴＧＦ−β２−44 2配列の残基番号116から135までの29個のアミノ 酸の配列に代えて単一のアスパラギン残基を含む ことを除いて、ＴＧＦ−β２−442のアミノ酸配 列と同等である。

サルＴＧＦ−β２−442前駆体をコードするBSC -40 ｃＤＮＡライブラリ由来のクローン、ならび にヒトＴＧＦ−β２−414前駆体をコードするヒ トPC-3 ｃＤＮＡライブラリ由来のクロンもま た同定されている。ヒトおよびサルＴＧＦ−β２ −442前駆体類は、ヒトおよびサルＴＧＦ−β２ −414前駆体類と同様に、アミノ酸の水準で完全 な相同性を有するものと思われる。ＴＧＦ−β１ およびＴＧＦ−β２の成熟型の112個のアミノ酸 の単量体は、71％の相同性を示す。

ここに実施例により更に記述される本発明の他 の実施態様において、ＴＧＦ−β１シグナルおよ び前駆体配列に相を合わせて(in-phase)結合した ＴＧＦ−β２成熟コード配列を含む発現ベクター 類（共有され／係属中である合衆国特許出願第 189,984号）が、構築され、チャイニーズハムス ター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）とトランスフェクト するために使用された。得られたＣＨＯおよびＣ ＯＳトランスフェクタントは、成熟の生物学的に 活性なＴＧＦ−β２を産生し分泌する。関連する 実施態様において、完全なサルＴＧＦ−β２− 414前駆体遺伝子が、トランスフェクトされたＣ ＨＯ細胞における成熟および前駆体形態のＴＧＦ −β２の両者の高水準発現を支配する発現ベクタ ーを構築するために使用された。

(1) 定 義 ここに使用される以下の用語は、単数あるいは 複数にかかわらずに示された意味を有する。

ＴＧＦ−β２：図１ａのアミノ酸残基番号約331 ないしアミノ酸残基番号約442に 図示したものと実質的に同一のア ミノ酸配列を有するヒトまたはサ ル（simian）起源の変換成長因子 (transforming growth factor)− ベータ２。

ＴＧＦ−β２ 図１ａのアミノ酸残基番号約１な 前駆体：いしアミノ酸残基番号約442、ま たはアミノ酸残基番号約１ないし アミノ酸残基番号約442において アミノ酸残基番号116からアミノ 酸残基番号144までのアミノ酸配 列が削除され、単一のアスパラギ ン残基に置換されたものと実質的 に同一のアミノ酸配列を有するヒ トまたはサル(simian)起源の変換 成長因子−ベータ２分子の一群。

該用語は、ヒトまたはサル起源に かかわらず、ＴＧＦ−β２−442 またはＴＧＦ−β２−414と称さ れるＴＧＦ−ベータ２前駆体を意 味する。

融合 ＴＧＦ−β1/ 図１ｂのアミノ酸残基番号約１な ＴＧＦ−β2 いしアミノ酸残基番号約390に図 前駆体：示したものと実質的に同一のアミ ノ酸配列を有する新規変換成長因 子−ベータ前駆体分子。

ＴＧＦ−β１ 図１ｂのアミノ酸残基番号約１な 前駆体：いしアミノ酸残基番号約278に図 示したものと実質的に同一のサル −変換成長因子−ベータ１前駆体 およびシグナル配列。

〔発明の説明〕

本発明は、ＴＧＦ−β前駆体遺伝子コード配列 からの生物学的に活性な成熟型ＴＧＦ−β２の生 産、及びその産物に関するものである。生物学的 に活性な成熟ＴＧＦ−β２は、ＴＧＦ−β２前駆 体のヌクレオチドコード配列の全長またはそれと 機能的に同等なものを、標品の天然ＴＧＦ−β２ とほとんど区別できない生物学的活性を有する成 熟ＴＧＦ−β２を生成するように前駆体を正しく プロセシングする宿主細胞内でクローニングし発 現させることによって生産できる。全長のＴＧＦ −β２前駆体ヌクレオチドコード配列と機能的に 同等なものには、適当な宿主細胞で発現されたと き成熟ＴＧＦ−β２の合成、プロセシング、及び 細胞外への輸送を指示する能力を持つあらゆるＤ ＮＡ配列が含まれる。この点に関して、例えばＴ ＧＦ−β２成熟配列にインフレームに連結された ＴＧＦ−β１前駆体配列を含むハイブリッド前駆 体コード配列を構築し生物学的に活性なＴＧＦ− β２の生産に用いることができる。

同様に、本発明はまた、潜在型高分子量ＴＧＦ −β２前駆体複合体、ＴＧＦ−β２のプロ領域、 及びプロセシングを受けていないＴＧＦ−β２前 駆体を含む完全なＴＧＦ−β２前駆体コード配列 をコードしたベクターでトランスフェクションさ れた真核宿主細胞による前駆体型ＴＧＦ−β２の 生産に関するものである。

発明の方法は単に説明の目的で以下の段階に分 けることができる。；(a) ＴＧＦ−β２の前駆体型 のコード配列の単離及び作成；(b) ＴＧＦ−β２ コード配列の発現を指示する発現ベクターの構築； (c) 該遺伝子を複製及び発現し、さらに該遺伝 子産物をプロセシングして成熟な生物活性型ＴＧ Ｆ−β２または潜在性ＴＧＦ−β２前駆体型を生 成させる能力を持つ適当な宿主細胞のトランスフ ェクション；および(d) 成熟、生物活性ＴＧＦ −β２または潜在性ＴＧＦ−β２前駆体型の同定 及び精製。ひとたびトランスフェクタントが高レ ベルのＴＧＦ−β２を発現することが確認されれ ば、発明の方法の実施は、該クローンの増殖及び 発現された遺伝子産物の単離を必要とする。

発明の方法を、ここに以下の例によって明らか に示す。その例において、ＴＧＦ−β２前駆体コ ード領域のｃＤＮＡを調製し、クローン化し、配 列決定し、哺乳類宿主細胞においてＴＧＦ−β２ の高レベル発現を指示する能力のある発現ベクタ ー構築に用いた。特定の実施態様において、出願 人はＴＧＦ−β２をコードするPC-3 ｃＤＮＡラ イブラリーからクローンを同定した。これらのク ローンのうちの一つのＤＮＡ配列分析は、ＴＧＦ −β２がＴＧＦ−β１同様より大きな前駆体タン パク質として合成され、そのカルボキシ末端が切 断されて成熟ＴＧＦ−β２単量体を生成すること を示した。ＴＧＦ−β１とＴＧＦ−β２の間には これらの分子の成熟部分を通して71％の相同性が あるが、前駆体の残りの部分には最大で31％の相 同性しか存在せず、このことはＴＧＦ−β１及び ＴＧＦ−β２のアミノ末端領域が機能的に異なっ ていることを示唆する。発明の特定の実施態様に おいて、新規ＴＧＦ−β１／ＴＧＦ−β２ハイブ リッド遺伝子のＣＨＯ細胞内での発現は、生物活 性ＴＧＦ−β２の大量生産に利用される。さらに 別の実施態様において、成熟型及び前駆体型ＴＧ Ｆ−β２は、完全なＴＧＦ−β２前駆体コード配 列を高レベルで発現するように工学的に作成され たＣＨＯ細胞から得られる。出願人は、これらの 細胞から分泌される組換えＴＧＦ−β２タンパク 質の様々な生化学的、免疫学的、及び構造的特徴 を決定し、ここに記述した。

様々な角度からみた本発明の方法は、以下の小 項目及びそれに続く実施例においてより詳細に記 述される。

(1) ＴＧＦ−β２コード領域の単離及び作成 ＴＧＦ−β２のヌクレオチドコード配列を図１ ａに記述する。発明の方法を実施に際しては、こ こに示されたヌクレオチド配列、またはこの断片 またはこれと機能的に同等なものを、適当な宿主 細胞内でＴＧＦ−β２産物の発現を指示する組換 え分子を作成するために利用できる。特定の実施 態様において、下記10項にさらに記述するが、Ｔ ＧＦ−β２及び414アミノ酸ＴＧＦ−β２前駆体 の高レベル発現がSV40プロモーターの調節制御下 でサルＴＧＦ−β２(414)前駆体及びジヒドロ葉 酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードした組換え プラスミドを用いてトランスフェクションされた チャイニーズハムスター卵巣細胞中で達成される。

その後のメトトレキセートを用いた発現の増幅は、 高レベルの成熟ＴＧＦ−β２並びの高分子量前駆 体複合体を分泌するクローンの単離をもたらす。

これらのクローンはml倍地当りおよそ５μｇの組 換えＴＧＦ−β２を分泌する。分泌ＴＧＦ−β２ 前駆体の予備的な性質検討は、そのプロ領域がグ リコシル化され、マンノース−６−リン酸をふく むことを示している。別の関連した実施態様にお いて、ＴＧＦ−β１／ＴＧＦ−β２ハイブリッド 遺伝子を構築し、ＣＨＯ細胞をトランスフェクシ ョンするために用いた；その結果得られたトラン スフェクタントはml倍地当り０．４μｇほどの組換 えＴＧＦ−β２を分泌する。

ヌクレオチドコード配列の縮退のために、図１ ａ及び図１ｂに記述したのと実質的に同じアミノ 酸配列をコードする別のＤＮＡ配列も、ＴＧＦ− β２のクローニング及び発現のための本発明の実 施に際して使用できる。このような変更には、様 々なヌクレオチド残基の欠失、付加、または置換 があり、これにより同一のまたは機能的に同等な 遺伝子産物をコードする配列を生じる。遺伝子は 配列内にアミノ酸残基の欠失、付加または置換を 含んでいてもよく、生物活性な産物を生成する表 に現れない変化を生じる。このようなアミノ酸置 換は、関連する残基の極性、荷電、溶解性、疎水 性、親水性及び／または両親媒性の類似に基づい て行われうる。たとえば負荷電アミノ酸にはアス パラギン酸とグルタミン酸がある；正荷電アミノ 酸にはリジン及びアルギニンがある；類似した親 水性を有し、非荷電極性の側鎖あるいは非極性側 鎖を有するアミノ酸には以下のものがある；ロイ シン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニ ン；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオ ニン；フェニルアラニン、チロシン。

ＴＧＦ−β２のヌクレオチドコード配列は、Ｔ ＧＦ−β２様活性を生じる細胞源から得ることが できる。該コード配列は、このような細胞源から 単離精製されたＲＮＡのｃＤＮＡクローニングま たはゲノムクローニングにより得られる。クロー ンのｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラ リーのいずれもが、制限酵素の使用を含むがこれ に限定されない当分野に周知の技法を用いて作成 されたＤＮＡフラグメントから調製できる。図１ に記述された配列の如何なる部分でもその部分と 事実上相補的なヌクレオチドプローブを用いて、 このようなライブラリーをスクリーニングするこ とによって、ＴＧＦ−β２をコードする断片であ ることが確認されよう。完全な長さを持つクロー ン、すなわちＴＧＦ−β２の完全なコード配列を 含むクローンを、発現によって選択することがで きる。

発明の別の実施態様において、当分野に周知の 化学的方法を用いて、図１のコード配列を全体と してあるいは部分的に合成することができた。例 としてCaruthersら、1980,Nuc.Acids Res. Symp.Ser.7:215-233:CreaおよびKern,1980, Nuc.Acids.Res.9(10):2331;Natteuceiおよび Carruthers.1980,Tetrahedron Letters 21:719 およびChowおよびKempe,1981,Nuc.Acids.Res. 9(12):2807-2817を参照のこと。また図１に記述 したアミノ酸配列を全体としてまたは部分的に合 成するために化学的方法を使用して該タンパク質 を製造することができた。例えば、ペプチドは固 相法によりベックマン990装置で合成され、すで に記載されたように（Gentry,L.E.ら、1983, J.Biol.Chem.258:11219-11228;Gentry,L.E. およびLawton,A.,1986,Virology 152:421-431)、 樹脂から溶離された。精製は調製用高速液体クロ マトグラフィーで行った。ペプチドの構造はアミ ノ酸分析によって確認された。

特定の実施態様において、下記６項にさらに記 述するが、ＴＧＦ−β２コード配列は、予めＴＧ Ｆ−β２を生産することが示されたタモキシフェ ン処理ヒト前立腺癌細胞系、RC-３から単離され たポリアデニル化ＲＮＡから誘導されるヒトＴＧ Ｆ−β２前駆体コード配列のｃＤＮＡクローニン グによって得られる。同様に、下記７項にさらに 記述される関連の実施態様において、ＴＧＦ−β ２コード配列は、アフリカミドリザル細胞系、 BSC-40から単離されたポリアデニル化ＲＮＡから 誘導されたサルＴＧＦ−β２前駆体コード配列の ｃＤＮＡクローニングによって得られる。ヒト及 びサルＴＧＦ−β２前駆体は同一のアミノ酸配列 を持つと思われ、そのヌクレオチド配列はほとん ど同一である。

ＴＧＦ−β２ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列分 析は、ＴＧＦ−β２がＴＧＦ−β１同様大きな前 駆体分子として合成され、そのカルボキシ末端が 切断されて成熟112アミノ酸ＴＧＦ−β２単量体 を生成することを示す。ＴＧＦ−β２は２個のジ スルフィド結合した13,000ドルトンサブユニット からなる分子量24,000を有することが示されてい る（Ikedaら、1987,Biochemistry 26:2406-2410: Cheifetzら、1987.Cell 48:409-415)。従って、 成熟ＴＧＦ−β２の生産は、適正なタンパク質加 水分解的切断、並びに分子内及び分子間ジスルフ ィド結合の形成を必要とする。アミノ末端疎水性 リーダー配列（残基３−９）が前駆体内に存在し、 該タンパク質を細胞の外へ方向付ける役割を果た すであろう。成熟ＴＧＦ−β２はこの過程におい てもなお前駆体の残りの部分と結合しているであ ろう。

ＴＧＦ−β２は前駆体の成熟部分を通じてＴＧ Ｆ−β１と71％の相同性を示し、実験的な証左に より支持される機能的な類似性を示唆する(Seyedin ら、1987,J.Biol,Chem,262:1946-1949;Cheifetz ら、1987,Cell 48:409-415)。ヒト、齧歯類、及 びサル起源からのＴＧＦ−β１の前駆体領域のア ミノ部分が、高度の相同性を示し(Derynckら、 1985.Nature 316:701-705;Derynckら、1986, J.Biol.Chem.261:4377-4379;Sharplesら、 19 87,DNA 6:239-244)、重要な生物学的機能が、該 分子のこの部分と関連していることを示唆する。

これとは対照的に、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β ２のＮ−末端前駆体領域の間には31％しか相同性 はなかった。推定シグナルペプチドを切断後、Ｔ ＧＦ−β２前駆体はＴＧＦ−β１前駆体より多く のアミノ酸を含んでいるであろう。ＴＧＦ−β１ 及びＴＧＦ−β２前駆体タンパク質のアミノ末端 領域内の一次構造の相違は、機能的な相違を反映 するかも知れない。しかしながら、前駆体内の顕 著な相同領域が、単離されたブロックに見いださ れ、重要な機能的ドメインはＮ−末端前駆体領域 内でも保存されていることを示唆する。

ノーザンブロット分析は、4.1および6.5kbの 二つの主要なサイズクラスのＴＧＦ−β２−特異 的ｍＲＮＡを示した。ラモキシフェン処理PC- ３細胞は、4.1kb、5.1kb、および6.5kbの三種 類のＴＧＦ−β２転写物を含む。これらのサイズ の異なったメッセージは、別の遺伝子について記 載されているように(Helfmanら、1986,Mol.Cell. Biol.6:3582-3595;Sayreら、1987,Prac.Natl. Acad.Sci.USA 84:2941-2945)、異なったＲＮＡ スプライシング、ポリアデニル化、または両者の 結果であろう。別のＴＧＦ−β２ｃＤＮＡクロー ンの予備的な分析は、それがpPC-21及びpPC-14よ り約1kb大きな3'−非翻訳領域をもつこと、およ び異なったポリアデニル化部位を持つことを示し、 変化したポリアデニル化がノーザンブロットで見 られる複数のＴＧＦ−β２ｍＲＮＡ生成の原因と なることを示唆する。

BSC-40細胞は比較しうるレベルのＴＧＦ−β１ 及びＴＧＦ−β２特異的転写物を含む；タモキシ フェン処理PC-3細胞はＴＧＦ−β２より多くの ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡを含む（図３Ｂ）。これら の細胞がＴＧＦ−β１より多くのＴＧＦ−β２タ ンパク質を生産する（ ）ため、後者の結果は予 想外であり、転写後の調節レベルがこの成長活性 調節因子の合成に関係することを示唆する。組換 えＤＮＡ技法による必要量のＴＧＦ−β２の生産 は、ＴＧＦ−β１について行われたように、この タンパク質の様々な効果を調べるための実験をさ らに企画することを助けるものである。

(2) ＴＧＦ−β２をコードする配列を含む発現ベ クターの構築 生物学的に活性な成熟ＴＧＦ−β２を発現させ るためには、高レベルの転写及び翻訳のみならず、 遺伝子産物の正確なプロセシングをもたらすよう な発現ベクター宿主系が選択されるべきである。

このことを特に発現構築物においてＴＧＦ−β２ 前駆体のコード配列全体を使用するときに重要で あるが、これは、成熟ＴＧＦ−β２が、細胞のプ ロセシングを経て前駆体産物から生じると思われ るためである。さらに、産物の分泌をもたらすよ うな発現／宿主細胞系が選択されよう。

とりわけ、サブユニット当り112個のアミノ酸 からなるジスルフィド結合したホモ二量体である 成熟ＴＧＦ−β２は、Arg-Alaのアミノ酸の間（図 １ａにおいて残基番号330と331）でのタンパク質 加水分解的開裂を含む細胞のプロセシングによっ て生じる。さらに、ＴＧＦ−β２前駆体は成熟型 には認められない３箇所のＮ−グリコシル化可能 部位を有している；前駆体の正しいグリコシル化 は成熟分子の細胞での合成、及び放出または分泌 に重要であるだろう。このことについては、出願 人は、ＴＧＦ−β２前駆体のプロ領域がグリコシ ル化され、リン酸化されている（下記10.2項参照） ことを決定している。さらにＴＧＦ−β２の成熟 型は、サブユニット当り９個のシステインを含む ジスルフィド結合した二量体からなる。これらの いくつかは、鎖間の及び他のいくつかは鎖内の結 合に関与し、このことは成熟型分子の三次構造あ るいは立体配置、そして結果としてのその生物活 性に影響を与える。従って、発現系において使わ れる宿主細胞のＴＧＦ−β２遺伝子産物を正確に 発現しプロシイングする能力は、ＴＧＦ−β２の 前駆体型の生産だけでなく、生物活性な成熟型Ｔ ＧＦ−β２の生産についても重要である。

当業者は、様々な他の動物の宿主／発現ベクタ ー系（すなわち適当な宿主細胞内でＴＧＦ−β２ コード配列の複製、転写及び翻訳を支配するため の必要要素を含有するベクター）を同じように利 用することができる。これらは、ウイルス発現ベ クター／哺乳類宿主細胞系（例えば、シトメガロ ウイスル、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、 その他同種類のもの）；昆虫ウイルス発現ベクタ ー／昆虫細胞系（例えば、バクロウイスル）；ま たは哺乳類細胞のゲノムから誘導された非ウイル ス性プロモーター発現系（例えばマウスメタロチ オネインプロモーター）を含むがこれに限定され ない。

これらのベクターの発現要素はその強度及び特 異性において変化する。使用する宿主／ベクター 系に依存して、多くの適当な転写及び翻訳要素の うちのどれでも一つを使用することができる。例 えば哺乳動物細胞系内でのクローニングの場合に は、哺乳類細胞のゲノムから（例えばマウスメタ ロチオネインプロモーター）またはこれらの細胞 内で成育可能なウイルスから（例えばワクシニア ウイルス7.5Ｋプロモーター）単離されたプロモ ーターが使用できる。組換えＤＮＡまたは合成技 術により製造されたプロモーターもまた、挿入配 列の転写のために使用することができる。

特定の開始シグナルもまた、挿入されたタンパ ク質コード配列の十分な翻訳のために必要である。

これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接 配列を含む。それ自身の開始コドン及び隣接した 配列を含む全ＴＧＦ−β２遺伝子が適当な発現ベ クターに挿入されている場合、追加の翻訳制御シ グナルは必要とされない。しかし、コード配列の 一部のみが挿入された場合には、ＡＴＧ開始コド ンを含む外来の翻訳制御シグナルが供給されなけ ればならない。さらに全挿入物の翻訳を確実に行 うためには、開始コドンはＴＧＦ−β２コード配 列の読み枠と一致しなければならない。これらの 外来の翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然 及び合成の様々な起源のものであってよい。発現 効率は、転写減衰配列。エンハンサー等の含有に より増強されうる。

ＴＧＦ−β２遺伝子及び適切な転写／翻訳制御 シグナルを含む発現ベクターを構築するために、 先に記載したＤＮＡ断片をベクター中に挿入する ためのあらゆる方法を使用できる。これらの方法 は、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ 組換え（遺伝子組換え）を含んでよい。

例えば、発現ベクターとしてアデノウィルスを 使用する場合には、ＴＧＦ−β２コード配列は、 アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後 方プロモーター及び３分節系リーダー配列に連結 される。次いで、該ハイブリッド遺伝子を、アデ ノウイルスのゲノム中に、インビトロまたはイン ビボ組換えによって挿入することができる。該ウ イルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１また はＥ３）への挿入は、感染宿主内において生存可 能で、ＴＧＦ−β２の発現能を有する組換えウイ ルスを生じるであろう。同様にして、ワクシニア 7.5Ｋプロモーターも用いられる。

ＴＧＦ−β２発現のために用いられる別の発現 系は、昆虫系である。このような系の一つにおい て、オートグラファ カリフォルニカ(Autographacalifornica) 核ポリヘドロシスウイルス(AcNPV) が、外来遺伝子を発現させるベクターとして用い られる。該ウイルスは、スボドプテラフルジペル ダ(Spodoptera frugiperda)細胞内で増殖する。

ＴＧＦ−β２コード配列を、該ウイルスの非必須 領域（例えばポリヘドリン遺伝子）中にクローン 化し、AcNPVプロモーター（例えばポリヘドリン プロモーター）の制御下に置くことができる。Ｔ ＧＦ−β２コード配列の好結果の挿入は、ポリヘ ドリン遺伝子の不活化及び非閉塞組換えウイルス （すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードさ れるタンパク質性外皮を欠失したウイルス）の生 成をもたらす。次いで、これらの組換えウイルス は、挿入遺伝子を発現するスポドプテラフルジペ ルダ 細胞を感染させるために使用される。

さらに、該挿入配列の発現を調節する。または 該遺伝子産物を特定の望ましい様式で修飾及びプ ロセシングする宿主細胞株が選択される。ある種 のプロモーターによる発現を、ある種の誘導因子 の存在下で上昇させることができる（たとえば、 メタロチオネインプローターに対する亜鉛及び カドミウムイオン）。従って、遺伝的に操作され たＴＧＦ−β２の発現を制御することができる。

このことは、クローン化された外来遺伝子のタン パク質産物が、宿主細胞にとって致命的である場 合に重要である。さらに、グリコシル化のような 翻訳後の修飾、及びタンパク質産物のタンパク質 加水分解的切断のようなプロセシング過程は、タ ンパク質の機能化にとって重要である。様々な宿 主細胞は、タンパク質の翻訳後のプロセシング及 び修飾のための、特徴的かつ特異的な機構を有し ている。発現される外来タンパク質の正しい修飾 及びプロセシングを確実にするために、適切な細 胞系または宿主系を選択することができる。

(3) ＴＧＦ−β２遺伝子生成物を表現するトラン スフェクタント又は変換体の同定 組換えＴＧＦ−β２をコードしている配列を含 み、生物学的に活性な成熟生成物を表現する宿主 細胞は、少くとも４つの一般的なアプローチによ り同定しうる：(a) ＤＮＡ−ＤＮＡ雑種化、(b) “マーカー”遺伝子機能の存在又は不存在； ＴＧＦ−β２ｍＲＮＡトランスクリプトの発現に より測定される、宿主細胞での転写のレベルの評 価；及び(d) イムノアッセイにより測定され、 究極的には、その生物活性により測定される、成 熟及び／又は前駆体遺伝子生産物の検出。

第１のアプローチにおいて、発現ベクター中に 挿入されたＴＧＦ−β２をコードしている配列の 存在は、実質的に第１ａ図に示されているＴＧＦ −β２をコードしている配列又はその一部又は誘 導体に相同性のヌクレオチド配列を有するプロー ブを使用するＤＮＡ−ＤＮＡ殺種化により検出で きる。

第２のアプローチにおいて、組換え発現ベクタ ー／宿主系は、特定の“マーカー”遺伝子機能 （例えばチミジンキナーザ活性、抗生物質に対す る抵抗性、メトトレキセートに対する抵抗性、形 質転換発現型、バキュロウイルスにおけるオクル ージョン(occlusion)体の形成等）の存在又は不 存在に基づき、同定され、かつ、選択しうる。例 えば、もしＴＧＦ−β２をコードしている配列が ベクターのマーカー遺伝子配列に挿入されると、 ＴＧＦ−β２をコードする配列はマーカー遺伝子 機能の不存在によって同定できる。代わりに、マ ーカー遺伝子はＴＧＦ−β２をコードする配列の 発現をコントロールするために使用される同一又 は異なるプロモーターのコントロール下で、ＴＧ Ｆ−β２配列に連結して置くことができる。誘導 又は選択に応答するマーカーの発現は、ＴＧＦ− β２をコードする配列の発現を示す。

第３のアプローチにおいて、ＴＧＦ−β２をコ ードしている領域のための転写活性は雑種化アッ セイにより評価できる。例えば、ポリアデニル化 されたＲＮＡは、ＴＧＦ−β２をコードしている 配列又はその特別な一部分に相同性のプローブを 使用するノーザンブロット法により分離され、そ して分析できる。代わりに、宿主細胞の全核酸は、 かかるプローブに対する雑種化のために抽出され、 アッセイしてもよい。

第４のアプローチにおいて、成熟及び／又は前 駆体蛋白生産物の発現は、例えば、ウエスタンブ ロット、ラジオイムノー沈澱、酵素結合イムノア ッセイ等のイムノアッセイ及びその他により、免 疫学的に評価できる。しかしながら、発現システ ムの成功についての究極的な試験は、生物学的に 活性なＴＧＦ−β２遺伝子生成物の検出を含む。

宿主細胞が遺伝子生成物を分泌する場合、培養さ れたトランスフェクタント宿主細胞から得られた 細胞フリーの媒質は、ＴＧＦ−β２の活性のため にアッセイ可能である。遺伝子生成物が分泌され ない場合には、細胞分解物を、かかる活性に対し てアッセイし得る。どちらの場合においても、こ こで記載される成長抑制アッセイ又はターゲット 細胞中の固定非依存性(anchoroge independent) 成長の刺激（Twardzik及びSherwin,1985,J.Cell. Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２８９〜２９７；Ｄｅｌａｒｃ
ｏ及びTodaro, 1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:4001- 4005）等の生物学的なアッセイを使用しうる。

一度、高レベルの生物学的に活性なＴＧＦ−β ２を生産するクローンが同定されると、このクロ ーンは展開されることができ、そして、ＴＧＦ− β２は公知の手法を使用して精製しうる。かかる 方法は、イムノアフィニティ精製、高性能液体ク ロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー法等 を含む。

(4) ハイブリッドＴＧＦ−β１／β２前駆体遺伝 子を使用する、ＣＨＯ細胞におけるＴＧＦ−β ２の安定な発現 本発明の特別な態様において、ハイブリッドＴ ＦＧ−β１／(NH₂)／β２(COOH)前駆体に対する 配列のコードを含み、組換え表現プラスミドによ りトランスフェクトされたチャイニーズハムスタ ー卵巣(CHO)細胞が合成され、そして正しく処理 され、生物学的に活性で成熟ＴＧＦ−β２を分泌 した。ＴＧＦ−β１／(NH₂)／ＴＧＦ−β２(COOH) と命名された、発現プラスミドによりコードされ たハイブリッド前駆体蛋白は、トランスフェクト されたＣＨＯ細胞において、後記実施例３で詳述 するように、イムノブロッティング、受容体結合 及びアミノ酸配列研究により決定されたとおりに、 正しく処理された。

組換えＴＧＦ−β２の成熟を指揮する、ＴＧＦ −β１アミノ末端前駆体ドメインの能力は、成熟 ＴＧＦ−β２の処理に伴う分子イベントに関して 問題を提起し、そして、ＴＧＦ−β１とＴＧＦ− β２は共通の成熟経路を共有するかもしれないこ とを示唆する。ＴＧＦ−β１前駆体のアミノ末端 ドメインは成熟ＴＧＦ−β１の処理において活性 な役割を果たすという示唆は、このドメインは前 駆体マンノース−６−ホスフェート受容体に結合 することを可能とするマンノース−６−ホスフ ェート残基を含むという知見により支持される (Purchioら、1988,J.Biol.Chem.263:14211〜 15215)。ＴＧＦ−β前駆体のマンノース−６−ホ スフェート受容体への結合は、分子をリソソーム に向けるように作用することがありうるもので、 そして、リソソームプロテアーゼの助けにより処 理が生じうる。ＴＧＦ−β１前駆体のアミノ末端 ドメインにおけるマンノース−６−ホスフェート 残基の存在は、ＴＧＦ−β１の成熟における前駆 体のこのドメインに対する機能的な役割に影響を 与える。このドメインを含むハイブリッドＴＧＦ −β前駆体が正しく処理されて成熟ＴＧＦ−β２ を形成するという出願人の発見は、ＴＧＦ−β１ とＴＧＦ−β２の双方によって共通にフォローさ れる成熟経路の存在を示唆している。それにもか かわらず、かかる経路が処理イベントを実行する 有効性及び効率は変動しうるものであり、それを フォローする前駆体分子の全体の構造組成物に依 存しているように思われる。この点に関し、完全 なＴＧＦ−β２前駆体の蛋白をコードするプラス ミドによりトランスフェクトされたＣＯＳ細胞は、 完全なＴＧＦ−β１、又は、ハイブリッドＴＧＦ −β１(NH₂)／ＴＧＦ−β２(COOH)前駆体蛋白の いずれかをコードしているプラスミドによりトラ ンスフェクトされたＣＯＳ細胞に比較して、成熟 成長因子を処理する際に、かなり効率的であるよ うに思われる（後記実施例４）。この観察された 処理の変化の理由は今のところ不明ではあるが、 プロテアーゼによる開裂箇所の認識が関連する因 子の中に存在するのかもしれない。例えば、プロ テアーゼ認識及び作用は、他のものよりも、特別 の二次構造に好都合であるかもしれず、そして、 一つの前駆体の形態は他のものよりも処理に対し てより好ましい基質であるかもしれない。

本発明は、又、精製された組換えＴＧＦ−β２ にも関する。生物活性なＴＧＦ−β２は、培養さ れたＣＨＯトランスフェクタントの血清を含まな い条件化された媒質から精製しうる。この精製法 に細部は、後記実施例３及び５で与えられる。本 発明の精製された組換えＴＧＦ−β２は、ＳＤＳ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分析 すると、還元条件下では単一の12KDの蛋白として、 非還元条件下では単一の24KDの蛋白として移動す るが、これは、調製物の均一性を示している。配 列の分析は、組換え生成物は正しく処理され、そ して、天然のＴＧＦ−β２と同一のアミノ末端ア ミノ酸配列を有していることを示している。受容 体結合の研究は、組換えＴＧＦ−β２(rＴＧＦ− β２）はヒト胚の口蓋の間葉(palatal mesenchyme) 細胞上のＴＧＦ−β受容体に結合することを示し ている。総括すると、本発明の精製γＴＧＦ−β ２は、免疫学的に、機能的に、そして構造的に天 然のＴＧＦ−β２と同一であるように思われる。

(5) ＣＯＳ細胞におけるＴＧＦ−β２の移行 (transient)表現 本発明の他の態様において、生物活性の成熟Ｔ ＧＦ−β２は、上記したハイブリッド前駆体の配 列をコードする、又は完全なＴＧＦ−β２前駆体 の配列をコードする、いずれかのものを含む発現 プラスミドでトランスフェクトされたアフリカグ リーンサルＣＯＳ細胞により製造される。比較分 析の目的のために、ＣＯＳ細胞は、完全なＴＧＦ −β１前駆体の合成をプログラムする構造体でト ランスフェクトされる。３つのケースすべてにお いて、成熟及び前駆体成長因子生成物は、トラン スフェクトされたＣＯＳ細胞により分泌される。

すべてのケースにおいて、成熟蛋白は生物学的に 潜伏した形態で大いに分泌され、トランスフェク トされたＣＨＯ細胞における生物学的に潜伏した ＴＧＦ−β１の分泌と一致した結果を生じている (Gentryら、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３
４１８〜３４２７)。

最高の生物活性の生成物を得るには、潜伏した形 態のものを活性化するルーチン化した酸性化工程 を必要とする。

ＴＧＦ−β２前駆体の配列のコードの表現する ＣＯＳトランスフェクタントは、ＴＧＦ−β１又 はハイブリッドＴＧＦ−β２(NH₂)／β２(COOH) 前駆体のいずれかのコード化配列を発現するＣＯ Ｓトランスフェクタントよりも、ずっと生物学的 に活性な蛋白を分泌する。後記実施例４で詳述す るように、この観察は、より少ない成熟ＴＧＦ− β２モノマーが、ＴＧＦ−β２前駆体を発現する 細胞において高分子量前駆体蛋白と関連して存在 することを示している。モノマー性ＴＧＦ−β１ とＴＧＦ−β１前駆体の間での、このようなジス ルフィド結合の会合は観察されており（Gentryら、 1977,Mol.Cell.Biol.,インプレス）、そして、 処理スキームにおける中間的な複合体として作用 するかもしれない。ＴＧＦ−β２前駆体でトラン スフェクトされた細胞により分泌された、増大さ れた生物学的活性の可能な説明は、ＴＧＦ−β２ は、ＴＧＦ−β１及びハイブリッドＴＧＦ−β１ ／β２前駆体よりも、より効率にプロテアーゼに より認識され、開裂されるということかもしれな い。又は、ＴＧＦ−β２前駆体の第二次構造の特 性が、他のＴＧＦ−β前駆体よりも、処理に対し て、ずっと敏感に反応するようにしているのかも しれない。増大されたレベルの生物活性組換えＴ ＧＦ−β２は、完全なＴＧＦ−β２前駆体遺伝子 を使用することにより得られるという提案は、後 述の(6)及び実施例５において議論される、本発 明の特別の態様に関連して、本出願人により得ら れた実験的なデータにより、更に支持されている。

(6) ＴＧＦ−β２−414前駆体遺伝子を使用する ＣＨＯ細胞におけるＴＧＦ−β２の安定な高レ ベルでの発現 後記実施例５により詳述される。本発明の特別 の態様において、高レベルのγＴＧＦ−β２が、 414アミノ酸ＴＧＦ−β２前駆体に対するコード 化配列を含む発現プラスミドによりトランスフェ クトされたＣＨＯ細胞により合成され、そして分 泌され、引き続き、メトトレキセートにより発現 が増幅された（β２(414)cl.32細胞）。ＴＧＦ −β２は潜伏された形態で分泌され、最高レベル の生物学的活性の検出のためには酸性化が必要で ある。精製されたｒＴＧＦ−β２のアミノ末端配 列は、成熟成長因子が予期された開列箇所（ＴＧ Ｆ−β２(414)のAla303）で蛋白分解的に処理さ れることを示している。さらに、ｒＴＧＦ−β２ のカルボキシ末端のシアノゲンブロマイドペプチ ドの蛋白配列分析は、無傷の蛋白を示唆している。

このように、ＣＨＯ細胞は、プロ−ＴＧＦ−β２ を正しく処理するために、相応のプロテアーゼを 保持している。プロ−、及び、成熟領域配列に特 異的な抗ペプチド抗体でのイムノブロットによる、 これらＣＨＯ細胞トランスフェクタントにより分 泌された組換え蛋白の分析は、非還元状態におけ るＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析がなされた時は、 130KD、105KD及び85KDの分子量をもつ、３つの 主要なプロ領域を含む蛋白が分泌されることを示 している。130KD及び105KDの蛋白のみがＴＧＦ −β２の３６７〜３７９番目の残基に対する抗体により 検出されることは、これらの蛋白は、成熟及びプ ロ−領域に特異的な配列の両方を含むことを示唆 しているのに対して、85KDの帯は恐らく、ダイマ ー性のプロ領域蛋白を表わしている。成熟ＴＧＦ −β２は、また、これらの抗体により検出される。

β２(414)cl.32により分泌される高分子量のプロ −領域含有蛋白は、β１cl.17細胞が、90〜110KD の一本鎖複合体を分泌する点で、β１cl.17によ り分泌されるものと異なる。ハイブリッドＴＧＦ −β１／β２発現ベクター（後記実施例３）によ りトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、β１cl. 17-条件化上清においてみられる90〜110KDの複 合体を主に分泌するので、この差異は分子のプロ 領域におけるジスルフィド結合パターンによるも ののようである。33番目のシステインがセリン で置き換えられた突然変異ＴＧＦ−β１前駆体 （Brunrerら、1989,J.Biol.Chem.264:13660 〜１３６６４）をコードするプラスミドでトランスフェ クトされたＣＯＳ細胞により条件化された上清中 にみられる、90〜110KD種の崩壊及び85KDのプロ 領域ダイマー出現は、さらに、プロ領域中でのジ スルフィド結合パターンは、これらの高分子量の 複合体の形成に有意に寄与することを示唆してい る。

還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分 画された後のイムノブロッティングによる、β１ (414)cl.32細胞からの条件化された媒質の分析は、 プロ領域の配列のみを含有する、12KDＴＧＦ−β ２モノマーと30〜42KD蛋白が分泌された主要な蛋 白であることを示している（後記実施例５）。こ れに対して、極く微量の未開裂プロＴＧＦ−β２ が見い出され、この観察は、これらの細胞から分 泌される［^３５Ｓ］−メチオニンと［^３５Ｓ］−システ イン、［^３２Ｐ］−オルトホスフェート、及び［^３Ｈ］ グルコサミンでラベルされた全蛋白の分析により、 更に、確認された（後記実施例５）。

前の実験は、γＴＧＦ−β２前駆体は、プロ− 領域内の３個のグルコシル化箇所の２つにおいて、 マンノース−６−ホスフェート（Ｍ−６−Ｐ）を 含有することを示している。ＴＧＦ−β２(414) 前駆体のプロ領域もグリコシル化されており、Ｍ −６−Ｐを含む（後記実施例５(2.3)。Ｍ−６− Ｐは、蛋白処理が行なわれる酸性の小胞にこれら の蛋白を運搬するための関与するＭ−６−Ｐ受容体 に結合するための認識マーカーとして作用するも のと考えられる(Kornfeld,1986,J.Clin.Invest. ７７：１〜６：Ｄａｈｍｓら.,1989,J.Biol.Chem.264: １２１１５〜１２１１８）。ＴＧＦ−β１前駆体は、受
容体が プラスチック(Plastic)に結合するとき(Purchio ら、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４
２１１〜１４２１５）、 又は、ＣＨＯ細胞の表面で過度に表現されるとき (Kovancinaら、1987,Biochem.Biophys.Res. Ｃｏｍｍ．１６０：３９３〜４０３）、Ｍ−６−Ｐ受容
体に結合す る。酸性プロテアーゼの作用を阻止する、モネン シン、クロロキン及び塩化アンモニウムのような 剤は、プロ−ＴＧＦ−β１の開裂を阻止し、この ことは、Ｍ−６−Ｐ受容体への結合及び酸性プロ テアーゼによる開裂は、ＴＧＦ−β１前駆体の処 理に関連するかもしれないことを示唆している (Shaら、１９８９，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，
３：１０９０〜１０９8)。

同一又は類似の経路が、ＴＧＦ−β２(414)前駆 体の処理に関連することもありうる。

前述したように、ｒＴＧＦ−β２は生物学的に 潜伏した形態で、β２(414)cl.32細胞により分泌 される。この現象は、γＴＧＦ−β１を分泌する 哺乳動物細胞に対して観察され、（Gentryら、1987, Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４１８〜３４２
７；Ｍａｄｉｓｅｎら、19 ８９，ＤＮＡ ８：２０５〜２１２；Ｗａｋｅｆｉｅｌ
ｄら、1989,Growth Ｆａｃｔｏｒｓ １：２０３〜２１８）、そして、少く
とも部分的に は、成熟ＴＧＦ−β１と高分子量プロ領域含有複 合体との非共有結合の結合物によるものかもしれ ない。

実施例１PC-3細胞からＴＧＦ−β２前駆体の ｃＤＮＡクローニング 次の実施例は、予めＴＧＦ−ベータ−２が分離 された、ヒトの前立腺癌セルライン、PC-3から の、ＴＧＦ−β２前駆体コード化配列のｃＤＮＡ クローニングを記載する。

(1) 材料及び方法 (1.1) 細胞の成長とＲＮＡ抽出 ヒトの前立腺セルライン、PC-3がタモキシフ ェンの補充された媒質中で成育された(Ikedaら、 １９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６：２４０６
〜２４１０）。10％の子牛 胎児血清と６単位／mlのインシュリンを含有する、 ドルベコ(Dulbecco's)の修飾イーグル(Eagle's) 媒質において、MCF-7細胞が成育された。他のす べてのセルラインは、インシュリンの存在しない 同一の媒質中で成育された。ポリアデニル化され たＲＮＡは、オリゴ[dT]−セルロースクロマトグ ラフィーにより分離された(Purchio及びFareed, １９７９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２９：７６３〜７６９）。

(1.2) ｃＤＮＡライブラリーの構築とスクリーニ ング タモキシフェンで24時間処理されたPC-3細胞 より分離されたポリアデニル化されたＲＮＡから、 二重鎖ｃＤＮＡが合成された。（Maniatisら、19 82,in Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spiring Habor Press,Cold Spring Habor, New York)1000塩基対より大きいｃＤＮＡ分画は、 lambda gt10にクローン化された（Webbら、1987, ＤＮＡ ６：７１〜７９）。ライブラリーは、最初に、
ＴＧＦ −β１とＴＧＦ−β２の間に維持された、ＤＮＡ コード化アミノ酸WKWIHEP（プローブ１）に相補 的な［^３２Ｐ］−ラベル化24重（fold）変成プロー ブで重複してスクリーンされた： ポジティブなクローンは、次に、ＤＮＡコードア ミノ酸CFRNVQD（プローブ２）に相補的な２番目 の128重変成プローブでスクリーンされた；これ らの７個のアミノ酸の５つはＴＧＦ−ベータ２に 特異的であった： 交雑は、42℃で、６×ＳＳＣ、５×デンハルト (Denhart)溶液、0.15mMピロリン酸、100マイ クログラム／mlの変性子牛胸腺ＤＮＡ、100マ イクログラム／mlのイーストｔＲＮＡ及び1mM のＥＤＴＡ中で実施した(Maniatisら、1982,in Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Habor Press,Cold Spring Harbor,New York)。フィルターを２×ＳＳＣ、0.1％Na Dod SO₄中で、30分間、４回、42℃にて洗った。

幾つかのｃＤＮＡクローンが分離され、両方のプ ローブに交雑され、pEMBLヘキブクローンされた (Danteら、1983,Nucleic Acids Res,11:16４５〜 1654)。2.6kbのインサートを含有する１個のク ローン(pPC-21)が、特別のオリゴヌクレオチド プリミング(priming)と結合された種々の制限及 びエクソヌスレアーゼIII欠失（deletion）断片を 使用して（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９８４，Ｇｅｎｅ ２
８：３５１〜３５９）、 ジデオキシチェーンターミネーション法（chain- termination）により、両方の鎖にシークエンス された。（Songerら、1977,Proc.Natl.Acad. Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３〜５４６７）。2.2kb
インサートを含 む他のクローン（pPC-14）が部分的にシークエン スされた。リーバーサイドサイエンティフィク社 (Riverside Scientific Enter prises;Seattle, WA)から得られるジーンプロソフトウェア(Gene Pr- o software)を使用して、IBM ATPCで、ドットマ トリックス分析が実施された。

(1.3) ノーザンブロット分析 ポリアデニル化されたＲＮＡが、１％アガロー スホルムアルデヒドゲル上で分画され(Lehrachら、 １９７７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６：４７４３
〜４７５１）、ナイロン膜 に移され(Hybond,Amersham)、そして、［^３２Ｐ］ −ラベル化プローブに交雑させた。交雑は、42℃ で、0.9MのNaClを含む50％ホルムアミド、50 mMのリン酸ナトリウム（pH7.0）、5mMのＥＤＴＡ、 0.1％のNa Dod SO₄、４×デンハルト溶液、0.4 mg／mlのイーストｔＲＮＡ、及び0.25mg／mlの変 性子牛胸腺ＤＮＡ中で実施された。フィルターは、 65℃で、0.25×ＳＳＣ、0.1％Na Dod SO₄中で 洗浄され、乾燥され、そして、照射及び増巾スク リーン(Lightening Plus intersifier screens: Dupont)により、クロネックス(Cronex)−4Ｘ線 フィルム(Dupont)に露光された。

(2) 結 果 ｃＤＮＡライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）は、タモキ
シ フェン(tamoxifen)で処理されたPC-3細胞から 単離されたポリアデニル化ＲＮＡを用いて構築さ れた。より初期の観察は、タモキシフェン処理は ＴＧＦ−β２の分泌を２ないし５倍増加させるこ とを示した(Ikeda et al.,1987.Biochemistry 26:2406-2410)。該ライブラリーは、上述したプ ローブ１および２で選抜（screen）した。５つの クローンを得、両プローブにハイブリッド化した ：2.6kbの挿入物(insert)を含む１つのクローン、 pPC-21は、シーケンシング(sequencing)のために 選択された。2.2kbの挿入物(insert)を含むもう 一つのクローン、pPC-14は部分的に配列(sequence) された。該ＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配列 を第１図に示す。

pPC-21は、アミノ酸442個の推定されるポリペ プチドをコードする単一の開放読み枠を含む;112 個のカルボキシ末端のアミノ酸は、成熟(mature) ＴＧＦ−β２モノマー（第１ａ図中に組込まれて いる）を含む。該開放読み枠によってコードされ る最初のメチオニンの直後に、シグナルペプチド の特徴である連続した疎水性の荷電されていない アミノ酸（第１ａ図にオーバーラインされている） が続く。このメチオニンをコードするヌクレオチ ド配列も該開放読み枠に存在するその次の二つの メチオニンをコードするヌクレオチド配列も開始 メチオニン(initiating methionine)配列(Kozak， 1986.Cell 44:283-292)についての一致配列 (consensus sequence)に一致しない。翻訳は、普 通、開放読み枠における最初のメチオニンで始ま り、ＴＧＦ−β１に相応する領域は、以下に論じ るように、２番目のメチオニンの上流に存在する ので、最初のメチオニンが翻訳開始部位であると 推定した。そして、ＴＧＦ−β１に似ているＴＧ Ｆ−β２は、非常に大きな分泌された前駆体の一 部として発現されると思われる。pPC-21クローン は、推定上の開始メチオニンの上流に467bp、お よびその上流にポリアデニル化シグナル配列(poly- adenylation signal sequence)(Proudfootnd Brownlee,1976.Nature 263:211-214)が存在す る15個の塩基であるポリ［Ａ］痕跡（track）を含 む約800bpの3'非翻訳領域を含む。

ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２ pPC-21ｃＤ ＮＡクローンのコード領域（coding regions）内 のヌクレオチド配列の相同性は、53％であると決 定された。成熟（mature）蛋白質をコードする該 領域は57％の相同性を有し、一方、その上流の前 駆体領域は48％の相同性を有する。該二つの配列 を最適に整列させた後、数個のヌクレオチドの挿 入がＴＧＦ−β２前駆体領域中に示され、その一 つはヌクレオチド75個に達した。これらの挿入が ＴＧＦ−β２中の過剰エキソン(extra exsons)の 存在に起因するか否かは知られていない。該二つ のクローンの非コード領域(non-coding regions) 中のＤＮＡ配列の間には有意な相同性は検出され なかった。実際に、ＴＧＦ−β１は拡張された (extended)Ｇ−Ｃに富む非コード領域(non-coding regions)を有するが、ＴＧＦ−β２は広い(exten- sive)Ａ−Ｔに富む非コード領域（non-coding regions）を有する。両ｃＤＮＡクローンは、（プ リン）CCCC(Sharples et al.,1987,DNA 6:239- 244)からなるＴＧＦ−β１中の、およびＡＴＧま たはＡ（ピリミジン）（プリン）中の反復(repeats) とともに3'非コード領域(non-coding regions)中 に反復する構造的モチーフを含む。

多くのクローンの制限酵素切断地図作成は、一 つのクローン、pPC-14がＴＧＦ−β２をコードす る配列のアミノ部分(amino portion)に位置するKpn I制限酵素部位を欠いていることを示した。

pPC-14及びpPC-21の制限酵素切断地図を第１ｄ図 に示す。pPC-14は、第１ａ図中のヌクレオチド 277ないし296に相補的な20-merオリゴヌクレオチ ドで特異的にプライミング(priming)することに よって該分子のこの領域に対応する連続した約100 個のヌクレオチドにわたって配列(sequence)され た。この結果はpPC-14クローンは87ヌクレオチド の欠失(deletion)（第１ａ図におけるヌクレオチ ド位置346ないし432；第１ｅ図も参照）を含み、 この欠失は欠けているKpnI制限酵素部位を明ら かにし、これは配列ＡＡＴ、すなわちアスパラギ ンについてのコドンで置き換えられていることを 示す。この結果は、pPC-14クローンが、アミノ酸 残基116ないし144が欠失され単一のアスパラギン 残基で置き換えられていることだけで、pPC21に よってコードされる配列と異なる、より短いアミ ノ酸414個のＴＧＦ−β２前駆体をコードするこ とを示唆する。pPC-14の完全なコード領域は決定 されなかったが、KpnI制限酵素部位を除き、該 二つのクローンの制限酵素切断地図が完全に重 なることから（第１ｄ図）、これは、おそらく pPC-21がコードする配列と完全に一致する。更に、 同様の29アミノ酸の欠失および置き換えを含む 414アミノ酸ＴＧＦ−β前駆体をコードするサル (simian)クローンは、後の第７節で述べるように、 同定された。このサル(simian)クローンは、領域 5'および3'ないし該欠失において(in the rgions 5'and3'to the deletion)、ヒトpPC-21クロー ンのそれにほとんど一致するコード配列(coding sequence)を有する。

第２Ａ図は、ヒトＴＧＦ−β１の推定された蛋 白質配列（Derynck et al.,1985.Nature 316: 701-705)をヒトＴＧＦ−β２−442のそれと比較 して示す。ＴＧＦ−β2は、先に報告(Marquardt et al.,1987,J.Biol.Chem.,262:12127-12131) された分子の成熟部分（mature portion）全体で ヒトＴＧＦ−β１と71％相同であることが決定さ れた。該成熟分子(mature molecure)の上流の前 駆体のアミノ部分は、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ −β２−442の間で31％の相同性を示した。第２ Ｂ図に示したドット・マトリックス相同性（dot matrix homology）の比較は、該蛋白質のいくつか の特定領域(specific areas)に有意の相同性が依 存することを示す。推定上のシグナルペプチド領 域中のＮ−末端アミノ酸配列の比較は、有意の相 同性を示さない。

ＴＧＦ−β２ではシグナル配列の開裂部位は、 ＴＧＦ−β１中のアミノ酸20（セリン）の後とア ミノ酸29（グリシン）の後にある予想される(Von Heijne,1983,Eur.J.Biochem.133:17-21)。

この開裂部位は、下流の34個のアミノ酸に及びＴ ＧＦ−β１とＴＧＦ−β２の間の相同性の最初の 遮断(block)の直前にある。該シグナル配列の脱 離後、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２の前駆体 は、位置４のシステインを含む最初の４個のアミ ノ酸上に同一のＮ−末端を分配するであろう。こ の推定上のＮ−末端の下流の14個のアミノ酸、次 の21個のアミノ酸の外の19は、ＴＧＦ−β１とＴ ＧＦ−β２の間に保存され、Ｃ−末端でもみられ るいかなるものよりも大きな相同性遮断(homology block)は成熟蛋白質(the mature protein)を含む。

長続きの非相同性アミノ酸によって分離された強 い相同性のいくつかのより多くの遮断(several m ore blocks)は、第２Ａ図及び第２Ｂ図にみられ るような成熟蛋白質(the mature protein)の下流 の領域内に存在する。

該ＴＧＦ−β２前駆体は、３つの潜在的なＮ− グリコシル化部位（第１ａ図における残基72、 168、および269に位置する）を有する。その最 初の部位だけがＴＧＦ−β１中に保存され、保存 された残基（conserved residues）のより大きな 遮断(block)内にあり、この潜在的なグリコシル 化部位が重要な構造的および／機能的特徴を有す ることを示唆する。

シグナル配列の脱離後、該ＴＧＦ−β２前駆体 は、そのＴＧＦ−β１相対物(counterpart)より 多くの31または59個のアミノ酸を含むであろう。

ＴＧＦ−β２中の更なるシステイン残基は、成熟 配列(the mature sequence)の前にある非相同性 アミノ酸の大きな領域のちょうど上流に位置する。

ＴＧＦ−β１と同様に、成熟ＴＧＦ−β２蛋白質 の開裂部位は、第２Ａ図に示したように４−５個 の塩基性アミノ酸の領域のちょうど後にある。該 成熟領域(the mature region)は、９個のシステ インを含む。該９個のシステインのうちの７個 の保存（conservation）は、該ＴＧＦ−β系統群 (family)の異なる一員(members)の特徴を示す。

ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２の水治法(hydro- pathy)分析は、前駆体および成熟領域の両者にお いて、自然界で一般に親水性である両蛋白質と類 似のパターンを示す。

第３Ａ図は、BSC-40(an African green monkey 腎細胞系統）およびタモキシフェン(tamoxifen) で処理されたPC-3細胞からのプローブ(probe) ポリアデニル化ＲＮＡに大してpPC-21を用いるノ ーザンブロット分析を示す。PC-3細胞は、大き さ4.1、5.1および6.5kbの３つの主なＴＧＦ− β２−特異的ｍＲＮＡ種を含む（第３Ａ図、レー ン２）；BSC-40細胞は、主に4.1および6.5kbの 転写物(transcript)とより少量の5.1kbのＲＮＡ を含む（第３Ａ図、レーン１）。

該pPC-21は、ここで用いられるハイブ リダイゼーション条件下でこの細胞系統に存在す る2.5kbのＴＧＦ−β１−特異的ｍＲＮＡ種を検 出しないことに留意すべきである。これらの結果 および先の観察(Sharples et al.,1987,DNA 6: 239-244)は、BSC-40細胞がＴＧＦ−β１およびＴ ＧＦ−β２−特異的ｍＲＮＡの両者を含むことを 示唆する。これをより明らかに証明するために、 ノーザンブロットを、同じ比放射能まで放射標識 された等量のＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２プ ローブを含む混合物に対してハイブリッド化した。

第３Ｂ図のレーン１は、BSC-40細胞が2.5kbのＴ ＧＦ−β１−特異的ｍＲＮＡならびに4.1および 6.5kbのＴＧＦ−β２ｍＲＮＡ種を含むことを 示す；第３Ｂ図のレーン２は、タモキシフェン (tamoxifen)で処理されたPC-3細胞も2.5kbの ＴＧＦ−β１−特異的ｍＲＮＡを含むことを示す。

第３Ｂ図は、また、タモキシフェン(tamoxifen) で処理されたPC-3細胞がＴＧＦ−β２−特異的 メッセージより多くのＴＧＦ−β１−特異的メッ セージを含むことを証明する。

ＴＧＦ−β２−特異的ｃＤＮＡクローンの同定 によって、我々は、種々の細胞系統におけるＴＧ Ｆ−β２ｍＲＮＡを選抜(screen)することができ た。第４図に示されたノーザンブロットは、ＴＧ Ｆ−β２−特異的転写物(trascript)がHBL100 （人乳由来の正常上皮細胞）、MCF-7（ヒト乳癌 細胞系統）、SK-MEL28（メラノーマ細胞系統）中 で検出され得たことを示し、ＫＢ細胞（鼻咽頭癌 細胞系統）は非常に低いレベルのＴＧＦ−β２ｍ ＲＮＡを含む。

実施例２：BSC-40細胞からのＴＧＦ−β２前駆体の ｃＤＮＡクローン化学 以下の実施例は、ＴＧＦ−β２特異的ｍＲＮＡ を含むと示された（前の第６節）African green monkey腎細胞系統、BSC-40からのＴＧＦ−β２を コードする配列のｃＤＮＡクローン化について述 べる。結果は、ヒトＴＧＦ−β２に似ているサル ＴＧＦ−β２が、二つのより長い前駆体の少なく とも一つとして合成され、これから成熟ＴＧＦ− β２分子が蛋白質分解開裂によって誘導されるこ とを示す。

(1)材料および方法 (1.1) 細胞の成長およびＲＮＡ抽出 BSC-40細胞は、10％ウシ胎児血清を含むDulbecco の変性イーグル培地中で成長させた。ポリアデニ ル化ＲＮＡは、記述されたように（Purchio and Fareed,1979.J.Virol,29:763-769）オリゴ ［dT］−セルロース・クロマトグラフィーによっ て単離した。

(1.2) ｃＤＮＡライブラリー構築およびスクリー ニング 二重鎖ｃＤＮＡは記述されたように(Maniatis et al.,1982.Moleculer Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Sprig Harbor.NY.371-372)BSC-40ポリアデ ニル化ＲＮＡから合成し、EcoR Ｉメチラーゼで処 理した後、EcoR Ｉ制限酵素認識部位を含むオリゴ ヌクレオチド・リンカー（EcoR Ｉリンカー）に連 結（ligate）させた。核ｃＤＮＡは、EcoR Ｉで消 化し、Sephacry1 S-1000のクロマトグラフィー によって分画した。750塩基対より大きなｃＤＮ Ａ画分をプールし、EcoR Ｉで切られたラムダgt10 (Davis et al.,1980.A Manual for Genetic Engineering;Advanced Bacterial Genetics;Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Hardor, NY)に連結(ligate)させ、パッケージし(Grosveld et al.,1981,Gene 13:227-237)、E.col i C₆₀₀ rk^-mk⁺hfl上にプレート化(plate)した。該ライ ブラリーは、［^３２Ｐ］−標識pPC-21およびpPC-14 プローブに対するプラーク・ハイブリダイゼーシ ョン（Bentonet et al.,1977,Science 196:180- 182)によって選抜(screen)した。pPC-21プロー ブをハイブリッド化したクローンpBSC-40-16、お よびpPC-14プローブをハイブリッド化したクロー ンpBSC-40-1を単離し、pEMBLへサブクローン化 した。pBSC-40-1のＴＧＦ−β２をコードする配 列は、ジデオキシ読終り法（the dideoxy chain- termination method)(Sanger et al.,1977,Proc. Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467)を用いて両 鎖をシーケンシングsequencing)することによっ て決定された。pBSC-40-16は部分的に配列決定 (sequence)された。

(2) 結 果 ヒトＴＧＦ−β２−442およびＴＧＦ−β２− 414前駆体をコードする配列から構築されたプロ ーブに対して選択的にハイブリッド化したBSC-40 ｃＤＮＡライブラリーから二つのクローンを得た。

ＴＧＦ−β２−442プローブに対してハイブリ ッド化したクローンpBSC-40-16は、第１ａ図にお ける位置346ないし432からの29アミノ酸セグメン トについてのコード配列を含むと予想された150 ヌクレオチド・ストレッチ（第１ａｚ図におけるヌ クレオチド300ないし450）にわたって配列決定 (sequence)された。この結果は、この領域上で、 pBSC-40-16が、ヒトＴＧＦ−β２−442ｃＤＮＡ クローンが、pPC-21中の対応する配列と同一のアミ ノ酸配列をコードすることを示し、pBSC-40-16が 442アミノ酸ＴＧＦ−β２前駆体をコードするこ とを示唆する。

ＴＧＦ−β２−414プローブに対してハイブリ ッド化したクローンpBSC-40-1は、全コード領域 にわたって配列決定(sequence)された。この結果 は、ヒトＴＧＦ−β２−442のアミノ酸残基116 ないし144が欠失（delete）され、単一のアスパ ラギン残基で置き換えられていることを除き、ヒ トＴＧＦ−β２−442前駆体と同一の414アミノ 酸ＴＧＦ−β２前駆体をこのクローンがコードす ることを示す。ヌクレオチド・レベルで、pBSC-40 1は、欠失領域(deletion region)においてヒト ＴＧＦ−β２−442と異なる：第１ａ図における ヌクレオチド346ないし432は、欠失（delete） され、アスパラギンについてのコドン、ＡＡＴで 置き換えられている。13個の発現しない塩基の変 化を除き、該二つの構造は、その他の点ではコー ド配列の残部にわたって完全に相同である。

実施例３：ＣＨＯ細胞におけるＴＧＦ−β２の発 現 以下の実施例は、SV40プロモーター配列の調節 制御下における、下流でかつフレーム内(in-frame) でサルＴＧＦ−β１前駆体についてのコード配列 と連結（ligate）された成熟ヒトＴＧＦ−β２に ついてのコード配列を含む組換え体プラスミドで トランスフェクト（transfect）されたChinese Hamster Ovary細胞（ＣＨＯ細胞）における成熟 した(mature)生物学的に活性なＴＧＦ−β２の発 現について述べる。該構築物(the construct)は、 成熟した(mature)生物学的に活性なＴＧＦ−β２ を、約0.4mg／Ｌのレベルで合成し分泌させた。

(1) 材料および方法 (1.1) 細胞培養 ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）−欠損 Chinese Hamster Ovary（ＣＨＯ）細胞(Urlaud and Chasin,1980 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 77:4216)を、10％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およ び１５０μｇ／mlのＬ−プロリンを補足したHam's F-12培地（Gibco Laboratories.NY）中で増殖 (propagate)させた。ペニシリンおよびストレプ トマイシンを、それぞれ100U／mlおよび１００μｇ／ ml含ませた。ＣＨＯトランスフェクタント(tran- sfectants)は、上で示したものと同様の補足物を 含むDulbeccoの変性イーグル培地中で成長させた。

ＣＨＯ細胞およびそれらの誘導体は、１：５の分 割比でトリプシナイゼーション(trypsinization) するそとによってルーチンに継代(passage)させ た。

メソトレキサート(Sigma,M0)は、水中10mg／ mlの貯蔵濃度(stock concentration)で調製し、 最終pH６まで希NaOH(0.2M)を加えて可溶化させた。

該貯蔵物(the stock)は滅菌濾過し、−20℃で貯 蔵した。培地(media)中のメソトレキサートの貯 蔵溶液(stock solution)(100uM)は、１カ月以 下の間４℃に保持した。

(1.2) ＤＮＡ操作およびプラスミド構築 制限酵素、Ｔ_４ＤＮＡリガーゼ、子ウシ(calf) 腸管ホスファターゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩの Klenow断片および他のＤＮＡ試薬は、Bethesda Research Laboratories,MDから購入した。標準 ＤＮＡ操作は、Maniatis,T.,et al.,1982, Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Habor Laboratory,New Yorkに概説さ れたように行なった。

サルＴＧＦ−β１ｃＤＮＡおよび縦列の(intan dem)マウスＤＨＦＲ遺伝子ならびに介在SV40配列 を含むプラスミドpSV2（β１−ＴＧＦ−dhfr） は、記述されたように(Gentry et al.,1987,Mol. Cell.Biol.7:3418)構築した。

プラスミドpSV2／β１−β２／dhfrは、後の 第8.2節で概説するように構築した。

(1.3) ＤＮＡトランスフェクション ＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞１０^６個を100mmの皿 上に接種後約24時間に、培養物(culture)をリン 酸カルシウム沈澱物としてのNdeＩ線状化(linea- rized)pSV2−（β１−ＴＧＦ−dhfr）プラスミ ド２０μｇでトランスフェクト（transfect）した (Wigler,M.,et al.,1979,Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.76:1373-1376）。簡単に、20μｇの 線状化（linearized）ＤＮＡを１mlの250mM無菌 CaCl₂に加えた。次いで、１mlずつの２×ＨＥＰ ＥＳ溶液（280mM NaCl、50mM ＨＥＰＥＳ、1.5 mMリン酸ナトリウム、pH7.1）を滴下し、混合物 を氷上に30分間置いた。次いで、沈澱物を、細胞 を含む10mlのＦ12培地(the cells containing 10 ml ｏｆ ｔｈｅ Ｆ１２ ｍｅｄｉａ）上に滴下・分
散させた。37 ℃で４時間インキュベーションした後、培地を除 去し、25％グリセリンを含む10mlのＦ12培地で90 秒間室温で置き換えた。細胞を20mlのＦ12培地で 洗浄し、非選択Ｆ12培地（20ml）中で更に48時間 インキュベートした。ＤＨＦＲ−発現トランスフ ェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ）についての
選択を、 該培地を10％透析ＦＢＳ（Gibco,N.Y.）および１ 50μｇ／mlのＬ−プロリンを補足したＤＭＥＭで 置き換えることによって行なった。細胞を該選択 培地中で10−14培養した後、コロニーが観察さ れた。10個のコロニーをパスツール・ピペットで 吸引し、拡張させた。

(1.4) メソトレキサート耐性細胞の選択 ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）−増幅細胞 は、本質的に記述されたように（Gasser,C.S. and Schimke.R.T.,1986.J.Biol.Chem.261 :6938-6946）一次トランスフェクタント（the primary transfectants）から誘導された。拡張 (expansion)後、細胞10^５個を100mmの皿上に接 種し、ますます増加する濃度のメソトレキサー トに適応させた。最大メソトレキサート濃度で 可視コロニーを含むプレートをトリプシナイズ (trypsinize)し、その濃度のメソトレキサートに、 少なくとも２回の更なる１：５細胞継代の間適応 させた。次いで、細胞（10^５）を、その濃度の５倍 のメソトレキサート中で100mmの皿上に接種した。

可視コロニーを含む皿を再びトリプシナイズ (trypsinize)し、メソトレキサートを含む培地に 適応させた。細胞を、40％ＦＢＳ、10％ジメチル スルホキシドおよび50％ＤＭＥＭを含む培地中で 種々の段階の増幅で凍結させた。メソトレキサー トは、凍結培地には加えなかった。

(1.5) 成長阻害分析 ＴＧＦ−β１に極めて感受性であるイタチ肺上 皮細胞、Mv 1 Lu（受託番号CCL-64,American Type Culture Collection）を成長阻害分析に用いた。

分析はＤＮＡ合成を評価するためにチミジン類 似体5'−［^１２５Ｉ］−ヨード−2'−デオキシウリジ ン（¹²⁵IdU）を用いて行なった。活性の１単位は、 未処理のCCL-64細胞に比較して、¹²⁵IdUの取込み を50％阻害するのに必要な量として定義した。

トランスフェクト(transfect)された細胞を活 性ＴＧＦ−β２の分泌について分析するため、無 血清上清(serum free supernatants)を、細胞の 集密的培養（confluent cultures）における１回 の24時間の採集（one 24-hour collection）から 集め、0.2M酢酸に対して広く透析した。凍結乾 燥によって酢酸を除去し、試料を分析用の無菌完 全培地中に再溶解した。

(1.6) 組換え蛋白質の精製および配列分析 １β９、12.5 CL36細胞からの無血清無細胞上 清（serum and cell-free supernatants）を1M 酢酸に対して酸性化し、濃縮し、0.2M酢酸に対 して透析し、0.1％ＴＦＡ、40％CH₃CNを用いて Bio-Sil TSK-250カラム上でゲル濾過クロマトグ ラフィーに付した。活性画分をプールし、H₂O中 の0.05％ＴＦＡで１：１に希釈し、有機調節剤 （organic modifier）として0.05％ＴＦＡおよび CH₃CNを用いてμＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ_１８カラム（3.9
×300 mm）上でクロマトグラフィーに付した。活性画分 を再びプールし、H₂O中の0.05％ＴＦＡで１：１ に希釈し、有機調節剤（organic modifier）とし てH₂O中の0.05％ＴＦＡおよび１−プロパノール を用いて同様のカラム上で再びクロマトグラフィ ーに付した（Ikeda et al.,1987,Biochemistry 262406-2410）。アミノ酸配列分析は、モデル470 Ａアミノ酸シーケンサー(sequencer)(Applied Biosystems)上で行なった。組換えＴＧＦ−β１ （ｒＴＧＦ−β１）は、記述されたように(Gentry et al.,1988,Mol.Cell,Biol.8:4162-4168) β−３−2000細胞のならし培地から精製した。

(1.7) ペプチド合成と抗体の作製 ペプチドは、Beckman 990自動シンセサイザー 上で固相法により合成し、前記のように樹脂担体 から分離した(Gentry et al.,1987,MOl.Cell. Biol.7:3418-3427;Gentry and Lawtor,1986, Virology 152:421-431)。ペプチドは高速液体ク ロマトグラフィーで精製し、アミノ酸組成を分析 的に確認した。

合成されたペプチドは、前記のようにウシγ− グロブリンと結合させた(Gentry et al,.1987, Mol.Cell.Biol.7:3418-3427;Gentry and Lawtor,1986,Virology 152:421-431)。ニュージ ーランドホワイトラビットに対し、皮下及び皮内 合わせて３〜６箇所に、フロイントの完全アジュ バントでエマルジョンとした上記のペプチドコン ジュゲートを一次免疫注射した。追加免疫注射は ２−３週間の間隔で行った。ウサギは、追加免疫 の後７−14日飼育した。

(1.8) イムノブロッティング タンパクはＳＤＳ−ポリアクリルアミドの7.5 ％−17.5％のグラジェントゲル上で分画し、修飾 していないニトロセルロース（０．４５μｍ，Ｓｃｈｌ
ｅｉ− cher及びschnell）上に４℃、200mAの条件下で 14−18時間かけて移した。ニトロセルロース上の 余剰の結合部は、0.2％NP-40を含むＰＢＳに溶 かした2.5％〔ＢＬＯＴＴＯ〕（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．
Ａ．，ｅｔ ａｌ．， 1984,Gene Anal.Tech.1:3-8)でブロッキング した。2.5％〔ＢＬＯＴＴＯ〕溶液で１：75に希釈した 抗ウサギ抗体を、ブロッキングしたニトロセルロ ースシートとともに室温下で２時間インキュベー トした。2.5％〔ＢＬＯＴＴＯ〕溶液中で５分間の洗浄 を行うことにより余剰の抗体を除去した後、2.5 ％BLOTTOで１：500に希釈したアルカリホスフ ァターゼ−プロテインＡコンジュゲート（溶液） で当該ニトロセルロースシートをインキュベート した。１時間のインキュベート後、0.2％NP-40 を含むＰＢＳでニトロセルロースシートを５回洗 浄し、発色させた。（Lecry et al.,1983,Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:4045-4059)。

(1.9) レセプターバインディングアッセイ 前記のクロルアミンＴ法を用いて、γＴＧＦ− β２及びγＴＧＦ−β１を［^１２５Ｉ］で比活性100 −１５０μＣｉ／μｇとなるように標識した(Frolik et al.,1984,J.Biol.Chem.259:10995-11000)。

細胞数約３×10⁵のヒト胎児に蓋間充織細胞を結 合バッファー（ＤＭＥＭに0.1％ＢＳＡと25mM Hepes緩衝液との混合物、pH7.2）で２回洗浄し てから、同バッファーで37℃下２時間インキュベ ートし、細胞表面レセプターで結合しているＴＧ Ｆ−β１を解離させた。バッファーを捨て、単層 （ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）１μＣｉの［^１２５Ｉ］−ＴＧ
Ｆ−β１も しくは［^１２５Ｉ］−ＴＧＦ−β２とともに、１０００
μ ｇ／mlの対応する（同種の）非標識タンパクの存在 下又は非存在下、４℃で３時間インキュベートし た。単層を氷冷温の結合バッファーで２回洗浄し、 ２５０μＭのスベリン酸ジスクシンイミドで４℃下15 分間インキュベートした。単層を再度ＰＢＳで３ 回洗浄し、１％のトライトンＸ−100,10mMトリ ス，1mM ＥＤＴＡを含むpH7.0の溶液で可溶化し た。可溶物質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ルによる分析の前に、12,000×ｇで遠心分離した。

(2) ＴＧＦ−β２発現のためのＴＧＦ−BETA1／ ＴＧＦ−BETA2ハイブリッド前駆体遺伝子の構 築 サルＴＧＦ−β１前駆体をコードする部分と5' 側の非翻訳配列からなるＴＧＦ−β前駆体遺伝子 ハイブリッドはフレームにおいてヒトＴＧＦ−β ２の成熟〔matureな〕遺伝子と結合し、3'側の非 翻訳配列は図１ｃのように構成した。

pPC-21をEcoR Ｉで切断し、クレノウ酵素で処理 (filled-in)して、該2.3kbのフラグメントを Hinc IIで切断したpEMBLに連続させ、これをE.coli の形質転換に用いた。反対側に挿入部位を有する ２つのクローンを、即ちpPC-21／Hinc II⁺及びpPC- 21／Hinc II^-を、Sst I及びBamH Iで切断するこ とによりExo IIIによる被切断クラグメントの重複 を起こすために用い、これにさらにExo IIIによる 切断、クレノウ修復、該ＤＮＡの再結合、そして E.coliの形質転換と続く処理を行った。２つのク ローンExo5.9及びExo25Cが、各々異なる長さ の5'及び3'（末端側の）配列を有していることが わかり、これらをpEMBL中にサブクローン化して pEMBL5.9及びpEMBL25Cを得た。

pEMBL5.9をHind IIIで切断し、クレノウ酵素で末 端を二重鎖にそろえ、さらにKpn Iで切断して0.6 kbのフラグメント（フラグメント１）を分離した。

Exo25Cは、EcoR I及びKpn Iで切断して、1.1Kb のフラグメント（フラグメント２）を分離した。

pGS62はBamH Iで切断し、クレノウ酵素で処理 （fill in〕し、さらにEcoR Iで切断してフラグ メント１及び２に連結させた(pGS62は、pGS20 (Mackett et al.,1984,J.Virol.49:857)の EcoR Ｉによるシグナル切断部位を除去することにより 得た。）。この混合物をE.coliの形質転換のため に採用pGS62／CIFBを単離した。

pGS62／CIFBをPst I及びEcoR Iで切断して１600 bpのフラグメントを単離し、これをさらにXho II で切断した。得られた400bpのXho II−EcoR Iに よるフラグメントを単離した（フラグメント３）。

〔ｐＳＶ２−ｂｅｔａ−ＴＧＦ〕（Ｇｅｎｔｒｙ ｅｔ
ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４１８〕をApa I及びEcoR
Iで切断 して3000bpの大フラグメントを分離した（フラグ メント４）。

下記のような２種の相補的ＤＮＡ鎖を合成して リン酸化し、アニーリングして、上記フラグメン ト３及び４に連結させた。

'5 CAA CAT CTG CAA AGC TCC CGG CAC CGC CGA GCT TTG GAT GCG GCC TAT TGC TTT AGA AAT GTG CAG GAT AAT TGC TGC CTA CGT CCA CTT TAC ATT GAT TTC AAG AGG
3' 5' GATC CCT CTT GAA ATC AAT GTA AAG TGG ACG TAG GC
A GCA ATT ATC CTG CAC ATT TCT AAA GCA ATA GGC CG
C ATC CAA AGC TCG GCG GTG CCG GGA GCT TTG CAG AT
G TTG GGCC 3' これをE.coliの形質転換に用い、プラスミド ｐβ１／β２を分離した。

プラスミドｐβ１／β２をEcoR Iで切断し、Ｄ ＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで処 理し、Hind IIIで切断して1600bpのフラグメントを 分離した。pSV2.β１／β２は、pSV2中にこの フラグメントを挿入することにより作製した。こ のネオは、ネオジーンを除去するためにあらかじ めHind III及びHpa Iで切断していた。

pSV.β１／β２をPvu I及びEcoR Iで切断して クレノウ酵素で処理し、さらにNde Iで切断して （約）2.6kbのNde I-EcoR Iフラグメントを分離 し、〔ｄｈｆｒ〕Ｎｄｅ Ｉ及びPvu IIで切断していた
pSV ２に連結した。該連結物をE.coliの形質転換に供 しpSV2／β１−β２／dhfrを分離した。

(3) ＣＨＯ細胞中のＴＧＦ−BETA2の(expression) pSV／β１−β２／dhfrをＤＨＦＲ−陰性（欠 失性の）ＣＨＯ細胞に対してトランスフェクトさ せるために用い、〔materials and methods〕に 記載した１次トランスフェクタントからＤＨＦＲ −増巾細胞を得た。陽性のクローンは〔Section ８．１．５〕ｓｕｐｒａ〕に記載された生長阻害アッセ
イ 法を用いた同定した。組換えタンパクは、成熟し たＴＧＦ−β２中に存在するNH₂-YIVTINPEASAS PC-COOH(Gentry et al.,1987,Mol.Cell.Biol. 7:3418)に対する抗ペプチド抗血清を用いたウエ スタンブロッティング法により検出した。最適な （ＴＧＦ−β２）の生物活性の検出には、分析前 に〔ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（酸性化能）ｓｔｅ
ｐ〕を必要とし た。

１つ（１株）のライン（セルライン、細胞株） １β９，12.5が240ng／mlのＴＧＦ−β２を分泌 （生産）することを見出した（第５図）。この株 を96穴のプレートで限界希釈（法）によりクロー ニング（クローン化）した。１つのクローン１β ９，12.5,CL36は約400ng／mlを生産（図５）、 次いで特性決定するために選択された。

クローン１β９，12.5,CL36の分泌するタンパ クを、抗血清を用いたウエスタンブロッテイング （法）により分析した結果を図６に示す。天然の 24kdのＴＧＦ−β２二量体が、より高分子の（約 90kd）前駆体とともに存在していることがわかる。

(4) トランスフェクトしたＣＨＯ細胞により分泌 される組換えタンパクの分析 ＣＨＯ細胞により生産されるＴＧＦ−β１前駆 体タンパクはグリコシル化され、さらにマンノー ス残基がリン酸化されてマンノース−６−リン酸 ができ、マンノース−６−リン酸レセプター（受 容体）に結合する(Brurmer et al.,1988,Mol.Cell. Biol.8:2229-2232;Purchio et al.,1988,J． Biol.Chem.263:14211-14215)。マンノース−６ −リン酸レセプターへの結合は、細胞内タンパク のリソゾームへの移送に関係している（ことがわ かっている）(Korntelet,1988,J.Clin.Invest. 77:1-6参照）。このことは、ＴＧＦ−β１のアミ ノ末端側の前駆体部位が成熟体のＴＧＦ−β１を 生成するために必要なタンパク分解の過程におい て何らかの役割を果たしている可能性があること を示唆している。さらにＴＧＦ−β１(NH₂)／β 2(COOH)を研究し（することで、）、果たしてＴ ＧＦ−β１のアミノ末端側の前駆体部位が、機能 的で〔mature〕なＴＧＦ−β２分子の正確な生成 過程を〔lead〕し得るのか否かを決定することは 興味深いことであった。ＣＨＯ細胞をpSV／β１ −β／dhfrでトランスフェクトし、個々のクロー ンを上記第8.1章に記したようにして増巾させた。

１β９，12.5クローン(CL)36株により生産され るタンパクのイムノブロット（ブロッティング） による解析結果を図７Ａに示す；還元されたＴＧ Ｆ−β２の単量体を表す12kdのタンパクが、より 高分子の45−55kdの前駆体ポリペプチドとともに みられる（図７Ａ、第２レーン）。非還元条件下 でイムノブロット分析を行った結果、24kdの二量 体が高分子の前駆体とともに現れた（図７、第２ レーン）。免疫（抗原抗体）反応活性は、前もっ て抗血清をペプチドとともにインキュベートする ことによってブロックされた（図７Ａ、第３レー ン）。12Kd及び24Kdのタンパクは、天然のＴＧＦ −β２還元体、非還元体と挙動を同じくした（図 ７Ａ、第１レーン及び第７Ｂ、第１レーン）。

γ−ＴＧＦ−β２は、実施例３の(1.6)に記載 したように、無血清培地より精製した。γＴＧＦ −β２のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動、及びその後の銀染色もしくはイムノブロッテ ィングによる分析結果を図８Ａ及び８Ｂに示す。

［^１２５Ｉ］標識に続く付加的解析結果を図８Ｃに示 す。これらの結果は、pSV2／β１−β／dhfrで トランスフェクトされ増殖したＣＨＯ細胞が、非 還元条件下で分子量24Kd（還元条件下で12Kd）の ポリペプチドを産生し、そのタンパクは、免疫学 的及び機能的にみて天然のＴＧＦ−β２と等価の ものであることを示している。また、図８Ａに示 す24kdのタンパクの最初の12残基のシークエンス の解析結果より、該タンパクが天然のＴＧＦ−β ２と同一物質であることが証明された。このこと より、成熟したＴＧＦ−β２はまちがいなくＴＧ Ｆ−β１(NH₂)／β２(COOH)前駆体から加工され てできるということが示唆された。

細胞表面のＴＧＦ−βレセプターへの結合能力 を調べるため精製したγＴＧＦ−βをさらに解析 した。レセプターバインディングアッセイは、実 施例３の記載にしたがってＨＥＰＭ細胞を用いて 行った。その結果を図９に示す。［^１２５Ｉ］−γＴ ＧＦ−β２でアフィニティーラベルされ、還元状 態下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析されたＨＥＰＭ細胞 表面のＴＧＦ−βレセプターは、移動して３本の はっきりしたバンドを示し、シグナルの大部分は、 図９中の高分子量のバンド中に集中した。このバ ンドはおそらく、分子量約250Kd−350KdのＴＧ Ｆ−βレセプターの第IIIタイプのものであろう。

比較的少ない、分子量約90Kd及び65Kdのレセプタ ー結合分子を検出された（図９）。非標識γＴＧ Ｆ−β２が競合して［^１２５Ｉ］−γＴＧＦ−β２の 結合を妨げ得た。

実施例４ コス細胞におけるＴＧＦ−β２の発現 以下の実施例では、ＴＧＦ−β２前駆体（pve- cusor）又はＴＧＦ−β１／ＴＧＦ−β２の雑種前 駆体(bybrid precusor)をコードする配列を含む 組換えプラスミドで形質転換されたＣＯＳ細胞に おいて、サイトメガロウイルス(cytomegalovirus) 及びＨＩＶウイルスの発現制御要素（エレメント） の制御約コントロールの下で、ＴＧＦ−β２の成 熟活（生）性型及び前駆体型の発現を説明する。

二種類のプラスミド、一つはＴＧＦ−β２前駆体 をコードし他の一つはＴＧＦ−β１／ＴＧＦ−β ２雑種前駆体をコードしているが、この二種類の プラスミドが、前駆体型及び（生）活性成熟型の ＴＧＦ−β２ポリペプチドの合成及び分泌を行わ せる。

(1) 材料及び方法 (1.1) 細胞培養 ＣＯＳ細胞（アフリカ緑ザル腎細胞ライン）は 10％胎児牛血清を添加したＤＭＥＭ中で増殖させ られた。（ペニシリン及びストレプトマイシンは それぞれ１００μ／ml及び１００μｇ／mlの濃度で含ま れた。）ＣＯＳ形質転換体は同じ培地で培養され た。細胞はトリプシン処理して１：５の分割比で 定期的に継代された。

(1.2) プラスミドの構築及びＣＯＳ細胞の形質転 換 猿(simian)のＴＧＦ−β１及びpPC-21(2.3Kbで ヒトＴＧＦ−β２をコードしている）をコードす るプラツミドｐＴＧＦ−β２ついては既に述べら れている。(Sharples et al.,1987,DNA 6:239- 244;Madisen et al.,1988,DNA 7:1-8)。λBSC- １β２からの挿入物（Webb et al.,1988,DNA: 493-497）はpEMBLのEcoR Iサイトヘサブクローン (subclone)されて、猿ＴＧＦ−β２をコードする 配列を含有するpBSC40,１／β２(414)が作られ た。92ヌクレオチドの5'側非翻訳配列と、ＴＧ Ｆ−β２のコード部の開始73ヌクレオチドでPst Ｉ部位までからなる合成二本鎖ＤＮＡがアプライ ドバイオシステム社のＤＮＡ合成装置で調製され た。この断片は結合(ligation)を容易化するため に5'末端にHind III部位を付けて合成された。

ＴＧＦ−β２前駆体のコード領域及び3'非翻 訳領域の残りの部分を取得するために、pBSC40， １／β２(414)プラスミドがPst I及びSty Iで 切断(digest)された。Xho Iサイト間にポリリン カーを欠いているｐπＨ３Ｍプラスミド(Aruffo及び Seed,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:85 73-8577)が、Xho Iで切断され、クレノウ(Klenow) 断片を充填（filled-in）され、Hind IIIで切断され、 上述の二つの断片と結合されて、ＴＧＦ−β２前 駆体をコードするｐβ−2'が作成された。

ＣＯＳ細胞での発現のために、ＴＧＦ−β１を コードする配列及びＴＧＦ−β１(NH₂)／β２ (COOH)の雑種をコードする配列が上述と同じｐπ H3Mベクターに挿入されてｐβ1'及びｐβ１／β 2'が作成された。ｐβ1'，ｐβ2'，及びｐβ１／ β2'中に含まれるＴＧＦ−βのコード領域は図10 Ａに示されている。ＤＮＡの結合（ligation）、 MC1061／p3細胞の形質転換及びＣＯＳ細胞へのト ランスフェクション(Transfection)は既に述べら れた(Seed及びArufdo,1987,Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.84:8573-8577)ものに以下の修正を ほどこして行なわれた。

トランスフェクションは10⁶個の細胞を持つ100 mmの培養皿（dish）で、５mlのトランスフェクシ ョン材料を用いて37℃で2.5時間行われた。10％ ＦＢＳ添加10ＤＭＥＭで48時間インキュベーショ ン後培地は、無血清ＤＭＥＭと交換された。トラ ンスフェクトされた細胞は調整培地を採取する前 に更に48時間インキュベートされた。

(1.3) 組換えタンパク質の分析 無血清、細胞不含の調整(conditioned)培地が 形質転換（トランスフェクト）細胞から回収され、 0.2M酢酸に対して透析され、セクション8.1.5 （前述）で説明したようにミンクの肺細胞の成長 阻害を測定された。組換え蛋白質は、前述のセク ション8.1.8で説明したように、成熟ＴＧＦ−β ２領域中の成熟ＴＧＦ−β２ペプチド配列395-407 に対する抗血清（抗−ＴＧＦ−β２_{３９５−４０７}）を
用 いて、免疫ブロッティング(immunoblotting)によ っても分析された。抗−ＴＧＦ−β２_{３９５−４０７}抗 血清はＴＧＦ−β２に対し特異的であって、ＴＧ Ｆ−β１と交差反応しなかった。（図１０Ｃ、レ ーン１）；抗−ＴＧＦ−β２_{３９５−４０７}の全反応性 は過剰のペプチドによりブロックされる図７Ａ、 レーン３）。

(2) 結 果 ＴＧＦ−β１，ＴＧＦ−β２，及びＴＧＦ−β 1(NH₂)／ＴＧＦ−β２(COOH)をそれぞれコード するｃＤＮＡを含有するプラスミドでＣＯＳ細胞 とトランスフェクトすると、ラテント(latent)成 熟型のＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２を分泌した。

生物学的活性を検出するためには、前もって酸性 処理することによりトランスフェクトされたＣＯ Ｓ細胞から分泌されたラテント(Latent)成熟型を 活性化することが必要であった。この結果は、γ ＴＧＦ−β１を分泌するトランスフェクトされた ＣＨＯ細胞について得られた結果(Gentry他、19 87,Mol.Cell.Biol.7:3418-3427)と矛盾しな いもので、この結果は、前駆体分子と関連するラ テント(latent)成熟型の分泌がＣＨＯ細胞による 発現に特徴なものではないことを示唆している。

ｐβ1',pβ2'，及びｐβ１／β2'に含まれたＴ ＧＦ−β蛋白質領域のラインダイヤグラムは図10 Ａに示されている。ＣＯＳ細胞は各々のプラスミ ドで別々にトランスフェクトされ、無血清上清の 免疫ブロッティングにより分析された。図10Ｂは 抗−ＴＧＦ−β１_{３６９−３８１}を用いて還元状態下で 免疫ブロッティングで分析された時、ｐβ1'でト レーン１）ので、ＴＧＦ−β２に特異的であるよ うだ。ｐβ2'でトランスフェクトされたＣＯＳ細 胞も、還元条件下で分析された時、12KDのＴＧＦ −β２単量体及び50KDの前駆体蛋白質（図10Ｅ、 レーン１）を分泌した。ｐβ１／β2'でトランス フェクトされた細胞（図10、レーン２）は、 ｐβ2'でトランスフェクトされた細胞（図10Ｅ、 レーン１）よりも、かなりより高分子量の前駆体 蛋白質を生産する。

表１は、生物学的に活性なＴＧＦ−β１及びＴ ＧＦ−β２がトランスフェクトされたＣＯＳ細胞 から分泌されることを示している。最大の成長阻 害活性の検出には分析前に酸性化処理工程が必要 である。

ＣＯＳ細胞は、ｐβ１’，ｐβ２’，及びｐβ１／β
２’で トランスフェクトされた。トランスフェクト48時 間後、上清は無血清培地と交換された。48時間後、 調整培地が採取され、0.2M酢酸（＋酸）又は50 mM NH₄HCO₃,pH7.4（−酸）に対して透析され、前 述の セクション8.1.5で説明されたようにCCL64 細胞で成長阻害活性が測定された。

実施例５：チャイニーズ ハムスター オバリー （ＣＨＯ）細胞における猿(simian)ＴＧＦ−β ２及び414アミノ酸猿(simian)ＴＧＦ−β２前 駆体の高レベル発現 ここで説明されるのは、SV-40プロモーターの 制御的コントロール下に猿（simian）ＴＧＦ−β (414)前駆体及びジヒドロ葉酸レダクターゼ（Ｄ ＨＦＲ）をコードする組換えプラスミドでトラン スフェクトされたチャイニーズ ハムスター オ バリー（ＣＨＯ）細胞で成熟型ＴＧＦ−β２及び 414アミノ酸のＴＧＦ−β２前駆体を高レベルで 発現することである。

メトトレキセートでの発現の増巾により、成熟 型ＴＧＦ−β２及び高分子量前駆体複合体(comp- lexes)分泌するクローンを分離した。分泌され たＴＧＦ−β２前駆体の予備的な特徴づけにより、 そのプロ領域(pro-region)はグリコシル化されて、 おりマンノース−６−リン酸を含んでいることが 示された。

(1) 材料と方法 (1.1) 細胞培養 ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠失チ ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、前 記実施例３の(1.1)に記載されているように増殖 させる。

(1.2) ＤＮＡ操作とプラスミド構築 基本的なＤＮＡ操作は、Maniatisら，1982年， Molecular Cloning：実習手引，Cold Springs Harbor Laboratory,New Yorkに概説されている ようにして行う。

ｐＴＧＦ−β２(414)、これはサルのＴＧＦ− β２−414とＤＨＦＲをコードしているプラスミ ドであるが、これは以下に述べる様にして構築さ れる。；サルのＴＧＦ−β２−414をコードして いるpBSC-40-1（実施例２(2)前述）は、pEMBLにお けるトランスレーションの開始地点から74ベース 下流に位置するコード化配列のPst I地点から始 まり、トランスレーションのストップコドンＴＡ Ａを100ベースを越えたSty Iで終了する。２番目の ＴＧＦ−β２遺伝子を構築する。pBSC-40-1はPty Iによって切られ、ＤＮＡポリメラーゼＩの Klenow enzymeによってblunt endsまで修復され、 Sph Iで切られる。その結果、SphI−StyI(blunt) 末端を有する298bpフラグメントが単離される。

pBSC-40-1はまた、Pst IとSpy Iで切られ96bpフ ラグメントも単離される。これら２つのフラグメ ントはｐβ２(Pst-Sty)をつくるために先にPs tIとSma Iで切られたpEMBL中に連結される。

次に、ｐβ２(Pst-Sty)内のＴＧＦ−β２コー ディングシークエンスはEcoR Iでｐβ２を切り、 Klenow enzymeで処理しそしてPst Iで切ることに より、１つのフラグメントとして単離される。こ の1.3kbフラグメントは、まだ最初の73ＴＧＦ− β２コーディングヌクレオチドを欠いているが、 これはpSV2-neoに連結される。このpSV2-neo は、もう最初に5'側のトランスレーションしてい ないシークエンスの92ヌクレオチドとＴＧＦ−β ２コーディングシークエンスの最初の73ヌクレオ チド（Pst I側まで）とともにHind IIIとHpa I（ネ オ遺伝子を除く為）で切られている。（セクショ ン9.1.2,Madisenら、1989,DNA 8:205-212）。

その結果、ライゲーションによって出来たものは、 ベクターｐＴＧＦ−β２(414)、すなわちＴＧＦ −β２−414とＤＨＦＲをコードしている遺伝子 を含むベクターpSV2を構築することに使われる。

(1.3)ＤＮＡトランスフェクション（挿入）と Methotrexate抵抗性細胞セクション（選出） ｐＴＧＦ−β２はＣＨＯ細胞中にトランスフェ クトされ、増殖されたクローンは、マイナーな修 正で、実質的に（Gentryら、1987,Mol.Cell. Biol.7:3418-3427）に記載されているようにし て得られる。

トランスフェクションの後、ＤＨＦＲを示して いる細胞は非選択的培養液を10％ＦＢＳ，150mg／ mlＬ−プロリンと0.3mg／mlグルタミンを含んで いるＤＭＥＭに置き換えることにより選択される。

コロニーを採り、広げ、100mm組織培養用ディッ シュに10^５細胞ずつまき、0.1μM methotrexate に順応させる。プレートをトリプシン処理細胞を 1:5の比率で分割して３回継代培養する。その 時は10^５細胞は連続的に0.5,2.5,10.0,50.0 μM methotrexateに順応させる。

セルラインは、96穴ディッユでリミティング ダイリューションを行うことによりクローン化さ れる。10μＭと50μM methotrexateで成育した２ 種類のクローンβ２(414)Cl.32とβ２(414)Cl.35 を各々単離した。両クローンともおよそ５μＭ／ mlＴＧＦ−β２を分泌しており、更に性決定する 為に両クローンを選んだ。(Purchioら、1988, J.Biol.Chem.263:14211-14215）に記載されて いるようにして、γＴＧＦ−β１、後記のβ１cl. 17,を分泌するＣＨＯ細胞のクローンが単離され、 それは20μM methotrexate培養液で増殖させ (1.4) ノザンブロット解析 セクション6.1.3.前述で述べたように、全セル ラーＲＮＡを１％アガロールゲルでフランクショネ ーション（分画）を行い(Lehrachら、1977,Bio- chemistry 16:4743-4751)ナイロン膜に転写し (Hybond Amersham)、そしてセクション6.1.3に 記載されているように［^３２Ｐ］でラベルされたプ ローブにハイブリダイゼーションを行った。

(1.5) ＰＡＧＥと２次元電気泳動による分泌蛋白 の 無血清及び無細胞の順化培地は、(Brunnerら、 1988,Mol.Cell.Biol.8:2229-2223)に記載さ れて［^３５Ｓ］−システイン及び［^３５Ｓ］−メチオ ニン，［^３Ｈ］−グルコサミン，［^３２Ｐ］−オルソ ホスフェートでラベルされ、還元又は、非還元状 況下、1.5％又は7.5〜17.5％のポリアクリルア ミドゲル上でのＰＡＧＥにより分析された。

Cronex-4Ｘ線フィルムに感光する前に、［^３５Ｓ］ と［^３Ｈ］を含むゲルを蛍光観察(fluorographed) した。［^３２Ｐ］で、ラベルされた蛋白の酸分解物 の２次元電気泳動［^３２Ｐ］で、ラベルされた蛋白 の酸分解物の２次元電気泳動は(Cooper et al., １９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９９：３
８７〜４０２）に記載さ れたごとくに行った。

(1.6) 免疫ブロット分析と抗ペプタイド抗体 成熟ＴＧＦ−β２領域内に位置するＴＧＦ−β ２−414ペプタイド配列367−379（抗−ＴＧＦ −β２(414)−367−379'第12Ａ図）に対して生成 する抗ペプチド抗血清が前記の実施例３の(1.7) に記載されたごとくにして得られた。この抗血清 は前に特徴ずけられており、そしてＴＧＦ−β２ に対して特異的であることが示された：それはＴ ＧＦ−β１と反応せず、全ての反応性は過剰の非 標識化ペプタイドで培養することによりブロック された（前記実施例４、この抗血清は実施例４に おいて抗−ＴＧＦ−β２_{３９５−４０７}と名付けられ、 これは442アミノ酸ＴＧＦ−β２前駆体である残 基に対応するものであることに注意すべきである）。

ＴＧＦ−β２(414)のプレ領域内に位置し、アミ ノ酸51−66（抗−ＴＧＦ−β２(414)51−66',第 12Ａ図）に対応するペプチド配列に対する抗ペプ チド抗血清は、前記実施例３の(1.7)に記載の通 り産生された。ＴＧＦ−β１前駆体のプロ−及び 成熟−領域に対して向けられる抗ＴＧＦ−β１_{８１ −９４} と抗−ＴＧＦ−β１_{３６９−３８１}、抗ペプタイ
ド 抗血清は(Gentry et al.,1987,Mol.Cell.Biol. 7:3418-3427)に記載されている。集合細胞は無 血清培地で３回洗浄し、無血清培地中で24hrs培 養した：無血清及び無細胞順化培地は0.2M酢酸 に対して透析され、前記実施例３の(1.8)に記載 された通り免疫ブロッティングにより分析された、 (1.7) 成育阻害アッセイ 細胞は100mmディッシュ上で集合無血清培養液 で３回洗浄される。その後５ml無血清培養液が加 えられ、細胞を24時間培養する。培養液は0.2M 酢酸又は50mM NH₄HCO₃,pH7.0に対して透析され て集められ、セクション8.1.5，前述で述べたよ うにmilk lung cellsの成育阻害アッセイを行う。

このアッセイにおいては、ＴＧＦ−β１及びＴＧ Ｆ−β２は類似した特異的活性を有している。

(1.8) リコンビナント蛋白の精製とシークエンス 解析 β２(414)CL.32由来の無血清及び無細胞順化培 養液を酢酸（培養液１mlにつき56mlのglacial酢 酸）で酸性にし、その後、0.2M酢酸に対して透 析を行う。その溶液を1N NaOHでpH4.0に調整し、 25,000×ｇで遠心分離を行い、溶液を静澄化する。

50mMのアセテート塩でpH4.0に前もって平衡化し たCM-Trisacrylをつめたカラムにその上済を流す。

γＴＧＦ−β２の溶出は、開始緩衝液中で直線性 の０−1M塩化ナトリウム勾配を用いて行った。

γＴＧＦ−β２を含む分画はプールされ、そし てその分画を予め水中において0.5％トリフルオ ロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡化したC4 Vydac column （4.6×250mm）に流す。γＴＧＦ−β２は0.05％ ＴＦＡを含むアセトニトリルで直線性25％−35％ 勾配法を用いて流出された。

アミノ酸解析のためには、6Mグアニジン／HCl と0.1％Na₂EDTAを含むpH8.5の0.4Mトリス− HCl緩衝液１００μml中20mMジチオスレイトールを 用いて50℃で２時間遷元し、続いて100mM 4−ビ ニルピリジンを用いて23℃で18時間Ｓ−ピリジル エチル化した。反応混合物を20％ＴＦＡでpH 2.0に酸性化し、逆相ＨＰＬＣにより脱塩した (Marquardtら、1987,J.Biol.Chem.262:12127 -12131)。メチオニル残基における切断のため、 Ｓ−ピリジルエチル化したｒＴＧＦ−β２の60pM を70％蟻酸中のCNBrで処理した。モデル475Ａア ミノ酸シークエンサーにおいて、文献記載のよう にして((Marquardtら、1987,J.Biol.Chem.262 :12127-12131)自動配列解析を行った（Applied Biosystems,Inc.,Foster City,California）。

(2) 結 果 (2.1) 組換えＴＧＦ−β２は潜在形で分泌される ＣＨＯ細胞をｐＴＧＦ−β２(414)でトランス フェクトし、後記実施例５(1.3)に記載のように して増幅した。96プレートにおいて限定希釈し てクローニングすることにより単離された２種の クローン，β１(414)cl.32及びβ２(414)cl.35を、 さらに特定決定するために選択した。第11Ａ図及 び第11Ｂ図は、β２(414)cl.32が約５μｇ／mlの ｒＴＧＦ−β２を分泌すること、そして最高生物 活性の検出には酸活性化が必要であることを示し ている。同様の結果はβ２(414)cl.35についても 得られる。ノーザンブロット解析は、正常ＣＨＯ 細胞においては検出されない主要の1.9kbＴＧＦ −β２−特異的ＲＮＡ種を含有することを示す （第11Ｃ図）。

(2.2) トランスフェクトされたＣＨＯ細胞によっ て分泌されたリコンビナントＴＧＦ−β２蛋 白質の分析 第12Ａ図は、抗ペプチド抗体が提起され(raise) ているＴＧＦ−β２−414前駆体の領域を示して いる。抗−ＴＧＦ−β２(414)_367-379は、ＴＧＦ −β２に対して特異的であり、ＴＧＦ−β１と反 応せず、そして全ての免疫反応性は過剰のペプチ ドによってブロックされ得る。同様な特異性は抗 −ＴＧＦ−β２(414)_51-66に関しても得られた。

第12Ｂ図は、β２(414)cl.32細胞によって分泌 されたＴＧＦ−β２−関連蛋白質の免疫ブロット の結果を示しており、比較の事例として、それら はβ１cl.17細胞によって分泌されたＴＧＦ−β １特異蛋白質と共に示されている。β１cl.17細 胞は、プロ−ＴＧＦ−β１からなる44−56KD種 (species)（バンド「ａ」、第12Ｂ図、レーン１） を分泌し、そして、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅによって蛋白質が分離され抗−ＴＧＦ−β１_{８１ −９４} とともに免疫ブロット(immunoblotting)によ って分析される場合は、ＴＧＦ−β１のプロー領 域からなる30−42KD種(species)（バンド「ｂ」、 第12Ｂ図、レーン１）を分泌する。β２(414)cl. 32細胞は、抗−ＴＧＦ−β２(414)_51-66（第12図、 レーン２）によって検出され得るこの分子量範囲 の蛋白質もまた分泌する。β２(414)cl.32細胞は、 ＴＧＦ−β２前駆体（バンド「ｂ」）の切断され た(cleaved)プロ−領域に比例して、切りさかれ ていないプロ−ＴＧＦ−β２（バンド「ａ」）を、 β１cl.17細胞が分泌するのよりもより少なく分 泌することに注目されたい。免疫ブロットが、Ｔ ＧＦ−β１の前駆体（抗ＴＧＦ−β１_{３６９−３８１}）
に 向けられた抗−ペプチド抗体を用いて行われた場 合は、12KDＴＧＦ−β１モノマー（バンド「ｃ」、 第12Ｂ図、レーン３）と同様に44-56KDプロ−Ｔ ＧＦ−β１種（バンド「ａ」第12Ｂ図、レーン３） が、β１cl.17細胞によって条件付けられた上澄 液中に検出される。抗−ＴＧＦ−β２(414)_367-379 は、また45−56KD種(species)（バンド「ａ」、第 12Ｂ、レーン４）と12KDＴＧＦ−β２モノマー （バンド「ｃ」、第12Ｂ、レーン４）を、β２(4 14)cl.32細胞によって条件付けられた上澄液中に 検出し、バンド「ａ」が成熟(mature)とプロ−領 域の両方のＴＧＦ−β２−特異配列を含むのに対 し、バンド「ｂ」はプロ−領域配列のみを含む （第12Ａ図参照）ということを示唆している。β １cl.17細胞によって条件付けされた上澄液に比 較して、β２(414)cl.32細胞上澄液中にバンド 「ｃ」に比例した(relative to)バンド「ａ」の 減少量に注意されたい。

β１cl.17細胞によって条件付けされた培地 が、非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画 され、抗−ＴＧＦ−β１_{８１−９４}を用いる免疫ブロ ットにより分析される場合は、主要な90−110KD 種(species)が検出された（第12Ｃ図、レーン１）。

同じような分析が抗−ＴＧＦ−β２(414)_51-66を 用い条件付けされた培地でβ２(414)cl.32に対 して行われる場合は、成熟24KDＴＧＦ−β１ダ イマーと同様に90−110KD種(species)も見ら れる（第12Ｃ図、レーン３）。抗−ＴＧＦ−β２ (414)_367-379は、β２(414)cl.32細胞（第12Ｃ図、 レーン４）によって条件付けされた上澄液中に成 熟ＴＧＦ−β２（第12Ｃ図、矢印）と同様にバン ドＩとIIを検出する。バンドIIIはこの抗血清に よって検出されないので、この種(species)は明 らかに成熟ＴＧＦ−β２配列を欠き、プロ−領域 ダイマーのみからなる。

第12Ｄ図と第12Ｅ図は、〔^３５Ｓ〕−システイン 及び〔^３５Ｓ〕−メチオニンでラベルをし、条件付 けされた培地が非還元（第12Ｄ図）及び還元（第 12Ｅ図）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画 された後に、β１cl.17,β２(414)cl.32及びβ２ (414)cl.35によって分泌された全蛋白の分析を示 している。成熟ＴＧＦ−β２（矢印、第12Ｄ図） の増加量と、β１cl.17によって条件付けされた 上澄液に比較して、β２(414)cl.32及びβ２(414) cl.35によって条件ずけされた上澄液中のバンド 「ｃ」（第12Ｅ図）に比例して（ralative to）、 バンド「ａ」の量が減少していることに注意され たい。また、ＴＧＦ−β２−関連蛋白質が、β２ (414)cl.32とβ２(414)cl.35細胞によって分泌さ れた全蛋白質の主要部分を表わしているというこ ともに注目されたい。

(2.3) プロ−領域ｒＴＧＦ−β２前駆体のグリコ シル化とリン酸化 リコンビナントＴＧＦ−β１前駆体は、プロ− 領域の中の３つの部位でグリコシル化されそして、 これらの３つの部位の２つでマンノース−６−リ ン酸（Ｍ−６−Ｐ）を含む（Boranner等、1988, Mol.Cell.Biol.8:2229-2232;Purchio等，19 88,J.Biol.Chem.263:14211-14215）。同じ修 飾(modification)がＴＧＦ−β２−414前駆体で 起こるかどうかを決定するために、β２(414)cl. 32細胞は〔^３Ｈ〕−グルコサミンと〔^３２Ｐ〕−オ ルトリン酸でラベルされ、そして血清−及び細胞 −を含まない条件付けされた培地がＳＤＳ−ＰＡ ＧＥによって分析された。第13図は、ＴＧＦ−β ２前駆体のプロ−領域がリン酸化され（第13図、 レーン２）グリコシル化され（第13図、レーン４） ていることを示している。第13図のレーン４にみ られる高分子量物質は、免疫ブロット（第12図） により判定されるように、ＴＧＦ−β２前駆体に 関連させられているようには思われない。また、 〔^３Ｈ〕−グルコサミンでラベルされたβ２(414) cl.35細胞（第13図、レーン５）によって条件付 けされた培地中ではみられない。それはもっとも この特定のクローンによって分泌された非−特異 的生産物にように思える。ＴＧＦ−β１に対する 事例のように、〔^３２Ｐ〕又は〔^３Ｈ〕−グルコサ ミンの非ラベル化はＴＧＦ−β２12kDaモノマー 中にみられた。

第14Ａ図は、〔^３２Ｐ〕−ラベル化ｒＴＧＦ−β １前駆体の酸分解物の２次元電気泳動的分析結果 を示しており、また、この分子の内部に含まれる Ｍ−６−Ｐ残基の移動の位置を指示している。β ２(414)cl.32細胞によって分泌された〔^３２Ｐ〕− ラベル化−プロ−ＴＧＦ−β２−414において行 われた同様な分析は、ラベル化したものはP-Ser, P-Thr又はP-Tyr（第14Ｂ図）と共には移動しな いが、Ｍ−６−Ｐと共に移動する（第14Ｃ図）こ とを示している。

(2.4) 成熟リコンビナントＴＧＦ−β２の精製と 配列分析 成熟ｒＴＧＦ−β２は、セクション10.1.8.,同 上 において述べたようにβ２(414)cl.32−条件付 けされた血清を含まない培地から精製された。

第15図は、その精製蛋白質は還元（roducing) 条件下（第15図、レーン１）において、12KD種 (species)のように移動し、非還元(non-reducing) 条件下では、精製されたγ−ＴＧＦ−β１（第15 図、レーン３）と全く同じである、分子量が24KD のもの（第15図、レーン２）と共に移動するとい うことを示している。γＴＧＦ−β２は更に蛋白 質配列分析（表２、下記）によって特徴づけられ た。Ｓ−ピリジルエチル化(pyridylethylated)γ ＴＧＦ−β２は臭化シアンで104残基の所を切断 され、そして得られた２つのペプチドは同時に配 列が決められた。１つはアミノ−末端配列に相当 するものであり、もう１つはカルボキシ末端配列 105−112に相当するものである。それらの結果 は、生物学的に活性であるγＴＧＦ−β２は、予 定された切断部位で正確に加工(processed)され ることを示している。

1.Ｓ−ピリジルエチル化(pyridylethylated)γ ＴＧＦ−β２は、CNBrで切断された。２つの 配列、すなわちγＴＧＦ−β２(1-104)とγ ＴＧＦ−β２(105-112)、はサイクル1(56.1 pmol PTH Ala-1及び58.7pmol Ile-105)及 び 7(76.0pmol PTH Cys-7及びPTH Cys-111) で の収率から決定されるのと殆んど同じモル (equimolar)収率で得られた。

〔微生物の寄託〕 次の微生物は農業研究カルチャーコレクション、 北部地域研究センター（ＮＲＲＬ）によって寄託 されており、次の寄託番号が付されている； 次のトランスフェクタント（transfectant）は 米国タイプカルチャーコレクション、ロックビル (Rockville),MD,によって寄託されており、載 せた寄託番号が付されている。

トランスフェクタント プラスミド 寄託番号 チャイニーズ ハムスター オバリー ｐＳＶ２／β
１−β／ｄｈｆｒ ＣＲＬ 9800 （ＣＨＯ）１β９，１２．５ ＣＬ３６チャイニーズ ハムスター オバリー （ＣＨＯ） β２（４１４）ＣＬ．３２ ｐＴＧＦ−
β２（４１４） この発明は、この発明の一面の一実施例である ことを意図している寄託されたセルラインまたは ここに開示した実施例によって範囲が限定される ものではなく、機能的に均等であるいかなるもの もこの発明の範囲内に入る。実際、ここに示し又 は記載したものに加え、発明の色々な修正(modi- fication)が、他の記述(foreign deceription) から当業者にとって明らかとなるであろう。この ような修正は付加したクレームの範囲内に入る。

すべての塩基対とアミノ酸残基数をヌクレオチ ドとペプチドに対して与えられたサイズはおよそ のもの(approximate)であり、開示の目的のため に用いられていることが理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図は、ヒトＴＧＦ−β２−442ｃＤＮＡ のヌクレオチド配列およびそれから演繹したアミ ノ酸配列を示す。PC-21の2597挿入物(insert)を ｐＥＭＢＬ（Ｄａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Res.,11 ,1645-1654)にサブクローンして、ジデオキシ 鎖末端法（dideoxy chain-termination method） (Sanger et al.,1977,Proc.Natl.Acad.Sci． USA.74,5463-5467)を用い、両鎖上に配列した。 アミノ酸をコードする配列の直上に、演繹アミノ 酸配列を記した。成熟ＴＧＦ−β２の配列を線で 囲み、シグナルペプチドの上に線を引いて示した。 アステリスク（＊印）により、潜在グリコシレー ション部位を示した。矢印は、推定シグナル配列 開裂部位を示す。サルのＴＧＦ−β２−412ｃＤ ＮＡは、346番から432番のヌクレオチド（角カッ コで示した）が削除され、配列ＡＡＴで置き換え られている点、および構造中の数ケ所にサイレン トなヌクレオチド変換(silent nucleotide chang- es)が起こっている（変換ヌクレオチドの直下に、 アルファベット一文字で示した）点を除き、ヒト ＴＧＦ−β２−442ｃＤＮＡと同一である。サル ＴＧＦ−β２−414プレカーサーの演繹アミノ酸 配列は、ヒトＴＧＦ−β２−442中の第１１６〜１４４ 番目に存在するアミノ酸がアスパラギン酸と置き 換っている点を除き、ヒトＴＧＦ−β２−442プ レカーサーと同一である。ヒトＴＧＦ−β２−41 4ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、破断下線（−− −）で示される領域に配列されており、第346〜 432番目のヌクレオチドが削除され、配列ＡＡＴ に置き換えられている点を除き、ヒトＴＧＦ−β ２−442ｃＤＮＡ配列と完全に同一である。 第１ｂ図は、ハイブリッドＴＧＦ−β１／ＴＧ Ｆ−β２プレカーサーＤＮＡのヌクレオチド配列、 およびそれから演繹したアミノ酸配列を示す。ア ミノ酸をコードする配列の直上に演繹アミノ酸配 列を示した。成熟ＴＧＦ−β２の配列を線で囲み、 プレカーサーシグナルペプチドの上に線を引いて 示した。アステリスク（＊印）によりグリコシレ ーション部位を示した。矢印は、推定シグナル配 列開裂部位を示す。図示したＴＧＦ−β２成熟コ ーディング配列はヒト由来のものである。サルの ＴＧＦ−β２成熟テーディング配列は、ほとんど ヒトと同一であり、サイレントな塩基変換が３ケ 所存在するだけである。それらは、変換されるヌ クレオチドの直下にアルファベット一文字により 示されている。ＴＧＦ−β２のｃＤＮＡクローニ ングおよびハイブリッドＴＧＦ−β１／ＴＧＦ− β２遺伝子の構成の詳細については本明細書のセ クション８以下に記載されている。 第１ｃ図は、ハイブリッドＴＧＦ−β１／ＴＧ Ｆ−β２プレカーサー遺伝子の概略図を示す。 第１ｄ図は、pPC-14(2.2kb)およびpPC-21 (2.3kb)の制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。 線で囲った領域（boxed regions）は、ＴＧＦ−β ２モノマーのコーディング配列を示す。ＡＴＧは 開始メチオニンコドンを示す。pPC-21(2.3kb) 中のＡＴＧとKpn I部位との間の距離は、約420bp である。黒色部は、pPC-21(2.3kb)中の84bpの 挿入物を示す。 第１ｅ図は、pPC-21(2.2kb)のＤＮＡ配列の 部分分析を示す。ＤＮＡ配列決定反応(sequencing reactions)を開始させるため、合成したオリゴヌ クレチド、5'-AGGAGCGACGAAGAGTACTA-3'、を使 用した。このオリゴヌクレオチドは、pPC-21(2.3 kb)中の挿入物内のKpn I部位から約140bp上流 にハイブリッドした。この領域中において、pPC- 14(2.2kb)（上側）の配列は、Asn-116をコードす るヌクレオチドまで、pPC-21(2.3kb)と同一で ある。pPC-21(2.3kb)中に見出されたpPC-14 (2.2kb)のpPC-21(2.3kb)のAsn-116コドン内 の84-bp挿入物についても図示した。挿入物中のKpn I部位についても図示した。 第２ａ，２ｂ図は、ヒトＴＧＦ−β１およびＴ ＧＦ−β２−442のプレカーサー配列の相同性を 示す。第２ａ図：一次配列の相同性。同一の残基 を線で囲った。アステリスクは、ＴＧＦ−β２中 の潜在クリコシレーション部位を示す。潜在シグ ナル配列開裂部位および成熟ポリペプチドの開裂 部位についても示した。第２ｂ図：Gene Proソ フトウエアを用いたドットマトリクス比較。各ド ットは、アミノ酸10個中５個以上が同一の箇所を 示す。対角線は相同領域を示す。 第３図は、BSC-40およびPC-3のポリアデニル 化ＲＮＡのノーザンブロット(Northern blot)分 析の結果を示す。ポリアデニル化ＲＮＡは、BSC- 40およびPC-3細胞から単離し、アガロース−ホ ルムアルデヒドゲル上で分画し、ハイボンド−Ｎ (Hybond-N)フィルター上に移、^３２Ｐで標識した ＴＧＦ−β２特異性プローブ(pPC-21)（パネルＡ）、 または^３２Ｐで標識したＴＧＦ−β２およびＴＧＦ −β１（Sharples et al.,1987）特異性プローブ （パネルＢ）にハイブリダイズした。レーン１： BSC-40ポリアデニル化ＲＮＡ（５μｇ）。レーン２ ：PC-3ポリアデニル化ＲＮＡ（５μｇ）。 第４図は、他の採取源からのポリアデニル化Ｒ ＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す。分析 したポリアデニル化ＲＮＡは、MCF-7（ヒト乳癌） 細胞、SK-MEL28（ヒト黒色腫）細胞、KB（鼻咽頭 癌(nasopharangeal carcinoma))細胞およびHBL- 100（ヒト乳上皮(human mammary epithelial))細 胞から単離し、ＴＧＦ−β２特異性プローブpPC -21)へのノーザンブロットハイブリダイゼーショ ンにより分析した。各レーンは、SK-MEL28（レー ン１）、MCF-7（レーン２）、HBL-100（レーン３） またはKB（レーン４）細胞からのポリアデニル化 ＲＮＡを各５μｇ含んでいる。 第５図は、組換えＴＧＦ−β２の生物活性の分 析結果を示す。１β９、12.5クローン36細胞を、 100mmの組織培養皿中で密集状態となるまで培養 した。細胞を、無血清培地で３回洗浄し、無血清 培地５ml中で24時間培養した。培地を集め、0.2 M酢酸で透析し、Mol.Cell.Biol.,7,P.3418 （Gentry et al.,1987年）の記載に従い。CCL64 細胞中でのＤＮＡ合成の阻害を測定した。この測 定において、ＴＧＦ−β１の標準物3.3pgは、阻 害率50％を示した。ＴＧＦ−β２の比活性は、Ｔ ＧＦ−β１の比活性の約半分であることが計算に より求められた。 第６図は、１β９、12.5、クローン36細胞か ら分泌された組換え蛋白のウエスタンブロット (Wsetern blot)分析の結果を示す。酸透析した、 １β９、12.5、クローン36細胞の無血清順化培地 (conditioned media)を、ＳＤＳ−ポリアクリル アミドゲル電気泳動により分画し、ＴＧＦ−β２ プレカーサー内のアミノ酸配列第３９５〜４０７番に 位置する合成ペプチドNH₂-YNTINPEASASPC-COOH （抗ＴＧＦ−β２ 395-407）に対して製造した抗 血清を用いてウエスタンブロッテイングにより分 析した。 第７図は、増殖した形質移入ＣＨＯ細胞(ampli- fied,transfected CHO cells)から分泌された組 換え蛋白の特性を示す。パネルＡ：１β９，12.5 CL36から集めた無血清上澄みを 抗ＴＧＦ−β２_{３９５−４０７} を用いる免疫ブロッティング（レーン
２）、 または免疫ブロッティングに先立ち過剰のペプチ ドを用いて培養した抗ＴＧＦ−β２_{３９５−４０７}を用 いる免疫ブロッティング（レーン３）により分析 した。レーン１は、天然ＴＧＦ−β２(Marquardt et al.,1987,J.Biol.Chem.,262,12127-12131) を示す。サンプルは、還元条件下にリニア15％ポ リアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で分画した。パ ネルＢ：１β9,12.5 CL36順化培地（レーン２） および天然ＴＧＦ−β２（レーン１）を7.5〜15 ％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で分画し、 抗ＴＧＦ−β２_{３９５−４０７}を用いて免疫ブロットし た。ゲルは、非還元条件下に用いた。 第８図は、１β9,12.5 CL3細胞により順化し た(conditioned)無血清培地から精製した、精製 組換えＴＧＦ−β２（γＴＧＦ−β２）の特性を 示す。パネルＡ：非還元条件下に15％ポリアクリ ルアミド−ＳＤＳゲル上で分画し、銀を用いて染 色したｒＴＧＦ−β２。パネルＢ：7.5〜15％の 勾配ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で還元条 件下（レーン１）または非還元条件下（レーン２） に分画し、抗ＴＧＦ−β２_{３９５−４０７}を用いて免疫 ブロットにより検出したｒＴＧＦ−β２。パネル Ｃ：7.5〜15％勾配ポリアクリルアミド−ＳＤＳ ゲル上で還元条件下（レーン１）または非還元条 件下（レーン２）に分画し、オートラジオグラフ ィーにより検出した、ヨウ素化γＴＧＦ−β２。 第９図は、ｒＴＧＦ−β２のＨＥＰＭ細胞表面 のＴＧＦ−βレセプターへの結合を示す。〔^１２５Ｉ〕 −γＴＧＦ−β１または〔^１２５Ｉ〕−γＴＧＦ−β ２で標識したＴＧＦ−βレセプターの親和性を、 還元条件下に6.25％ポリアクリルアミド−ＳＤＳ ゲル上で分析した。レーン１〜３では、〔^１２５Ｉ〕 −γＴＧＦ−β１を用いて標識し、標識しないｒ ＴＧＦ−β１（レーン２）または標識しないｒＴ ＧＦ−β２（レーン３）と競合させた。レーン４ 〜６では、〔^１２５Ｉ〕−γＴＧＦ−β２を用いて標 識し、無標識γＴＧＦ−β１（レーン５）または 無標識γＴＧＦ−β２（レーン６）と競合させた。 第10図は、形質移入ＣＯＳ細胞（transfected COS cells）から分泌された組換え蛋白の特性を示 す。パネルＡ：ＴＧＦ−βプラスミドによりエン コードされた領域の線図。ｐβ１はＴＧＦ−β１ をエンコードし、ｐβ2'はＴＧＦ−β２をエンコ ードし、ｐβ１／ｐβ2'はβ１(NH₂)／β２(COOH) ハ イブリッド蛋白をエンコードしている。パネルＢ ：ＣＯＳ細胞にｐβ1'を移入し、移入の48時間後、 培地を無血清培地と置換し、48時間後に採取した。 サンプルを、0.2M酢酸を用いて透析し、乾燥し、 抗ＴＧＦ−β１_{３６９−３８１}を用いて還元条件下に免 疫ブロッティングにより分析した。レーン１＝Ｃ ＯＳ細胞＋ｐβ1'。レーン２＝ＣＯＳ細胞＋ベク ターのみ（ｐπＸＨ３Ｍ）。レーン３＝ＣＯＳ細胞＋Ｐ ＢＳ。パネルＣ：ＣＯＳ細胞に対し、ｐβ１（レ ーン１）、ｐβ１／β2'（レーン２）、ｐπＸＨ３Ｍ （ベクターのみ。レーン３）またはＰＢＳ（レー ン４）を形質移入した。形質移入の48時間後に無 血清上澄みを採取し、抗ＴＧＦ−β２_{３９５−４０７}を 用いて還元条件下に免疫ブロッティングにより分 析した。パネルＤ：ＣＯＳ細胞にｐβ１／β2'を 形質移入し、抗ＴＧＦ−β２_{３９５−４０７}を用いて非 還元条件下に免疫ブロッティングによりその上澄 みを分析した。パネルＥ：ＣＯＳ細胞に対し、ｐ ／β2'（レーン１）、ｐβ１／β2'（レーン２）、 ｐπＸＨ３Ｍベクターのみ（レーン３）またはＰＢＳ （レーン４）を形質移入し、抗ＴＧＦ−β２_{３９５− ４０７} を用いる免疫ブロンティングにより、その無 血清上澄みを分析した。 パネルの右側（但し、パネルＥは左側）の数字 は、分子量基準（何：キロダルトン）を示す。 サンプルは、7.5〜15％の勾配（但し、パネルＣ は15％リニアー）ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲ ル上で分画した。 第11図は、γＴＧＦ−β１およびγＴＧＦ−β ２によるミンクの肺細胞の成長阻害を示す。パネ ルＡ：γＴＧＦ−β１を文献記載の方法(Gentry et al.,1988,Mol.Cell.Biol.,8,4162-4168) により精製し、本明細書のセクション10.1.7以下 に記載した成長阻害アッセイに用いた。パネルＢ ：β２(414)cl.32細胞を、100mmの培養中で密 集状態となるまで成長させた。細胞を無血清培地 で３回洗浄し、無血清培地５mlを用いて24時間培 養した。培地を採取し、2000Ｇで５分間清澄化し、 0.2M酢酸（○−○−○）または50mMのNH₄HCO₃ 〔pH＝7.0〕（●−●−●）により透析し、ミン ク肺細胞の成長阻害を測定した。パネルＣ：正常 なＣＨＯ細胞（レーン１）またはβ２(414)cl.32 細胞（レーン２）から全ＲＮＡを抽出し、その30 μｇをアガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分 画し、ナイロン膜上に移し、本明細書のセクショ ン10.1.4以下に記載したように、〔^３２Ｐ〕標識Ｔ ＧＦ−β２特異性プローブ（pPC-21(2.3kb))を用 いてプローブした。 第12図は、免疫ブロッテキングおよび直接代謝 標識(direct metabolic labeling)によるＴＧＦ −β２特異性蛋白の検出を示す。パネルＡ：それ に対する抗ペプチド抗体を作成したペプチド配列 を示すＴＧＦ−β２プレカーサーの線図。「ａ」 はプロＴＧＦ−β２−414領域を示し「ｂ」は ＴＧＦ−β２−414プレカーサーに対するプロ領 域（pro-region）を示し、「ｃ」はＴＧＦ−β２ モノマーを示す。パネルＢ：β１cl.17細胞（レ ーン１および３）またはβ２(414)cl.32細胞（レ ーン２および４）により順化した無血清無細胞培 地を還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、抗 ＴＧＦ−β２_{８１−９４}（レーン１）、抗ＴＧＦ−β２ (414)_51-66（レーン２）、抗ＴＧＦ−β１
_{３６９−３８１} （レーン３）または抗ＴＧＦ−β２(414)_367-379 （レーン４）を用いる免疫ブロッティングにより 分析した。パネルＣ：β１cl.17細胞（レーン１ および２）またはβ２(414)cl.32細胞（レーン２ および４）により順化した無血清無細胞培地を非 還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、抗 ＴＧＦ−β１_{８１−９４}（レーン１）、抗ＴＧＦ−β２ (414)_51-66（レーン２）、抗ＴＧＦ−β１
_{３６９−３８１} （レーン３）または抗ＴＧＦ−β２(414)_367-379 （レーン４）を用いる免疫ブロッティングにより 分析した。パネルＤ：β１cl.17細胞（レーン１）、 β２(414)cl.32細胞（レーン２）およびβ２(414) cl.35細胞（レーン３）を、〔^３５Ｓ〕−メチオニ ン＋〔^３５Ｓ〕−システインにより標識し、無血清 上澄みを、非還元条件下に7.5〜17.5％のゲル上 でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。パネルＥ： 〔^３５Ｓ〕−メチオニン＋〔^３５Ｓ〕−システインを 用いてβ１cl.17細胞（レーン１）、β２(414) cl.32細胞（レーン２）およびβ２(414)cl.35細 胞（レーン３）を標識し、無血清上澄みを、還元 条件下に7.5〜17.5％のゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅにより分析した。 第13図は、組換えＣＨＯ細胞から分泌された、 〔^３２Ｐ〕−オルトフォスフェートおよび〔^３Ｈ〕 −グルコサミン標識蛋白の分析結果を示す。密集 状態(confluent)のβ１cl.17細胞（レーン１） またはβ２(414)cl.32細胞（レーン２）を1mCi/ mlの〔^３２Ｐ〕−オルトフォスフェートを用いて４ 時間標識し、無血清無細胞の上澄みを0.2M酢酸 で透析し、還元条件下に15％ゲル上でＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥにより分析した。あるいは、密集状態のβ １cl.17細胞（レーン３）、β２(414)cl.32細胞 （レーン４）およびβ２(414)cl.35細胞（レーン ５）を〔^３Ｈ〕−グルコサミンにより標識し、無 血清無細胞上澄みを還元条件下に7.5〜17.5％の ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。 第14図は、ＴＧＦ−β２−414中のプロ領域内 のマンノース−６−フォスフェートの同定を示す。 パネルＡ：密集状態のβ１cl.17細胞を〔^３２Ｐ〕 −オルトフォスフェートで標識し、無細胞無血清 上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した。第13 図レーン１のバンド「ａ」および「ｂ」を単離し、 6M HCl中で加水分解し、文献記載の方法(Cooper et al.,1983,Methods Enzymol.,99,387-402)に 従い、二次元電気泳動により分画した。ＴＧＦ− β１プロ領域（Purchio et al.,1988,J.Biol. Chem.,263,14211-14215）内に位置するＭ−６− Ｐの泳動位置を示した。パネルＢ：密集状態のβ １(414)cl.32細胞を〔^３２Ｐ〕−オルトフォスフェ ートにより標識し、無血清無細胞上澄みをＳＤＳ −ＰＡＧＥにより分画した。第１３図レーン２のバ ンド「ｂ」を単離し、6M HCl中で加水分解し、 二次元電気泳動により分画した。パネルＣ：Ａお よびＢの混合物。ＡおよびＢから等量のcpmを使 用した。 第15図は、精製したγＴＧＦ−β２の分析結果 を示す。γＴＧＦ−β２をβ２(414)cl.32細胞順 化培地から精製し、その１μｇを、還元条件下（レ ーン１）または非還元条件下（レーン２）に7.5 〜17.5％のゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画 した。ゲルはコマシーブル(comassie blue)によ り染色した。レーン３は。１μｇのγＴＧＦ−β １（非還元）を含有する。

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【手続補正書】

【提出日】平２．３．１４ (1) 明細書第20頁第２行と第３行の間に下記の文を挿
入する。 『〔図面の説明〕 第１ａ図は、ヒトＴＧＦ−β２−442 cDＮＡのヌクレ
オチド配列およびそれから演繹したアミノ酸配列を示
す。PC-21の2597挿入物(insert)をpEMBL (Dante et a
l.,1983,Nucleic Acids Res.,11,1645-1654)にサブクロ
ーンし、ジデオキシ鎖末端法(dideoxychain-terminatio
n method)(Sanger et al.,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA.74,5463-5467)を用い、両鎖上に配列した。アミノ酸
をコードする配列の直上に、演繹アミノ酸配列を記し
た。成熟ＴＧＦ−β２の配列を線で囲み、シグナルペプ
チドの上に線を引いて示した。アステリスク（＊印）に
より、潜在グリコシレーション部位を示した。矢印は、
推定シグナル配列開裂部位を示す。サルのＴＧＦ−β２
−412ｃＤＮＡは、346番から432番のヌクレオチド（角
カッコで示した）が削除され、配列ＡＡＴで置き換えら
れている点、および構造中の数ケ所にサイレントなヌク
レオチド変換(silent nucleotide changes)が起ってい
る（変換ヌクレオチドの直下に、アルファベット一文字
で示した）点を除き、ヒトＴＧＦ−β２−442ｃＤＮＡ
と同一である。サルＴＧＦ−β２−414プレカーサーの
演繹アミノ酸配列は、ヒトＴＧＦ−β２−442中の第116
〜144番目に存在するアミノ酸がアスパラギン酸と置き
換っている点を除き、ヒトＴＧＦ−β２−442プレカー
サーと同一である。ヒトＴＧＦ−β２−414ｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列は、破断下線（−−−）で示される領
域に配列されており、第346〜432番目のヌクレオチドが
削除され、配列ＡＡＴに置き換えられている点を除き、
ヒトＴＧＦ−β２−442ｃＤＮＡ配列と完全に同一であ
る。 第１ｂ図は、ハイブリッドＴＧＦ−β１／ＴＧＦ−β
２プレカーサーＤＮＡのヌクレオチド配列、およびそれ
から演繹したアミノ酸配列を示す。アミノ酸をコードす
る配列の直上に演繹アミノ酸配列を示した。成熟ＴＧＦ
−β２の配列を線で囲み、プレカーサーシグナルペプチ
ドの上に線を引いて示した。アステリスク（＊印）によ
りグリコシレーション部位を示した。矢印は、推定シグ
ナル配列開裂部位を示す。図示したＴＧＦ−β２成熟コ
ーディング配列はヒト由来のものである。サルのＴＧＦ
−β２成熟テーディング配列は、ほとんどヒトと同一で
あり、サイレントな塩基変換が３ケ所存在するだけであ
る。それらは、変換されるヌクレオチドの直下にアルフ
ァベット一文字により示されている。ＴＧＦ−β２のｃ
ＤＮＡクローニングおよびハイブリッドＴＧＦ−β１／
ＴＧＦ−β２遺伝子の構成の詳細については本明細書の
セクション８以下に記載されている。 第１ｃ図は、ハイブリッドＴＧＦ−β１／ＴＧＦ−β
２プレカーサー遺伝子の概略図を示す。 第１ｄ図は、pPC-14(2.2kb)およびpPC-21(2.3kb)の制
限エンドヌクレアーゼ地図を示す。線で囲った領域（bo
xed regions）は、ＴＧＦ−β２モノマーのコーディン
グ配列を示す。ＡＴＧは開始メチオニンコドンを示す。
pPC-21(2.3kb)中のＡＴＧとKpn I部位との間の距離は、
約420bpである。黒色部は、pPC-21(2.3kb)中の84bpの挿
入物を示す。 第１ｅ図は、pPC-21(2.2kb)のＤＮＡ配列の部分分析
を示す。ＤＮＡ配列決定反応(sequencing reactions)を
開始させるため、合成したオリゴヌクレチド、5'-AGGAG
CGACGAAGAGTACTA-3'、を使用した。このオリゴヌクレオ
チドは、pPC-21(2.3kb)中の挿入物内のKpn I部位から約
140bp上流にハイブリッドした。この領域中において、p
PC-14(2.2kb)（上側）の配列は、Asn-116をコードする
ヌクレオチドまで、pPC-21(2.3kb)と同一である。pPC-2
1(2.3kb)中に見出されたpPC-14(2.2kb)のpPC-21(2.3kb)
のAsn-116コドン内の84-bp挿入物についても図示した。
挿入物中のKpn I部位についても図示した。 第２ａ，２ｂ図は、ヒトＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−
β２−442のプレカーサー配列の相同性を示す。第２ａ
図：一次配列の相同性。同一の残基を線で囲った。アス
テリスクは、ＴＧＦ−β２中の潜在グリコシレーション
部位を示す。潜在シグナル配列開裂部位および成熟ポリ
ペプチドの開裂部位についても示した。第２ｂ図：Gene
Proソフトウエアを用いたドットマトリクス比較。各ド
ットは、アミノ酸10個中５個以上が同一の箇所を示す。
対角線は相同領域を示す。 第３図は、BSC-40およびPC-3のポリアデニル化ＲＮＡ
のノーザンブロット(Northernblot)分析の結果を示す。
ポリアデニル化ＲＮＡは、BSC-40およびPC-3細胞から単
離し、アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分画し、
ハイボンド−Ｎ(Hybond-N)フィルター上に移し、^３２Ｐ
で標識したＴＧＦ−β２特異性プローブ(pPC-21)（パネ
ルＡ）、または^３２Ｐで標識したＴＧＦ−β２およびＴ
ＧＦ−β１（Sharples et al.,1987）特異性プローブ
（パネルＢ）にハイブリダイズした。レーン１：BSC-40
ポリアデニル化ＲＮＡ（５μｇ）。レーン２：PC-3ポリ
アデニル化ＲＮＡ（５μｇ）。 第４図は、他の採取源からのポリアデニル化ＲＮＡの
ノーザンブロット分析の結果を示す。分析したポリアデ
ニル化ＲＮＡは、MCF-７（ヒト乳癌）細胞、SK-MEL28
（ヒト黒色腫）細胞、KB（鼻咽頭癌(nasopharangeal ca
rcinoma))細胞およびHBL-100（ヒト乳上皮(humanmammar
y epithelial))細胞から単離し、ＴＧＦ−β２特異性プ
ローブ(pPC-21)へのノーザンブロットハイブリダイゼー
ションにより分析した。各レーンは、SK-MEL28（レーン
１）、MCF-7（レーン２）、HBL-100（レーン３）または
KB（レーン４）細胞からのポリアデニル化ＲＮＡを各５
μｇ含んでいる。 第５図は、組換えＴＧＦ−β２の生物活性の分析結果
を示す。１β９、12.5クローン36細胞を、100mmの組織
培養皿中で密集状態となるまで培養した。細胞を、無血
清培地で３回洗浄し、無血清培地５ml中で24時間培養し
た。培地を集め、0.2M酢酸で透析し、Mol.Cell.Biol.,
7,P.3418(Gentry et al.,1987年）の記載に従い、CCL64
細胞中でのＤＮＡ合成の阻害を測定した。この測定にお
いて、ＴＧＦ−β１の標準物3.3pgは、阻害率50％を示
した。ＴＧＦ−β２の比活性は、ＴＧＦ−β１の比活性
の約半分があることが計算により求められた。 第６図は、１β９、12.5、クローン36細胞から分泌さ
れた組換え蛋白のウエスタンブロット(Wsetern blot)分
析の結果を示す。酸透析した、１β９、12.5、クローン
36細胞の無血清順化培地(conditioned media)を、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、Ｔ
ＧＦ−β２プレカーサー内のアミノ酸配列第３９５〜４
０７番に位置する合成ペプチドNH₂-YNTINPEASASPC-COOH
（抗ＴＧＦ−β２395-407）に対して製造した抗血清を
用いてウエスタンブロッテイングにより分析した。 第７図は、増殖した形質移入ＣＨＯ細胞(amplified,t
ransfected CHO cells)から分泌された組換え蛋白の特
性を示す。パネルＡ：１β９，12.5CL36から集めた無血
清上澄みを、抗ＴＧＦ−β２_{３９５−４０７}を用いる免
疫ブロッティング（レーン２）、または免疫ブロッティ
ングに先立ち過剰のペプチドを用いて培養した抗ＴＧＦ
−β２_{３９５−４０７}を用いる免疫ブロッティング（レ
ーン３）により分析した。レーン１は天然ＴＧＦ−β２
(Marquardtetal.,1987,J.Biol.Chem.,262,12127-12131)
を示す。サンプルは、還元条件下にリニア15％ポリアク
リルアミド−ＳＤＳゲル上で分画した。パネルＢ：１β
9,12.5 CL36順化培地（レーン２）および天然ＴＧＦ−
β２（レーン１）を7.5〜15％ポリアクリルアミド−Ｓ
ＤＳゲル上で分画し、抗ＴＧＦ−β２_{３９５− ４０７}を
用いて免疫ブロットした。ゲルは、非還元条件下に用い
た。 第８図は、１β9,12.5 CL3細胞により順化した(condi
tioned)無血清培地から精製した、精製組換えＴＧＦ−
β２（γＴＧＦ−β２）の特性を示す。パネルＡ：非還
元条件下に15％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で分
画し、銀を用いて染色したγＴＧＦ−β２。パネルＢ：
7.5〜15％の勾配ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で
還元条件下（レーン１）または非還元条件下（レーン
２）に分画し、抗ＴＧＦ−β２_{３９５−４０７}を用いて
免疫ブロットにより検出したγＴＧＦ−β２。パネル
Ｃ：7.5〜15％勾配ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上
で還元条件下（レーン１）または非還元条件下（レーン
２）に分画し、オートラジオグラフィーにより検出し
た、ヨウ素化γＴＧＦ−β２。 第９図は、ｒＴＧＦ−β２のＨＥＰＭ細胞表面のＴＧ
Ｆ−βレセプターへの結合を示す。〔^１２５Ｉ〕−γＴ
ＧＦ−β１または〔^１２５Ｉ〕−γＴＧＦ−β２で標識
したＴＧＦ−βレセプターの親和性を、還元条件下に6.
25％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で分析した。レ
ーン１〜３では、〔^１２５Ｉ〕−γＴＧＦ−β１を用い
て標識し、標識しないγＴＧＦ−β１（レーン２）また
は標識しないγＴＧＦ−β２（レーン３）と競合させ
た。レーン４〜６では、〔^１２５Ｉ〕−γＴＧＦ−β２
を用いて標識し、無標識γＴＧＦ−β１（レーン５）ま
たは無標識γＴＧＦ−β２（レーン６）と競合させた。 第10図は、形質移入ＣＯＳ細胞（transfected COS ce
lls）から分泌された組換え蛋白の特性を示す。パネル
Ａ：ＴＧＦ−βプラスミドによりエンコードされた領域
の線図。ｐβ１はＴＧＦ−β１をエンコードし、ｐβ2'
はＴＧＦ−β２をエンコードし、ｐβ１／ｐβ2'はβ１
(NH₂)／β２(COOH)ハイブリッド蛋白をエンコードして
いる。パネルＢ：ＣＯＳ細胞にｐβ1'を移入し、移入の
48時間後、培地を無血清培地と置換し、48時間後に採取
した。サンプルを、0.2M酢酸を用いて透析し、乾燥し、
抗ＴＧＦ−β１_{３６９−３８１}を用いて還元条件下に免
疫ブロッティングにより分析した。レーン１＝ＣＯＳ細
胞＋ｐβ1'。レーン２＝ＣＯＳ細胞＋ベクターのみ（ｐ
πＸＨ３Ｍ）。レーン３＝ＣＯＳ細胞＋ＰＢＳ。パネル
Ｃ：ＣＯＳ細胞に対し、ｐβ１（レーン１）、ｐβ１／
β2'（レーン２）、ｐπＸＨ３Ｍ（ベクターのみ。レー
ン３）またはＰＢＳ（レーン４）を形質移入した。形質
移入の48時間後に無血清上澄みを採取し、抗ＴＧＦ−β
２_{３９５−４０７}を用いて還元条件下に免疫ブロッティ
ングにより分析した。パネルＤ：ＣＯＳ細胞にｐβ１／
β2'を形質移入し、抗ＴＧＦ−β２_{３９５−４０７}を用
いて非還元条件下に免疫ブロッティングによりその上澄
みを分析した。パネルＥ：ＣＯＳ細胞に対し、ｐβ2'
（レーン１）、ｐβ１／β2'（レーン２）、ｐπＸＨ３
Ｍベクターのみ（レーン３）またはＰＢＳ（レーン４）
を形質移入し、抗ＴＧＦ−β２_{３９５−４０７}を用いる
免疫ブロンティングにより、その無血清上澄みを分析し
た。 パネルの右側（但し、パネルＥは左側）の数字は、分
子量基準（単位：キロダルトン）を示す。サンプルは、
7.5〜15％の勾配（但し、パネルＣは15％リニアー）ポ
リアクリルアミド−ＳＤＳゲル上で分画した。 第11図は、γＴＧＦ−β１およびγＴＧＦ−β２によ
るミンクの肺細胞の成長阻害を示す。パネルＡ：γＴＧ
Ｆ−β１を文献記載の方法(Gentry et al.,1988,Mol.Ce
ll.Biol.，8,4162-4168)により精製し、本明細書のセク
ション10.1.7以下に記載した成長阻害アッセイに用い
た。パネルＢ：β２(414)cl.32細胞を、100mmの培養中
で密集状態となるまで成長させた。細胞を無血清培地で
３回洗浄し、無血清培地５mlを用いて24時間培養した。
培地を採取し、2000Ｇで５分間清澄化し、0.2M酢酸（○
−○−○）または50mMのNH₄HＣＯ_３ 〔pH＝7.0〕（●
−●−●）により透析し、ミンク肺細胞の成長阻害を測
定した。パネルＣ：正常なＣＨＯ細胞（レーン１）また
はβ２(414)cl.32細胞（レーン２）から全ＲＮＡを抽出
し、その30μｇをアガロース−ホルムアルデヒドゲル上
で分画し、ナイロン膜上に移し、本明細書のセクション
10.1.4以下に記載したように、〔^３２Ｐ〕標識ＴＧＦ−
β２特異性プローブ(pPC-21(2.3kb))を用いてプローブ
した。 第12図は、免疫ブロッテキングおよび直接代謝標識(d
irect metabolic labeling)によるＴＧＦ−β２特異性
蛋白の検出を示す。パネルＡ：それに対する抗ペプチド
抗体を作成したペプチド配列を示すＴＧＦ−β２プレカ
ーサーの線図。「ａ」はプロＴＧＦ−β２−414領域を
示し、「ｂ」はＴＧＦ−β２−414プレカーサーに対す
るプロ領域（proregion）を示し、「ｃ」はＴＧＦ−β
２モノマーを示す。パネルＢ：β１cl.17細胞（レーン
１および３）またはβ２(414)cl.32細胞（レーン２およ
び４）により順化した無血清無細胞培地を還元条件下に
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、抗ＴＧＦ−β１_{８１−９４}
（レーン１）、抗ＴＧＦ−β２(414)_51-66（レーン
２）、抗ＴＧＦ−β１_{３６９−３８１}（レーン３）また
は抗ＴＧＦ−β２(414)_367-379（レーン４）を用いる免
疫ブロッティングにより分析した。パネルＣ：β１cl.1
7細胞（レーン１および２）またはβ２(414)cl.32細胞
（レーン２および４）により順化した無血清無細胞培地
を非還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、抗Ｔ
ＧＦ−β１_{８１−９４}（レーン１）、抗ＴＧＦ−β２(4
14)_51-66（レーン２）、抗ＴＧＦ−β２_{３６９− ３８１}
（レーン３）または抗ＴＧＦ−β２(414)_367-379（レー
ン４）を用いる免疫ブロッティングにより分析した。パ
ネルＤ：β１cl.17細胞（レーン１）、β２(414)cl.32
細胞（レーン２）およびβ２(414)cl.35細胞（レーン
３）を〔^３５Ｓ〕−メチオニン＋〔^３５Ｓ〕−システイ
ンにより標識し、無血清上澄みを、 非還元条件下に7.5〜17.5％のゲル上でＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより分析した。パネルＥ：〔^３５Ｓ〕−メチオニ
ン＋〔^３５Ｓ〕−システインを用いてβ１cl.17細胞
（レーン１）、β２(414)cl.32細胞（レーン２）および
β２(414)cl.35細胞（レーン３）を標識し、無血清上澄
みを、還元条件下に7.5〜17.5％のゲル上でＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより分析した。 第13図は、組換えＣＨＯ細胞から分泌された、〔^３２
Ｐ〕−オルトフォスフェートおよび〔^３Ｈ〕−グリコサ
ミン標識蛋白の分析結果を示す。密集状態(confluent)
のβ１1cl.17細胞（レーン１）またはβ２(414)cl.32細
胞（レーン２）を１ｍＣｉ／mlの〔^３２Ｐ〕−オルトフ
ォスフェートを用いて４時間標識し、無血清無細胞の上
澄みを0.2M酢酸で透析し、還元条件下に15％ゲル上でＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。あるいは、密集状態の
β１cl.17細胞（レーン３）、β２(414)cl.32細胞（レ
ーン４）およびβ２(414)cl.35細胞（レーン５）を〔^３
Ｈ〕グリコサミンにより標識し、無血清無細胞上澄みを
還元条件下に7.5〜17.5％のゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により分析した。 第12図は、ＴＧＦ−β２−414中のプロ領域内のマン
ノース−６−フォスフェートの同定を示す。パネルＡ：
密集状態のβ１cl.17細胞を〔^３２Ｐ〕−オルトフォス
フェートで標識し、無細胞無血清上澄みをＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより分画した。第13図レーン１のバンド「ａ」お
よび「ｂ」を単離し、6M HCl中で加水分解し、文献記載
の方法(Cooper et al.,1983,Methods Enzymol.,99,387-
402)に従い、二次元電気泳動により分画した。ＴＧＦ−
β１プロ領域（Purchio et al.,1988,J.Biol.Chem.,26
3,14211-14215）内に位置するＭ−６−Ｐの泳動位置を
示した。パネルＢ：密集状態のβ１(414)cl.32細胞を〔
^３２Ｐ〕−オルトォスフェートにより標識し、無血清無
細胞上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分画した。第13図
レーン２のバンド「ｂ」を単離し、6M HCl中で加水分解
し、二次元電気泳動により分画した。パネルＣ：Ａおよ
びＢの混合物。ＡおよびＢからの等量のcpmを使用し
た。 第15図は、精製したγＴＧＦ−β２の分析結果を示
す。γＴＧＦ−β２をβ２(414)cl.32細胞順化培地から
精製し、その１μｇを、還元条件下（レーン１）または
非還元条件下（レーン２）に7.5〜17.5％のゲル上でＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した。ゲルはコマシーブル(c
omassie blue)により染色した。レーン３は、１μｇの
γＴＧＦ−β１（非還元）を含有する。』 (2) 同第118頁下から２行乃至第134頁第１行の『第１
ａ図は、ヒトＴＧＦ……………１（非還元）を含有す
る。』を下記の様に訂正する。『第１ａ図は、ヒトＴＧ
Ｆ−β２−442ｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれ
から演繹したアミノ酸配列を示す図、 第１ｂ図は、ハイブリッドＴＧＦ−β１／ＴＧＦ−β
２プレカーサーＤＮＡのヌクレオチド配列、およびそれ
から演繹したアミノ酸配列を示す図、 第１ｃ図は、ハイブリッドＴＧＦ−β２／ＴＧＦ−β
２プレカーザー遺伝子の概略図を示す図、 第１ｄ図は、pPC-14(2.2kb)およびpPC-21(2.3kb)の制
限エンドヌクレアーゼ地図を示す図、 第１ｅ図は、pPC-24(2.2kb)のＤＮＡ配列の部分分析
を示す図、 第２ａ図は、ヒトＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２−
442のプレカーサー−一次配列の相同性を示す図、 第２ｂ図は、上記相相性（第２ａ図）をGeneProソフ
トウェアを用いたドットマトリックス比較を示す図、 第３図は、BSC-40およびPC-3のポリアデニル化ＲＮＡ
のノーザンブロット分析の結果を示す図、 第４図は、異なる採取源からのポリアデニル化ＲＮＡ
のノーザンブロット分析の結果を示す図、 第５図は、組換えＴＧＦ−β２のCCL 64細胞中でのＤ
ＮＡ合成の阻害を測定した結果を示す図、 第６図は、ＣＨＯ−１β９，12.5、クローン36細胞か
ら分泌された組換え蛋白のウェスタンブロット分析の結
果を示す図、 第７図は、増殖した形質移入ＣＨＯ細胞から分泌され
た組換え蛋白の特性を示す図、 第８図は、ＣＨＯ−１β９，12.5、CL3細胞により順
化した無血清培地から精製した。精製組換えＴＧＦ−β
２（γＴＧＦ−β２）の特性を示す図、 第９図は、γＴＧＦ−β２のＨＥＰＭ細胞表面のＴＧ
Ｆ−βレセプターへの結合を示す図、 第１０図は、形質移入ＣＯＳ細胞から分泌された組換
え蛋白の特性を示す図、 第11図は、γＴＧＦ−β１およびγＴＧＦ−β２によ
るミンクの肺細胞の成長阻害を示す図、 第12図は、免疫ブロッティングおよび直接代謝標識に
よるＴＧＦ−β特異性蛋白の検出を示す図、 第１３図は、組換えＣＨＯ細胞から分泌された〔^３２
Ｐ〕−オルトフォスフェートおよび〔^３Ｈ〕−グルコサ
ミン標識蛋白の分析結果を示す図、 第14図は、ＴＧＦ−β２−414中のプロ領域内のマン
ノース−６−フォスフェートの同定を示す図、 第15図は、精製したγＴＧＦ−β２の分析結果を示す
図である。』 ─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平４．９．９ (1) 別紙の通り (2) 別紙の通り (3) 別紙の通り (4) 別紙の通り（図面の浄書につき実体的内容に変更
なし） (5) 平成２年３月１４日提出の手続補正書第２０頁第
８行目「図、」を「電気泳動写真、」と補正する。 同頁第１１行目「図、」を「電気泳動写真、」と補正
する。 同頁第１７行目「ブロット分析の結果を示す図、」を
「ブロット分析の結果を示す電気泳動写真、」と補正す
る。 同頁下から２行目「・・・を示す図、」を「・・・を
示す電気泳動写真、」と補正する。 同書第２１頁第３行目「を示す図、」を「を示す電気
泳動写真、」と補正する。 同頁第５行目「・・・を示す図、」を「・・・を示す
電気泳動写真、」と補正する。 同頁第６行目から第７行目「第１０図は、・・・を示
す図、」を「第１０図（その１）は、形質移入ＣＯＳ細
胞から分泌された組換え蛋白の特性を示す図、第１０図
（その２）及び（その３）は、形質移入ＣＯＳ細胞から
分泌された組換え蛋白の特性を示す電気泳動写真であ
る。」と補正する。 同頁第８行目から９行目「第１１図は、・・・を示す
図、」を「第１１図（その１）は、γＴＧＦ−β１およ
びγＴＧＦ−β２によるミンクの肺細胞の成長阻害を示
す図、第１１図（その２）は、γＴＧＦ−β１及びＴＧ
Ｆ−β２によるミンクの肺細胞の成長阻害を示す電気泳
動写真である。」と補正する。 同頁第１０行目から１２行目「第１２図は、・・・を
示す図、」を「第１２図（その１）は、免疫ブロッティ
ングおよび直接代謝標識によるＴＧＦ−β２特異性蛋白
の検出を示す図、第１２図（その２）及び（その３）
は、免疫ブロッティング及び直接代謝標識によるＴＧＦ
−β２特異性蛋白の検出を示す電気泳動写真、」と補正
する。 同頁第１５行目「・・・を示す図、」を「・・・を示
す電気泳動写真、」と補正する。 同頁下から３行目「示す図、」を「示す電気泳動写
真、」と補正する。 同頁末行「果を示す図である。』」を「果を示す電気
泳動写真である。』」と補正する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/85 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ナンシー・ウエブ アメリカ合衆国，テキサス州 77840 カ レツジ・ステイシヨン，アドリーン 2911

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 図１ａに図示したものと実質上同一のヌ
   クレ オチド残基番号約１ないしヌクレオチド残基番 号約1326のヌクレオチドコード配列を含んでな る変換成長因子−β２前駆体をコードしている ヌクレオチド配列。
2. 【請求項２】 図１ａに図示したものと実質上同一の、
   ヌク レオチド残基番号346ないし432が削除され、ヌ クレオチド配列AATによって置換されているヌ クレオチド残基番号約１ないしヌクレオチド残 基番号1326のヌクレオチドコード配列を含んで なる変換成長因子−β２前駆体をコードしてい るヌクレオチド配列。
3. 【請求項３】 図１ａに図示したものと実質上同一のヌ
   クレ オチド残基番号約991ないしヌクレオチド残基 番号約1326のヌクレオチド配列を含んでなる成 熟変換成長因子−β２をコードしているヌクレ オチド配列。
4. 【請求項４】 図１ａに図示したものと実質上同一のア
   ミノ 酸残基番号約１ないしアミノ酸残基番号約442 のアミノ酸配列を含んでなる変換成長因子−β ２前駆体。
5. 【請求項５】 図１ａに図示したものと実質上同一の、
   残基 番号116ないし144が削除され、単一のアスパラ ギン残基によって置換されているアミノ酸残基 番号約１ないしアミノ酸残基番号約442のアミ ノ酸配列を含んでなる変換成長因子−β２前駆 体。
6. 【請求項６】 図１ａに図示したものと実質上同一のア
   ミノ 酸残基番号約20ないしアミノ酸残基番号約442 のアミノ酸配列を含んでなる変換成長因子−β ２前駆体。
7. 【請求項７】 図１ａに図示したものと実質上同一の、
   残基 番号116ないし114が削除され、単一のアスパラ ギン残基によって置換されているアミノ酸残基 番号約20ないしアミノ酸残基番号約442のアミ ノ酸配列を含んでなる変換成長因子−β２前駆 体。
8. 【請求項８】 図１ａに図示したものと実質上同一のア
   ミノ 酸残基番号約331ないしアミノ酸残基番号約442 のアミノ酸残基を含んでなる変換成長因子−β ２。
9. 【請求項９】 図１ｂに図示したものと実質上同一のヌ
   クレ オチド残基番号約−70ないしヌクレオチド残基 番号約1755のヌクレオチドコード配列を含んで なる変換成長因子−β２前駆体をコードするヌ クレオチド配列。
10. 【請求項１０】 図１ｂに図示したものと実質上同一の
    アミノ 酸残基番号約１ないしアミノ酸残基番号約390 のアミノ酸配列を含んでなる変換成長因子−β ２前駆体。
11. 【請求項１１】 図１ｂに図示したものと実質上同一の
    アミノ 酸残基番号約30ないしアミノ酸残基番号約390 のアミノ酸配列を含んでなる変換成長因子−β ２前駆体。
12. 【請求項１２】 図１ｂに図示したものと実質上同一の
    アミノ 酸残基番号約279ないしアミノ酸残基番号約390 のアミノ酸配列を含んでなる変換成長因子−β ２。
13. 【請求項１３】 (a) 変換成長因子−β２をコードし
    ているヌ クレオチド配列を含有する真核細胞を、遺伝子 発現を調節する第２のヌクレオチド配列の制御 下で培養して、変換成長因子−β２活性を有す るペプチド又はタンパク質を真核細胞で製造さ せ；更に (b) 培養物から変換成長因子−β２を回収す る、ことを特徴とする変換成長因子−β２の製 造方法。
14. 【請求項１４】 変換成長因子−β２をコードしている
    ヌクレ オチド配列が、図１のヌクレオチド番号１ない し1339に図示されているものと実質上同一のヌ クレオチド配列を含んでなる請求項13に記載の 製造方法。
15. 【請求項１５】 変換成長因子−β２をコードしている
    ヌクレ オチド配列が、図１ｂのヌクレオチド番号−70 ないし1755に図示されているものと実質上同一 のヌクレオチド配列を含んでなる請求項13に記 載の製造方法。
16. 【請求項１６】 真核細胞がチャイニーズハムスター卵
    巣細胞 を有してなる請求項13に記載の製造方法。
17. 【請求項１７】 真核細胞がＣＯＳ細胞を有してなる請
    求項13 に記載の製造方法。
18. 【請求項１８】 遺伝子発現を調節する第２のヌクレオ
    チド配 列がSV40プロモーターを有してなる請求項13に 記載の製造方法。
19. 【請求項１９】 第２のヌクレオチド配列がプロモータ
    ーおよ び真核細胞が欠失している選択可能なマーカー をコードしている配列を有しており、変換成長 因子−β２をコードしている配列を有している 真核細胞を同定することが出来る請求項13に記 載の製造方法。
20. 【請求項２０】 選択可能なマーカーがジヒドロ葉酸レ
    ダクタ ーゼからなる請求項19に記載の製造方法。
21. 【請求項２１】 真核細胞をメトトレキセートに暴露し
    て、ジ ヒドロ葉酸レダクターゼおよび変換成長因子− β２のコード化配列の増幅されたレベルを含ん でいる耐性コロニーを選択する工程を更に有す る請求項20に記載の製造方法。
22. 【請求項２２】 真核細胞がジヒドロ葉酸レダクターゼ
    欠失チ ャイニーズハムスター卵巣細胞からなる請求項 21に記載の製造方法。
23. 【請求項２３】 (a) ATCCに寄託されかつ寄託番号CRL
    9800が 与えられたトランスフェクタントＣＨＯ−１β９、 12.5、CL 36を培養し；そして (b) 培養物から変換成長因子−β２を回収す る、ことを特徴とする変換成長因子−β２の製 造方法。
24. 【請求項２４】 トランスフェクタントをメトトレキセ
    ートの 存在下で培養する請求項23に記載の製造方法。
25. 【請求項２５】 (a) ATCCに寄託されかつ寄託番号CRL
    -10300 が与えられたトランスフェクタントCHO β２ (414)cl.32を培養し；そして (b) 培養物から変換成長因子−β２を回収す る、ことを特徴とする変換成長因子−β２の製 造方法。
26. 【請求項２６】 トランスフェクタントをメトトレキセ
    ートの 存在下で培養する請求項25に記載の製造方法。
27. 【請求項２７】 遺伝子発現を調節して真核細胞に活性
    な変換 成長因子−β２を製造させる、第２のヌクレオ チド配列の制御下にある変換成長因子−β２を コードしているヌクレオチド配列を含む真核細 胞。
28. 【請求項２８】 変換成長因子−β２をコードしている
    ヌクレ オチド配列が図１ｂのヌクレオチド番号−70な いし1755に図示されているものと実質上同一の ヌクレオチド配列を有している請求項27に記載 の真核細胞。
29. 【請求項２９】 変換成長因子−β２をコードしている
    ヌクレ オチド配列が図１ａのヌクレオチド番号−467 ないし2111に図示されているものと実質上同一 のヌクレオチド配列を有している請求項28に記 載の真核細胞。
30. 【請求項３０】 チャイニーズハムスター卵巣細胞を有
    してな 請求項27に記載の真核細胞。
31. 【請求項３１】 ＣＯＳ細胞を有してなる請求項27に記
    載の真 核細胞。
32. 【請求項３２】 遺伝子発現を調節するヌクレオチド配
    列がSV 40プロモーターを有してなる請求項27に記載の 真核細胞。
33. 【請求項３３】 第２のヌクレオチド配列が、プロモー
    ターと 真核細胞が欠失している選択可能なマーカーを コードしている配列を有していて、サル変換成 長因子−β２をコードしている配列を含んでい る真核細胞を同定させることが出来る請求項27 に記載の真核細胞。
34. 【請求項３４】 選択可能なマーカーがジヒドロ葉酸レ
    ダクタ ーゼを有してなる請求項33に記載の真核細胞。
35. 【請求項３５】 ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠失チャイ
    ニーズ ハムスター卵巣細胞からなる請求項34に記載の 真核細胞。
36. 【請求項３６】 ATCCに寄託されかつ寄託番号CRL
    9800が与 えられたCHO-1β9、12.5、CL 36からなる細胞 系。
37. 【請求項３７】 ATCCに寄託されかつ寄託番号CRL 1030
    0が与 えられたCHO β2(414)cl.23からなる細胞系。
38. 【請求項３８】 図１ｂに図示したものと実質上同一の
    アミノ 酸残基番号約279ないしアミノ酸残基番号約390 のアミノ酸配列からなる実質上純粋なポリペプ チド。
39. 【請求項３９】 変換生長因子−β２を殺腫瘍性有効投
    与量を もって投与することを含むイン・ビボにおける 腫瘍の治療方法。
40. 【請求項４０】 細胞増殖の刺激に有効な濃度で組換え
    変換成 長因子−β２を含む組成物を投与することを特 徴とする増大する傷をいやす方法。