KR970001236B1 - 형질전환 성장인자 β2의 클로닝 및 발현 - Google Patents

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Description

형질전환 성장인자 β2의 클로닝 및 발현

제1a도는 인체 TGF-β2-442 cDNA의 뉴클레오티드 배열 및 연역된 아미노산 배열을 나타낸 도면.

제1b도는 하이브리드 TGF-β1/TGF -β2 전구체 DNA의 뉴클레오티드 배열 및 연역된 아미노산 배열을 나타낸 도면.

제1c도는 하이브리드 TGF-β1/TGF -β2 전구체 유전자를 도식적으로 나타낸 도면.

제1d도는 pPc-14(2.2kb)와pPc-21(2.3kb)의 제한 효소 엔도뉴클리에이즈 지도를 나타낸 도면.

제1e도는 pPc-14(2.2kb)의 부분적 DNA 배역분석을 나타낸 도면.

제2도는 인체 TGF-β1과 TGF-β2-442 전구체 배열의 상동성을 나타낸 도면.

제3도는 BSG-40과 PC-3 포릴아데닐화 RNA의 노던 블롯 분석(Northern blot analysis)을 나타낸 도면.

제4도는 상이한 근원으로부터의 폴리아데닐화 RNA의 노던 블롯 분석을 나타낸 도면.

제5도는 재조합 TGF-β2의 생물활성을 분석한 도면.

제6도는 1β9, 12.5, 클론 36에 의해 분비되는 재조합 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 도면.

[발명의 소개]

본 발명은 인체의 형질전환 성장인자-베타 2의 클로닝 및 발현에 관한 것이다.

[발명의 배경]

형질전환 성장인자-베타(Traansforming growth factor-Beta : TGF-β)는 세포 분화 및 증식을 조절하는 최근 설명된 폴리펩티드 집단이다. 이 집단의 기타 구성원으로는 뮬러리안(Mulleria) 억제물질(Cate et al., 1986, Cell, 45 : 685-698), 인히빈류(inhibins)(Mason et al., 1985, Nature 318 : 659-663)alc 드로조필라(Drosophilla)의 데카펜타플레지 유전자 복합체의 전사물로부터 예견되는 단백질(Padgett et al., 1987, Nature 325 : 81-84)을 들수 있다.

형질전환 성장인자-베타(TGF-β)는 분자량이 13,000인 2개의 동일한 디설파이드 연결 서브유니트로 이루어져 있다(Assoian et al., 1983, J.Biol.Chem. 258 : 7155-7160 ; Frolik et al., 1983, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 80 : 3676-3680 ; Frolik et al., 1984, J Biol. Chem. 260 : 10995-11000). 이것은 몇몇 조직, 예컨대 태반(Frolik et al., 1983, Nature 325 : 81-84), 혈소판(Childs et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 5312-5316, Assioan et al., 1983, J. Biol. Chem. 258 : 7155-7160), 신장( Roberts et al., 1983, Biochemistry 22 : 5692-5698), 및 무기분이 감소된 뼈(Seyedin et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 119-123)로부터 정제하여 왔다. 10% 혈청 및 표피성장 인자의 존재하에서는 TGF-β는 정상적인 래트의 신장 섬유아세포의 족장 비의존성(anchorage independent) 생육을 증진시키고(Roberts et al., 1981, Rpoc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 5339-5343 : Roberts et al., 1982, Nature 295 : 417-419 : Twardzik et al., 1985, J. Cell. Biochem. 28 : 289-297) : 10% 혈청만이 존재할때는 AKR-2B 섬유아세포의 집락 형성을 유도할 수 있다(Tucker et al., 1983, Cancer Res. 43 : 1518-1586). TGF-β는 또한 태아 래트의 근육간엽세포의 분화 및 연골 특이 거대분자의 생성을 야기하는 것으로 나타났다(Seyedin et al., 1986, J. Biol. Chem. 261 : 5693-5695).

세포증식에 미치는 그의 효과와는 대조적으로, 아프리카산 녹색 원숭이 세포(BSC-1)로부터 분리된 기능적 연관 단백질 뿐만 아니라 인체 혈소판으로부터 정제된 TGF-β는 배양중 어떤 세포의 생육을 저해하는 것으로 나타났다(Tucker et al., 1984, Science 226 : 705-707). TGF-베타는 또한 몇종류의 인체 암세포주의 생장도 저해하는 것으로 나타났다.(Roberts et., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 119-123). TGF-β의 이러한 억제/자극 효과는 예컨대 세포형태 및 세포의 생리상태와 같은 몇몇 인자에 의존하는 것같다(Spon et al., 1986, Science 232 : 534 참고).

인체 TGF-β(Derynck et al., 1985, Nature 316 : 701-705), 마우스 TGF-β(Derynck et al., 1986, J.Biol. Chem. 261 : 4377-4379) 및 시미안 TGF-β(Sharples et. al., 1987, DNA 6 : 239-244)의 유전자를 코딩하는 cDNA 클론들이 분리되어 왔다. 이러한 클론들의 DNA 배열분석결과 TGF-β 모노머를 생성시키게 하는 커다란 전구체 폴리펩티드로서 합성되는 것으로 나타났다.

상술한 모든 TGF-β원으로부터의 TGF-β 전구체 단백질을 통털어 강력한 배열 상동성이 발견되었다.

최근 무기분이 감소된 소의 뼈로부터 분리해낸 어떠한 단백질이 TGF-β에 관련되는 것으로 동정되었다(Seyedin et al., 1987, J. Biol. Chem, 262 : 1946-1949). 이 단백질은 또한 돼지의 혈소판(Cheifetz et al., 1987, Cell 48 : 409-415), 인체 전립선 선암종 세포주 PC-3(Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26 : 2406-2410), 및 인체 교아 세포주(Wrann et al., 1987, EMBO 6 : 1633-1636)로부터도 분리되어 왔다.

이 단백질의 일부 아미노산 배열은 이것이 TGF-β와 상동인 것으로 나타났기 때문에 TGF-β2라 명명되었다. 상술한 인체 TGF-β(Derynck et al., 1985, Nature 316 : 701-705), 마우스 TGF-β(Derynck et al., 1986, J. Biol. Chem. 261 : 4377-4379) 및 시미안 TGF-β(Sharples et al., 1987, DNA 6 : 239-244)는 TGF-β1이라고 명명되었다.

[발명의 개요]

본 발명은 발현 조절소에 의해 조절되는 TGF-β2 암호 배열이 포함된 재조합 DNA 벡터로 형질도입된 성숙핵 숙주 세포에 의해 TGF-β2를 대량 생산하는데 관련된 것이다. 특별한 구체예에서, 인체 TGF-β2 전구체를 코딩(coding)하는 cDNA클론을 타목시펜(tamoxifen)으로 처리한 인체 전립선 선암종 세포주 PC-3으로 만든 cDNA 라이브러리로부터 수득하였다. 이러한 클론의 cDNA 배열은 그로부터 성숙한 112아미노산 TGF-β2 서브유니트가 단백질 가수분해에 의해 유도되는 442 아미노산 폴리펩티드 전구체로서 TGF-β2가 합성됨을 예견한다.

TGF-β2-442롤 명명된 이 TGF-β2 전구체는 TGF-β1의 전구체와 41%의 상동성을 갖는다. 다른 구체예에서, 시마안 TGF-β2 전구체를 코딩하는 cDNA 클론을 아프리카산 녹색 원숭이의 신장세포주 BCS-40으로부터 만든 cDNA 라이브러리로부터 얻었다. 이러한 클론의 cDNA 배열은 그로부터 성숙한 112 아미노산 TGF-β2 서브유니트가 단백질 가수분해에 의해 유도되는 414 아미노산 폴리펩티드 전구체로서도 TGF-β2가 합성됨을 예견한다. TGF-β2-414로 명명된 이 TGF-2 전구체는 414개의 아미노산 잔기 배열을 가지며 인체 TGF-β2-442 배열의 잔기 번호 116-135의 29개의 아미노산 대신 하나의 아스파라긴 잔기를 갖는다는 것을 제외하고는 TGF-β2-442의 아미노산 배열과 동일하다.

인체 TGF-β2-414 전구체를 코딩하는 인체 PC-3 cDNA 라이브러리로부터의 클론 뿐만 아니라 시미안 TGF-β2-442 전구체를 코딩하는 BSC-40 cDNA 라이브러리부터의 클론도 동정되었다. 인체 TGF-β2-442 전구체와 시미안 TGF-β2-442 전구체는 인체 TGF-β2-414 전구체와 시미안 TGF-β2-414 전구체가 그러하듯이 아미노산 수준에서는 완전히 상동이었다.

TGF-β1 및 TGF-β2의 성숙한 112 아미노산 모노머는 71%의 상동성을 나타내었다.

TGF-β1 시그날 및 전구체 배열에 인-페이즈(in-phase) 결합된 성숙한 TGF-β2를 코딩하는 배열을 함유하는 발현 벡터(공유/계류중인 미합중국 특허출원 제 189,984호)를 제조하여 중국산 햄스터 난소 세포(Chinese Hamster ovary 세포 : CHO 세포)를 형질도입시키는데 이용하였다. 결과적인 CHO 형질도입체는 성숙하고, 생물활성적인 TGF-β2를 생산 및 분비하였다.

(3.1.) 정의

단수 또는 복수로 본 명세서에 사용된 다음의 용어는 다음과 같은 의미를 갖는다.

TGF-β2 : 제1a도에 도시된 바와 같이 아미노산 잔기 331번-442번의 배열로 이루어진 사람 또는 시미안으로부터 유래된 형질전환 성장인자-베타2

TGF-β2 전구체 : 제1a도의 아미노산 잔기 1번-아미노산 잔기 442번, 또는 아미노산 잔기 116번부터 아미노산 잔기 144번까지가 결실되고 그대신 하나의 아스파라긴 잔기가 이를 대치한 아미노산 잔기 1번-아미노산 잔기 442번의 아미노산 잔기 배열로 이루어진 사람 또는 시미안으로부터 유래된 형질전환 성장인자-베타 2 분자 집단. 이 용어는 그 기원이 사람이던 시미안이던 TGF-β2-442나 TGF-β2-414로 표시되는 TGF-베타2 전구체를 의미한다.

하이브리드 TGF-β1/TGF-β2 전구체 : 제1b도의 아미노산 잔기 1번부터 아미노산 잔기 390번까지의 아미노산 잔기 배열로 된 신규의 형질전환 성장인자-베타 전구체 분자

TGF-β1 전구체 : 제1b도에 도시된 바와 같이 아미노산 잔기 278번까지의 시미안 형질전환 성장인자-β1 전구체 및 시그날 배열

[도면의 설명]

제2a도는 인체 TGF-β2-442 cDNA의 뉴클레오티드 배열 및 연역된 아미노산 배열을 나타낸 것으로서, PC-21의 2597bp 삽입물을 pEMBL에 서브클론시키고(Dante et al., 1983, Nucleic Acid Res. 11 : 1645-1654) 디데옥시 체인-종결법(Sanger et al., 1977, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 74 : 5463-5467)을 이용하여 양 사슬에서 배열을 분석하였다. 암호 배열을 나타내고 바로 그 위에 해당하는 아미노산 배열을 표시하였다. 성숙한 TGF-β2 배열을 박스안에 표시하고 시그날 펩티드의 위에 줄을 그었다. 잠재적인 글리오실화 부위는 별표로 나타냈다. 화살표는 추정적인 시그날 배열 절단 부위이다. 시미안 TGF-β2-414 cDNA의 뉴크렐오티드 배열은 뉴클레오티드 346-432([ ]로 표시)가 결손되고 그대신 AAT 배열에 의해 대치된 것과, 구조중 군데군데에서 몇가지 조용한 뉴클레오티드 변화가 일어난 것(바뀌어진 뉴클레오티드 바로 밑에 단일 문자로 표시함)을 제외하고는 인체 TGF-β2-442 cDNA 배열과 동일하다. 인체 TGF-β2-442 구조에서 아스파라긴이 아미노산 잔기 116-144를 대치한 것을 제외하고는 시미안 TGF-β2-414 전구체의 연역된 아미노산 배열은 인체 TGF-β2-442 전구체 아미노산 배열과 동일하다. 인체 TGF-β2-414 cDNA의 뉴클레오티드 배열은 점선(…)에 의해 표시된 영역을 통해 유전자 배열 분석되어 왔으며 뉴클레오티드 346-432가 결손되고 그대신 AAT 배열에 의해 대치된 것을 제외하고는 인체 TGF-β2-442 cDNA 배열과 완전히 상동인 것으로 밝혀졌다.

제1b도는 하이브리드 TGF-β1/TGF-β2 전구체 DNA의 뉴클레오티드 배열 및 연역된 아미노산 배열을 나타낸 것으로서, 암호 배열을 나타내고 바로 위에 연역된 아미노산 배열을 표시하였다. 성숙한 TGF-β2 매열은 박스안에 표시하고 전구체 시그날 펩티드에 윗줄로 표시하였다. 글라코실화 부분은 별표로 나타내었다. 화살표는 추정적인 시그날 배열 절단부위를 표시한다. 도시된 TGF-β2의 성숙한 암호 배열은 인체로부터 유래된 것이다. 시미안 TGF-β2의 성숙한 암호 배열은 인체 배열과 거의 동일하다 : 오직 3개의 조용한 염기변화만 있고 바뀌어진 뉴클레오티드 바로 밑에 단일 문자로 표시하였다. TGF-β2의 cDNA 클로닝 및 하이브리드 TGF-β1/TGF-β2 유전자의 제조는 상세한 설명에 나타내었다.

제1c도는 하이브리드 TGF-β1/TGF-β2 전구체 유전자를 도식적으로 나타낸 도면이다.

제1d도는 pPC-14(2.2kb)와 pPC-21(2.3kb)의 제한효소 엔도뉴클리에이즈 지도로서 박스로 표시된 영역은 TGF-β2 모노머의 암호 배열을 나타낸다. ATG는 개시 메티오닌 코돈을 가리킨다. pPC-21(2.3kb)에 있어서 Kpn Ⅰ부위와 ATG 사이의 거리는 약 420bp이다. 어두운 부분은 pPC-21(2.3kb )중에 삽입된 84-bp 부분을 나타낸다.

제1e도는 pPC-14(2.2kb)의 부분적 DNA 배열 분석으로 나타낸 것으로서 pPC-21(2.3kb)내의 삽입물중의 Kpn Ⅰ부위로부터 상류(upstream) 약 140bp를 교잡시키는 합성 올리고뉴클레오티드 5'-AGGAGCGACG-AAGAGTACTA-3'를 DNA 배열을 분석하는 반응을 개시하는데 이용하였다. 이 영역에서, pPC-14(2.2kb)(윗줄)는 Asn-116 에 해당하는 뉴클레오티드 배열까지는 pPC-21(2.3kb)와 동일하다. pPC-21(2.3kb)중에서 발견되고 pPC-14(2.2kb)의 Asn-116 코돈에 상응하는 84-bp 삽입물을 나타냈다. 삽입물중의 Kpn Ⅰ부위를 나타냈다.

제2도는 인체 TGF-β1과 TGF-β2-442 전구체 배열의 상동성을 나타낸 것으로서 2a도 및 2b도는 다음을 도시한다.

a)1차 배열 상동성 : 동일한 잔기는 박스안에 나타냈다. 별표는 TGF-β2내의 잠재적인 글리코실화 부위를 가리킨다. 잠재적인 시그날 배열 절단 부위와 성숙한 폴리펩티드의 절단 부위를 표시했다.

b)Gene Pro 소프트웨어를 이용한 도트 매트릭스(dot matrix) 비교. 각각의 도트는 아미노산 10개중 5개가 동일한 곳을 가리킨다. 대각선은 상동영역을 나타낸다.

제3도는 BSC-40RHK PC-3 폴리아데닐화 RNA의 노던 블롯 분석(Northern blot analysis)을 나타낸 것으로서 재료 및 방법에서 설명한 바와 같이 폴리아데닐화 RNA를 BSC-40 및 PC-3 세포로부터 분리하고 아가로스-포름알데히드 겔상에서 크기를 분별하고, Hybond-N 필터에 옮긴다음 [³²P]-포지 TGF-β2 특히 프로브인 pPC-21(판넬 A) 또는 [³²P]-포지 TGF-β2와 TGF-β1 특이 프로브와의 혼합물(판넬 B)(Sharples et al., 1987)에 교잡시켰다. 레인 1, BSC-40 폴리아데닐화 RNA(5㎍) ; 레인 2, PC-3 폴리아데닐화 RNA5㎍).

제4도는 상이한 근원으로부터의 폴리아데닐화 RNA의 노던 블롯 분석을 나타낸 것으로서 재료 및 방법에 설명된 바와 같이 폴리아데닐화 RNA를 MCF-7(인체 유방 암종), SK-MEL 28(인체 흑색종), KB(비인두 암종) 및 HBL-100(인체 유방 상피)세포로부터 분리하고 TGF-β2 특이 프로브 (pPC-21)로의 노던 블롯 하이브리다이제이션에 의해 분석하였다. 각 레인에는 SK-MEL 28(레인 1), MCF-7(레인 2), HBL-100(레인 3), 또는 KB( 레인 4) 세포로부터의 폴리아데닐화 RNA가 5㎍씩 함유되어 있다.

제5도는 재조합 TGF-β2의 생물활성을 분석한 것으로서 1β9 12.5, 클론 36 세포를 100mm 조직 배양기에서 키워 합류시켰다.세포를 혈청이 없는 배지로 3회 세척하고 혈청이 없는 배지 5㎖ 중에서 24시간 배양시켰다. 배지를 모아 0.2M 초산에 대해 투석하고 설명대로 CCL64 세포에 있어서의 DNA 합성의 억제에 대해 분석하였다(Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7 : 3418). 이 분석에서, 정제한 자연 TGF-1 스탠다드 3.3pga은 50% 저해를 나타냈으며 ; 정제한 자연 TGF-β2의 특이 활성은 TGF-β1의 약 절반인 것으로 계산되었다.

제6도는 1β9, 12.5, 클론 36에 의해 분비되는 재조합 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것으로서, 1β9, 12.5, 클론 36 세포로부터 혈청이 없는 배지르 산투석시켜 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분별시키고 설명된 바와 같이 합성 펩티드 NH2-YNTINPEASASPC-COOH에 대해 만들어진 항 혈청으로 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다(Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7 : 3418).

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 TGF-β 전구체 유전자 암호 배열로부터 생물활성적이고 성숙한 형태의 TGF-β2를 생산해내는 것과 그의 생산물에 관한 것이다. 성숙하며 생물활성적인 TGF-β2는 실제로 정통한 자연산 TGF-β2의 생물활성과 구별할 수 없을 정도의 생물활성을 갖는 성숙한 TGF-β2가 생산되도록 전구체를 정확히 프로세싱하는 숙주 세포내에서 TGF-β2 전구체가 그의 기능적 동가물의 완전한 길이의 뉴크레오티드 암호 배열을 클로닝 및 발현시킴으로써 제조할 수 있다. TGF-β2 전구체의 완전한 길이의 뉴클레오티드 암호 배열의 기능적 등가물에　 적절한 숙주 세포내에서 발현되는 경우, 성숙한 TGF-β2의 합성, 프로세싱 및 배출을 지시할 수 있는 DNA 배열이면 어느것이든 포함된다. 이와 관련해서, 예컨대, 성숙한 TGF-β2 배열에 인-프레임(in-frame) 결합되 TGF-β1 전구체 배열과 같은 하이브리드 전구체 암호 배열을 조립하여 생물활성적인인 TGF-β2를 제조하는데 이용할 수도 있다.

단순히 설명 목적을 위해 본 발명의 방법을 나눈다면 다음의 단계로 구분할 수 있다:

(a)TGF-β2의 전구체 형태에 해당하는 유전자 배열의 분리 및 생산 ;

(b)TGF-β2 유전자 암호 배열의 발현을 지시하게 될 발현 벡터의 제조 ;

(c)이 유전자를 복제 및 발현시키며, 성숙하고 생물활성적인 형태의 TGF-β2가 생산되도록 이 유전자 생산물을 프로세싱할 수 있는 적절한 숙주 세포로의 형질 도입(trensfection) ; 및

(d)성숙하며 생물할성적인 TGF-β2의 동정 및 정제 단계가 그것이다. 일단 형질도입체가 생물활성적인 성숙한 TGF-β2를 고도로 발현시키는 것으로 동정되면, 본 발명의 실행에는 이 클론을 확대시키고 발현된 유전자 생산물을 분리하는 것이 포함된다.

본 발명의 방법은 TGF-β2 전구체를 암호화하는 영역의 cDNA를 준비, 클로닝, 유전자 배열 결정, 및 이용하여 CHO 세포내에서 TGF-β2를 고도로 발현시키는 발현 벡터를 조립하는 실시예들에 의해 입증된다. 특별한 구체예에서는 성숙한 형태의 인체 TGF-β2의 완전한 아미노산 배열이 결정되었는데 이는 TGF-β1과 71%의 상동성을 나타내었다. 합성 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여, 본 발명자들은 TGF-β2에 대한 유전자 배열을 코딩하는 PC-3 cDNA 라이브러리로부터 클론을 동정하였다. 이들 클론들중의 하나에 대해 행한 DNA 배열 분석 결과 TGF-β2가 TGF-β1과 마찬가지로, 그의 카르복시 말단이 절단되어 성숙한 TGF-β2 모노머를 생산하는 보다 큰 전구체 단백질로서 합성되는 것으로 나타났다. 이 분자들의 성숙한 부분을 통털어 TGF-β1과 TGF-β2 사이에는 71%의 상동성이 있는 반면 나머지 전구체 사이에서는 최대 31%의 상동성만이 존재한다는 것은 TGF-β1과 TGF-β2의 아미노 말단부위 사이에 기능적인 차이가 있음을 암시하는 것이다.

본 발명의 특정 구체예에서는, CHO 세포중에서 신규의 TGF-β1/TGF-β2 하이브리드 유전자의 발현을 이용하여 대량의 생물활성적인 TGF-β2를 생산하였다.

본 발명의 방법의 다양한 측면을 다음의 설명 및 실시예를 통해 보다 자세히 기재하였다.

(5.1.) TGF-베타 2 코딩 영역의 분리 및 생산

TGF-β2에 대한 뉴클레오티드 유전자 암호 배열을 제1a도에 도시하였다. 본 발명의 방법을 수행하는데 있어서, 그안에 도시된 뉴클레오티드 배열이나 단편, 또는 그의 기능적 등가물의 적절한 숙주 세포내에서 TGF-β2 생산물의 발현을 지시할 재조합 분자를 생산하는데 이용할 수 있다. 특별한 구체예에서는, TGF-β1/TGF-β2 하이브리드 유전자(제1b도)를 조립하여 CHO 세포를 형질 도입시키는데 이용하였다. 생물활성적이며 성숙한 TGF-β2를 배지 ㎖당 500㎍만큼 생산해내는 형질 도입체를 분리하였다.

뉴클레오티드 암호 배열이 퇴화되므로, 제1a도 및 제1b도에 도시된 아미노산 배열과 실제로 동일한 것을 코딩하는 기타의 DNA 배열들의 TGF-β2를 클로닐 및 발현시키기 위한 본 발명의 수행에 이용할 수 있다. 이러한 변경 사항에는 동일하거나 기능적으로 동등한 유전자 생성물을 코딩하는 유전자 배열을 야기시키게 되는 상이한 뉴클레오티드 잔기의 부가, 치환 또는 결실이 포함된다. 유전자 생성물은 유전자 배열중에서 아미노산 자기의 결실, 부가 또는 치환을 포함할 수 있으며, 이것은 조용한 변화를 일으켜 생물활성적인 생성물을 생산시키게 된다. 이러한 아미노산 치환은 관여된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양극성에 있어서의 유사성을 근거로 하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 음전하를 띤 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산이 있고 ; 양전하를 띤 아미노산으로는 라이신 및 아르기닌이 있으며 ; 유사한 친수성 정도를 갖는 전하를 띄지 않는 극성 또는 비극성 헤드기(head group)를 갖는 아미노산으로는 류신, 이소류신, 발린; 글리신, 알라닌; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 페닐알라닌, 티로신을 들 수 있다.

TGF-β2에 대한 뉴클레오티드 암호 배열은 TGF-β2 유사 활성을 내는 세포원으로부터 얻을 수 있다. 암호 배열은 이러한 세포원으로부터 분리 및 정제한 RNA를 cDNA 클로닝시키거나 또는 게놈 클로닝에 의해 얻을 수 있다. 클론의 cDNA 또는 게놈 라이브러리는 제한 효소를 사용하는 것과 같은 기술분야에 알려진 기술을 이용하여 DNA 단편으로부터 제조할 수 있으나 꼭 제한효소 기술에 한정되는 것은 아니다. TGF-β2를 코딩하는 단편은 제1a도에 도시된 배열중의 어느 부분이던지와 실제로 상보적인 뉴클레오티드프로브를 이용하여 이러한 라이브러리를 스크리닝 함으로써 동정할 수 있다. 완전한 길이의 클론, 즉, TGF-β2 전구체 전체를 코딩하는 영역을 포함하는 클론을 발현을 위해 선택할 수 있다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 제1a도의 유전 암호 배열은 기술분야에 잘 알려진 화학적 방법을 이용하여 전체 또는 일부분만 합성할 수 있다. 예컨대, Caruthers et al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7 : 215-223 ; Crea 및 Horn, 1980, Nuc. Acids. Res. 9(10) : 2331 ; Mattencci 및 Carruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21 : 719 및 Chow 및 Kempe, 1981, Nuc. Acids, Res. 9(12) : 2807-2817 참고. 다른 한편, 이 단백질은 제2a도에 도시된 아미노산 배열을 전체, 또는 부분적을 h합성하는 화학적 방법을 이용하여 제조할 수 도 있다. 예컨대, 펩티드를 Beckman 990 기구상에서 고상 기술에 의해 합성하여, 전술한 바와같이 수지로부터 떼어낼 수 있다(Gentry. L.E., et al., 1983, J. Biol. Chem. 258 : 11219-11228 ; Gentry, L.E. 및 Lawton, A., 1986, Virology 152 :421-431 참고). 예비 고성능 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 펩티드 조성은 아미노산 분석으로 확인하였다.

본 발명의 실시예에 기재된 특정 구체예에서는, 앞서 TGF-β2를 생산하는 것으로 나타난 타모특신-처리한 인체 전립선 선암종 세포주 PC3으로부너 분리해낸 폴리아데닐화 RNA로부터 유래된 인체 TGF-β2 전구체의 암호 배열을 cDNA 클로닝하여 TGF-β2의 암호 배열을 얻었다. 하나의 cDNA 클론 전체를 암호화한 영역의 유전자 배열을 분석하고 공표된 인체 TGF-β1의 유전자 배열과 비교하였다(제 2 도).

TGF-β2 cDNA 클론의 DNA 배열 분석 결과는 TGF-β1과 마찬가지로 TGF-β2가 그의 카르복시 말단이 절단되어 성숙한 112개의 아미노산 TGF-β2 모노머를 생산하게 되는 커다란 전구체 단백질로서 합성됨을 가리킨다. TGF-β2는 2개의 디설파이드-결합된 각 13,000달돈의 서브유니트로 이루어지며 분자량은 24,000인 것으로 나타났다(Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26 : 2406-2410 ; cheifetz et al., 1987, Cell 48 : 409-415). 그러므로, 성숙한 TGF-β2를 생산하기 위해서는 분자내(intra-molecular) 및 분자간(inter-molecular) 디설파이드 결합의 형성 뿐만 아니라 적당한 단백질 가수분해도 요구된다. 아미노 말단 소수성 리더 배열(잔기 3-9)가 전구체내에 존재하는데 단백질을 세포외로 내보내는데 책임이 있을지 모른다. 성숙한 TGF-β2는 이 과정동안 전구체의 나머지 부분과 여전히 관련되어 있을 것이다.

TGF-β2는 전구체의 성숙한 부분으 통털어 TGF-β1과 71%의 상동성을 나타내는데, 이것은 실험적 입증에 의해 지지되는 바와같이 기능적 유사성을 내포하는 것이다(Seyedin et al., 1987, J Biol. Chem. 262 : 1946-1949 :; Cheifetz et al., 1987, Cell 48 : 409-415). 인간, 설치류 및 시미안(Derynck et al., 1985, Nature 316 :701-705 ; Derynck et al., 1986, J. Biol. Chem. 261 : 4377-4379; Sharples et al., 1987, DNA 6 : 239-244)으로부터의 TGF-β1의 전구체 영역의 아미노부분은 고도로 보존되며 이것은 분자중 이 부분이 중요한 생물적 기능을 담당함을 암시하는 것이다. 이와 대조적으로, TGF-β1과 TGF-β2의 N-말단 전구체 영역 사이에는 오지 31%의 상동성만이 있었다. 추정적인 시그날 펩티드의 절단후, TGF-β2 전구체는 TGF-β1 전구체보다 더 많은 아미노산을 함유할 것이다.

TGF-β1과 TGF-β2 전구 단백질의 아미노 말단 영역간의 1차 구조의 차이는 기능적 차이를 반영한다고 할 수 있다. 그러나, 전구체 사이의 상당한 상동영역이 분리된 블록에서 발견된다는 것은 심지어 N-말단 전구체 영역사이에서도 중요한 기능영역이 보존됨을 시사하는 것이다.

노던 블롯 분석결과 BSC-40 세포내에 크기가 각각 4.1kb 및 6.5kb 인 2가지 주요한 부류의 TGF-β2-특이 mRNA가 있음이 밝혀졌다.

타목시펜으로 처리한 PC-3 세포에는 크기가 4.1kb, 5.1kb 및 6.5kb인 3개의 TGF-β2 전사체가 포함된다. 이렇게 크기가 다른 메시지는 다른 유전자에 대해 기재된 바와같이 특이한 PNA 스플라이싱, 폴리아데닐화 또는 두가지 모두에 기인한 것일 수 있다(Helfman et al., 1986, Mol, Cell. Bio. 6 : 3582-3595 ; Sayre et al., 1987, Rpoc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :2941-2945). 또다른 TGF-β2 cDNA 클론의 예비 분석결과는 이것이 pPC-21 및 pPC-14의 것들보다 약 1kb나 더 큰 3'-비번역 영역을 포함하며 상이한 폴리아데닐화 부위를 포함함을 나타내는데 이는 양자 택일적인 폴리아데닐화가 노던 블롯에서 관찰되는 다중 TGF-β2 mRNAs 발생의 한 책임요소임을 시사한다.

BSC-40 세포는 TGF-β1 및 TGF-β2 특이 전사체을 필적할만한 정도로 함유하며 ; 타목시펜 처리한 PC-3 세포는 TGF-β2 보다 TGF-β1 mRNA를 더 많이 함유한다(제 3도). 후자의 결과는 이 세포들이 TGF-β1 보다 TGF-β2 단백질으 더 많이 생산해내기 때문에 예기치 못한 것이었으며 이 성장 모듈레이터의 합성과 관련한 전사후 조절수준을 암시한다.

TGF-β1과 TGF-β2 생산으로 이끄는 전사 및 번역조절 기작을 이해하려는 목적의 실험이 진행중이다. TGF-β1에 행해졌던 것과 마찬가지로, 재조합 DNA 기술에 의해 적절한 양의 TGF-β2를 생산하는 것은 이 단백질의 다른 효과를 찾아내려는 실험을 고안하는데 더 도움이 될 것이다.

다른 구체예에서, 아프리카산 녹색 원숭이 세포주 BSC-40으로부터 분리한 폴리아데닐화 RNA로부터 유도된 시미안 TGF-β2 전구체 암호 배열을 cDNA 클로닝시킴으로써 TGF-β2 암호 배열을 얻었다. 한가지 cDNA 클론의 전 코딩 영역을 분석하였다.

인간 및 시미안 TGF-β2 전구체는 동일한 아미노산 배열을 갖는 것으로 나타났으며, 그들의 뉴클레오티드 배열은 거의 동일하였다.

(5.2.) TGF-베타2 암호 배열을 포함하는 발현 벡터의 조립

생물활성적이며, 성숙한 형태의 TGF-β2를 발현시키기 위해서는 높은 전사 및 번역수준을 제공할 뿐만아니라 유전자 산물을 정확한 프로세싱하는 발현 벡터/숙죽계를 선택해야만 한다. 이것은 발현 조립체내에서 TGF-β2 전구체의 전 암호 영역을 사용하는 경울 특히 중요한데 이는 성숙한 형태의 TGF-β2가 세포적 프로세싱 과정을 경우하여 전구체 산물로부터 유래되는 것으로 나타나기 때문이다. 덧붙여, 생성물의 분비를 제공하는 발현/숙주 세포계도 선택될 수 있다.

특히, 성숙한 TGF-β2, 즉 서브유니트당 112 아미노산의 디설파이드-연결 동족 이량체가 전구체의 Arg-Ala 아미노산 사이(제2aehdptj 잔기 번호 330 및 331)에서의 단백질 가수분해를 포함한 세포 프로세싱에 의해 형성되는 것으로 나타났다. 덧붙여, TGF-β2 전구체는 성숙한 형태의 TGF-β2에서는 발견되지 않는 세 개의 잠재적인 N-글리코실화 부위를 포함하는데 전구체의 적절한 글리코실화는 성숙한 분자의 세포합성 및 배출 또는 분비에 있어 중요하다. 더욱이, 성숙한 형태의 TGF-β2는 서브유니트당 9개의 시토신잔기를 포함하는 디설파이드-결합된 이량체로 이루어진다. 이들중 몇가지는 인터체인 디설파이드 결합에 포함되고, 다른것들은 인트라체인 디설파이드 결합에 포함되는데 이는 성숙한 분자의 3차 구조 및 공간배치에 영향을 미치고, 그 결과 그의 생물활성에도 영향을 미치게 된다. 따라서, TGF-β2 유전자 산물을 정확히 발현시키고 프로세싱하기 위해 발현계에 이용되는 숙주 세포의 이용성은 생물활성적이고, 성숙산 TGF-β2를 생산하는데 중요하다.

여러가지 동물숙주/발현 벡터계(즉, 적합한 숙주 세포내에서 TGF-β2 암호 배열의 복제, 전사 및 번역으 지시하는데 필요한 요소들을 함유하는 벡터)는 숙련된 기술자에 의해 마찬가지로 잘 이용될 수 있을 것이다. 이러한 것들에는 바이러스 발현 벡터/포유류 숙주 세포계(예컨대, 시토메갈로바이러스, 벡시니아바이러스, 아데노바이러스 등) ; 곤충바이러스 발현 벡터/곤충 세포계(예컨대, 배클로바이러스) ; 또는 포유류 세포의 게놈으로부터 유도된 비바이러스성 프로모터 발현계(예컨대, 마우스 메탈로티오닌 프로모터)를 들 수 있다.

이 벡터들의 발현 요소는 그들의 강도와 특이성에 있어 차이가 난다. 이용되는 숙주/벡터계에 의존하여, 몇가지의 적합한 전사 및 번역 요소중 어느것이든 이용될 수 있다. 예컨대, 포유류 세포계에서 클로닝하는 경우, 포유류 세포의 게놈으로부터 분리한 프로모터(예컨대, 마우스 메탈로티오닌 프로모터), 또는 이러한 세포내에서 생장하는 바이러스로부터 분리한 프로코터(예컨대 벡시니아바이러스 7.5K 프로모터)를 사용할 수 있다. 재조합 DNA 또는 합성기술에 의해 생산한 프로모터들 또한 삽입된 배열의 전사를 대비하는데 이용될 수 있다.

특별한 개시 시그날도 삽입된 단백질 암호 배열의 충분한 번역을 위해 요구된다.

이러한 시그날에는 ATG 개시 코돈과 인접한 배열이 포함된다. 그 자신의 개시 코돈과 인접한 배열을 포함하여 TGF-β2 전체 유전자가 적합한 발현 벡터에 삽입되는 경우에는 부가적인 번역 조절 시그날이 필요하지 않다. 그러나, 암호 배열의 일부만이 삽입되는 경우엔 ATG 개시 코돈을 포함하여, 외연성 번역 조절 시그날이 제공되어야만 한다. 게다가, 전체 삽입물의 번역으 확실히 하기 위해 TGF-β2 암호 배열의 리딩 프레임의 페이즈(phas)내에 개시 코돈이 있어야 한다. 이러한 외인성 번역 조절 시그날 및 개시 코돈은 그 기원이 자연 및 합성 모두의 여러가지일 수 있다. 발현 효율은 전사 약화 배열, 증강 요소 등의 함유에 의해 개선될 수 있다.

DNA 단편을 벡터에 삽입하는 것에 대해 이전에 기술한 방법은 어떠한 것이든지 TGF-β2 유전자 및 적합한 전사/번역 조절 시그날을 함유하는 발현 벡터를 조립하는데 이용할 수 있다. 이러한 방법에는 생체의 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합(유전자 재조합)을 들 수 있다.

발현 벡터로서 아데노바이러스를 이용하는 경우, TGF-β2 암호 배열을 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예컨대, 후기 프로모터 및 3분절에 리더 배열에 연결시킬 수 있다.

이 키메라 유전자는 다음 생체의 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입시킬 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역(예컨대, E1 또는 E3 영역)에 삽입시키면 감염된 숙주내에서 생존가능하며 TGF-β2를 발현시킬 수 있는 재조합 바이러스가 생산될 것이다. 이와 유사하게, 벡시니아 7.5K 프로코터도 이용할 수 있다.

TGF-β2를 발현시키는데 이용할 수 있는 또 다른 발현계는 곤충계이다. 이러한 곤충계중 하나에서는 외래 유전자를 발현시키는 벡터로서, Autographa californica 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV)를 이용한다. 이 바이러스는 Spodoptera frugiperda 세포내에서 생장한다. TGF-β2 암호 배열을 바이러스의 비필수 영역(예컨대 폴리헤드린 유전자)으로 클로닝되어 AcNPV 프로모터(예컨대 폴리헤드린 프로모터)조절하에 자리잡을 수 있다. TGF-β2 암호 배열이 성공적을 HTKQ입되면 폴리헤드린 유전자의 불활성화 및 비차단 재조합 바이러스(WRM, 폴리헤드린 유전자에 의해 암호화되는 단백질 피복이 결여된 바이러스)의 생성을 야기할 수 있다. 이러한 재조합 단백질은 다음 Spodoptera frugiperda 세포를 감염시키는데 이용되어 그 내부에서 유전자를 발현시킨다.

덧붙여, 삽입된 배열의 발현을 조절하거나, 요구되는 특이한 형태로 유전자 산물을 변형 및 가공하는 숙주 세포주도 선택될 수 있다. 특정 프로모터로부터의 발현은 특정 유발물질(예컨대, 메탈로티오닌 프로모터의 아연 및 카드륨 이온)의 존재하에 향상될 수 있다. 그러므로, 유전조작된 TGF-β2의 발현은 제어될 수 있다. 이것은 만약 클론된 외래 유전자의 단백질 생성물이 숙주 세포에게 치명적일 때 중요하다. 더욱이, 단백질 생성물의 변형(예컨대, 글리코실화) 및 프로세싱(예컨대, 절단)은 단백질 기능에 있어 중요하다.

상이한 숙주 세포는 단백질의 후기 번역 프로세싱 및 변형을 위한 특히 기작과 특성을 갖는다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 확실히 하기위해 적절한 세포주 또는 숙주계를 선별할 수 있다.

(53) 2TGF-베타 유전자 산물을 발현시키기는 형질도입체 또는 형질전환체의 동정

재조합 TGF-β2 암호 배열을 함유하고 생물활성적이며 성숙한 생성물을 발현시키는 숙주 세포는 적어도 4가지의 일반적 접근법에 의해 동정될 수 있다. 즉 (a) DNA-DNA 교잡(hybridization)(b) 표식(marker) 유전자 기능의 유무 ; (c) 숙주 세포내에서 TGF-β2 mRNA 전사체의 발현에 의해 측정되는 전사수준의 평가 ; 및 (d) 면역 분석 및, 궁극적으로는 그의 생물활성에 의해 측정되는 성숙한 유전자 산물의 검색이 그것이다.

처음의 접근법에 있어서, 발현 벡터내에 삽입된 TGF-β2 암호 배열의 존재는 제2a도에 도시된 TGF-β2 암호 배열, 또는 그의 유도물의 일부와 상등인 뉴클레오티드 배열로 이루어진 프로브를 이용하는 DNA-DNA 교잡에 의해 검색될 수 있다.

두 번째 접근법에서 재조합 발현 벡터/숙주계는 특정한 표식 유전자 기능(예컨대, 티미딘 키나아제 활성, 항체에 대한 저항성, 메토트렉세이트에 대한 내서, 형질전환 표현형, 배큘로바이러스내의 차단체 형성등)의 유무에 기초하여 동정 및 선별될 수 있다. 예컨대, 만일 TGF-β2 암호 배열이 벡터의 표식 유전자 배열내에 삽입되면, TGF-β2 암호 배열을 함유하는 재조합체는 표식 유전자 기능의 부재에 으해 동정될 수 있다. 다른 한편, 표식 유전자는 TGF-β2 암호 배열의 발현을 제어하는데 이용되는 같거나 다른 프로모터의 제어하에서 TGF-β2 배열과 함께 탄뎀(tandem)내에 위치할 수 있다. 유도 및 선별에 반응하여 일어나는 표식자의 발현은 TGF-β2 암호 배열의 발현을 가리키는 것이다.

세 번째 접근법에서, TGF-베타 2 암호 영역에 대한 전사 활성은 교잡 분석에 의해 평가될 수 있다. 예컨대, 폴리 아데닐화 RNA를 TGF-베타 2 암호 배열이나 그의 특정부분과 상동인 프로브를 이용하여 노던 블롯에 의해 분리 및 분석할 수 있다. 다른 한편, 숙주 세포의 핵산 전체를 추출하여 이러한 프로브에 대한 교잡에 대해 분석할 수 있다.

네 번째 접근법에 있어서, 성숙한 단백질 생성물의 발현은 면역 분석적으로, 예컨대, 웨스턴 블롯, 방사성면역 침전, 효소-연결 면역 분석등과 같은 면역분석법등에 의해 평가할 수 있다. 그러나, 발현계의 성공을 궁극적으로 시험하는 것은 생물활성적인 TGF-β2 유전자 산물의 검색을 포함한다. 숙주 세포가 유전자 산물을 분비하는 경우 배양한 형질도입 숙주 세포로부터 얻어진 무세포 배지르 TGF-β2 활성에 대해 평가할 수 있다. 유전자 산물이 분비되지 않는 경우 세포 용균물을 이러한 활성측정에 이용할 수 있다. 둘중 어느 경우에서도, 여기에 기재된 생장 저해 분석과 같은 생물적 분석이나 표적 세포에 있어서의 족장 비의존성(anchorage independent)(Twardzik and Sherwin, 1985, J Cell. Bio Chem. 28 : 289-297 ; Delarco and Todaro, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A 75 : 4001-4995). 생육의 촉진등과 같은 것이 이용될 수 있다.

일단, 생물 활성적이며, 성숙한 TGF-β2를 고수준으로 생산하는 클론이 동정되면, 이 클론을 증폭시키고 기술분야에 잘 알려진 기술을 이용하여 TGF-β2를 정제할 수 있다. 이러한 방법에는 면역흡착분석, 고성능 액체 크로마토그래피를 포함하느 크로마토그래피법 등이 포함된다.

(6) 실시예 : PC-3 세포로부터의 TGF-베타 2 전구체의 cDNA 클로닝

다음의 실시예들에는 그로부터 TGF-베타 2를 이미 분리해낸 인체 전립선 선암종 PC-3으로부터의 TGF-β2 전구체 암호 배열을 cDNA 클로닝시키는 것이 기재된다.

(6.1.) 재료 및 방법

다음의 공정들을 이용하여 인체 TGF-베타 2 전구체를 코딩하는 cDNA를 클로닝시켰다.

(6.1.1.)세포 생육 및 RNA 추출

인체 전립선 선암종 세포 PC-3을 기재된 바와 같이 타목시펜-보강 배지중에서 생육시켰다.(Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26 : 2406-2410). MCF-7 세포를 10% 송아지 태아 혈청과 6units/㎖ 인슐린이 함유된 Dulbecco's 면형 Eagle's 배지내에서 생육시켰다. 다른 모든 세포주들은 동일한 배지내에서 인슐린없이 생육시켰다. 폴리아데닐화 RNA를 개재된 바와 같이 올리고 [dT]-셀룰로오스 크로마토그래피에 의해 분리시켰다(Purchio and Fareed, 1979, J. Viol. 29 : 763-769)

(6.1.2.) cDNA 라이브러리 조립 및 스크리닝

기재된 바와 같이 타목시펜으로 24시간 처리한 PC-3 세포에서 분리한 폴리아데닐화 RNA로부터 이중사슬 cDNA를 합성하였다(Maniatis et al., 1982, in Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York), 크기가 1000bp를 초과하는 cDNA 단면을 기재된 바와 같이 람다 gt10에 클로닝시켰다(Webb et al., 1987, DNA 6 : 71-79). TGF-β1과 TGF-β2 사이에 보존된 아미노산 WKWIHEP를 암호화하는 DNA에 상보적인 [³²P]-포지 24배 퇴화 프로브(프로브 1)로 라이브러리를 우선 2번 스크리닝하였다.

다음 양성 클론을 아미노산 CFRNVQD를 암호화하는 DNA에 상보적인 2차 128배 퇴화 프로브(프로브 2)로 스크리닝시켰다 ; 이 7가지 아미노산중 5가지는 TGF-β2에 대해 특이적이다:

교잡은 42℃에서 6×SSC, 5×Denhart 용액, 0.15 mM 피로인산, 100㎍/㎖ 변성된 송아지 흉선 DNA , 100㎍/㎖ 효모 tRNA 및 1mM EDTA 중에서 수행하였다(Maniatis et al., 1982, in Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor press, Cold Spring Harbor, New York). 필터를 42℃에서 2×SSC, 0.1% NaDodSO4 중에서 30분동안 4회 세척하였다. 양쪽 프로브에 모두 교잡되는 몇가지 cDNA 클론을 분리하여 pEMBL에 서브클론 시켰다(Dante et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11 : 1645-1654). 2.6kb 삽입물을 함유하는 한 클론(pPC-21)을 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이밍과 결합된 액소뉴클리에이즈 Ⅲ 결실 단편 및 여러 제한 효소를 이용하여(Henikoff, 1984, Gene 28 : 351-359) 디데옥시 체인-종결법(Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Scl. USA 74 : 5463-5467)에 의해 양 사슬상에서 유전자 배열을 결정하였다. 2.2.kb 삽입물이 함유된 또다른 클론(pPC-14)도 부분적으로 유전자 배열 결정시켰다. Riverside Scientific Enterprises(시애틀, 워싱턴)사의 Gene Pro 소프트웨어를 이용하여 IBM ATPC 상에서 도트 매트릭스 분석을 수행하였다.

(6.1.3.) 노던 블롯 분석

폴리아데닐화 RNA를 1% 아가로스포름알데히드 겔 (Lehrach et al., 1977, Biochemistry 16 : 4743-4751) 상에서 분별시키고, 나일론 막에 옮긴다음(Hybond, Amersham), [32P]-표지 프로브에 교잡시켰다. 교잡은 42℃에서 0.9M NaCl, 50mM 인산나트륨(pH 7.0) 5mM EDTA, 0.1% NaDodSO4, 4×Denhardt 용액 0.4 mg/㎖ 효모 tRNA, 및 0.25mg/㎖ 변성된 송아지 흉선 DNA가 함유된 50% 포름아미드내에서 수행하였다. 필터를 65℃에서 , 0.1% NaDodSO4 중에서 세척하고 건조시킨 다음, Lightening Plus 증강 스크린(DuPont)의 도뭉으로 Cronex-4 X-선 필름( DupPont)에 노출시켰다.

(6.2.) 결과

cDNA 라이브러리는 타목시펜으로 처리한 PC-3 세포로부터 분리된 폴리아데닐화 RNA를 이용하여 조립하였다. 초기 관찰은 타목시펜 처리가 TGF-β2 분비를 2-5배 증가시킴을 나타냈다(Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26 : 2406-2410). 이 라이브러리는 상술한 바와 같이 프로브 1 및 2로 스크리닝하였다. 프로브 2개에 모두 교잡되는 클론 5개를 얻었는데 : 2.6kb 삽입물을 함유하는 한가지 클론 pPC-21을 유전자 배열 분석을 위해 선별하였다. 2.2kb 삽입물을 함유하는 또 다른 클론 pPC-14를 특히 유전자 배열 결정하였다. 이 DNA 와 영역된 아미노산 배열을 제 1 도에 나타내었다.

pPC-21은 442 아미노산의 연역된 폴리펩티드를 암호화하는 단일의 오픈 리딩 프레임을 함유하는데 ; 112 카르복시말단 아미노산은 성숙한 TGF-β2 모노머로 이루어지다(제1a도 박스로 표시됨). 오픈 FLED 프레임에 의해 코딩된 초오의 메티오닌은 시그날 펩티드 특성적인 소수성 및 비전하 아미노산(제1a도내에서 위줄친 부분) 스트레치 바로 앞에 있다.이 메치오닌을 코딩하는 뉴클레오티드 배열과 오픈 리딩 프레임에 존재하는 다음의 2 메티오닌을 암호화하는 배열중 어느것도 개시 메티오닌 배열에 대한 콘센서스 배열에 상동이지 않다(Kozak, 1986, Cell : 283-292). 번역은 대개 오픈 리딩 프레임중의 최초의 메티오닌과 더불어 시작되고, 후술하는 바와 같이, TGF-β1과 상동인 영역이 2번째 메티오닌의 상류( upstream)에서 발생되므로, 최초의 메티오닌은 잠정적으로 번역 개시부로 할당되어 왔다. 그다음, TGF-β1과 같이, TGF-β2는 훨씬 큰 분비된 전구체의 일부로서 발현된다. pPC-21 클론은 추정적인 개시 메티오닌의 상류 467bp와 그의 상류 15염기가 폴리아데닐화 시그날 배열을 가리키는 포리 [A]트랙을 포함하는 약 800bp의 3' 미번역 영역을 포함한다(Proudfoot and Brownlee, 1976, Nature 263 : 211-214).

TGF-β1과 TGF-β2 pPC-21 cDNA 클론의 암호 영역사이의 뉴클레오티드 배열 상등성은 53%인 것으로 결정되었다. 성숙한 단백질을 암호화하는 영역은 57% 상동성을 갖는 반면 상류 전구체 영역은 48% 상동성을 가진다. 두 배열의 최적 정렬후, 몇가지 뉴크레오티드 삽입물이 TGF-β2 전구체 영역내에서 주지되었는데, 이들중 하나는 75 뉴클레오티드의 연장되었다. 이 삽입물들이 TGF-β2내의 엑스트라 엑손의 존재에 기인하는 것인지는 알려져 있지 않다. 2가지 클론의 비-암호화 영역내의 DNA 배열 사이에서는 별다른 상동성이 검색되지 않았다. 실제로, TGF-β1은 G-C가 풍부한 논-코딩 영역을 연장시킨 반면, TGF-β2는 광범위한 A-T가 풍부한 논-코딩 영역을 갖는다. 이 두가지 cDNA 클론 모두 (퓨린)CCCC(Sharples et al., 1987, DNA 6 : 239-244)으로 구성된 TGF-β1 및 ATG 또는 A(피리미딘(퓨린)으로된 TGF-β2내에서 반복되는 3' 비암호화 영역내에서의 반복구조 모티프를 함유한다.

많은 클론의 제한 효소 지도는

제한 효소 부위가 결여된 한 클론 pPC-14가 TGF-β2 암호 배열의 아미노 부분에 위치함을 가리켰다. pPC-14와 pPC-21의 제한 효소 지도는 제1d도에 나타나 있다. pPC-14는 제2a도에서 뉴클레오티드 277-296에 상보적인 20-mer 올리고뉴클레오티드로 특이적으로 프라이밍 시킴으로써 분자의 이 영역에 상응하는 약 100 뉴클레오티드 스트레치에 대해 유전자 배열 분석하였다. 그 결과, 잃어버린

부위를 설명해주며, 아스파라긴에 상응하는 코돈 AAT 배열로 대치된 87개의 뉴클레오티드 결실부분(제2a에서 뉴클레오티드 부위 346-432 ; 제1e 도도 참고)이 pPC-14 클론에 포함된 것으로 나타났다. 이 결과는 pPC-21에 의해 코딩된 배열과는 오직 아미노산 잔기 116-144가 결실되고 대신 하나의 아스파라긴 잔기에 의해 대치되었다는 점에서만 차이가 잇는 보다 짧은 414 아미노산의 TGF-β2 전구체를 pPC-14 클론이 코딩함을 암시한다.

비록 pPC-14의 전 암호 영역이 결정되지 않았다 해도,

부위를 제외하고는 2 클론의 제한 효소지도가 완전히 일치하므로, 이것은 pPC-21 암호 배열과는 완전한 일치를 보인다고 할 수 있다(제1d도). 게다가, 동일한 29 아미노산의 결실 및 대치를 포함하는 414 아미노산 TGF-전구체를 코딩하는 시미안 클론이 실시예(7)(허술)에 기재된 바와 같이 동정되었다. 이 시미안 클론은 결실된 5' 및 3' 영역에서 인체 pPC-21 클로로 암호 배여로가 거의 동일한 암호 배열을 갖는다.

제2A도는 인체 TGF-β2-442의 연역된 단백질 배열과 비교하여 인체 TGF-β1의 연역된 단백질 배열을 보여준다(Derynck et al., 19895, Nature 316 : 701-705). 앞서 보고된 바와 같이(Marqurdt et al., 1987, J. Biol. Chem. in press) TGF-β2는 전 분자의 성숙한 영역을 통털어 인체 TGF-β1과 71%의 상동성을 보이는 것으로 측정되었다. 성숙한 분자의 전구체 상류의 아미노 부분은 TGF-β1과 TGF-β2-442 사이에서 31%의 상동성을 나타낸다. 제2B도에 나타낸 도트 매트릭스 상동성 비교는 상당한 상동성이 이 단백질의 몇몇 특이 영역에 존재함을 가리킨다. 추정적인 시그날 펩티드 영역에서의 N-말단 아미노산 배열의 비교는 별다른 상동성이 없음을 나타낸다.

시그날 배열 절단부위는 TGF-β2에서는 아미노산 20(세린) 후에 있고 TGF-β1에서는 아미노산 29(글리신)후에 있을 것으로 예상된다(Von Heijne, 1983, Eur. J. Biochem. 133 : 17-21). 이 절단 부위는 하류의 34 아미노산으로 연장된 TGF-β2와 TGF-β1 사이의 최초의 상동 블록 바로 앞에 있다. 시그날 배열이 제공된 후에도, TGF-β1과 TGF-β2 전구체는 제 4 위치의 시스테인을 포함하는 최초의 4개의 아미노산에서 동일한 N-말단을 공유할 것이다. 이 추정적인 N-말단의 하류의 14 아미노산, 다음의 21 아미노산중 19개는 TGF-β1과 TGF-β2사이에서 보존되며, 성숙한 TGF-β 단백질을 함유화는 C- 말단 영역에서 볼 수 있는 그 어느 것보다도 큰 상동 블록이다. 제2A도 및 2B도에 나타난 바와 같이 성숙한 단백질의 상류의 영역에서 강력한 상동 블록이 몇 개 더 존재한다. 이 영역들은 비 상동 아미노산의 긴 스트레치에 의해 분리된다.

TGF-β2 전구체는 세 개의 잠재적인 N-글리코실화 부위(제1a도에서 잔기 번호 72,168 및 269에 위치)를 갖는다. 오직 첫 번째 부위만이 TGF-β1에서 보존되고, 보존되는 잔기의 보다 큰 블록사이에 놓여 있다는 것은 이 잠재적인 글리코실화 부위가 중요한 구조 및/기능 특성을 갖는다는 것을 암시한다.

시그날 배열의 제거후, TGF-β2 전구체는 그의 TGF-β1 상대물(counterpart)보다 31 또는 59 아미노산을 더 많이 함유할 것이다. TGF-β2내의 부가적인 시스테인 잔기는 성숙한 배열에 선행하는 커다란 비상동 아미노산 영역의 바로 상류에 위치한다. TGF-β1과 마찬가지로, 성숙한 TGF-β2 단백질의 절단 부위는 제2A도에 나타난 바와 같이 4-5개의 염기성 아미노산 영역 직후에 발생된다. 성숙한 영역에는 시스테인이 9갱 있다. 9개의 시스테인중 7개가 보존되는 것은 TGF-β 집단의 상이한 구성원의 특색이다. TGF-β1과 TGF-β2의 수치(水治) 분석법은 전구체 및 성숙한 영역 모두에서 두 단백질 모두가 본래 대체로 친수성임을 비슷한 유형으로 나타난다(데이타 싣지 않음).

제3A도는 pPC-21을 이용하여 타목시펜을 처리한 PC-3 세포 및 BSC-40(아프리카산 녹색 원숭이의 신장 세포주)으로부터의 폴리아데닐화 RNA를 탐색하는 노던 블록 분석을 보여준다. PC-3세포는 크기가 각각 4.1, 5.1 및 6.5kb 전사체와 이보다 적은 양으로 5.1kb RNA를 갖는다(제3A도, 레인 2) ; BSC-40세포는 비교적 많은 4.1 및 6.5 kb 인 세가지 주요한 TGF-β2 특히 mRNA를 함유하고(제3A도, 레인 1). 여기에 이용된 교잡 조건하에서는 이 세포주내에 존재하는 2.5kb의 TGF-β1 특이-mRNA를 pPC-21이 타색해내지 못함을 주의해야 한다. 이러한 결과들과 앞서의 관찰(Shaples et al., 1987, DNA 6 : 239-244)들은 BSC-40 세포가 TGF-β1과 TGF-β2 특이 mRNA's를 모두 함유함을 가리킨다. 이것은 보다 분명히 입증하기 위해, 동일한 특이 활성으로 방사능 표지시킨 TGF-β1 및 TGF-β2 프로브를 동량 함유하는 혼합물에 노던 블롯들을 교잡시켰다. 제3B도의 1레인은 BSC-40 세포가 4.1 및 6.5kb의 TGF-베타 2mRNA뿐만 아니라 2.5kb TGF-β1 특이 mRNA를 함유함을 보여주며 : 제3B도는 또한 타목시펜 처리한 PC-3 세포 역시 2.5kb 의 TGF-β1 특이 mRNA를 함유함을 나타낸다. 제3B도는 2레인은 타목시펜으롤 처리한 PC-3 세포가 TGF-2 특이 메시지 보다 TGF-β1 트이 메시지를 더 많이 함유함을 입증한다.

TGF-β2 특이 cDNA 클론의 동정은 본 발명자들이 여러가지 세포주에서 TGF-2mRNA를 스크리닝하는 것을 가능케 하였다. 제 4 도에 나타난 노던 블롯은 TGF-β2-특이 전사몰이 HBL 100(사람의 젖에서 유래된 정상 상피세포주, 그렉 슐츠박사 제공), MCF-7(인체 유방암종세포주), SK MEL 28(흑색종 세포주)에서 검출될 수 있었으며 KB 세포(비인두 암종 세포)는 TGF-β2 2mRNA를 매우 낮은 수준으로 함유함을 가리킨다.

(7) 실시예 : BSC-40 세포로부터의 TGF-베타-2 전구체의 cDNA 클로닝

다음의 실시예들은 TGF-β2 특이 mRNAsFMF 함유하느 것으로 나타난 아프리카산 녹색 원숭이의 신장 세포주 BSC-40으로부터 TGF-β2 암호 배열을 cDNA 클로닝하는 것에 대해 기재한 것이다.그 결과들은 시미안 TGF-β2가 인체 TGF-β2와 마찬가지로, 성숙한 TGF-β2 분자가 단백질 가수분해에 의해 그로부터 유도되는 적어도 2개의 보다 긴 전구체중 하나로서 합성됨을 가리킨다.

(7.1.) 재료 및 방법

다음의 공정들은 시미안 TGF-β2 전구체를 암호화하는 cDNAs를 클로닝하는데 이용되었다.

(7.1.1.) 세포 생육 및 RNA) 추출

BSC-40 세포를 10% 송아지 태아 혈청이 함유된 Dulbecco's 변형 Eagle's 배지에서 생육시켰다. 폴리아데닐화 RNA를 기재된 바와 같이 올리고 [dT]-셀룰로스 크로마트글피에 의해 분리시켰다(Purchio and Fareed, 1979, J Virol. 29 : 763-769).

(7.1.2.) cDNA 라이브러리 조립 및 스크리닝

기재된 바와 같이 BSC-40 폴리아데닐화 RNA로부터 이중 사슬 cDNA를 합성하고(Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning : A Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 371-372)

메틸라제 처리후

제한 효소 인식 부위가 포함된 올리고튜클레오티드 링커(

링커)와 연결시켰다. cDNA를

으로 절단하고 세파크릴 S-1000상에서 크로마토그래피에의해 크기를 분별시켰다. 크기가 750bp를 초과하는 cDNA 단편을 모아으로 절단시킨 람다 gt10에 연결시키고(Davis et al., 1980, A Manual for Genetic Engineering : Advanced Bacterial Genetics ; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 패키징한 다음(Grosveld et al., 1981, Gene 13 : 227-237)

C₆₀₀rK-mK+hf1로 옮겼다. [32P]-표지한 pPC-21 및 pPC-21 프로브에 교잡한 p BSC-40-16 클론과 pPC-14 프로브에 교잡한 pBSC-40-1 클론을 분리하여 pEMBL에 서브클로시켰다. pBSC-40-1 클론의 TGF-β2 암호 배열을 디데옥시 체인-종결법(Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 5463-5467)에 의해 양 사슬에 대해 모두 분석하였다. pBSC-40-16은 부분적으로 분석하였다.

(7.2.) 결과

인체 TGF-β2-442 및 TGF-β2-414 전구체 암호 배열로부터 조립된 프로브에 양자 택일적을 교잡하는 BSC-40 cDNA-라이브러리로부터 클론 2개를 수득하였다.

제1a도의 346-432 위치로부터의 29개 아미노산 단편에 해당하는 암호 배열을 포함하는 것으로 예상되는 150개의 뉴클레오티드 스트레치(제1a도의 뉴클레오티드 300-450)에 대해 TGF-β2-442 프로브에 교잡한 pBSC-40-16 클론의 배열을 분석하였다. 그 결과, 이 영역에서, pBSC-40-16이 인체 TGF-β2-442 cDNA 클론인 pPC-21중의 상응하는 배열과 동일한 아미노산 배열을 갖는 것으로 나타났으며, 이는 pPSC-40-16이 442 아미노산 TGF-β2 전구체를 코딩함을 시사한다.

TGF-베타 2-414 프로브에 교잡하는 pBSC-40-1 클론을 전 암호 영역에 대해 분석하였다. 그 결과, 인체 TGF-β2-442의 아미노산 잔기 116-144가 결실되고 그대신 하난의 아스파라긴 잔기가 이 결실 부분을 대치한 것을 제외하고는 인체 TGF-β2-442 전구체와 동일한 414 아미노산 TGF-β2-전구체를 이 클론이 코딩하는 것으로 나타났다. 뉴클레오티드 수준에서 pBSC-40-1은 결실된 영역(제2a도의 뉴클레오티드 346-432가 결실되고 아스파라긴에 해당하는 코돈 AAT에 의해 대치된 영역)에서 인체 TGF-β2-442와 차이가 있다. 13개의 조용한 염기 변화를 제외하고는, 이 두 구조는 나머지 암호 배열에서는 완전히 상동이었다.

(8) 실시예 : TGF-β2의 발현

다음의 실시예들은 SV40 프로모터 배열의 조절적 제어하에서, 시미안 TGF-β1 전구체의 암호 배열과 하류 및 인-프레임 연결된 성숙한 인체 TGF-β2의 암호 배열을 함유하는 재조합 플라스미드로 형질도입된 중국산 햄스터 난소 세포(Chinese Hamster Ovary 세포 : CHO 세포)중에서 성숙하고, 생물활성적인 TGF-β2를 발현시키는 것에 대해 기재되어 있다. 이 조립체는 성숙하고 생물활성적인 TGF-β2를 약 0.5 mg/L의 수준의 합성 및 분비를 지시하였다.

(8.1.) 재료 및 방법

(8.1.1.) 세포 배양

디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase : dhfr)-결여 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포(Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. U.S.A. 77 :4216)를 10% 송아지 태아 혈청(FBS) 및 L-프롤린 150μb/㎖로 보강된 Ham's F-12 배지(Gibco Laboratories, NY)에서 중슥시켰다. 페니실린과 스트랩토마이신을 각각 100㎍/㎖ 및 100㎍/㎖ 첨가시켰다. CHO 형질도입체를 상술한 것과 동일한 보강물이 함유된 Dulbecco's 변형 Eagle's 배지에서 생육시켰다. CHO 세포와 그들의 유도물을 1 : 5 분할 비율로 트립신화시켜 통상적으로 계대 배양하였다.

메토트렉세이트(Sigma. MO)를 물에서 원액 농도 10mg/㎖로 인하여 준비하였다. 약품(최종 pH6)을 가용화시키기 위해 묽은 NaOH(0.2M)를 첨가하였다. 원액을 필터-멸균시켜 -20℃에서 보관하였다. 배기(100μM)중의 메토트렉세이트 원액은 4℃에서 최대 1개월 유지되었다.

(8.1.2.) DNA 조작 및 플라스미드 조립

제한 효소, T4 DNA 리가아제, 송아지 내장 포스파타제, DNA 폴리머라제Ⅰ의 클레노우(Klenow) 단편 및 기타 DNA 시약을 Bethesda Research Laboratories, MD에서 구입하였다. 표준 DNA 조작은 Maniatis, T., et al., 1982, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York의 지침대로 수행하였다.

개재된 SV40 배열뿐 아니라 탄멤내의 마우스 dhfr 유전자와 시미안 TGF-β1 cDNA를 함유하는 플라스미드 pSV1(β1-TGF-dhfr)를 기재된 바와 같이 조립하였다(Gentry et al., 1987, Mol, Cell. Biol. 7 : 3418).

플라스미드 pSV2/β1-β2/dhfr은 후술하는 (9.2.)에 개략된 바와 같이 조립하였다.

(8.1.3.) DNA 형질 도입

10⁶개의 dhfr-결여 CHO 세포를 100mm 디쉬에 접종한지 약 24시간 후, 배양체를 인산칼슘 침전물로서 20㎍의

선형 pSV2-(μ1-TGF-dhfr) 플라스미드로 형질도입시켰다(Wigler, M. et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 : 1373-1376). 간단히, 20㎍의 선형 DNA를 250mM의 멸균 CaCl2/㎖에 첨가하였다. 다음 2×HEPES 용액(280mM NaCl, 50mM HEPES, 1.5mM 인산나트륨, pH 7.1) 1㎖ 부분을 적가하고, 혼합물을 30분간 얼음위에 얹어놓았다. 세포를 함유하는 F12 배지 10㎖에 침전물을 첨가하여 확산시켰다. 37℃에서 4시간 배양한 후, 배지를 제거하고 25% 글리세롤을 함유하는 F12 배지 10㎖ 로 실온에서 90초동안 대치시켰다. 세포를 F12 배지 12㎖로 1회 헹구고 비선택적인 F12 배지(20㎖)중에서 48시간 더 배양시켰다. dhfr-발현 형질도입체의 선별은 이 배지대신 10% 투석된 FBS(Gibco, N.Y.) 및 150㎍/㎖ L-프롤린이 보강된 DMEM을 사용하여 수행하였다. 선택 배지에서 세포를 10-14일 배양시킨 수 집략을 관찰하였다. 집락 10개를 파스퇴르 피펫으로 흡입하여 확장시켰다.

(8.1.4.) 메토트렉세이트 내서 세포의 선별

기재된 바와 같이 본질적으로 1차 형질도입체로부터 디하이드로폴레이트 완원효소(dhfr)-증폭 세포를 유도시켰다(Gasser, D.S. 및 Schimke, R.T., 1986, J. Biol. Chem. 261 :6938-6946). 증폭후, 105 세포를 100mm 디쉬에 접종하고 농도가 증가하는 메토트렉세이트에 응용하였다. 최고 농도의 메토트렉세이트에서 보이는 집락을 함유하는 평판을 트립신 처리하고 그 농도의 메토트렉세이트에 적용시켜 적어도 2회 더 1 : 5세포 계대 배양하였다. 다음 세포(10⁵개)를 메토트렉세이트 농도가 5배 더 강한 100mm 디쉬에 접종시켰다. 살아있는 집락을 함유하는 디쉬를 다시 트립신 처리하고 메토트렉세이트 함유 배지에 적용시켰다. 40% FBS, 10% 디메틸 설폭시드 및 50% DMEM이 함유된 배지중에서 증폭의 여러단계에서 세포로 냉각시켰다. 메토트렉세이트는 동결 배지에 포함되지 않았다.

(8.1.5.) 생육 억제 분석

TGF-β1에 극도로 민감한 밍크의 폐 상피 세포 MvlLu(American Type Culture Collection CCL-64)를 생육 저해 분석에 이용하였다. DNA 합성을 평가하기 위해 티미딘 동족체 5'-[¹²⁵I]-요오도-2' 데옥시우리딘[¹²⁵IdU]을 이용하여 분석을 수행하였다. 활성 1unit는 미처리 CCL-64 세포에 비교하여¹²⁵IdU의 인코포레이션을 50% 억제하는데 필요한 양으로 정의하였다.

형질도입세포를 활성 TGF-β2 분비에 대해 평가하기 위해 세포 연합 배양체성의 하나의 24시간 수집물로부터 혈청이 없는 상등액을 수집하고 0.2M 초산에 대해 광범위하게 투석하였다. 초산을 동결건조에 의해 제거하고 분석을 위해 샘플을 멸균 완전 배지에서 재 가용화시켰다.

(8.2.) TGF-베타 2 발현을 위한 TGF-베타 1/TGF-베타 2 하이브리드 전구체 유전자의 조립

성숙한 인체 TGF-베타 2 암호 배열 및 3' 비번역 배열과 인-프레임 결합된 시미안 TGF-베타 1 전구체 암호 배열 및 5' 비번역 배열로 이루어진 하이브리드 TGF-베타 전구체 유전자를 제1c도에 도시된 바와 같이 조립하였다.

pPC-21을 우선

으로 절단하고, 클레노우 효소로 충전시킨 후 2.3kb 단편을

로 절단시킨 pEMBL에 연결시켜

를 형질전환 시키는데 이용하였다. 반대방향에 삽입물을 갖는 2개의 클론 pPC-21/

와 pPC-21/

를

과

모두로 절단시킴으로써 겹쳐지는

절단 단편을 생산시키고, 이어서

절단, 클레노우 보수(repair), 및 DNA를 재연결하여

를 형질전환시켰다. 2개의 클론 Exo 5.9와 Exo 25c는 각각 다른 길이의 5' 및 3' 배열을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이를 pEMBL에 서브클론시켜 pEMBL 5.9와 pEMBL 25C를 생산하였다.

pEMBL 5.9를

로 절단하고, 클레노우 효소로 블런트 앤드(blunt end)로 만든다음,

으로 절단하여 0.6kb 단편(단편 1)을 분리하였다. Exo 25C를

과

으로 절단하여 1.1kb 단편(단편 2)을 분리해냈다. pGS62를

으로 절단하고 클레노우 효소로 충진시킨 후

으로 절단시켜 단편 1 및 2에 연결시켰다(pGS62는 pGS20(Mackett et al., 1984, J. Virol. 49 : 857)으로부터 단일

부위를 결실시켜 얻었다). 이 혼합물을 이용하여

를 형질전환시키고 pGS62/CIFB를 분리하였다.

pGS62/CIFB를

과

으로 절단하고 1600bp 단편을 분리하여

로 더 절단시켰다. 그 결과 얻어진 400bp

단편을 분리하였다(단편 3). pSV2-베타-TGF(Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7 : 3418)를

과

으로 절단시키고 커다란 3000bp 단편을 분리하였다(단편 4).

다음에 나타낸 배열을 갖는 2개의 상보적인 DNA 사슬을 합성, 인산화, 어닐링(annealing) 및 연결시켜 상술한 '3' 및 '4' 단편을 만들었다.

연결(ligation) 혼합물을 이용하여

를 형질전환시키고 pβ1/β2를 분리하였다.

플라스미드 pβ1/β2를

으로 절단시키고 DNA 폴리머라제Ⅰ의 클레노우 단편으로 충진시킨 다음,

로 절단하여 1600bp 단편을 분리하고 :

와

으로 미리 절단시킨 pSV2, neo에 이 단편을 삽입시켜 pSV2,β1/β2를 조립하여 네오(neo) 유전자를 제거하였다.

pSV2,β1/β2를

과

으로 절단하고, 클레노우 효소로 충진시키고

으로 절단하여 2.6kb(대략)의

단편을 분리하여

및

로 절단된 pSV2, dhfr에 연결시켰다. 이 연결 혼합물을 이용하여

를 형질전환시키고 pSV2/β1-β2/dhfr을 분리하였다.

(8.3.) CHO 세포중에서의 TGF-베타 2의 발현

dhfr-결여 CHO 세포를 형질전환시키는데 pSV2/β1-β2/dhfr을 이용하고 재료 및 방법(상술)에 기재된대로 1차 형질 도입체로부터 dhfr-증폭 세포를 수득하였다.

기재된 바와 같이(Gentry et al., 1987, Mol, Cell. Biol. 7 : 3418) 바이오 분석(밍크의 폐 상피 세포 CCL-64의 억제)에 의해 양성 클론을 동정하였다. 성숙한 TGF-베타 2에 존재하는 NH2-YNTINPEASASPC-COOH 배열(Gentry et al., 1987, Mol, Cell. Biol. 7 : 3418)에 대해 만들어진 항-펩티드 항혈청을 이용하여 재조합 단백질을 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.

한 세포주, 1β9, 12.5는 240mg/㎖의 TGF-β2를 분비하는 것으로 밝혀졌다(제 5 도). 이 세포주는 다음 96웰 플레이트 중에서 제한 희석 에 의해 클로닝시켰다. 한 클론, 1β9, 12.5, c1 36은 약 500ng/㎖의 TGF-β2를 생산하였다(제 5 도).

클론에 의해 분비되는 단백질의 분석을 제 6 도에 나타난 바와 같이 항-펩티드 항혈청을 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 수행하였으며, 그 결과 보다 큰(약 90kd) 전구체 형태뿐 아니라 성숙한 24 kd TGF-β2 이량체도 존재하는 것으로 나타났다.

(9) 미생물의 기탁

다음의 미생물들은 Agricultural Research Culture Collection, Nothern Regional Research Center (NRRL)에 기탁되었으며 다음의 기탁 번호를 부여받았다 :

pSV/β1-β2/dhfr을 지니는 중국산 햄스터 난소 세포는 American Type Culture Collection(ATCC)에 1988년 8월 23일자 기탁되었으며 기탁 번호 ATCC CRL 9800번을 부여받았다.

Claims (34)

1. 제1a도에 도시된 바와 같이 뉴클레오티드 잔기 1번에서 1326번까지의 뉴클레오티드 암호 배열로 이루어진 형질전환 성장인자-β2 전구체를 코딩하는 뉴클레오티드 배열.
2. 제1a도에 도시된 바와 같이 그 사이의 뉴클레오티드 잔기 346번에서 432번까지의 결실되고 그 대신 뉴클레오티드 배렬 AAT로 대체된 뉴클레오티드 잔기 1번에서 1326번까지의 뉴클레오티드 암호 배열로 이루어진 형질전환 성장인자-β2 전구체를 코딩하는 뉴클레오티드 배열.
3. 제1a도에 도시된 바와 같이 뉴클레오티드 잔기 991번에서 1326번까지의 뉴클레오티드 배열로 이루어진 성숙한 형질전환 성장인자-β2를 코딩하는 뉴클레오티드 배열.
4. 제1a도에 도시된 바와 같이 아미노산 잔기 1번에서 442번까지의 아미노산 배열로 이루어진 형질전환 성장인자-β2 전구체.
5. 제1a도에 도시된 바와 같이 그 사이의 아미노산 잔기 116번에서 144번까지가 결실되고 그 대신 하나의 아스파라긴 잔기로 대체된 아미노산 잔기 1번에서 442번까지의 아미노산 배열로 이루어진 형질전환 성장인자-β2 전구체.
6. 제1a도에 도시된 바와 같이 아미노산 잔기 20번에서 442번까지의 아미노산 배열로 이루어진 형질전환 성장인자-β2 전구체.
7. 제1a도에 도시된 바와 같이 그 사이의 아미노산 잔기 116번에서 144번까지가 결실되고 그 대신 하나의 아스파라긴 잔기로 대체된 아미노산 잔기 20번에서 442번까지의 아미노산 배열로 이루어진 형질전환 성장인자-β2 전구체.
8. 제1a도에 도시된 바와 같이 아미노산 잔기 331번에서 442번까지의 아미노산 배열로 이루어진 형질전환 성장인자-β2.
9. 제1b도에 도시된 바와 같이 뉴클레오티드 잔기 -70번에서 1755번까지의 뉴클레오티드 암호 배열로 이루어진 하이브리드 형질전환 성장인자-β1/형질전환 성장인자-β2를 코딩하는 뉴클레오티드 배열.
10. 제1b도에 도시된 바와 같이 아미노산 잔기 1번에서 390번까지의 아미노산 배열로 이루어진 하이브리드 형질전환 성장인자-β1/형질전화 성장인자-β2 전구체.
11. 제1b도에 도시된 바와 같이 아미노산 잔기 30번에서 390번까지의 아미노산 배열로 이루어진 하이브리드 형질전환 성장인자-β1/형질전환 성장인자-β2 전구체.
12. (a) 형질전환 성장인자-β2 활성을 갖는 펩티드 또는 단백질이 성숙핵 세포에 의해 생산되도록 유전자 발현을 조절하느 제 2 뉴클레오티드 배열의 조절하에서 형질전환 성장인자-β2를 코딩하는 뉴클레오티드 배열을 함유하는 성숙핵 세포를 배양하고 ; (b) 이 배양체로부터 형질전환 성장인자-β2를 회수하는 단계로 이루어지는 형질전환 성장인자-β2의 제조방법.
13. 제12항에 있어서, 형질전환 성장인자-β2를 코딩하는 뉴클레오티드 배열이 제2a도에 도시된 바와 같이 뉴클레오티드 1번에서 1339번까지의 뉴클레오티드 배열로 된 것이 특징인 형질전환 성장인자-β2의 제조방법.
14. 제12항에 있어서, 형질전환 성장인자-β2를 코딩하는 뉴클레오티드 배열이 제2b도에 도시된 바와 같이 뉴클레오티드 -70번에서 1755번까지의 뉴클레오티드 배열로 된 것이 특징인 형질전환 성장인자-β2의 제조방법.
15. 제12항에 있어서, 성숙핵 세포가 중국산 햄스터 난소 세포로 된 것이 특징인 형질전환 성장인자-β2의 제조방법.
16. 제12항에 있어서, 유전자 발현을 조절하는 제 2 뉴클레오티드 배열이 SV40 프로모터롤 된 것이 특징인 형질전환 성장인자-β2의 제조방법.
17. 제12항에 있어서, 제 2 뉴클레오티드 배열이, 형질전환 성장인자-β2 암호 배열을 함유하는 성숙핵 세포가 동정될 수 있도록, 성숙핵 세포에는 결여된 선택가능한 표식자와 프로코터를 포함하는 것이 특징인 형질전환 성장인자-β2의 제조방법.
18. 제17항에 있어서, 선별가능한 표식자가 디히드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase)로 된 것이 특징인 형질전환 성장인자-β2의 제조방법.
19. 제18항에 있어서, 디히드로폴레이트 환원효소와 형질전환 성장인자-β2 암호 배열을 증폭된 수준으로 함유하는 저항성 집락이 선택되도록, 성숙핵 세포를 메토트렉세이트에 노출시키는 단계가 추가됨을 특징으로 하는 형질전환 성장인자-β2의 제조방법.
20. 제19항에 있어서, 성숙핵 세포가 디히드로폴레이트 환원효소가 결여된 중국산 햄스터 난소 세포로 된 것이 특징인 형질전환 성장인자-β2의 제조방법.
21. (a) ATCC에 기탁된 형질도입체 1β9, 12.5, 클론 36을 배양하여 (b) 이 배양체로부터 형질전환 성장인자-β2를 회수하는 단계로 이루어지는 형질전환 성장인자-β2의 제조방법.
22. 제21항에 있어서, 형질도입체를 매토트렉세이트 존재하에서 배양함을 특징으로 하는 형질전환 성장인자-β2의 제조방법.
23. 성숙핵 세포가 활성 형질전환 성장인자-β2를 생산하도록 유전자 발현을 조절하는 제 2 뉴클레오티드 배열의 조절 하에서 형질전환 성장인자-β2를 코딩하는 뉴클레오티드 배열을 함유하는 성숙핵 세포.
24. 제23항에 있어서, 형질전환 성장인자-β2를 코딩하는 뉴클레오티드 배열이 제2b도에 도시된 바와 같이 뉴클레오티드 -70번에서 1755번까지의 뉴클레오티드 배열로 이루어진 것이 특징인 성숙핵 세포.
25. 제23항에 있어서, 중국산 햄스터 난소세포로 된 것이 특징인 성숙핵 세포.
26. 제23항에 있어서, 유전자 발현을 조절하는 제 2 뉴클레오티드 배열이 SV40 프로모터롤 된 것이 특징인 성숙핵 세포.
27. 제23항에 있어서, 제 2 뉴클레오티드 배열이 시미안 형질전환 성장인자-β2 암호 배열을 함유하는 성숙핵 세포가 동정될 수 있도록, 성숙핵 세포에는 결여된 선택가능한 표식자와 프로모터로 이루어진 것이 특징인 성숙핵 세포.
28. 제27항에 있어서, 선택가능한 표식자가 디히드로폴레이트 환원효소로 된 것이 특징인 성숙핵 세포.
29. 제28항에 있어서, 디히드로폴레이트 환원효소가 결여된 중국산 햄스터 난소 세포로 된 것이 특징인 성숙핵 세포.
30. ATCC(American Type Culture Collection) 에 기탁번호 CRL 9800호로 기탁된 CHO 1β9, 12.5, 클론 36 세포주
31. NRRL(Agricultural Research Culture Collection)에 기탁번호 B 18256호로 기탁된 Eschericia coli HB101 세포주.
32. NRRL에 기탁번호 B 18333호로 기탁된 Eschericia coli HB101 세포주.
33. NRRL에 기탁번호 B 18335호로 기탁된 Eschericia coli HB101 세포주.
34. NRRL에 기탁번호 B 18334호로 기탁된 Eschericia coli HB101 세포주.

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