JPH02444A - トランスフォーミング成長因子β２のクローン化及び形質発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔（１）産業上の利用分野〕 本発明はヒトのトランスフォーミング成長因子−β２の
クローン化及び形質発現に関する。

〔（２）従来の技術〕 トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）
は、細胞の分化及び増９Ｉｌを調節するポリペプチドの
最近記述されている群の一つである。この群の他のもの
は、ミュラー擬態（Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ　）阻害物質〔
ケート（Ｃａｔｅ　）ら、１９８６、　［セル（Ｃｅｌ
ｌ　）Ｊ　４５：６８５〜６９８〕、インヒビン類〔マ
ソン（Ｍａｓｏｎ　）ら、１９８５、「ネイチュアー（
Ｎａｔｕｒｅ）Ｊ　３１８：６５９”６６３３そしてキ
イロショウジョウバエ属のノ１工のデカベンタプレギツ
ク（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ　）遺伝子コンプ
レックスの転写物から予想される蛋白〔パジェット（Ｐ
ａｄｇｅｔｔ　）ら、１９８７、［ネイチュアーＪ３２
５：８１〜８４〕を含む。

トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）
は、分子量１３０００を有する２個の同じジスルフィド
で結合したサブユニットよりなる〔アソイアン（Ａｓｓ
ｏｉａｎ）ら、１９８３、「Ｊ、バイオ口、ケム、　　
（Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）Ｊ２５８ニア１５５〜７１
６０；フロリック（Ｆｒｏｌｉｋ）ら、１９８３、［プ
ロン・ナツル・アカデ・サイ（Ｐｒｏｃ・Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　）　ＵＳＡ　Ｊ　　８０　　
二　３６７６〜３６８０；フロリックら、１９８４、「
Ｊ、バイオ口・ケム・」２６０：１０９９５〜１１００
０’ｌ。それは胎盤（７０リツクら、１９８３　ｒネイ
チュアーＪ３２５：８１〜８４）、血液の血小板〔チル
ズ（Ｃｈｉｌｄｓ）ら、１９８２［プロン・ナツル・ア
カデ・サイ・ＵＳＡＪ　７９　：　５３１２〜５３１６
：アソイアンら、１９８３、［Ｊ、バイオ口・ケム・Ｊ
２５８ニア１５５〜７１６０］、腎臓〔ロバーツ（Ｒｏ
ｂｅ　ｒ　ｔ　ｓ　）ら、１９８３、「バイオケミスト
リー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）Ｊ　２２　：　５
６９２〜５６９８）及び脱ミネラ化骨〔七ニシン（５ｅ
ｙｅｄｉｎ　）ら、１９８５、［プロン・ナッル・アカ
デ・サイ・ＵＳＡＪ８２：１１９〜１２３〕を含む数種
の組織の源からＭ製されている。

１０チ血清及び上皮成長因子の存在下、ＴＧＦ−βは正
常のラットの腎臓の繊維芽細胞の固定独立成長を促進し
〔ロバーツら、１９８１、ｌ−ブロン・ナツル・アカデ
・サイ・ＵＳＡＪ　７８　：　５３３９〜５３４３；ロ
バーツら、１９８２、］ネイチュアーＪ２９５：４１７
〜４１９：）ワーズキ（Ｔｗａｒｄｚｉｋ　）ら、１９
８５、［Ｊ、セル・バイオケム・（Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、）　Ｊ　２８　：　２８９〜２９７　）、１
０チ血清のみの存在下それはＡＫＲ−２Ｂ繊維芽細胞の
コロニー形成を誘導できる〔タッカ−（Ｔｕｃｋｅｒ　
）ら、１９８３、［キャンザー・リサ−（Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅｓ、　）　ＪＪ３：１５１８〜１５８６）ｏＴＧ
Ｆ−βは又胎児ラット筋肉間葉性細胞をＥ７て分化させ
そして軟骨の特定の巨大分子を生ずることを示している
（セエジンら、１９８６、［ｙ、バイオ口・ケム・Ｊ　
２６１　：５６９３〜５６９５）。

細胞の増殖に対するその効果とは対照的に、ヒトの血小
板から精製されたＴＧＦ−β並にアフリカミドリザルの
細胞から単離された官能的に関係のある蛋白（ＢＳＣ−
１）は、培養物中の成る細胞の成長を阻害することが示
されている〔タッカ−ら、１９８４、［サイエンス（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ月２２６　：　７０５〜７０７］。ＴＧＦ
−βは、又数種のヒトの癌細胞系の成長を阻害すること
が示されている（ロバーツら、１９８５、「ブロン・ナ
ツル・アカデ・サイ・ＵＳＡＪ８２：１１９〜１２３）
。ＴＧＦ−βのこの阻害／刺激効果は、細胞のタイプ及
び細胞の生理学上の状態を含む数也の要素に依存するだ
ろう〔綜説としてスポーン（Ｓｐｏｒｎ）ら、１９８６
、［サイエンスＪ　２３３　：５３２〜５３４８照〕。

ヒト〔プリンク（Ｄｅｒｙｎｃｋ）ら、１９８５、［ネ
イチュアーＪ　３１６８７０１〜７０５〕、マウス（プ
リンクら、１９８６、　ＪＪ、バイオ口・ケム・Ｊ２６
１：４３７７〜４３７９）及びサル〔シャープレス（５
ｈａｒｐｌｅｓ　）ら、１９８７、［Ｉ）ＮＪ６：２３
９〜２４４〕のＴＧＦ−βについてコードしたｃ　ＤＮ
Ａクローンは単離されてきている。

これらのクローンのＤＮＡ配列分析によれば、ＴＧＦ−
βは大きなプレカーサーポリペプチドとして合成され、
そのカルボキシ末端は開裂して成熟ＴＧＦ−βモノマー
を生ずることが示されている。強い配列の相同性が上記
の源のすべてからのＴＧＦ’−βプレカーサー蛋白全体
に見出されている。

極めて最近、ウシの脱ミネラル化骨から単離された蛋白
がＴＧＦ−βに関連があるとして同定されている（セエ
ジｙら、１９８７、［Ｊ、バイオ口・ケム・Ｊ２６２：
１９４６〜１９４９）。蛋白はブタの血小板〔チェイフ
エツ（Ｃｈｅｉｆｅｔｚ　）ら、１９８７．１−セルＪ
４８：４０９−４１５〕、ヒトの前立腺癌細胞系ＰＣ−
３（イケダら、１９８７、［バイオケミストリーＪ　２
６　：　２４０６〜２４１０）及びヒトの神経膠芽細胞
腫細胞系〔ラン（Ｗｒａｎｎ）ら、１９８７、　「ＥＭ
ＢＯＪ　６　：　ｌ　６３３−１６３６）から即離され
ている。この蛋白の部分的アミノ酸配列は、それがＴＧ
Ｆ−βに似ていることが示されそしてＴＧＦ−β２と命
名された。前述のヒト（プリンクら、１９８５、［ネイ
ヂュアーＪ　３１６　：　７０１〜７０５）、マウス（
プリンクら、１９８６、「Ｊ、バイオ口・ケム・」２６
１：４３７７〜４３７９）及びサル（シャープレスら、
１９８７、ｒＴ）ＮＡＪ６：２３９〜２４４）のＴＧＦ
−βは、ＴＧＦ−β１と命名された。

〔（３）発明の概要〕 本発明は、形質発現調節エレメントによりコントロール
されたＴＧＦ−β２コーディング配列を含む組換えＤＮ
Ａベクターによってトランフエクトされた真核生物の宿
主細胞によるＴＧＦ’−β２の犬漬生産に関する。特定
の態様においてヒトＴＧＦ−β２プレカーサーに関して
コードするｃＤＮＡクローンは、タモキシフェン処理ヒ
ト前立腺癌細胞系ＰＣ−３から作られたｃＤＮＡライブ
ラリーから得られた。一つのこのようなりローンのｃＤ
ＮＡ配列は、ＴＧＦ−β２は成熟１１２アミノ酸ＴＧＦ
−β２サブユニツトが蛋白分解開裂により誘導される４
４２アミノ酸ポリペプチドプレカーサーとして合成され
ることを予言する。

ＴＧＦ−β２−４４２と名付けられるこのＴＧＦ−β２
プレカーサーは、ＴＧＨ−β１のプレカーサーと４１係
の相同性を共有している。他の態様においてサルＴＧＦ
−β２プレカーサーに関してコードするｃＤＮＡクロー
ンは、アフリカミドリザル腎）滅細胞系ＢＣ８−４０か
ら作られたｃＤＮＡライブラリーから得られた。一つの
このようなりローンのｃＤＮＡ配列は、ＴＧＦ−β２は
それから成熟１１２アミノ酸ＴＧＦ−β２サブユニツト
が蛋白分解開裂により誘導される４１４アミノ酸ポリペ
プチドプレカーサーとして合成されることを予言する。

ＴＧＦ−β２−４１４と名付けられたＴＧＦ−β２プレ
カーサーは４１４アミノ酸残基のアミノ酸配列を有しそ
してＴＧＦ−β２−４４２のアミノ酸配列と同じである
が、ただしそれはヒ）ＴＧＦ−β２−４４２配列の残基
数１１６〜１３５からの２９アミノ酸配列の代りに単一
のアスパラギン残基を含む。

サルＴＧＦ−β２−４４２プレカーサーをエンコードす
るＢ５Ｃ−４０ｃＤＮＡライブラリーからのクローン並
にヒトＴＧＦ−β２−４１４７’レカーサーをエンコー
ドするヒトＰＣ−３ｃＤＮＡライブラリーからのクロー
ンも又同定されている。ヒト及びサルのＴＧＦ−β２−
４４２７’レカーサーは、ヒト及びサルのＴＧＦ−β２
−４１４プレカーサーと同じく、アミノ酸レベルにおい
て完全に相同であるように見える。

ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２の成熟１１２アミノ酸モ
ノマーは７１％の相同性を示す。

ＴＧＦ−β１／グナル及びプレカーサー配列に同相で結
合したＴＧＦ−β２成熟コーディング配列を含む形質発
現ベクター（米国特許出願第１８９９８４号）が構築さ
れそしてチャイニーズ・ノ・ムスター卵巣細胞（ＣＨＯ
細胞）をトランスフェクトするのに用いられる。得られ
たＣＨＯトランス７エクタントは、成熟した生物学上活
性なＴＧＦ−β２を生成且分泌する。

（３，１，）定義 本明細書で用いられる下記の用語は、単数でも複数でも
下記の意味を有する。

ＴＧＦ−β２： 約アミノ酸残基数３３１から約アミノ酸残基数４４２の
第４ａ図に実質的に描かれたアミノ酸配列よりなるヒト
又はサルの起源のトランスフォーミング成長因子−ベー
タ２゜ＴＧＦ−β２プレカーサー： 約アミノ酸残基数１から約アミノ酸残基数４４２、又は
約アミノ酸残基数１から約アミノ酸残基数４４２（アミ
ノ酸残基数１１６〜アミノ酸残基数１４４のアミノ酸配
列が欠失しており単一のアスパラギン残基により置換さ
れている）の第１ａ図に実質的に描かれたアミノ酸配列
よりなるヒト又はザルの起源のトランスフォーミング成
長因子−ベータ２分子の一群。用語はヒト又はサルの起
源の何れであれＴＧＦ−β２−４４２又はＴＧＦ’−β
２−４１４と名付けられたＴＧＦ−ベータ２プレカーサ
ーを意味する。

ハイブリッドＴＧＦ−βｌ／ＴＧＦ−β２プレカーサー
：約アミノ酸残基数１から約アミノ酸数３９０の第１ｂ
図に実質的に描かれたアミノ酸配列よりなる新規なトラ
ンスフォーミング成長因子−ベータプレカーサーＴＧＦ
−β１ブレカーサ： 約アミノ酸残基数１から約アミノ酸残基数２７８の第１
ｂ図に実質的に描かれたサルトランスフォーミング成長
因子−ベータｌプレカーサー及びシグナル配列。

〔（４）図面の説明〕 第１ａ図はヒトＴＧＦ−β２−４４２ｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列及び演理されたアミノ酸配列を示す。ＰＣ−
２１の２５９７ｂｐインサートをｐＥＭＢＬ（ダンテ（
Ｄａｎｔｅ　）ら、１９８３、［ヌクレイツク・アンス
・リサ−（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）
Ｊ　１１　：　１６４５−１６５４）にサブクローンし
そしてジデオキシ鎖停正法〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ　
）ら、１９７７、［プロン・ナツル・アカデ・サイ・Ｕ
ＳＡＪ　７４　：５４６３〜５４６７）を用いて両方の
鎖に配列された。コーディング配列が示されそして演縛
されたアミノ酸配列がその上に直接示される。

成熟したＴＧＦ−β２配列は枠で囲まれそしてシグナル
ペプチドは上線を付されている。潜在的なグリコジル化
部位は星印により示される。矢は推定のシグナル配列開
裂部位金示す。サルのＴＧＦ−β２−４１４ｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列はヒトのＴＧＦ−β２−４４２ｃＤＮ
Ａ配列と次の点全除いて同一である。３４６〜４３２の
ヌクレオチド（カッコされた）が除かれそして配列ＡＡ
Ｔにより置換され、さらに数種のサイレントヌクレオチ
ド変化が構造中のどこかで生じている（変化したヌクレ
オチドの下に直接単一の字により示される）。サルのＴ
ＧＦＩ−β２−４１４プレカーサーに関する演理された
アミノ酸配列は、アスパラギンがヒトＴＧＦ−β２−４
４２構造におけるアミノ酸残基１１６〜１４４ｒ置換し
ている以外は、と）ＴＧＦ−β２−４４２プレ力−ザー
アミノ酸配列と同一である。ヒトＴＧＦ−β２−＝！１
４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は鎖状の下線により示さ
れる領域全通して配列され、そして３４６〜４３２のヌ
クレオチドが失われそして配列ＡＡＴにより！換されて
いる以外はヒトＴＧＦ−β２−４４２ｃＤＮＡ配列と完
全に相同性であることが分った。

第１ｂ図は／・イブリッドＴＧＦ−β１　／Ｔ　Ｇ　Ｆ
−β２プレカーサーＤＮＡのヌクレオチド配列及び演譚
されたアミノ酸配列を示す。コーディング配列が示され
そして演理されたアミノ酸配列がその上に直接示される
。成熟ＴＧＦ−β２配列は枠で囲まれそしてプレカーサ
ーシグナルペプチドは上線をつけられる。グリコジル化
部位は星印で示される。矢は推定のシグナル配列開裂部
位を示す。描かれたＴＧＦ−β２成熟コーディング配列
はヒト起源のものである。サルＴＧＦ−β２成熟コーデ
ィング配列はほとんどヒト配列と同じであるが、３個の
サイレント塩基の変化のみが生じそして変化したヌクレ
オチドの下に直接単一の字により示される。、ＴＧＦ−
β２のｃＤＮＡクローニング及びハイブリッドＴＧＦ−
β１／ＴＧＦ’−β２遺伝子の構造の詳細は、本文に示
される。

第１ｃＮｌはハイブリッドＴＧＦ’−β１　／Ｔ　Ｇ　
Ｆ−β２プレカーサー遺伝子の概略図金示す。

第１ｄ図はｐＰＣ−１４（２，２ｋｂ）及びｐＰＣ−２
１（２，３ｋｂ）の制限エンドヌクレアーゼのマツプで
ある。枠内の領域はＴＧＦ−β２モノマーに関するコー
ディング配列を示す。ＡＴＧは開始メチオニンコドンを
示す。ｐＰＣ−２１（２，３４ｋｂ）ＫおけるＡＴＧと
ジ江工部位との間の距離は約４２０ｂｐである。黒色の
領域はｐＰＣ−２１（ｚ、３ｋｂ）における８４−ｂｐ
そう人の位置を示す。

第１ｅ図はｐＰＣ−１４（２，２ｋｂ）の部分的ＤＮＡ
配列の分析を示す。ｐＰＣ−２１（２，３ｋｂ）Ｋおけ
るインサート内のＫｐｎ　１部位から約１４０　ｂｐ上
流でハイブリッドした合成オリゴヌクレオチド５’−Ａ
ＧＧＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＴＡＣＴＡ−３’をプラ
イムＤＮＡ配列反応に用いた。

この領域において、ｐＰ　ｃ　−１４（２，２ｋｂ）　
（上線）の配列はＡｓｎ　−１１６に関してコードして
いるヌクレオチドまでｐＰＣ−２１（２，３ｋｂ）と同
一である。ｐＰＣ−２１（２，３ｋｂ）に見い出された
ｐＰＣ−１４（２，２ｋｂ）のＡｓｎ−１１６コドン内
の８４−ｂｐそう人を示す。インサート内のＫＰｎ　１
部位を指示する。

第２図はヒトＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２−４４２プ
レカーサーの配列の相同性を示す。ａ）　　１欠配列の
相同性：同一の残基は枠で囲まれている。星印はＴＧＦ
−β２における潜在的なグリコジル化部位に関する。潜
在的なシグナル配列開裂部位及び成熟ポリペプチドの開
裂部位が示される。ｂ）ジーン・プロ（Ｇｅｎｅ　Ｐｒ
ｏ　）ソフトウェアを用いるドツト・マトリックスの比
較。各ドツトは、１０個のアミノ酸の中の５個が同じで
ある点に存在する。対角線は相同性の領域を示す。

第３図はＢ２Ｏ−４０及びＰＣ−３ポリアデニル化ＲＮ
Ａのノーザン・プロット分析を示す。ポリアデニル化Ｒ
ＮＡはＢ２Ｏ−４０及びＰＣ−３細胞から単離され、ア
ガロース・ホルムアルデヒドゲルで分画され、ハイボン
ド（Ｈｙｂｏｎｄ　）　−Ｎフィルターに移されそして
以下に記載されている〔３）ｐ　　］　−ラベルされた
ＴＧＦ−β２特異性プローブ、ｐＰＣ−２１（パネルＡ
）又は（：３２ｐ：］−ラベルされたＴＧＦ−β２及び
ＴＧＦ−βｌの混合物（シャープレスら、１９８７）の
特異性プローブ（パネルＢ）にハイブリッド婆れた。レ
ーン１、Ｂ２Ｏ−４０ポリアデニル化ＲＮＡ　（５ミク
ロ？）；レーン２、ＰＣ−３ポリアデニル化ＲＮＡ　（
５ミクロ？）。

第４図は異る源からのポリアデニル化ＲＮＡのノーザン
プロット分析を示す。ポリアデニル化ＲＮＡはＭＣＦ−
７（ヒト乳癌）、ＳＫ−ＭＥＬ２８　（ヒト黒色腫）、
ＫＢ（鼻咽頭癌）及びＨＢＬ−１００（ヒト乳上皮）細
胞から単離されそして下記のＴＧＦ−β２特異性プロー
ブ（ｐＰＣ２１）へのノーザンプロットハイブリッド化
により分析された。各レーンはｓＫ−ＭｇＬ２ｇ　（レ
ーン１）、ＭＣＦ−７（レーン２）、ＨＢＬ−１００（
ジー／３）又はＫＢ（レーン４）細胞からのポリアデニ
ル化ＲＮＡ５ミクロ２金含む。

第５図は組換えＴＧＦ−β２の生物活性アッセイを示す
。

１β９．１２．５、クローン３６細胞を１００ｕ組織培
養皿で集密的に成長させた。細胞を無血清培地で３回洗
い５ｄの無血清培地中で２４時間インキュベートした。

培地を集め０．２　Ｍ酢酸に対して透析しそして記述さ
れたようにＣＣＬ６４細胞中のＤＮＡ合成の阻害につい
てアッセイした〔ゼントリ−（Ｇｅｎｔｒｙ　）ら、１
９８７、［モル・セル・バイオルー　（Ｍｏ１．　Ｃｅ
１１．　Ｂｉｏｌ、　）Ｊ　７　：　３４１８）。

このアッセイにおいて３．３ｐｆの精製した天然ＴＧＦ
〜β１標準品は５０％の阻害を行い、精製した天然ＴＧ
Ｆ−β２の特異的活性はＴＧＦ−β１のそれの約半分で
あると計算された。

第６図Ｖｉｌβ９．１２．５、クローン３６により分泌
された組換え蛋白のウェスタンプロット分析を示す。１
β９、β２．５、クローン３６細胞からの酸透析無血清
調整培地をＳＤＳ〜ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よ部分画しそして記述されたように合成ペプチドＮＨ２
−ＹＮＴ　ＩＮＰＥＡＳＡＳＰＣ−ＣＯＯＨに対して製
造された抗血清によるウェスタンプロットにより分析し
た。

〔（５）本発明の説明〕 本発明はＴＧＦ−βプレカーサー遺伝子コーディング配
列からの生物学的に活性な成熟した形のＴＧＦ−β２の
製造及びその生成物に関する。成熟した生物学的に活性
なＴＧＦ−β２は、プレカーサーを正確に処理する宿主
細胞中でＴＧＦ−β２プレカーサー又はその機能的に同
等なものの全ヌクレオチドコーディング配列をクローン
化及び形質発現化することにより製造され、生成した成
熟ＴＧＦ−β２は真正な天然ＴＧＦ−β２のそれとｆ１
！とんど区別のつかない生物学的活性を有する。ＴＧＦ
−β２プレカーサーの全ヌクレオチドコーディング配列
の機能的同等物は、適切な宿主細胞の内で形質発現され
たとき成熟ＴＧＦ−β２の合成、処理及び放出を導きう
るすべてのＤＮＡ配列を含む。この関係で、例えばＴＧ
Ｆ−β２成熟配列に骨組みで結合したＴＧＦ−β１プレ
カーサー配列を含むハイブリッドプレカーサーコーディ
ング配列が構築されそして生物学的に活性なＴＧＦ−β
２を生成するのに用いられる。

本発明の方法は記述の目的のみで下記の段階に分けるこ
とができる。（ａ）プレカーサーの形のＴＧＦ−β２に
関するコーディング配列の単離又は生成；（ｂ）ＴＧＦ
−β２コーディング配列の形質発現を導く形質発現ベク
ターの構築；（Ｃ）遺伝子を複製且形質発現することが
できしかも遺伝子生成物を処理して成熟且生物学的に活
性な形のＴＧＦ−β２を生成することができる適切な宿
主細胞のトラ／ス７エクション；そして（ｄ）　ａ：熟
且生物学的に活性なＴＧＦ−β２の同定及び精製。−度
高いレベルの生活性の成熟ＴＧＦ−β２を形質発現する
トランス７エクシントが同定されると、本発明の実施は
そのクローンの増大及び形質発現された遺伝子生成物の
単離を含む。

本発明の方法は実施例により本明細畜で説明され、ＴＧ
Ｆ−β２プレカーサーコーディング領域のｃＤＮＡが生
成されクローンきれ配列されそして利用されて、ＣＨＯ
細胞細胞性ＧＦ−β２の高度の形質発現を導く形質発現
ベクターを構築する。特定の態様において、ヒトＴＧＦ
−β２の成熟形の完全なアミノ酸配列は決定されており
そしてＴＧＦ−β１について７１チの全体の相同性を示
す。合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて本発明者
らはＴＧＦ−β２についてコードするＰＣ−３ｃＤＮＡ
ライブラリーからのクローンを同定した。これらのクロ
ーンの一つのＤＮＡ配列分析は、ＴＧＦ−β１と同じ＜
ＴＧＦ−β２が大きなプレカーサー蛋白として合成され
そのカルボキシ末端が開裂して成熟ＴＧＦ−β２モノマ
ーを生ずることを開示している。これらの分子の成熟部
分を通してＴＧＦ−β１とＴＧＦ−β２との間に７１％
の相同性があるが、最大３１チの相同性がプレカーサー
の残りに存在するに過ぎず、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−
β２のアミノ末端領域は機能的に区別されうろことを示
唆している。

本発明の特定の態様において、ＣＨＯ細胞細胞性規なＴ
ＧＦ−β１　／Ｔ　Ｇ　Ｆ−β２ハイブリツド遺伝子の
形質発現は多量の生物学的に活性なＴＧＦ−β２全生成
するのに用いられる。

本発明の方法の色々な態様は下記の記述に一層詳細に記
載されている。

（５，１，）　Ｔ　Ｇ　Ｆ−β２コーディング領域の単
離又は生成ＴＧＦ−β２に関するヌクレオチドコーディ
ング配列は第１ａ図に描かれている。本発明の方法の実
施にあたり、そこに描かれたヌクレオチド配列又はその
フラグメント又は機能的同等物が用いられて適切な宿主
細胞中にＴＧＦ−β２生成物の形質発現を導く組換え分
子を生成することができる。特定の態様においてＴＧＦ
−β１　／Ｔ　Ｇ　Ｆ−β２ハイブリツド遺伝子（第１
ｂ図）が構築されそしてＣＨＯ細胞をトランスフェクト
するのに用いられた。培養培地１ｄ当り約５００μｉの
成熟且生物学的に活性なＴＧＦ−β２を生成するトラン
スフェクトントが単離された。

ヌクレオチドコーディング配列の同義性により、第１ａ
図及び第１ｂ図に描かれているのと実質的に同じアミノ
酸配列をエンコードする他のＤＮＡ配列がＴＧＦ−β２
のクローニング及び形質発現のために本発明の実施に用
いられることができる。このような変更は異るヌクレオ
チド残基の欠失、付加又は置換を含み、同−又は機能的
に等しい遺伝子生成物をエンコードする配列を生じさせ
る。遺伝子生成物は配列内のアミノ酸残基の欠失、付加
又は置換を含み、生物に作用する生成物を生成するサイ
レント変化をもたらす。このようなアミノ酸の置換は、
関係する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及
び／又は両親媒性の類似性に基づいて行うことができる
。例えば負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸及びグ
ルタミン酸を含み；正に荷電したアミノ酸はリジン及び
アルギニンを含み；同様な親水度を有する非電荷極性先
端基又は非極性先端基を有するアミノ酸は以下のものを
含む。ロイシン、インロイシン、バリン；グリシン、ア
ラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニ
ン；フェニルアラニン、チロシ／。

ＴＧＦ−β２に関するヌクレオチドコープイン配列はＴ
ＧＦ−β２類似活性を生成する細胞源から得ることがで
きる。コーディング配列は、このような細胞源から単離
且精製されたＲＮＡのｃＤＮＡクローン化により又はゲ
ノムクローン化により得ることができる。ｃＤＮＡ又は
クローンのゲノムライブラリーの何れかは、それに限定
されないが制限酵素の使用を含む当業者に周知の技術を
用いて生じたＤＮＡフラグメントから生成されうる。Ｔ
ＧＦ−β２をエンコードするフラグメントは、第１ａ図
に描かれた配列の任意の部分に実質的に相補的なヌクレ
オチドプローブによりこのようなライブラリーをスクリ
ーニングすることにより同定されうる。省略なしのクロ
ーン即ちＴＧＦ−β２プレカーサーに関する全コーディ
ング領域を含むものが、形質発現のために選択される。

本発明の別の態様において、第１ａ図のコーディング配
列が、当業者に周知の化学的方法を用いて全部又は一部
合成された。例えばカルザース（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　
）ら、１９８０、［ヌク・アンス・リサ・シンボー　（
Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

Ｓｙｍｐ−）Ｊシリーズ７：２１５〜２２３；クリア（
Ｃｒｅａ）及びホーン（Ｈｏｒｎ　）、１９８０、［ヌ
ク・アンス・リサ・ｊ　９　（１０）　：　２３３１　
；？チラシ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　）及びカルザース、
１９８０、［テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　）　Ｊ　２１　：　７１
９及びチョウ（Ｃｈｏｗ　）及びケンペ（Ｋｅｍｐｅ　
）、１９８１、［ヌク・アンス・リサ・Ｊ　９　（１２
）　：　２８０７〜２８１７参照。−方、蛋白は化学的
方法を用いて生成されて全部又は一部第１ａ図に描かれ
たアミノ酸配列を合成することができた。

例えばペプチドはベンクマン（Ｂｅｃｋｍａｎ　）　９
９０装置により固相技術により合成されそして前述した
ように樹脂から開裂されうる〔イントリー、Ｌ、　Ｅ、
ら、１９８３、［Ｊ、バイオ口・ケム・Ｊ２５８：１１
２１９〜ｌ　１２２８；イントリー、Ｌ、　Ｅ、及びロ
ウトン（Ｌａｗｔｏｎ　）Ａ。

１９８６、「ウイｏｏジー（ＶｉｒｏｌＯｇＹ）Ｊ　１
５２　：４２１〜４３１〕。精製は標品高速液体クロマ
トグラフィにより達成される。ペプチドの組成はアミノ
酸分析により確認された。

実施例に記載された特色の態様においてＴＧＦ−β２コ
ーディング配列は、ＴＧＦ−β２を生成することが既に
示されているタモキシフェン処理ヒト前立腺癌細胞系Ｐ
Ｃ３から単離されたポリアデニル化ＲＮＡから誘導され
たヒ）ＴＧＦ−β２プレ力−サーコーディング配列のｃ
ＤＮＡクローン化により得られた。一つのｃＤＮＡクロ
ーンの全コーディング領域配列されそしてヒトＴＧＦ−
β１の公表された配列と比べられた（第２図参照）。

ＴＧＦ−β２　ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列分析は、
ＴＧＦ−βｌと同じ（ＴＧＦ−β２が大きなプレカーサ
ー蛋白として合成されそのカルボキシ末端が開裂して成
熟１１２アミノ酸ＴＧＦ−β２モノマーを生ずることを
示している。ＴＧＦ−β２は、２個のジスルフィド結合
１３．０００ダルトンサブユニツトよりなる２４０００
の分子ｉｔ有することが示畑れている〔イケダら、１９
８７、［バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　）Ｊ　２６　：２４０６−２４１０；チェイフエツ
（Ｃｈｅｉｆｅｔｚ　）ら、１９８７、　［セル（Ｃｅ
ｌｌ）Ｊ　４８：４０９−４１５）。

それ故成熟ＴＧＦ−β２の製造は、イントラ−及びイン
ター分子ジスルフィド結合の形成と同じく適当な蛋白分
解開裂を必要とする。アミノ末端疎水性リーダー配列（
残基３〜１９）は、プレカーサー中に存在しそして細胞
外へ蛋白を導くことに関係がある。成熟ＴＧＦ−β２は
この工程中プレカーサーの残りの部分となお関係がある
。

ＴＧＦ−β２はプレカーサーの成熟部分全体についてＴ
ＧＦ−β１と７１％の相同性全示し、機能的な同等性を
示唆し、それは実験的な証拠により支持される〔セエイ
ジン（５ｅｙｅｄｉｎ　）ら、１９８７、　「Ｊ、バイ
オ口・ケミ・」２６２；１９４６〜１９４９；チェイフ
エツら、１９８７、「セルＪ４８：４０９〜４１５〕。

ヒト、けつ歯動物及びサルの源からのＴＧＦ−βｌのプ
レカーサー領域のアミン部分〔プリンク（Ｄｅｒｙｎｃ
ｋ）ら、１９８５［ネイチュア−Ｊ３１６：７０〜７０
５；プリンクら、１９８６、「Ｊ。

バイオ口・ケミ・Ｊ２６１：４３７７〜４３７９　；シ
ャープレス（５ｈａｒｐｌｅｓ　）ら、１９８７、　ｊ
’−ＤＮＡＪ　６　：２３９〜２４４〕は、非常に保存
されておりそして分子のこの部分が重要な生物学的機能
を有することを示唆している。逆に、ＴＧＦ’−β１と
ＴＧＦ’−β２とのＮ〜末端プレカーサー領域の間には
３１％以下の相同性がある。推定されたシグナルペプチ
ドの開裂後、ＴＧＦ−β２プレカーサーは又ＴＧＦ−β
１プレカーサーよりもアミノ酸を含むだろう。ＴＧＦ−
β１及びＴＧＦ−β２プレカーサーの蛋白のアミノ末端
領域内の一次的構造の差は、機能上の差を反映している
こ吉だろう。しかしブレカーダー内の有意な相同的な領
域が単離されたブロックに見い出され、それはたとえＮ
−末端プレカーサー領域内ですら重要な機ｕｒ的ドメイ
ンの保存を示唆している。

ノーザン・プロット分析は、ＢＳＣ〜４０細胞において
４１及び６．５ｋｂのＴＧＦ’−β２−特異的ｍＲＮＡ
の２ｆ４の主な大きさのクラス全町らかにした。タモキ
シフェン処理ＰＣ−３細胞は、４．１ｋｂ、５．１ｋｂ
及び６．５ｋｂの３種のＴＧＦ−β２のトランスクリプ
トを含む。これらの異る大きさのメツセージは、他の遺
伝子について記述されているように、差次ＲＮＡスプラ
イシング、ポリアデニル化又はその両者の結果であろう
〔ヘルツマン（Ｈｅ　Ｉ　ｆｍａｎ　）ら、１９８６、
［モル・セル・バイオロー　（Ｍｏ１．　Ｃｅ　ｌ　ｌ
。

Ｂｉｏｌ−）　Ｊ　６　：　３５８２−３５９５　：七
イヤー（ｓａｙｒｅ）ら、１９８７、［ブロン・ナツル
・アカデ・サイ・ＵＳＡＪ８４：２９４１〜２９４５］
。他のＴＧＦ−β２　ｃＤＮＡクローンの予備的な分析
は、それがｐＰＣ−２１及びｐＰＣ−１４のそれより約
１ｋｂ大きい３′−未翻訳領域を含みそして異るポリア
デニル化部位全含むことを示し、それは二者択一のポリ
アデニル化がノーザン・プロットで観察されたマルチプ
ルＴＧＦ−β２ｍＲＮＡの発生に関係がある一つのファ
クターであることを示唆している。

Ｂ５Ｃ−４０細胞は比較しうるレベルのＴＧＦ−β１及
びＴＧＦ−β２−特異的トランスフリプ）ｆ含み：タモ
キシフエン処理ＰＣ−３細胞はＴＧＦ−β２よりＴＧＦ
−β１ｍＲＮＡを含む（第３Ｂ図）。これらの細胞がＴ
ＧＦ−β１より多くのＴＧＦ−β２蛋白を生成するので
（イケダら、１９８７、　「バイオケミストリーＪ　２
６　：　２４０６〜２４１０）、後者の結果は予想され
ないものでありそしてこの成長調節物の合成に関する転
写後のレベルの調節を示唆している。ＴＧＦ−β１及び
ＴＧＦ−β２の生成に導かれる転写及び翻訳のコントロ
ールメカニズムを理解することを目的とする実験は、進
行中である。ＴＧＦ−β１について行われたような組換
えＤＮＡ技術による適切な量のＴＧＦ−β２の生成は、
この蛋白の異る作用を開発する実験をデザインするのに
さらに助けとなるだろう。

他の態様においてＴＧＦ−β２コーディング配列は、ア
フリカミドリザル細胞系Ｂ５Ｃ−４０から単離されたポ
リアデニル化ＲＮＡから誘導されたサルＴＧＦ−β２プ
レカーサーコーディング配列のｃＤＮＡクローン化によ
り得られた。一つのｃＤＮＡクローンの全コーディング
領域が配列された。ヒト及びサルのＴＧＦ−β２プレカ
ーサーは同じアミノ酸配列を有するように思われそして
それらのヌクレオチド配列はほとんど同一である。

（５，２−）ＴＧＦ−β２コーディング配列を含む形質
発現ベクターの構築 ＴＧＦ−β２の生物学的に活性な成熟した形を形質発現
するために、形質発現ベクター／宿主系が選ばれ、それ
は高度の転写及び翻訳を提供するばかりでなく遺伝子生
成物の正確な処理を提供しなければならない。成熟した
形のＴＧＦ−β２が細胞処理を経てプレカーサー生成物
から誘導されるように思われるので、形質発現構築物中
にＴＧＦ−β２プレカーサーの全コーディング配列を用
いるとさ、これは特に重要である。さらに生成物の分泌
をもたらす形質発現／宿主細胞系が選択される。

特に成熟ＴＧＦ−β２即ち１サブユニット当り１１２ア
ミノ酸のジスルフィド結合ホモダイマーが、プレカーサ
ーのＡｒｇ−Ａｌａアミノ酸間の蛋白分解開裂を含む細
胞処理により形成されうるように思われる（第４ａ図の
残基数３３０及び３３１）。さらにＴＧＦ−β２プレカ
ーサーは成熟形に見い出せない３種の潜在的なＮ−グリ
コジル化部位を含み、プレカーサーの適切なグリコジル
化は成熟分子の細胞合成及び放出又は分泌に重要である
。その上ＴＧＦ−β２の成熟形は１サブユニット当９９
個のシスティン残基を含むジスルフィド結合ダイマーよ
りなる。これらのあるものはインター鎖ジスルフィド結
合に含まれそして他のものはイントラ鎖ジスルフィド結
合に含まれ、それは成熟分子の三次構造及び立体配置に
影響しその結果その生物学的活性に影響する。従ってＴ
ＧＦ−β２遺伝子生成物を正確に形質発現しそして処理
する形質発現系で用いられる宿主細胞の能力は、生物学
的に活性な成熟ＴＧＦ−β２の生成に重要である。

種々の動物宿主／形質発現ベクター系（即ち適切な宿主
細胞中にＴＧＦ−β２コーディング配列の複製、転写及
び翻訳を導く必要な要素を含有するベクター）は、当業
者により等しく利用される。これらは、ウィルス形質発
現ベクター／哨乳動物宿主細胞系（例えばサイトメガウ
ィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルスなど）；
昆虫ウィルス形質発現ベクター／昆虫細胞系（例えばバ
キュロウィルス）；又は呻乳動物の細胞のゲノムから誘
導された非ウィルスプロモーター形質発現系（例えばマ
ウスメタロチオニエンプロモーター）（ｉｌ−含むがこ
れに限定されない。

これらのベクターの形質発現要素はそれらのｇｉ度及び
特異性において変化する。用いられる宿主／ベクター系
に応じて、多数の適肖な転写及び翻訳要素の任意の一つ
が用いられる。例えば咄乳動物の細胞のクローン化では
、哨乳動物の細胞に成長するウィルスから単離されるプ
ロモーター（例えばワクシニアウィルス７．５にプロモ
ーター）又は咄乳動物細胞のゲ２ツムから単離されるプ
ロモーター（例えばマウスメタロチオニエンプロモータ
ー）が用いられる。組換えＤＮＡ又は合成技術により生
成するプロモーターは、又用いられてインサートされた
配列の転写全提供する。

特異的な開始／グナルも又インサートされた蛋白コーデ
ィング配列の充分な翻訳のために必要とされる。これら
のシグナルはＡＴＧ開始コドン及び隣接した配列？含む
。それ自体の開始コドン及び隣接した配列を浮む全ＴＧ
Ｆ−β２遺伝子が適切な形質発現ベクターにインサート
されるとき、追加の翻訳コントロールシグナルは必要と
されない。

しかしコーディング配列の一部のみがインサートされる
場合、ＡＴＧＩＡ始コドン全コドン因性の翻訳コントロ
ールシグナルが提供されねばならない。その上開始コド
ンは、全インサートの翻訳を確実にするためにＴＧＦ−
β２コーディング配列の読みとりフレームと相が合わね
ばならない。

これらの外因性翻訳コントロールシグナル及び開始コド
ンは、天然及び合成の両方の種々の起源のものが用いら
れる。

形質発現の能率は、転写減衰配列、エンハンサ−要素な
どの包含により増大されうる。

ベクターへのＤＮＡフラグメントのインサートについて
既に記載された方法の任意のものが用いられて、ＴＧＦ
−β遺伝子及び適切な転写／翻訳コントロールシグナル
を含む形質発現ベクターを構築する。これらの方法は、
生体外組換えＤＮＡ技術、合成技術及び生体内組換え（
遺伝学的、組換え）を含む。

アデノウィルスが形質発現ベクターとして用いられると
き、ＴＧＦ−β２コーディング配列はアデノウィルス転
写／′翻訳コントロールコンプレックス例えば後のプロ
モーター及び３部分リーダー配列にリゲートされる。こ
のキメラ遺伝子は次に生体外又は生体内の組換えにより
アデノウィルスのゲノムにインサートされる。ウィルス
ゲノムの非必須領域におけるインサート（例えば領域Ｅ
１又はＥ３）は、生存可能でしかも感染された宿主にお
けるＴＧＦ−β２の形質発現を行いうる組換えウィルス
金もたらすだろう。同様にワクシニア７．５にプロモー
ターも用いうる。

ＴＧＦ−β２を形質発現するのに用いられる他の形質発
現系は、昆虫系である。このような系の一つにおいてア
ウトグラファ・カリホルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　
Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉｃａ）核ポリへドロシスウィルス（
ＡｅＮＰＶ）が、外来の遺伝子を形質発現するベクター
として用いられる。ウィルスはスボドプテラＯフルギペ
ルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）
細胞中で成長する。ＴＧＦ’−β２コーディング配列は
ウィルスの非必須領域（例えばポリヘトリン遺伝子）に
クローンされそしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポ
リへドリンプロモーター）のコントロールの下に置かれ
る。ＴＧＦ−β２コーディング配列の成功したインサー
ト化は、ポリヘトリン遺伝子の不活性化及び非包接ｍ換
２ｔウィルス（即ちポリヘトリン遺伝子によりコードさ
れる蛋白性被覆を欠くウィルス）の生成を生じよう。こ
れらの組換えウイルスは、次にインサートされた遺伝子
が形質発現されるスボドプテラ・フルギペルダ細胞を感
染するのに用いられる。

さらに、宿主細胞株は選ばれ、それはインサートされ欠
配列の形質発現を調節するか又は所望の特異的なやり方
で遺伝子生成物を修飾しそして処理する。成るプロモー
ターからの形質発現は、成る誘導剤（例えばメタロチオ
ネエイングロモーターに関する亜鉛及びカドミウムイオ
ン）の存在下増大する。それ故遺伝子工学的なＴＧＦ−
β２の形質発現はコントロールされうる。もしクローン
された外来の遺伝子の蛋白生成物が宿主細胞に対して致
死的であるならば、これは重要である。その上、蛋白生
成物の修飾（例えばグリコジル化）及び処理（例えば開
裂）は、蛋白の機能のために重要である。異る宿主細胞
は蛋白の翻訳後の処理及び修飾にとシｑ！ｆ徴的且つ特
異的なメカニズムを有する。

適切な細胞系又は宿主系は、形質発現される外来の蛋白
の正確な修飾及び処理を確実にするために選ばれる。

（５，３，）　　ＴＧＦ−β２遺伝子生成物を形質発現
するトランスフエクタント又は形質転換体の同定組換え
ＴＧＦ−β２コーディング配列を含みそして生物学的に
活性な成熟生成物を形質発現する宿主細胞は、少くとも
４Ｗｉの一般的なアプローチによシ同定される。即ち（
ムンＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド化、（ｂ）「マーカー
」遺伝子機能の存在又は不存在、（ｅ）宿主細胞中のＴ
ＧＦ−β２ｍＲＮＡ２ｍＲＮＡトランスクリブトにより
測定される転写のレベルの評価そして、（ｄ）免疫アッ
セイそして最終的にはその生（・・物学的活性によシ測
定される成熟遺伝子生成物の検出。

第１のアプローチでは、形質発現ベクターにインサート
されｆｃＴＧＦ−β２コ一テイング配列の存在は、第１
１図で夾質的に示されるＴＧＦ−β２コーディング配列
又はその一部又は誘導体に相同的なヌクレオチド配列よ
りなるグローブを用いるＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド化
により検出される。

第２のアプローチでは、組換え形質発現ベクター／宿主
系は、成る「マーカー」遺伝子機能（例えばシミジンキ
ナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、メトトレキセート
に対する耐性、形質変換表現型、バキュロウィルスにお
ける包接体の形成）の存在又は不存在に基づいて同定且
選押されうる。例えばもしＴＧＦ−β２コーディング配
列がベクターのマーカー遺伝子配夕ＩＪ内にインサート
されるならば、ＴＧＦ−β２コーディング配列を含む組
換え体は、マーカー遺伝子機能の不存在により同定され
うる。一方、マーカー遺伝子は、ＴＧＦ−β２コーディ
ング配列の形質発現をコントロールするのに用いられる
同−又Ｆｉｐるプロモーターのコントロールの下でＴＧ
Ｆ−β２配列と一列に並んで置かれる。

誘導又は選択に応するマーカーの形質発現は、ＴＧＦ−
β２コーディング配列の形質発現を示す。

第３のアプローチでは、ＴＧＦ−β２コーディング領域
に関する転写活性は、ハイブリッド化アッセイによシ計
価されうる。例えばポリアデニル化ＲＮＡｔｉＴＧＦ−
β２コーディング配列又はその特別な部分に相同なグロ
ーブを用いてノーザンプロットにより単離且分析される
。一方、宿主細胞の全核酸は抽出されそしてこのような
プローブに対するハイブリッド化について分析される。

第４のアプローチでは、成熟蛋白生成物の形質発現は、
例えばウェスタンプロット、免疫アッセイ例えば免疫放
射沈でん、酵素結合免疫アッセイなどにより免疫学的に
評価される。しかし形質発現系の成功の最後のテストは
、生物学的に活性なＴＧＦ−β２遺伝子生成物の検出を
含む。宿主細胞が遺伝子生成物を分泌するとき、培養さ
れたトランスフエククント宿主細胞から得られた細胞を
含まない媒体がＴＧＦ−β２活性についてアッセイされ
る。遺伝子生成物が分泌されないとき、細胞融解物がこ
のような活性について分析される。両者の場合において
、生物学的なアッセイ例えば本明細書に記載され念族長
阻害アッセイ又は目標細胞における固定独立性成長の刺
激〔トワードジク（Ｔｖａｒｄｚｉｋ　）及び７ヤーウ
イン（Ｓｈｅｒｗｉｎ　）、１９８５゜［Ｊ、セル、バ
イオケミ・（Ｃａ１１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、）Ｊ２８；２
８９〜２９７；デラルコ（Ｄｅｌａｒｃｏ　）及びトダ
ロ（Ｔｏｄａｒｏ　）、　１９８７、［ブロモ・ナツル
・アカデ・サイ・ＵＳＡＪ７５；４００１〜４００５］
などが用いられる。

一度高度の生物学的に活性な成熟ＴＧＦ−β２を生成す
るクローンが同定されると、クローンは増殖しセしてＴ
ＧＦ−β２は当業者に周知の技術全周いて精製される。

このような方法は免疫アフイニテイｆｆＩ製、クロマト
グラフィ方＃’　（高速液体クロマトグラフィを含む）
などを含む。

〔実施例〕

（６，）　実ｍ％ｉ１：　ｐｃ−３細胞からのＴＧＦ−
／３２ブｖ−ｈ−サーのｅＤＮＡクローン化 下記の実施例け、ＴＧＦ−β２から先に即離されたヒト
前立腺癌細胞系ＰＣ−３からのＴＧＦ−β２プレ力−サ
ーコーディング配列のｃＤＮＡクローン化を記述してい
る。

（６，１，）材料及び方法 下記のやり方を用いてヒトＴＧＦ−β２プレカーサーを
エンコードするｃＤＮＡ’！ｊ＝クローンする。

（６，１，１，）　　細胞の成長及びＲＮＡ抽出ヒトヒ
ト腺痛細胞系ＰＣ−３をイケダら、１９８７、［バイオ
ケミストリーＪ２６：２４０６〜２４１０に記載された
ようにタモキシフェン添加培地に成長させた。ＭＣＦ−
７ａ胞′ｆｆ：ｌｏチ胎児ウシ血清及び６単位／７！の
インスリンを含むダルベツコ修飾イーグルの培地に成長
させ女。すべての他の細胞系は、インスリンなしの同一
の培地で成長させた。ポリアデニル化ＲＮＡをプルチオ
（Ｐｕｒｃｈｉｏ　）及びファジート責Ｆａｒｅｅｄ）
　　１９７９．ｒＪ、　　ライｏ。

（Ｖｉｒｏｌ、）Ｊ２９　：　７６３〜７６９に記載さ
れたようにオリゴ［ｄＴ］セルロースクロマトグラフィ
により単離した。

（６，１，２，）　　ｃＤＮＡライブラリー構築及びス
クリーニング 二本釦ｃＤＮＡ’ｉ、マ＝アチ、Ｘ　（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ　）ら、１９８２゜［イン・モレキュラー・クローニ
ング（ｉｎ　ＭｏｌｅｅｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　）　
ニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏ−ｒａ
ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　）　Ｊ＝ｙ−、Ｑ／ド祷スス
プリングハーバ−ｅプレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　）、コールド・スプリング
・ハーバ−、ニューヨークに記載畑れたように、２４時
間タモキシフェン（より処理されたＰＣ−３細胞から単
離されたポリアデニル化ＲＮＡから合成した。１０００
塩基対より大きいｃＤＮＡ画分を、ウェブ（Ｗｅｂｂ）
ら、１９８７、ｒＤＮＡＪ６；７１〜７９に記載された
ようにラムダｇｔｌＯに、クローンした。ＴＧＦ−β１
とＴＧＦ−β２との間に保存されているアミノｐｗＫｗ
ｘＨＥｐ（プローブ１） 全エンコードするＤＮＡに相補的な［３２ｐ］ラベル２
４倍同義プローブにより、ライブラリーは先ず２回スク
リーンされた。正のクローンを、次にアミノ９ＣＦＲＮ
ＶＱＤ（グローブ２）（これらの７個のアミノ酢の中５
個がＴＧＦ−β２に対して％ｌ♂的である）［５’　Ｔ
ＣＴＴＧＡＡＣＧＴＴＴＣＴＧＡＡＧＣＡ−３’　］Ｃ
ＡＣＡＡ ↑ をエンコードするＤＮＡに対して相補的な第二の１２８
倍同義グローブによりスクリーンした。ハイブリッド化
は、６ＸＳＳＣ１５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｔ　）
の溶液、０．１５ｍＭピロホスフェート、１００ミクロ
ｙ／ｍｔの変性ウシ胸腺ＤＮＡ、１００ミクロｆ／Ｔｎ
ｔのイーストｔＲＮＡ及び１ｍＭのＥＤＴＡ中で４２℃
で行われた（マニアチスら、１９８２、ｒイン・モレキ
ュラー・クローニング；ア・ライラリー・マニュアル」
コールド・スプリンク拳ハーバ−・フレス、コールド修
スプリングーハーバ−、ニューヨーク）。フィルターを
３０分間４回２ＸＳＳＣ１０，１チＮａ　Ｄａｄ　８０
４中で４２℃で洗った。両方のグローブにハイブリッド
した三、四のｃＤＮＡクローンを単離しセしてｐＥＭＢ
Ｌにサブクローンした〔ダンプ（Ｄａｎｔｅ）　　ら、
１９８３、［ヌクレイツク・アンス・リサ（Ｎｕｅｌｅ
ｉｅＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、）Ｊｌｌ；１６４５〜１６５
４］。Ｚ６ｋｂインサートを含む一つのクローン（ｐＰ
Ｃ−２１）を、特異的オリゴヌクレオチドプライミング
〔ヘニコフ（Ｈｅｎｉ−ｋｏｆｆ　）、１９８４、「ジ
ーン（Ｃａｎｅ）Ｊ２８；３５１〜３５９〕と組合わさ
れた種々の制限及びエキソヌクレアーゼ■欠失フラグメ
ン）ｆ用いてジデオキシ鎖停止法〔サンガー（Ｓａｎｇ
ｅｒ）ら、１９７７、［プロン・ナツル・アカデ・サイ
・ＵＳＡＪ７４：５４６３〜５４６７］により両方の鎖
に配列した。Ｚ２ｋｂインサートを含有する他のクロー
ン（ｐＰＣ−１４）’を部分的に配列した。リバーサイ
ド・サイエンティフィック・エンタープライゼス（Ｒｉ
ｖｅｒｓｉｄｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｅｎｔｅｒｐ
ｒｉｓｅｓ　）（シアトル、ワシントン州）からのジー
ン・プロ・ソフトウェア（Ｇｅｎｅ　Ｐｒｏ　　Ｓｏｆ
ｔｗａｒｅ　）　　を用いてドツト・マトリックス分析
をＩＢＭ　ＡＴＰＣについて行った。

（６，１，３，）　　ノーザンプロット分析ポリアデニ
ル化ＲＮＡを１チアガロースホルムアルデヒドゲルによ
り分画し〔ジーラツハ（Ｌｅｈｒａｃｈ）ら、１９７７
、［バイオケミストリーＪ１６：４７４３〜４７５１）
、ナイロン膜〔ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ　）　、アマ
−ジャム（Ａｍ　ａ　ｒ　−ｓｈａｍ）］に移し、そし
て（Ｏｐ：ｌラベルプローブに）・イブリッド化した。

ハイブリッド化を、０．９Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭの燐
酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．
１チＮａ　Ｄｏｄ　８０４．４×デンハートの溶液、０
．４η／−のイーストｔＲＮＡ及びｏ、２５ｑ／−の変
性ウシ胸腺ＤＮＡを含有する５０−ホルムアミド中で４
２℃で行われた。フィルターを０．２５ＸＳＳＣ，０，
１チＮａ　Ｄｏｄ　ＳＯ４中で６５℃で洗い、乾燥しそ
してライトニング・プラス（Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ　Ｐ
ｌｕｓ　）増感スクリーン（デュポン）の助けによりク
ロネツクス（Ｃｒｏｎｅｘ　）　−４Ｘ線フィルム（デ
ュポン）に露出した。

（６，２，）　　結果 ｅＤＮＡライブラリーをタモキシフェン処理ＰＣ−３細
胞から単離されたポリアデニル化ＲＮＡを用いて構築し
た。

タモキシフェン処理がＴＧＦ−β２の分泌を２〜５倍増
大させたことを以前の観察は示していた〔イケダら、１
９８７、［バイオケミストリーＪ２６：２４０６〜２４
１０］。ライブラリーを前述のようにグローブ１及び２
によりスクリーンした。両方のプローブにハイブリッド
化した５種のクローンが得られた。そしてＺ６ｋｂ’ｉ
含む一つのクローンｐＰＣ−２１ｆ、配列のため選んだ
。２．２ｋｂインサートを含む他のクローンｐＰＣ−１
４’ｉ部分的に配列した。ＤＮＡ及び演鐸したアミノ識
配列を第１図に示す。

ｐＰＣ−２１は４４２アミノ醒の演鐸されたポリペプチ
ドについてコードする単一の開放読み取シフレームを含
み、１１２カルボキシ末端アミノ醒は成熟ＴＧＦ−β２
モノマ−よりなる（第１ａ図中の枠内）。開放読み取り
フレームによりエンコードされた第一のメチオニンの直
後に、単一のペプチドの特徴である一連の疎水性且未荷
電アミノ酸（第１１Ｌ図中で上線のついた）が続く。こ
のメチオニン全コードするヌクレオチド配列又は開放読
み取りフレーム中に存在する次の２個のメチオニンをコ
ードするヌクレオチド配列の何れも開始メチオニン配列
に関するコンセンサス配列と相同的ではない〔コザツク
（ｋｏｚａｋ　）、１９８６、［セルＪ４４　：　２８
３〜２９２〕。翻訳は通常は開放読み取りフレーム中の
第一のメチオニンにより開始しそして下記に述べｂよう
にＴＧＦ’−β１に相同的な領域が第二のメチオニンの
上流に生ずるので、第一のメチオニンが翻訳開始の部位
として一時的に定められている。次にＴＧＦ−β１と同
じ（ＴＧＦ−β２が非常に大きな分泌されたプレカーサ
ーの一部として形質発現される。ｐＰＣ−２１クローン
は、推定の開始、メチオニンの４６７　ｂｐ上流及びポ
リ［Ａ）トラック（その１５塩基上流がポリアデニル化
シグナル配列を示す）を含む約ｓ　ｏ　ｏ　ｂｐの３′
非翻訳領域を含有する〔ブロードフート（Ｐｒｏｕｄｆ
ｏｏｔ　）　　及びブラウンジー（Ｂｒｏｗｎｉｅｓ　
）、１９７６、［ネイチュアーＪ２６３　：２１１〜２
１４］。

ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２　ｐＰＣ−２１ｃＤＮＡ
クローンのコーディング領域内のヌクレオチド配列の相
同性は、５３％であると測定されていた。成熟蛋白につ
いてコードする領域は５７チの相同性含有し、一方上流
グレカーサー領域は４８％の相同性を有する。２種の配
列の好寸しい整列後、三、四のヌクレオチドそう人がＴ
ＧＦ−β２プレカーサー領域に認められ、その一つは７
５ヌクレオチドに延長していた。これらのそう人がＴＧ
Ｆ−β２の余分のエクソンの存在によるかどうかは未知
である。２種のクローンの非コーディング領域中のＤＮ
Ａ配列間に、有意な相同性は検出されなかった。事実、
ＴＧＦ−β１が延長されたＧ−Ｃの多い非コーディング
領域金有したが、ＴＧＦ−β２は延長しｆｒ、Ａ−Ｔの
多い非コーディング領域を有した。両方のｃＤＮＡクロ
ーンは、ＴＧＦ−β１において（プリン）ＣＣＣＣ〔／
ヤープレスら、１９８７、ｒ　ＤＮＡ　Ｊ６：２３９〜
２４４〕よりなる繰返しそしてＴＧＦ−β２ンこおいて
ＡＴＧ又はＡ（ピリミジン）（プリン）よりなる繰返し
を有する、３′非コーディング領域における反復構造モ
チーフ全含む。

１種のクローンｐＰＣ−１４が、ＴＧＦ−β２コーディ
ング配列のアミノ部分に存在するＫｐｎ　　Ｔ制限部位
を欠くことを、多くのクローンの制限マツプが示してい
た。ｐＰＣ−１４及びｐＰＣ−２１の制限マツプは第１
ｄｔＭ１に示される。ｐＰＣ−１４は、第１ａ図のヌク
レオチド２７７へ・２９６に相補的な２０−マーオリゴ
ヌクレオチドにより特異的にブライすることにより分子
のとの領域に相当する一連の約１００ヌクレオチド上に
配列された。ｐＰＣ−１４クローンが、失われたＫｐｎ
　　Ｔ部位に相当しそして配列ＡＡＴ即ちアスパラギン
のコドンにより置換されている８７ヌクレオチド欠失（
第１ａ図のヌクレオチド位置３４６〜４３２；又第１ｅ
図参照）を含むことを、結果は示す。

アミノ酸残基１１６〜１４４が欠失しそして単一のアス
パラギン残基により置換されている点だけでｐＰＣ−２
１によりエンコードされている配列とは相違して、ｐＰ
ｃ−１４クローンが４１４アミノ酸の短いＴＧＦ−β２
グレカーサーをエンコードすることを、結果は示唆して
いる。

ｐＰＣ−１４の全コーディング領域は決定されていない
が、Ｋｐｎ　　夏部位を除いて２種のクローンの制限マ
ツプが完全に重複する（第１ｄ図）ので、それは恐ら＜
ｐｐｃ−２１コーディング配列と完全に一致する。その
上、同一の２９７ミノ醒欠失及び置換を含む４１４アミ
ノｒＲＴＧＦ−βプレカーサーをエンコードしているサ
ルのクローンは、実施例セクション７に記載されている
ように同定されている。このサルのクローンは、欠失に
関する領域５′及び３′のヒトｐＰＣ−２１クローンの
それとほとんど同一のコーディング配列を有する。

第２Ａ図は、ヒ）ＴＧＦ−β２−４４２のそれと比較し
てヒトＴＧＦ−β１（プリンクら、１９８５ｒネイチュ
ア−Ｊ３１６：７０１〜７０５）の演鐸された蛋白配列
を示す。ＴＧＦ’−β２が既に報告されたように分子の
成熟部分を通してヒトＴＧＦ−β１と７１％相同的であ
ることが決定された〔マルクアルト（Ｍａｒｑｕａｒｄ
ｔ　）ら、１９８７゜［Ｊ、パイオロ、ケム、」印刷中
〕。成熟分子のプレカーサー上流のアミノ部分はＴＧＦ
−β１とＴＧＦ−β２−４４２との間に３１チの相同性
を示している。第２Ｂ図に示されでいるドツト・マトリ
ックス相同性の比較は、有意な相同性が蛋白の三、四の
特定の領域で存在することを示している。推定のシグナ
ルペプチド領域のＮ−末端アミノ酸配列の比ｆは、有意
な相同性を示さない。

ＴＧＦ−β２において、シグナル配列開裂部位はＴＧＦ
−β１においてアミノ＠２０（セリン）後そしてアミノ
酸２９（グリシン）後であることが予想されている〔フ
ォノ・バイン（Ｙｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ　）、１９８３、
［ヨー口６　Ｊ、バイオケム、（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、）Ｊ１３３：　　１７〜２１〕。この開裂部位
は、３４アミノ酸下流に延長するＴＧＦ−β１及びＴＧ
Ｆ−β２の間の相同性の第１のブロックよシ本直接先に
ある。シグナル配列の除去後、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ
−β２プレカーサーは位ｔ４のシスティンを含む初めの
４個のアミノ藪と同じＮ−末端をともにする。この推定
のＮ−末端の下流の１４アミノ酸及び次の２１アミノ酸
の中の１９個はＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２の間に保
存され、成熟ＴＧＦ−β蛋白を含むＣ−末端領域におい
てすら見られるすべてのものより大きい相同性のブロッ
クである。強い相同性の三、四の他のブロックが、第２
Ａ及び２Ｂ図に見られるように成熟蛋白の上流の領域内
に存在する。これらのドメインは、長い非相同的アミノ
酸のつながりにより分離されている。

ＴＧＦ−β２プレカーサーは３個のＮ−グリコジル化部
位（第１＆図の残基７２．１６８及び２６９に位置する
）を有する。第一の部位のみがＴＧＦ−β１に保存され
そして保存され次残基の大きなブロック内にあり、この
潜在的なグリコジル化部位が重要な構造上及び／又は機
能上の特徴を有することを示唆している。

シグナル配列の除去後、ＴＧＦ−β２プレカーサーはそ
のＴＧＦ−β１対応部分よりも３１又は５９アミノ駿の
何れかを含むだろう。ＴＧＦ−β２の追加のシスティン
残基は、成熟配列より先の非相同性アミノ酸の大きな領
域のまさに上流に位置している。ＴＧＦ−β１と同じく
、成熟ＴＧＰ−β２蛋白の開裂部位は、第２Ａ図に示さ
れるように４〜５基本的アミノ醒の領域直後に生ずる。

成熟領域は９個のシスティンを含む。９個のシスティン
の中の７個の保存は、ＴＧＦ−β類の異るメンバーにつ
いて％金的である。ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２のバ
イトロバシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　）分析は、プレ
カーサー及び成熟領域の両方において同様なパターン金
示し、両方の蛋白は一般に靭、水性である（データは提
示せず）。

第３Ａ図は、Ｂ２Ｏ−４０（アフリカミドリザル腎臓細
胞系）及びタモキシフェン処理ＰＣ−３細胞からのポリ
アデニル化ＲＮＡｔ−グローブするｐＰＣ−２１を用い
てノ−ザンプロット分析を示す。ＰＣ−３細胞は大きさ
が４．１．５．１そして６．５ｋｂの３種の主なＴＧＦ
−β２−特異性ｍ　ＲＮ　Ａを含み（第３Ａ図、レーン
２）：ＥＳＣ−４０細胞は主として４．１及び６．５ｋ
ｂ）ランスクリプト及びより少い量の５．１ｋｂＲＮＡ
を含む（第３Ａ図、レーン１）。

ｐＰｃ−２１プローブは、こ＼で用いられたハイブリッ
ド化条件下でこの細胞系に存在する１５ｋｂＴＧＦ−β
１−特異性ｍＲＮＡ’ｉ検出しないことに注意する必要
がある。

これらの結果及び従来の観察（シャープレスら、１９８
７、ｒＤＮＡＪ６：２３９〜２４４）は、ＥＳＣ−４０
細胞はＴＧＦ−βｌ−及びＴＧＦ−β２−特異性ｍＲＮ
Ａの両者を含むことを示唆している。これをさらに明ら
かに立証すｂために、ノーザンプロットを、同一の特異
的な活性について放射ラベルされた等量のＴＧＦ−β１
及びＴＧＦ−β２プローブを含む混合物にハイブリッド
した。第３Ｂ図のし一ン１は、ＥＳＣ−４０細胞は２−
５ｋｂＴＧＦ−β１−特異性ｍＲＮＡ並に４．１及び６
．５ｋｂＴＧＦ−β２ｍＲＮＡを含むことを示し：第３
Ｂ図のレーン２ｔ：ｌ：、タモキシフェン処理ＰＣ−３
細胞は又２．５ｋｂＴＧＦ−β１〜％異性ｍ　ＲＮ　Ａ
　ｋ含むこと全示す。第３Ｂ図は、タモキシフェン処理
ＰＣ−３細胞がＴＧＦ’−β２−特異性メツセージより
もＴＧＦ−β１−特異性メツセージを含むことを証明し
ている。

ＴＧＦ−β２−特異性ｃＤＮＡクローンの同定に、種々
の細胞系におけるＴＧＦ−β２ｍＲＮＡについてスクリ
ーンすることを可能にした。第４図に示されているノー
ザンプロットは、ＴＧＦ−β２−特異性トランスクリプ
トがＨＢＬ　１００　Ｃブレツブ・シュルツ（Ｇｒｅｇ
　５ｃｈｕｌｔｚ）博士から得られたヒトの乳から誘導
された正常の上皮細胞系」、ＭＣＦ−７（ヒト乳癌細胞
系）、ＳＫ−ＭＥＬ２８（黒色腫細胞系）に検出されそ
してＫＢ細胞（鼻咽喉癌細胞系）が非常に少量のＴＧＦ
−β２　ｍＲＮＡを含むことを示している。

（７，）実施例２：ＥＳＣ−４０細胞からのＴＧＦ−β
２プレカーサーのｅＤＮＡクローン化 下記の実施例は、ＴＧＦ−２２％異性ｍＲＮＡを含むこ
とが示されているアフリカミドリザル腎臓細胞系Ｂ５Ｃ
−４０（セクション６）からのＴＧＦ−β２コーディン
グ配列のｃＤＮＡクローン化を記載している。ヒトＴＧ
Ｆ−β２と同じくサルＴＧＦ−β２が、少くとも２種の
長いプレカーサーの一つ（成熟ＴＧＦ−β２分子が蛋白
分解開裂により誘導される）として＠成されることを結
果は示している。

（７，１，）　　材料及び方法 下記の方法はサルＴＧＦ−β２プレカーサーをエンコ−
（７，１，１，）　　細胞の成長及びＲＮＡ抽出Ｂ５Ｃ
−４０細胞を１０％胎児ウシ血清を含むダルベツコの修
飾イーグル培地で成長させた。ポリアデニル化ＲＮＡを
、プルチオ（Ｐｕｒｃｈｉｏ　）及びファサード（Ｆａ
ｒｅｅｄ　）、１９７９、［Ｊ、ウイロロ、Ｊ２９ニア
６３〜７６９に記載されたようにオリゴ［ｄＴ］−セル
ロースクロマトグラフィにより単離した。

（７，１，２，）　　ｅＤＮＡライブラリー構築及びス
クリーニング 二本鎖ｅＤＮＡｅ、マニアチスら、１９８２、［モレキ
ュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル
」コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ５トリー、：
７−ルド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク、３７
１〜３７２に記載しであるようにＥＳＣ−４０ポリアデ
ニル化ＲＮＡドするｃＤＮＡをクローンするのに用いら
れた。

制限酵素認識部位を含むオリゴヌクレオチドリンカー（
Ｅｅｏ　　ＲＩリンカ−）にリゲートし次。ｅＤＮＡを
星三免ＲＩにより消化しセしてセファクリルＳ’−１０
００のクロマトグラフィにより分画した。７５０塩基対
より大きいｅＤＮＡ画分をプールしそしてラムダｇｔ　
１０　（ＥｃｏＲＩにより切断された〔デービス（Ｄａ
ｖｌｇ）ら、１９８０、［ア・マニュアル・フォア・ゼ
ネチツク・エンジニアリング：アドバンスド・バクチリ
アル・ゼネチツクス（ＡＭａｎｕａｌ　　ｆｏｒ　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　：　Ａｄｖａｎ
ｃ＠ｄＢａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）Ｊコー
ルド・スプリング・ノーパー・ラボラトリ−、コールド
・スフリング・ノ・−ノクーセニューヨーク〕）にリゲ
ートされ、ノ（ツケージされ〔グロスベルド（Ｇｒｏｓ
ｖｓ　ｌｄ　）ら、１９８１、「ジーン（Ｇｏｎｅ）Ｊ
１３：２２７〜２３７）、そしてＥ、コリＣｇｏｏ　　
ｒＫ−ｍＫ”ｈｆｌ　　にプレートされた。ライブラリ
ーを、［３！ｐ］−ラベルｐＰＣ−２１及びｐＰＣ−１
４グローブへのグラーク・ハイブリッド化〔ベントネッ
ト（１３ｅｎｔｏｎａｔ　）ら、１９７７、−［サイエ
ンスＪ１９６：１８０〜１８２〕によシスクリーンした
。ｐＰＣ−２１プローブをハイブリッドしたクローンｐ
ＢＳＣ−４０−１６及びｐＰＣ−１４グローブをハイブ
リッドしたクローンｐＢＳＣ−４０−１単離しそしてｐ
ＥＭＢＬにサブクローンした。ｐＢＳＣ−４０−１のＴ
ＧＦ−β２コーディング配列は、ジデオキシ鎖停止方法
（サンガーら、１９７７、「プロン・ナツル・アカデ・
サイ・ＵＳＡＪ７４　：　５４６３〜５４６７）’！ｉ
−用いて両方の鎖を配列することにより決定された。ｐ
Ｂｓｃ−４０−１６は部分的に配列された。

（７，２，）　　結果 ２種のクローンが、ヒトＴＧＦ−β２−４４２及びＴＧ
Ｆ−β２−４１４プレ力−サーコーディング配列から構
築されたプローブに二者択一的にハイブリッドし７’ｊ
ＢＳＣ−４０ｃ　ＤＮＡライブラリーから得られた。

ＴＧＦ−β２−４４２プローブへハイブリッドし次クロ
ーンｐＢＳＣ−４０−１６は、第１ａ図の位置３４６〜
４３２からの２９アミノ醒セグメントに関するコーディ
ング配列を含むことが予想される１５０ヌクレオチド列
（第１ａ図のヌクレオチド３００〜４５０）に配列され
た。この領域についてｐＢＳＣ−４０−１６は、ヒトＴ
ＧＦ−β２−４４２　ｅ　ＤＮＡクローン、ｐＰＣ−２
１における対応する配列に同一のアミノ豪配列をエンコ
ードすることを結果は示し、セしてｐＢＳＣ−４０−１
６Ｆｉ４４２アミノ酸ＴＧＦ−β２プレカーサーをエン
コードすることを示唆する。

ＴＧＦ−β２−４１４グローブにノ為イブリットするク
ローンｐＢＳＣ−４０−１は、全コーディング領域に配
列された。このクローンが、アミノ酸残基１１６〜１４
４ヒトＴＧＦ−β２−４４２が欠失し単一のアスパラギ
ン残基によジ置換されること以外はヒ）ＴＧＦ−β２−
４４２プレカーサーに同一の４１４アミノ醒ＴＧＦ−β
２プレカーサーをエンコードしていることを結果は示す
。ヌクレオチドレベルで、欠失領域においてｐＢｓｃ−
４０−１はヒトＴＧＦ−β２−４４２とは異シ、第１ａ
図におけるヌクレオチド３４６〜４３２は欠失しそして
アスパラギンＡＡＴに関するコドンにより置換される。

１３サイレント塩基変化以外に、２桟の構造Ｆｉａ、ｂ
のコーディング配列について完全に相同である。

（８，）実施例３：ＴＧＦ−β２の形質発現本実施例に
、ＳＶ４０プロモーター配列の調節コントロールの下サ
ルＴＧＦ−β１グレカーサーに関するコーディング配列
により下流でしかもイン・フレームでリゲートされた成
熟ヒトＴＧＦ−β２に関するコーディング配列を含ム組
換えプラスミドによりトランスフェクトされたチヤイニ
ーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）における成熟
した生物学的に活性なＴＧＦ−β２の形質発現を記述し
ている。構築物は、約０．５′ＭＩ／ｌのレベルで成熟
した生物学的に活性なＴＧＦ−β２の脅威及び分泌に関
した。

Ｃ８，１，）　　材料及び方法 （８，１゜１．）細胞培養 ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｂｆｒ）欠損チャイニーズ・
ノ・ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞〔ウルラウブＣＵｒｌ
ａｕｂ　）及びナアシン（Ｃｈａｓ　ｉｎ　）、１９８
０、［ブロシ、ナツル。

アカデ、サイ、ＵＳＡＪ７７：４２１６）を、１０チ胎
児ウシａ清（ＦＢＳ）及び１　ｓ　ｏ　ｐｆ／−のＬ−
プローリンｆ補給したノ・ム（Ｈａｍ　）のＦ−１２培
地〔ギブコ・ラボラトリーズ（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）］中で増殖した。ゝニジリン及びスト
レプトマイシン全それぞれ１００　Ｕ／ｄ及び１００μ
ｙ／ａｔ加えた。ＣＨＯ）ランフエクタントを、前述の
ものと同じ補給物を含むダルベツコの修飾イーグル培地
中で成長させた。ＣＨＯ細胞及びそれらの誘導体を日課
として１：５のスプリット比でトリプシン化により継代
化した。

メトトレキセート〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ＭＯ）を水
中ｘｏｔｔｑ／ゴの原液濃度で調製した。薬剤を溶解す
るために希釈Ｎａ０Ｈ（０，２Ｍ）ｆ加えた（最終のｐ
Ｈ６）ｏ原液をｒ過滅菌し一２０℃で貯蔵した。培地中
のメトトレキセートノ原ｆｊ、（１００ｕＭ）　ｆ４℃
で１ケ月以内保存した。

（８，１，２，）　　ＤＮＡ操作及びプラスミド構築制
限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、仔ウシ小腸ホスファター
ゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１０）フレナラ（Ｋｌｅｎｏｖ
）フラグメント及び他のＤＮＡ試薬ベテスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　Ｌａｔ＋ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ＭＤ、から購入した
。標準のＤＮＡ操作は、マニアチスら、１９８２、「モ
レキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュ
アル」コールド・スプリング・ノル−バー・ラボラトリ
−、ニューヨークに概説されたように行われた。

サルＴＧＦ−β１ｃＤＮＡ及びマウスｄｈｆｒ遺伝子を
一列に含みそしてＳＶ４０配列を間にはさむプラスミド
ｐＳＶ２（β１−ＴＧＦ−ｄｈｆｒ）’ｉゼントリー（
Ｇｅｎｔｒｙ）ら、１９８７、［モレ・セル・パイオロ
、　（Ｍｏ１．　Ｃ＠ｌｌ。

Ｂｉｏｌ、）　Ｊ　７　：　３４１８に記載されたよう
に構築した。

グラスミドｐＳＶ２／β１−β２／ｄｈｆｒは、セクシ
ョン８．２．に概説されたように構築された。

（８，１，３，）　　ＤＮＡ）ランスフエクション１０
０畷皿に１０＠ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞を接徨してから
約２４時間後に、培養物を、燐面カルシウム沈でん物と
しテ２０　／１１９　（７）Ｎｄｅ　　Ｉ線状ｐｓＶ２
−（β１−ＴＧＦ−ｄｈｆｒ　）プラスミドによりトラ
ンスフェクトした〔ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ　）Ｍ、
ら、１９７９、［プロン・ナツル・アカデ・サイ・ＵＳ
ＡＪ７６：１３７３〜１３７６：］。簡単には２０μ２
の線状Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆ　１　ｍｌの２５０　ｒｎＭ滅菌
ＣｌｌＣｌ！に加えた。Ｉｇ／の２ｘＨａＰＥｓ溶液（
２８０ｍＭＮａＣＩ、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１．５ｍＭ
燐酸ナトリウム、ｐ！（７，１）を次に滴下しそして混
合物全氷上で３０分間放置した。沈でん物を次に１０−
〇ＦＩＺ培地を含む細胞に滴下して分散した。４時間３
７℃でインキュベーションした後、培地全除き室温で９
０秒間２５チグリセロール含有Ｆ１２培地１０−により
置換し７た。細胞を１回２０ｆｆＬｔのＦ１２培地に浸
しそしてさらに４８時間非選択性Ｆ１２培地（２０ｍ）
中でインキニベートした。ｄｈｆ　ｒ形質発現トランス
フェクトントに関する選択は、培地を１０チ透析ＦＢＳ
　（ギブコ、ニューヨーク）及び１５０μ２／−のし−
プローリンにより補給されたＤＭＥＭにより置換するこ
とくよ＃）達成された。

選択培地で１０〜１４日間細胞を培養後コロニーを観察
した。１個のコロニーをパスツールピペットによシ吸引
しそして増殖した。

（８，１，４，）　　メトトレキセート耐性細胞の選択
ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）増殖細胞を、ゲーサ
ー（Ｇａ５５ｅｒ　）　Ｃ，Ｓ、及びシムケ（Ｓｃｈｉ
ｍｋａ　）　Ｒ，Ｔ、、１９８６、「Ｊ、バイオロ、ケ
ミ、Ｊ２６１　：６９３８〜６９４６に主として記軟さ
れたように一次トランスフエクタントから誘導した。増
殖後１０５細胞を１００ｗｍ皿に接称しそして増大する
濃度のメトトレキセートに適合させた。

最高のメトトレキセート濃度で肉眼で見えるコロニーを
含むプレートラトリプシン化しそして少くとも２回の追
加の１：５細胞継代についてその濃度のメトトレキセー
トに適合させたつ細胞（１０’）を次に５倍の濃度のメ
トトレキセートの１００ｍ皿に接種した。肉眼でｙえる
コロニーを含む皿を再びトリプシン化しメトトレキセー
ト耐性細胞に適合させた。細胞を、４０％ＦＢＳ、１０
チジメチルスルホキシド及び５０％ＤＭＥＭ’ｉ含む培
地中で種々の段階の拡大で凍結した。メトトレキセート
は凍結培地に含才れなかった。

（ｓ、　ｉ、　ｓ、）　　成長阻止アッセイＴＧＦ−β
１に非常に感度の高いミンク肺上皮細胞ＭｖＩＬｕ（受
入れ番号ＣＣＬ−６４、アメリカン・タイプ・カルチュ
ア・コレクション）を成長阻止アッセイに利用した。ア
ッセイをチミジンアナログ５／−（１２１１）−ヨード
−２′デオキシウリジン（”’　Ｉ　ｄｔｒ）　２用い
て行ってＤＮＡ合成を評価した。１単位の活性を、未処
理のＣＣＬ−６４細胞に比較して１２６　工ｄＵ　　の
５０％導入を阻止するのに必要な量として規定した。

活性ＴＧＦ−β２の分泌についてトランスフェクトされ
た細胞をアッセイするために、無血清上澄み液を細胞の
集密的培養物上の２４時間コレクションから集めそして
０．２Ｍ酢酸に対して充分に透析した。酢酸を凍結乾燥
により除きそしてサンプルをアッセイのために滅菌完全
培地に再溶解した。

（８−２，）　　ＴＧＦ−β２形質発現の念めのＴＧＦ
−β１／ＴＧＦ−β２ハイブリツドプレカーサー遺伝子
の構築サルＴＧＦ−β１プレカーサーコーディング並に
ヒトＴＧＦ−β２成熟コーディングとイン・７レームで
結合した５′未翻訳配列並に３′未翻訳配列よりなるノ
・イブリッドＴＧＦ−βプレカーサー遺伝子を第１Ｃ図
に示したように構築した。

ｐＰＣ−２１を先すＥｅｏＲＩにより消化し、フレナラ
酵素、Ｈｉｎ　　ｅ■消化ｐ　ＥＭＢＬにリゲートした
１３ｋｂフラグメントにより充填されセしてＥ、コリを
形質転換するのに用いた。逆の配向にインサートを有す
る２種のクロク消化し、Ｅｘａ　ｍ消化し、フレナラ修
復し、ＤＮＡの再すゲートしセしてＥ、コリを形質転換
することによシ重複Ｅｘｏ　Ｉｎ消化７ラグメントを発
生させた。２種のクローン、Ｅｘｏ　５．９及びＥｘｏ
２５Ｃはそれぞれ異る長さの５′及び３′配列を含むこ
とが分り　ｐＥＭＢＬにサブクローンされてｐＥＭＢＬ
５．９及びｐＥＭＢＬ２５ｃを発生させた。

ｐＥＭＢＬ５．９をＨｉｎｄＩｌｌにより消化され、フ
レノウ酵素にニジプラント末端され、そして０．６ｋｂ
７ラグメント（フラグメント１）を単離した。Ｅｘｏ２
５ＣをＥｃ。

ＲＩ及びＫｐｎ　　ｌにより消化しそして１．１ｋｂ　
　フラグメント（フラグメント２）′！Ｉ−単離した。

ｐＧｓ６２’！ｉＢａｍ　ＨＩにより消化しフレノウ酵
素により充填しＥｅｏＲＩにより消化しそしてフラグメ
ント１及び２にリゲートしｉ［ｐＧＳ６２は、単一のＥ
ｅｏＲＩ部位の欠失によりｐＧｓ２０（マケット（Ｍａ
ｃｋｅｔｔ）ら、１９８４、「Ｊ、ウイロロ、」４９：
８５７１から誘導された］。混合物を用いてＥ、コｌＪ
ｔ形質転換しそしてｐ　Ｇ　Ｓ　６２　／　ＣＩ　Ｆ　
Ｂ　ｋ単離した。

１）ＧＳ６２／ＣＩＦＢ全力銭工及び４二ＲＩ　により
消化し１６００　ｂｐフラグメントを単離しそしてさら
にＸｈｏ　　ＩＩにより消化した。得られた４００ｂｐ
Ｘ互ヱｎ−ＥｃｏＲＩフラグメントを単離した（フラグ
メント３）。

ｐＳＶ２−β−ＴＧＦ（ゼン）リーら、１９８７、［モ
ル・セル・バイオ口、Ｊ　７：３４１８）ｔＡｐａ　　
Ｉ及びＥｅ。

ＲＩにより消化しそして大きな３０００　ｂｐフラグメ
ントを単離した（フラグメント４）。

下記に示す配列を有するＤＮＡの２本の相補的鎖全合成
し、ホスホリル化し、アンニールしそして前述のフラグ
メント ′３′及び′４′にリゲートした。

ｒＧＣＴＧＣＣＴＡ　ＣＧＴ　ＣＣＡ　ＣＴｒ　ＴＡＣ
ＡＴＩ’　ＧＡＴ　ＴＩ’ＣＡＡＧ　ＡＧＧＡＴＣＣＡ
Ａ　ＡＧＣＴＣＧ　ＧＣＧ　ＧＴＧ　ＣＣＧ　ＧＧＡ　
ＧＣＴ　ＴＴＧ　ＣＡＧ　ＡＴＧＴＴＧＧＧｃＣ３′ リゲーション混合物を用いてＥ、コリを形質転換させセ
してｐβ１／β２を単離した。

プラスミドｐβ１／β２を均コＲＩにより消化し、ＤＮ
Ａポリメラーゼ１０）フレノウフラグメントにより充填
し、Ｈｌｎｄｌｌｌにより切断して１６００ｂｐ　　７
ラグメント全単離し：ｐｓｖ２、β１／β２ｉｐＳＶ２
、ネオ（予めにこのフラグメントをそう入することによ
り構築した。

ｐＳＶ２、β１／β２’１Ｐｖｕｌ及びＥｃｏＲＩ　　
により消化し２、フレノウ酵素により充填し、Ｎｄｅ　
Ｉにより消化してＺ６ｋｂ（約）　Ｎｄｓ　Ｉ−Ｅｃｏ
　ＲＩ７ラグメントを単離しそしてｐＳＶ２、ｄｈｆｒ
　（Ｎｄａ　Ｉ及びＰｖｕ　Ｉｌｌ　　により消化して
あった）にリゲートした。リゲーション混合物を用いて
Ｅ、コリを形質転換してｐＳＶ２／β１−β２／ｄｈｆ
ｒを単離した。

（８，３，）　　ＣＩＯ細胞におけるＴＧＦ−β２の形
質発現ｐＳ■／β１−β２／ｄｈｆｒｉ用いてｄｈｆ　
ｒ欠損ＣＨＯ細胞をトランスフェクトしそしてｄｈｆ　
ｒ増大細胞を前述の材料及び方法に記述したように一次
トランスフエクタントから誘導した。

正のクローン全バイオアッセイ〔ゼントリーら、１９８
７、［モル・セル・バイオ口、Ｊ　　７：３４１８に記
載されたようにミンク肺上皮細胞（ＣＣＬ−６４１の阻
止〕により同定しｆ。組換え蛋白を、又成熟ＴＧＦ−β
２に存在する配列ＮＨ，−ＹＮＴＩＮＰＥＡＳＡＳＰＣ
−ＣＯＯＨ（ゼントリーら、１９８７、「モル、セル、
バイオ口、Ｊ７　：３４１８）に対して作られた抗ペプ
チド抗血清を用いて、ウェスターンブロッティングによ
り検出した。

一つの系１β９．１２５は２４０ｎｇ／ＷのＴＧＦ−β
２全分泌していることが分った（第５図）。この系を次
に９６穴プレートにおける希釈全制限することによりク
ローンした。一つのクローン、１β９．１２．５、Ｃ１
３６が約５００　ｎｇＡｌ、’ｉ生成した（第５図）。

抗ペグチド抗血清を用いるウェスターンブロッティング
にエリこのクローンによって分泌された蛋白の分析を第
６図に示し、それは成熟２４ｋｄＴＧＦ−β２ダイマー
並により大きな（約９０ｋｄ）プレカーサーの形の存在
全量す。

（９，）微生物の寄託 下記の微生物はアグリカルチュアル・リサーチ・カルチ
ュア・コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　
）、　ノーザン・リジョナル・リサーチ６センター（Ｎ
ｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
Ｃｅｎｔｅｒ　）（ＮＲＲＬ）に寄託され、そして下記
の受入れ番号を付されている。

（Ｅ＋ｃｈｅｒｌｃｈｉａ　　ｃｏｌｔ　）エツジエリ
シア・コリＨＢＩＯＩ　　　　　ｐＰＣ−１４Ｂ−１８
３３３エツジエリシア・コリ）ＩＢ　１０１　　　　ｐ
ＢＳＣ−４０−Ｉ　　　Ｂ−１８３３５エツジエリ７ア
・コリＨＢＩＯＩ　　　　ｐＢＳＣ−４０−１６Ｂ−１
８３３４チヤイニーズ・ハムスター卵巣　ｐｓＶ％β１
−β２／ｄｈｆｒ

【図面の簡単な説明】

第１ａ図は、ヒトＴＧＦ−β２−４４２　ｅ　ＤＮＡの
ヌクレオチド配列及び演鐸されたアミノ酸配列を示す。 第１ｂ図は、ハイブリッドＴＧＦ−β１／ＴＧＦ−β２
プレカーサーＤＮＡのヌクレオチド配列及び演鐸された
アミノ酸配列を示す。 第１ｅ図は、ハイブリッドＴＧＦ−β１／ＴＧＦ−β２
プレカーサー遺伝子の概略図を示す。 第１ｄ図は、ｐＰＣ−１４（Ｚ２　ｋｂ）及びｐＰＣ−
２１（Ｚ３ｋｂ）の制限エンドヌクレアーゼのマツプで
ある。 第１ｅ図は、ｐＰｃ−１４（Ｚ２　ｋｂ）の部分的ＤＮ
Ａ配列の分析を示す。 第２図は、ヒトＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２−４４２
グレカーサーの配列の相四性を示す。 第３図は、Ｂ１０−４０及びＰＣ−３ポリアデニル化Ｒ
ＮＡのノーザンプロット分析を示す。 第４図は、異る源からのポリアデニル化ＲＮＡのノーザ
ンプロット分析を示す。 第５図は、組換えＴＧＦ−β２の生物活性アッセイを示
す。 第６図は、１β９、１２５、クローン３６により分泌さ
九ｆｃ組ｅえ蛋白のウェスタンプロット分析を示す。 ８　　　ρ　　　８ 　　　ｐ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）約ヌクレオチド残基数１から約ヌクレオチド残基
   数１３２６の第１ａ図に実質的に描かれているヌクレオ
   チドコーディング配列よりなるトランスフォーミング成
   長因子−β２プレカーサーをエンコードするヌクレオチ
   ド配列。 （２）ヌクレオチド残基数３４６〜４３２のヌクレオチ
   ド配列が欠失しヌクレオチド配列「ＡＡＴ」により置換
   されている約ヌクレオチド残基数１から約ヌクレオチド
   残基数１３２６の第１ａ図に実質的に描かれているヌク
   レオチドコーディング配列よりなるトランスフォーミン
   グ成長因子−β２プレカーサーをエンコードするヌクレ
   オチド配列。 （３）約ヌクレオチド残基数９９１から約ヌクレオチド
   残基数１３２６の第１ａ図に実質的に描かれているヌク
   レオチド配列よりなる成熟トランスフォーミング成長因
   子−β２をエンコードするヌクレオチド配列。 （４）約アミノ酸残基１から約アミノ酸残基４４２の第
   １ａ図に実質的に描かれているアミノ酸酸列よりなるト
   ランスフォーミング成長因子−β２プレカーサー。 （５）残基数１１６から１４４のアミノ酸配列が欠失し
   ており単一のアスパラギン残基により置換されている約
   アミノ酸残基数１から約アミノ酸残基数４４２の第１ａ
   図に実質的に描かれているアミノ酸配列よりなるトラン
   スフォーミング成長因子−β２プレカーサー。 （６）約アミノ酸残基数２０から約アミノ酸残基数４４
   ２の第１ａ図に実質的に描かれているアミノ酸配列より
   なるトランスフォーミング成長因子−β２プレカーサー
   。 （７）残基数１１６〜１４４のアミノ酸配列が欠失して
   おり単一のアスパラギン残基により置換されている約ア
   ミノ酸残基数２０から約アミノ酸数４４２の第１ａ図に
   実質的に描かれているアミノ酸配列よりなるトランスフ
   ォーミング成長因子−β２プレカーサー。 （８）約アミノ酸残基数３３１から約アミノ酸残基数４
   ４２の第１ａ図に実質的に描かれているアミノ酸配列よ
   りなるトランスフォーミング成長因子−β２。 （９）約ヌクレオチド残基数−７０から約ヌクレオチド
   残基数１７５５の第１ｂ図に実質的に描かれているヌク
   レオチドコーディング配列よりなるハイブリッドトラン
   スフォーミング成長因子−β１／トランスフォーミング
   成長因子−β２プレカーサーをエンコードするヌクレオ
   チド配列。 （１０）約アミノ酸残基数１から約アミノ酸残基数３９
   ０の第１ｂ図に実質的に描かれているアミノ酸配列より
   なるハイブリッドトランスフォーミング成長因子−β１
   ／トランスフォーミング成長因子−β２プレカーサー。 （１１）約アミノ酸残基数３０から約アミノ酸残基数３
   ９０の第１ｂ図に実質的に描かれているアミノ酸配列よ
   りなるハイブリッドトランスフォーミング成長因子−β
   １／トランスフォーミング成長因子−β２プレカーサー
   。 （１２）（ａ）遺伝子の形質発現を調節する第二のヌク
   レオチド配列のコントロールの下トランスフォーミング
   成長因子−β２をエンコードするヌクレオチド配列を含
   む真核生物の細胞を培養して、トランスフォーミング成
   長因子−β２活性を有するペプチド又は蛋白を真核生物
   の細胞により生成させ；そして （ｂ）培養物からトランスフォーミング成長因子−β２
   を回収する ことよりなるトランスフォーミング成長因子−β２を製
   造する方法。 （１３）トランスフォーミング成長因子−β２をエンコ
   ードするヌクレオチド配列がヌクレオチド数１〜１３３
   ９の第１ａ図に実質的に描かれているヌクレオチド配列
   よりなる請求項１２記載の方法。 （１４）トランスフォーミング成長因子−β２をエンコ
   ードするヌクレオチド配列がヌクレオチド数−７０〜１
   ７５５の第１ｂ図に実質的に描かれているヌクレオチド
   配列よりなる請求項１２記載の方法。 （１５）真核生物の細胞がチヤイニーズ・ハムスター卵
   巣細胞よりなる請求項１２記載の方法。 （１６）遺伝子の形質発現をコントロールする第二のヌ
   クレオチド配列がＳＶ４０プロモーターよりなる請求項
   １２記載の方法。 （１７）第二のヌクレオチド配列がプロモーター、そし
   て真核生物の細胞が欠損している選択可能なマーカーを
   エンコードする配列よりなり、トランスフォーミング成
   長因子−β２コーディング配列を含む真核生物の細胞が
   同定される請求項１２記載の方法。 （１８）選択可能なマーカーがジヒドロ葉酸還元酵素よ
   りなる請求項１７記載の方法。 （１９）真核生物の細胞をメトトレキセートにさらして
   、増大したレベルのジヒドロ葉酸還元酵素及びトランス
   フォーミング成長因子−β２に関するコーディング配列
   を含む耐性コロニーを選択することをさらに含む請求項
   １８記載の方法。 （２０）真核生物の細胞がジヒドロ葉酸還元酵素欠損チ
   ヤイニーズ・ハムスター卵巣細胞よりなる請求項１９記
   載の方法。 （２１）（ａ）ＡＴＣＣに寄託されたトランスフエクタ
   ント１β９、１２．５、クローン３６を培養し；そして （ｂ）培養物からトランスフォーミング成長因子−β２
   を回収する ことよりなるトランスフォーミング成長因子−β２を製
   造する方法。 （２２）トランスフエクタントがメトトレキサートの存
   在下培養される請求項２１記載の方法。 （２３）真核生物の細胞が活性トランスフォーミング成
   長因子−β２を生成するように遺伝子の形質発現を調節
   する第二のヌクレオチド配列のコントロールの下トラン
   スフォーミング成長因子−β２をエンコードするヌクレ
   オチド配列を含む真核生物の細胞。 （２４）トランスフォーミング成長因子−β２をエンコ
   ードするヌクレオチド配列がヌクレオチド数−７０〜１
   ７５５の第１ｂ図に実質的に描かれているヌクレオチド
   配列よりなる請求項２３記載の真核生物の細胞。 （２５）チヤイニーズ・ハムスター卵巣細胞よりなる請
   求項２３記載の真核生物の細胞。（２６）遺伝子の形質
   発現をコントロールする第二のヌクレオチド配列がＳＶ
   ４０プロモーターよりなる請求項２３記載の真核生物の
   細胞。 （２７）第二のヌクレオチド配列がプロモーター、そし
   て真核生物の細胞が欠損している選択可能なマーカーを
   エンコードする配列よりなり、サルのトランスフォーミ
   ング成長因子−β２コーディング配列を含む真核生物の
   細胞が同定される請求項２３記載の真核生物の細胞。 （２８）選択可能なマーカーがジヒドロ葉酸還元酵素よ
   りなる請求項２７記載の真核生物の細胞。 （２９）ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チヤイニーズ・ハム
   スター卵巣細胞よりなる請求項２８記載の真核生物の細
   胞。 （３０）ＡＴＣＣに寄託された１β９、１２５、クロー
   ン３６よりなる細胞系。