LU87361A1 - Sequence nucleotidique codant pour le precurseur du facteur de croissance transformant beta2,precurseur du facteur de croissance transformant beta2,et facteur de croissance transformant beta2 - Google Patents
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Description
öö/B.ο 2.7b 4
Λ T 7 C 4 GRAND-DUCHÉ DE LUXEMBOURG
Brevet N° Jö......./_____v ¥ I * . .
Monsieur le Ministre du , ,1,0.....,P.C'fcQbrS .19,3.8 de l’Économie et des Classes Moyennes
Tjfrp ^ρΐΐνγ-ρ Service de la Propriété Intellectuelle
î re e vre LUXEMBOURG
Demande de Brevet d’invention ........................................................._ (!) I. Requête .....La.......société.....dite:........ONCOGEN. 3005 First Avenue, SEATTLE, _______ ( 2) .Washington 98121, Etats-Unis d’Amérique, repréasntée par__________________
Monsieur Jacques de Muyser, agissant en qualité de mandataire ------------------------------------------------------------------------------------------------:---------------------------------------------------------------------------------- (3) déposant) ce ........dix......octobre 1900.....quatre-vingt huit__________________________________________________ ( 4) à____________________heures, au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, à Luxembourg: 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant: "Séquence nucléotidique codant pour le précurseur du__________ ^ 5\ facteur de croissance transformant jÏ2, précurseur dü facteur de croissance transformant β2, et facteur de ......croissance transformant £2."..............................................................................................................................................................................................
2. la description en langue _______française.............................................de l’invention en trois exemplaires; 3. ................?...................................planches de dessin, en trois exemplaires; 4. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le ..-LQ........octobre 1988 .
5. la délégation de pouvoir, datée de.................................................................................................. le..........................................................................................; 6. le document d’ayant cause (autorisation); UV declaré(nt) en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) inventeur(s) est (sont) : ( 6) | .....pas......mentionner________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ •r-1 QJ Q)
S- "O 'CD
CL CO ..............................................................................................................------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- CD ,3 · ^ ................................................................................................................................................................. .....................................................................
................................................................................................................................................................................................................................................—..............................- C CD _ ............................................................................................................................................................................................................................................................ __ ........... _ o ro 3 +31-1 co revendique(nt) pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de ( 7) 8-S ο Έ .........brevets..............................................................................................................déposée(s)&i(8) aux Etats-Unis d'Amérique "lëS I 1e(Q) »6—eotobre— l„e. 2.5. janvier 1988 et le 18 août 19J8.8 _______ S g -σ S. sous le N° (10) .·75ΒNo. 148.267____________________________No. 234.065___________________________ au nom de (11) s.....inventeurs.______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ élit(élisent) domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg_____________________________________________ .............3.5.., boulevard Royal___________________________________________________________________________________________________________________________________ (12) sollicite(nt) la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, avec ajournement de cette délivrance à..........................................6...........................................................................................................mois. (13)
JktftßpBtent / mandataire: Ά____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ (14) -verbal de Dépôt
La susdite ; demande de breveTd’invention a été déposée au Ministère de l’Économie et des Classes Moyennes, Service de la Propriété Intellectuslleàlmxembourg, en date du: octobre 1988
-J
/ ^*· ·*·’λ ' ·% \ / V\ Pr. le Ministre de l’Ec >tfbmie et des Classes Moyennes, à..............——heures / ’t|l / P-d.
J i \ /» J Le chef du sera« déjà propriété intellectuelle,
v7.Y
A 68007_' V'i_PiY _ ΡΧΡΓ .ΓΓΑΤίΠΝ.ς RFTATTVFS A11 FOR MT f Jf [ I (1) s’il y a lieu "Demande de certificat d’addition aubrSVefflRnctpal, à la demande de brevet principal No /...........du............” - (2) inscrire les nom. prénom, profession.
Γ A A A / adresse du demandeur, lorsque celui-ci est un particulier ou les dénomination sociale, forme juridique, adresse du siège social, lorsque le demandeur est une personne morale - (3) inscrire { . /«( (V les nom, prénom, adresse du mandataire agréé, conseil en propriété industrielle, muni d'un pouvoir spécial, s’il y a lieu: "représenté par............agissant en qualité de mandataire" ^ - (4) date de dépôt en toutes lettres - (5) titre de l’invention - (6) inscrire les noms, prénoms, adresses des inventeurs ou l’indication "(voir) désignation séparée (suivra)”, lorsque la dési- ^ a anation se fait ou se fera dans un document séparé, ou encore l’indication "ne pas mentionner", lorsque l’inventeursiene ou sienera un document de non-mention à joindre à une désignation • 88/B.52.784
REVENDICATION DE LA PRIORITE
de la demande de brevet / • Aux Etats-Unis d'Amérique Du 6 octobre 1987 (No. 106.752),' du 25 janvier 1988 (No. 148.267) et ..du 18 août 1988 (No. · 234.065) Mémoire Descriptif déposé à l'appui d'une demande de
BREVET D’INVENTION
au
Luxembourg au nom de : oncogen SEATTLE, Washington 98121 (Etats-Unis d'Amérique) pour: "Séquence nucléotidique codant pour le précurseur du facteur dé croissance transformant ß2précurseur du facteur de croissance transformant |3 2, et facteur de croissance transformant jS2." "Séquence nucléotidique codant pour le précurseur du facteur de croissance transformant ß2, précurseur du facteur de croissance transformant ß2, et facteur de croissance transformant ß2." 5 La présente invention concerne généralement le clonage et l'expression du facteur de croissance transformant humain beta2.
Dans ce domaine technique, on sait que le facteur de croissance transformant beta (TGF-ß) est 10 un membre d'une famille décrite récemment de polypeptides qui règlent la différenciation et la prolifération cellulaires. D’autres membres de cette famille comprennent la substance inhibitrice de Muller (Cate et al, 1986, Cell 45:685-698), les 15 inhibines (Mason et al, 1985, Nature 318:659-663) et une protéine prédite à partir d'un transcrit du complexe de gène décapentaplégique de la drosophile (Padgett et al, 1987, Nature 325:81-84)
Le facteur de croissance transformant Beta 20 (TGF-ß) consiste en deux sous-unités identiques liées par ponts disulfures ayant des poids moléculaires de 13 000 (Assoian et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:7155-7160 ; Frolik et al, 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:3676-3680; Frolik et al.
25 1984, J. Biol. Chem. 260:10995-11000). Il a été purifié à partir de plusieurs sources de tissu y compris le placenta (Frolik et al., 1983, Nature 325:81-84), les plaquettes sanguines (Childs et al.,1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5312-5316 ; 30 Assoian et al., 1983; J. Biol. Chem. 258: 7155- 7160), le rein (Roberts et al., 1983, Biochemistry 22:5692-5698), et d'os déminéralisés (Seyedin et 2 al. , 1985, Proc. Natl. Acad._ Sei. USA 82:119-123). En présence de sérum à 10% et de facteur de croissance épidermique, TGF-ß favorise la croissance indépendante de l'ancrage de fibroblastes de reins 5 de rats normaux (Roberts et al., 1981, Proc Natl. Acad. Sei. USA 78:5339-5343; Roberts et al., 1982, Nature 295:417-419 ; Twardzik et al., 1985, J.
Cell. Biochem. 28:289-297) ; en présence de sérum à 10% seul, il est capable d'induire la formation de 10 colonies de fibroblastes AKRr-2B (Tucker et al.
1983, Cancer Res. 43:1518- 1586). TGF-ß s'est aussi révélé causer la différenciation de cellules de mésenchyme de muscles de foetus de rat pour produi-re des macromolécules spécifiques du cartilage 15 (Seyedin et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:5693-5695).
En contraste avec son effet sur la prolifération cellulaire, TGF-ß purifié à partir de plaquettes humaines de même qu'une protéine apparentée 20 du point de vue fonctionnel isolée à partir de cellules de callitriche africain (BSC-l) s'est révélé inhiber la croissance de certaines cellules en •culture (Tucker et al., 1984, Science 226:705-707).
‘TGF-ß s'est aussi révélé inhiber la croissance de 25 plusieurs lignées cellulaires cancéreuses humaines (Roberts et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:119-123). Cet effet inhibant/stimulant de TGF-ß peut dépendre de plusieurs facteurs y compris le type cellulaire et l'état physiologique des 30 cellules (pour un compte rendu voir Sporn et al., 1986, Science 233:532-534).
Des clones d'ADNc codant pour TGF-ß humain (Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705), murin (Derinck et al., 1986, J.Biol. Chem. 261:4377-4379) 4 3 et simien (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244) ont été isolés. L'analyse des séquences d'ADN de ces clones indique que TGF-ß est synthétisé sous forme d'un polypeptide précurseur de grande taille, 5 dont l'extrémité carboxy est clivée pour former le monomère mature de TGF-ß. Une forte homologie de séquences a été trouvée dans toute la protéine précurseur de TGF-ß provenant de toutes les sources ci-dessus.
10 Très récemment, une protéine isolée à partir, d'os bovins déminéralisés a été identifiée comme étant apparentée à TGF-ß (Seyedin et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:1946-1949). La protéine a également ' été isolée à partir de plaquettes de porc (Cheifetz 15 et al., 1987, Cell 48:409-415), d'une lignée cellulaire d'adénocarcinome de la prostate humain, PC-3 (Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26:2406- 2410), et d'une lignée cellulaire de glioblastome humain (Wrann et'al., 1987, EMBO 6:1633—1636)'. Une séquen-20 ce partielle d'acides aminés de cette protéine indiquait qu'elle était homologue de TGF-ß et a été dénommée TGF-B2. Le TGF-ß humain (Derynck et al., ‘1985, Nature 316:701-705), murin (Derynck et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:4377-4379) et simien 25 (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244) décrit précédemment a été dénommé TGF-ßl.
La présente invention a pour objet la production de grandes quantités de TGF-B2 par des cellules hôtes eucaryotes transfectées par des 30 vecteurs d'ADN recombinant contenant une séquence codant pour TGF-B2 contrôlée par des éléments régulateurs d'expression. Dans un mode de réalisation spécifique, des clones d'ADNc codant pour le précurseur de TGF-B2 humain ont été obtenus à 4 4 partir d'une bibliothèque d'ADNc constituée à partir d'une lignée cellulaire d'adénocarcinome de la prostate humain traitée au tamoxifen, PC-3. La séquence d'ADNc d'un tel clone prédit que TGF-B2 5 est synthétisé sous forme d'un précurseur de polypeptide de 442 acides aminés duquel est dérivée la sous-unité mature de TGF-B2 de 112 acides aminés par un clivage protéolytique. Ce précurseur de TGF-B2, dénommé TGF-B2-442, partage une homologie 10 de 41% avec le précurseur de-TGF-ßl. Dans un autre -mode de réalisation, des clones d'ADNc codant pour le précurseur de TGF-B2 simien ont été obtenus à partir d'une bibliothèque d'ADNc constituée à •partir d'une lignée cellulaire de rein de calli-15 triche africain, BCS-40. La séquence d'ADNc d'un tel clone prédit que TGF-ß2 est également synthétisé sous forme d'ion précurseur de polypeptide de 414 acides aminés duquel est dérivée la sous-unité i mature de TGF-ß2 de 112 acides aminés par clivage 20 protéolytique. Ce précurseur de TGFrß2, dénommé TGF-B2-414, a une séquence d'acides aminés de 414 résidus d'acides aminés et est identique à la séquence d'acides aminés de TGF-ß2-442, excepté qu'il contient un seul résidu d'asparagine au lieu 25 de la séquence de 29 acides aminés des résidus
No. 116 à 135 de la séquence de TGF-ß2-442 humain.
Des clones provenant de la bibliothèque d’ADNc de BSC-40 qui codent pour un précurseur de TGF-B2-442 simien de même que des clones provenant 30 de la bibliothèque d'ADNc de PC-3 humain qui codent pour un précurseur de TGF-B2-414 humain ont également été identifiés. Les précurseurs de TGF-B2-442 humain et simien paraissent être parfaitement « 5 homologues au niveau des acides aminés, comme le sont les précurseurs de TGF-ß2-414 humain et simien.
Les monomères matures de 112 acides aminés 5 de TGF-ßl et TGF-ß2 montrent 71 % d'homologie.
Des vecteurs d'expression contenant la séquence mature codant pour TGF-B2 jointe en phase aux séquences de signal et précurseur de TGF-ßl (demande de brevet US en instance et en co-pro-10 priété No. 189 984) ont été construits et utilisés pour transfecter des cellules ovariennes de hamster chinois (cellules CHO). Les transfectants de CHO résultants produisent et secrétent un TGF-B2
A
*mature, biologiquement actif.
15 Les termes suivants tels qu'utilisés ici au singulier ou au pluriel ont les significations indiquées.
TGF-ß2 : un facteur de croissance transformant ß2 d'origine humaine 20 ou simienne comprenant la séquence d'acides aminés sensiblement telle que représentée à la figure la depuis environ le reste d'acide aminé No. 331 jusqu'à environ le 25 reste d'acide aminé 442.
Précurseur de TGF-B2 : Une famille de molécules de facteur de croissance transformant B2 d'origine humaine ou simienne 30 comprenant une séquence d'acides aminés sensiblement telle que représentée à la figure la depuis i 6 environ le résidu d'acide aminé No. 1 jusqu'à environ le résidu d'acide aminé No.442 dans laquelle la séquence d'acides aminés depuis 5 le résidu d'acide aminé No. 116 jusqu'au résidu d'-acide aminé No. 144 est supprimée et remplacée par un seul résidu d'asparagine.
Le terme signifie un précurseur de 10 TGF-Î32 désigné TGF-32-442 ou TGF-B2-414 d'origine humaine ou simienne.
Précurseur de TGF-ßl/ 15 TGF-B2 hybride : Nouvelle molécule de précurseur de facteur de croissance transfo- i mant ß comprenanf la séquence d'acides aminés sensiblement telle 20 que représentée à la figure 1b depuis environ le résidu d'acide aminé No. 1 jusqu'à environ le résidu d'acide aminé No. 390.
»
Précurseur 25 de TGF-ßl : Séquences de précurseur et de signal du facteur de croissance transformant ßl simien sensiblement telle que représentée à la figure lb depuis environ le résidu 30 d'acide aminé No.1 jusqu'à environ le résidu d'acide aminé No. 278.
* 7
Les caractéristiques e_t avantages de l'invention apparaîtront mieux dans la description détaillée qui va suivre et qui se réfère aux figures annexées données à titre d'exemple, dans 5 lesquelles : - la figure la représente la séquence nucléotidique d'ADNc de TGF-ß2-442 humain et la séquence d'acides aminés déduite ; la séquence d'insersion bp 2597 de PC-21 a été sous-clonée dans 10 pEMBL (Dante et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11:1645-1654) et séquencée sur les deux brins à l'aide de la réaction de terminaison au didésoxy . nucléotide (Sänger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. -Sei. USA 74:5463-5467) ; la séquence codante est 15 montrée et.la séquence d'acides aminés déduite est présentée directement au-dessus ; la séquence de TGF-B2 mature est encadrée et le peptide signal est surmonté d'un trait ; les sites de glycosylation potentielle sont indiqués par des'astérisques ; la 20 flèche indique le site présumé de clivage de la séquence signal; la séquence nucléotidique de l'ADNc de TGF-32-414 simien est identique à la ‘séquence d'ADNc de TGF-ß2-442 humain excepté que les nucléotides 346 à 432 (entre crochets) sont 25 supprimés et remplacés par la séquence AAT, et s excepté que plusieurs changements silencieux de nucléotides ont lieu ailleurs dans la structure (ceci est indiqué par des lettres isolées directement au-dessous du nucléotide modifié) ; la 30 séquence d'acides aminés déduite pour le précurseur de TGF-32-414 simien est identique à la séquence d'acides aminés de précurseur de TGF-ß2-442 humain sauf que l'asparagine remplace les restes d'acides aminés 116 à 144 dans la structure de TGF-B2-442 i 8 humain ; la séquence nucléotidique d'un ADNc de TGF-B2-414 humain a été séquencée dans la région soulignée en traits interrompus et s'est révélée parfaitement homologue de la séquence d'ADNc de 5 TGF-B2-442 humain mis à part que les nucléotides 346 à 432 sont supprimés et remplacés par la séquence AAT ; - la figure lb représente la séquence nucléotidique d'ADN précurseur de TGF-ßl/TGF-ß2 10 hybride et la séquence d'acides aminés déduite ; la. séquence codante est montrée et la séquence d'acides aminés déduite est présentée directement au-dessus ; la séquence de TGF-B2 mature est encadrée '-et le peptide signal précurseur est surmonté d'un 15 trait. Les sites de glycosylation sont indiqués par des astérisques ; la flèche indique le site présumé de clivage de la séquence signal. La séquence de codage mature de TGF-B2 décrite est d'origine humaine. La séquence de codage mature de TGF-B2 20 simien est à peu près identique à la séquence humaine : seuls trois changements silencieux de bases ont lieu et sont indiqués par des lettres ‘isolées directement au-dessöus du nucléotide modifié ; les détails du clonage par ADNc de TGF-B2 25 et la construction ,du gène TGF-ßl/TGF-ß2 hybride * sont donnes dans le texte ; - la figure le représente un diagramme schématique du gène précurseur de TGF-ßl/TGF-ß2 hybride ; 30 - la figure ld représente les sites de l'endonucléase de restriction de pPC-14 (2,2 kb) et pPC-21 (2,3 kb);les régions encadrées indiquent les séquences de codage pour le monomère de TGF-B2 ; ATG représente le codon de méthionine d'initiation; « 9 la distance entre ATG et le site Kpnl dans pPC-21 (2,34 kb) est d'approximativement 420 bp ; la zone noircie indique la position de l'insertion de 84 bp dans pPC-21 (2,3 kb); 5 - la figure le représente une analyse partielle de séquences d'ADN de pPC-14 (2,2 kb) ; un oligonucléotide synthétique 5'-AGGAGCGACGAAG-AGTACTA-3' qui 's'hybridait approximativement 140 bp en amont du site Kpnl à l'intérieur de la séquence 10 d'insertion dans pPC-21 (2,3.kb) a été utilisé pour, amorcer les réactions de séquençage d'ADN ; dans cette région, la séquence de pPC-14 (2,2 kb) (ligne supérieure) est identique à pPC-21 (2,3 kb.) 4 '.jusqu'aux nucléotides codant pour Asn-116 ; 15 l'insertion de 84 bp à l'intérieur du codon Asn-116 de pPC-14 (2,2 kb) qui a été trouvée dans pPC-21 (2,3 kb) est montrée ; le site Kpnl à l'intérieur de la séquence d'insertion est représenté ; - la figure 2 représente des homologies de 20 séquences de précurseurs de TGF-ßl et TGF-B2-442 humain ; a) homologie primaire de séquences : les résidus identiques sont encadrés ; les astérisques •désignent les sites potentiels de glycosylation dans TGF-B2 ; le site potentiel de clivage de la 25 séquence signal et ,1e site de clivage du polypeptide mature sont indiqués ; b) comparaison de matrices de points à l'aide du logitiel Gene Pro; chaque point localise un point où 5 acides aminés sont identiques parmi 10 acides aminés ; les lignes 30 en diagonale indiquent les régions d'homologie ; - la figure 3 représente une analyse au Northern blot de l'ARN polyadénylé de BSC-40 et de PC-3 ; l'ARN polyadénylé a été isolé à-partir de cellules de BSC-40 et de PC-3, fractionné sur un 4 10 gel agarose-formaldéhyde, transféré sur des filtres Hybond-N et hybridé avec une sonde spécifique de TGF-B2 marquée au [32p1, avec pPC-21 (partie A) ou un mélange de sondes spécifiques de TGF-ßl et 5 TGF-132 marquées au [32P] (partie B) (Sharples et al., 1987) comme décrit dans la partie des matériaux et méthodes ·, bande 1, ARN polyadénylé de BSC-4Q (5 microgrammes) j bande 2, ARN polyadénylé de PC-3 (5 microgrammes) ; 10 - la figure 4 représente une analyse au
Northern blot d'ARN polyadénylé provenant de différentes sources ; l'ARN polyadénylé a été isolé à partir de cellules de MCF-7 (carcinome mammaire humain), de SK-MEL 28 (mélanome humain), de KB 15 (carcinome nasopharyngien) et de HBL-100 (épithélium mammaire humain) et analysé par hybridation au Northern blot avec une sonde spécifique de TGF-S2 (pPC-2l) comme décrit dans la partie matériaux et méthodes ; chaque bande contient S 20 microgrammes d'ARN polyadénylé provenant de cellules de SK-MEL 28 (bande 1), de MCF-7 (bande 2). de HBL-100 (bande 3) ou de KB (bande 4) ; - la figure 5 correspond à un test de bioactivité de TGF-B2 recombinant ; des cellules de 25 clone 36 de 1B9» 12,5 dont la lignée cellulaire a été déposée à l’ATCC (American Type Culture Collection) sous le numéro d'accès CflL 9800. ont été cultivées jusqu'à la confluence dens des bacs de culture de tissus de 100 mm ; les cellules ont été levées trois fois avec un 30 milieu dépourvu de sérum"et ont été mises à innuber pendant 24 heures dans 5 ml de milieu dépourvu de sérum } le milieu a été recueilli, dialysé contre de 1’acide acétique 0»2M, et testé concernant l'inhibition de la synthèse d*ADN dans
H
les cellules de CCL64 comme décrit (Gentry et al., 1307, Moi. Coll. Biol. 7«341Ô). Däne oo toefe, 3,3 pg de TOf-Ol purifié naturel otondard ont donné 60 % d'inhibition ; l'activité spécifique du TGF-32 5 purifié naturel a été calculée : elle était environ la moitié de celle de TGF-ßl î et - la figure 6 représente une analyse au Western blot de protéines recombinantes secrétées par le clone 36 de lß9, 12,S dont la lignée 10 cellulaire a été déposée à l'ATCC (American Type culture collection) sous la numei-u u’cuxea crl 0600 j un milieu conditionné dépourvu de sérum dialysé à l'acide provenant de cellules 'du clone 36 de 1ΑΘ, 12,5', a été fractionné par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide et 15 analysé par Western blot avec un anti-sérum préparé contre le peptide synthétique NH2-YNTINPEASASPC-COOH comme décrit (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7}3418).
T..3 présente invention concerne la production 20 d'une forme mature biologiquement active de TGF-Ö2 à partir d'une séquence codante du gène précurseur de TGF-ß et son produit# Le TGF-B2 mature biologiquement actif peut être produit par le clonage et l'expression de toute la longueur de la séquence de 25 codage du nucléotide du précurseur de TGF-A2 ou de son équivalent fonctionnel dans une cellule hôte qui transforme correctement le précurseur de sorte qu’est produit un TGF-ß2 mature ayant une activité biologique qui virtuellement ne peut pas être 30 distinguée de celle du TGF-ß2 naturel authentique, tes équivalents fonctionnels de la longueur totale de la séquence de codage du nucléotide du précurseur de TGF-B2 comprennent toute séquence 12 d'ADN qui, lorsqu'elle est exprimée à l'intérieur d'une cellule hôte appropriée, est capable de diriger la synthèse, la transformation et l'export de TGF-B2 mature. A cet égard, des séquences de 5 codage de précurseur hybride incluant par exemple la séquence de précurseur de TGF-ßl dans le cadre de lecture de la séquence mature de TGF-B2, peuvent être construites et utilisées pour produire un TGF-B2 biologiquement actif. Le procédé selon 10 l'invention peut être divisé, en les étapes suivantes dans un but de description uniquement : (a) isolement ou production de la séquence de codage pour une forme de précurseur de TGFe-ß2 ; (b) construction d'un vecteur d'expression qui va 15 diriger l'expression d'une séquence de codage de TGF-ß2 ; (c) transfection de cellules hôtes appropriées qui sont capables de répliquer et d'exprimer le gène et de transformer le produit du gène pour'produire la forme mature biologiquement 20 active de TGF-B2 ; (d) identification et purification du TGF-B2 mature biologiquement actif. Le transfectant qui exprime des niveaux élevés de •TGF-ß2 mature bioactif étant identifié, la pratique de l'invention inclue l'expansion de ce clone et 25 l'isolement du produit de gène exprimé.
Le procédé de*1'invention est démontré ici au moyen d'exemples dans lesquels des ADNc de la région de codage du précurseur de TGF-B2 ont été préparés, clonés, séquencés et utilisés pour 30 construire des vecteurs d'expression qui dirigent l'expression à niveau élevé de TGF-B2 dans des cellules de CHO. Dans un mode de réalisation spécifique, la séquence d'acides aminés complète de la forme mature du TGF-B2 humain a été déterminée « 13 et présente une homologie globale de 71 % avec TGF-ßl. A l'aide de sondes d'oligonucléotiques synthétiques nous avons identifié les clones provenant d'une bibliothèque d'ADNc de PC 3 codant 5 pour TGF-B2. L'analyse de séquences d'ADN de l'un de ces clones a révélé que le TGF-B2, de même que le TGF-ßl, est synthétisé sous forme d'une protéine de précurseur de plus grande taille, dont l'extrémité carboxy est clivée pour produire le 10 monomère de TGF-B2 mature. Tandis qu'il y a une homologie de 71 % entre TGF-ßl et TGF-B2 d'un bout à l'autre des portions matures de ces molécules, il existe seulement un maximum de 31 % d'homologie '•dans le reste du précurseur, ce qui suggère que les 15 régions d'extrémité amine de TGF-ßl et TGF-B2 peuvent être distinctes du point de vue fonctionnel.
Dans un mode dë réalisation spécifique de ) l'invention, l'expression d'un nouveau gène hybride 20 de TGF-ßl/TGF-ß2 dans des cellules de CHO est utilisée pour produire de grandes quantités de TGF-B2 biologiquement actif. Les différents aspects du procédé de l'invention sont décrits plus en détails dans les sous-sections suivantes et dans 25 les exemples qui suivent.
La séquence de codage du nucléotide pour TGF-B2 est représentée à la figure la. Dans la pratique du procédé de l'invention, la séquence du nucléotide représentée ici, ou des fragments ou des 30 équivalents fonctionnels de celle-ci, peut être utilisée pour produire les molécules recombinantes qui vont diriger l'expression du produit de TGF-B2 dans des cellules hôtes appropriées. Dans un mode de réalisation spécifique, un gène hybride de « 14 TGF-ßl/TGF-ß2 (figure lb) a é.té construit et utilisé pour transfecter des cellules de CHO. Des transfectants produisant une quantité aussi importante que 500 )ig de TGF-B2 mature biologi-5 quement actif par ml de milieu de culture ont été isolés.
Du fait de la dégénérescence des séquences de codage de nucléotide, d'autres séquences d'ADN qui codent sensiblement pour les mêmes séquences 10 d'acides aminés que celles représentées à la figure-la et la figure lb peuvent être utilisées dans la pratique de la présente invention pour le clonage . et l'expression de TGF-ß2. De telles modifications 'comprennent les délétions, les additions ou les 15 substitutions de différents résidus de nucléotides ayant pour résultat une séquence qui code pour le même produit de gène ou pour un produit de gène équivalent du point de vue fonctionnel. Le produit de gène peut contenir des délétions, des additions 20 ou des substitutions de restes d'acides aminés dans la séquence, ce qui a pour résultat une modification silencieuse produisant ainsi un produit 'bio-actif. De telles substitutions d'acides aminés peuvent être réalisées sur la base de similarité de 25 polarité, de charge, de solubilité, d'hydropho- « bicité, bydrophilicité et/ou de nature amphipathique des résidus impliqués. Par exemple, les acides aminés chargés négativement comprennent l'acide aspartique et l'acide glutamique ; les 30 acides aminés chargés positivement comprennent la lysine et l'arginine ; les acides aminés comportant des groupes de tête polaires non chargés ou des groupes de tête non polaires ayant des'valeurs semblables d'hydrophilicité comprennent les « « 15 suivants : leucine, isoleucine, valine; glycine, alanine; asparagine, glutamine; sérine, thréonine; phénylalanine, tyrosine, la séquence de codage de nucléotide pour 5 TGF-B2 peut être obtenue à partir de sources cellulaires qui produisent une activité semblable à TGF-B2. La séquence de codage peut être obtenue par clonage par ADNc d'ARN isolé et purifié à partir de telles sources cellulaires ou par clonage 10 génomique. L'ADNc ou les bibliothèques génomiques . de clones peuvent être préparés à partir des fragments d'ADN produits à l'aide de procédés bien connus dans la technique comprenant sans ê.tre
A
\ limités à celle-ci l'utilisation d'enzymes de 15 restriction. Les fragments qui codent pour TGF-82 peuvent être identifiés par criblage de telles bibliothèques avec une sonde de nucléotide qui est sensiblement complémentaire de toute portion de la séquence représentée à la figure -la. Des clones de 20 longueur totale, c'est-à-dire ceux contenant la région de codage totale pour le précurseur de TGF-J32 peuvent être choisis en vue de l'expression.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence de codage de la figure la 25 peut être synthétisée en entier ou en partie, à l'aide de procédés chimiques bien connus dans la technique. Voir par exemple, Caruthers et al., 1980, Nue. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-223 ; Créa et Horn, 1980, Nue Acids. Res. 9(10):2331 ; 30 Matteucci et Carruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21:719 et Chow et Kempe, 1981, Nue. Acids. Res. 9(12):2807-2917. Ou bien encore, la protéine pourrait être produite à l'aide de procédés chimiques pour synthétiser la séquence d'acides 4 16 aminés représentée à la figure la en entier ou en partie. Par exemple, des peptides peuvent être synthétisés par des procédés en phase solide sur un instrument Beckman 990, et clivés à partir de la 5 résine comme décrit précédemment (Gentry, L.E., et al, 1983, J. Biol. Chem. 258:11219-11228 ; Gentry, L.E. et Lawton, A., 1986, Virology 152:421-431). La purification peut être réalisée par chromatographie liquide préparative à haute performance. La compo-10 sition des peptides a été confirmée par analyse des. acides aminés.
Dans un mode de réalisation spécifique, décrit dans les exemples ci-inclus, la séquence de Λ \ codage de TGF-B2 a été obtenue par clonage par ADNc 15 de séquences de codage de précurseur de TGF-B2 humain dérivées d'ARN polyadénylé isolé à partir d'une lignée cellulaire d'adénocarcinome de la prostate humain traitée par tamoxifen, PC3, dont il a été montré précédemment qu'elle- produit TGF-B2.
20 La région de codage entière d'un clone d'ADNc a été séquencée et comparée à la séquence publiée de TGF-ßl humain (voir figure 2).
L'analyse de séquences d'ADN des clones d'ADNc de TGF-B2 indiquent que TGF-B2 de même que 25 TGF-ßl est synthétisé sous forme d'une protéine précurseur de grande* taille, dont l'extrémité carboxy est clivée pour produire le monomère mature de TGF-B2 de 112 acides aminés. Il a été montré que TGF-B2 a un poids moléculaire de 24 000 composé de 30 deux sous-unités de 13 000 daltons liés par ponts disulfure (Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26:2406-2410 ; Cbeifetz et al., 1987, Cell 48:409-415). Ainsi, la production de TGF-B2 nécessite un clivage protéolytique approprié de meme que la « 17 formation de ponts disulfure intra- et intermoléculaires. Une séquence leader hydrophobe à l'extrémité amine (résidu 3-19) est présente dans le précurseur et peut être responsable du fait de 5 diriger la protéine hors de la cellule. Le TGF-B2 mature peut encore être associé à la partie restante du précurseur au cours de ce processus.
TGF-B2 présente 71 % d'homologie avec TGF-ßl dans toute la partie mature du précurseur, ce qui 10 implique une similarité fonctionnelle qui est soutenue par les preuves expérimentales (Seyedin et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:1946-1949 ; Cheifetz et al., 1987, Cell 48:409-415). La partie -amine de '· la région précurseur de TGF-ßl provenant de sources 15 humaines, de rongeurs ou de sources simiennes (Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705; Derynck et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:4377-4379;
Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244) est hautement conservée*et suggère que cette partie'de la 20 molécule peut avoir une fonction biologique importante. Par contraste, il n'y a pas plus de 31 % d'homologie entre les régions précurseur * N-terminales de TGF-ßl et TGF-ß2. Après clivage du peptide signal supposé, le précurseur de TGF-B2 25 contiendrait également davantage d'acides aminés que le précurseur de TGF-ßl. Les différences structurales primaires à l'intérieur de la région de l'extrémité amine des protéines précurseur de TGF-ßl/TGF-ß2 peuvent refléter des différences 30 fonctionnelles. Cependant, des régions homologues de façon significative à l'intérieur des précurseurs sont trouvées dans des blocs isolés suggérant « 18 la conservation de domaines fonctionnels importants même à l'intérieur de la région précurseur N-terminales.
L'analyse par Northern blot a révélé deux 5 classes de dimensions importantes de l'ARNm spécifique de TGF-B2 de 4,1 et 6,5 kb dans les cellules de BSC-40. Les cellules de PC-3 traitées au tamoxifen contiennent trois séquences transcrites de TGF-B2 de 4,1 kb, 5,1 kb et 6,5 kb. 10 Ces messages de dimensions différentes pourraient être le résultat d’épissage d'ARN différentiel, de la polyadénylation, ou des deux comme cela a été décrit pour d'autres gènes (Helfman et al1986, '•Mol Cell. Biol. 6:3582-3595; Sayre et al., 1987, 15 Proc. Natl. Acad, Sei. USA 84:29841-2945). Une analyse préliminaire d'un autre clone d'ADNc de TGF-B2 montre qu'il contient une région non traduite en 3' plus grande d'environ 1 kb que celle de pPC-211 et de pPC-14 et qu'il contiént un site de 20 polyadénylation différent suggérant qu'une autre polyadénylation est un facteur responsable de la production d'ARNm de TGF-B2 multiples observés sur • des Northern blots.
Les cellules de BSC-40 contiennent des 25 niveaux comparables de séquences transcrites spécifiques de TGF-ß'l et TGF-B2 : les cellules de PC-3 traitées au tamoxifen contiennent davantage d'ARNm de TGF-ßl que TGF-B2 (figure 3B). Ce dernier résultat est inattendu puisque ces cellules 30 produisent davantage de protéine de TGF-B2 que TGF-ßl (Ikeda et al, 1987, Biochemistry 26: 2406-2410) et suggère un niveau de post-transcription de régulation concernant la synthèse de ce modulateur de croissance. Les expériences destinées à compren- 4 19 dre les mécanismes de commande de transcription et de traduction qui conduisent à la production de TGF-ßl et de TGF-B2 sont en cours. La production de quantités adéquates de TGF-B2 par des techniques 5 d'ADN recombinant, comme cela a été fait pour TGF-ßl, devrait encore aider à concevoir des expériences pour explorer les différents effets de cette protéine.
Dans un autre mode de réalisation, la 10 séquence de codage de TGF-B2. a été obtenue par clonage par ADNc de séquences de codage de précurseur de TGF-B2 simien dérivées d'ARN polyadénylé isolé à partir d'une lignée cellulaire de jDalli-triche africain, BSC-40. La région codante totale 15 d'un clone d'ADNc a été séquencée. Les précurseurs de TGF-ß2 humain et simien semblent avoir des séquences d'acides aminés identiques, et leurs séquences de nucléotides sçnt à peu près identiques. - 20 Afin d'exprimer une forme mature biologiquement active de TGF-B2 on devrait choisir un système vecteur d'expression/hôte pourvoyant non • seulement à des niveaux élevés de transcription et de traduction mais aussi à l'élaboration correcte 25 du gène produit. Ceci est particulièrement important lorsqu'on utilise la séquence codante entière d'un précurseur de TGF-B2 dans les vecteurs d'expression car la forme mature de TGF-B2 semble être dérivée du produit de précurseur par 30 l'intermédiaire de phénomènes de transformation cellulaire. En outre, un système expression/cellule hôte qui pourvoit à la sécrétion du produit peut être choisi.
4 v 20
En particulier, il apparaît que le TGF-B2 mature, un homodimère lié par pont disulfure de 112 acides aminés par sous-unité peut être formé par transformation cellulaire mettant en jeu un clivage 5 protéolytique entre les acides aminés Arg-Ala du précurseur (résidus numéros 330 et.331 à la figure la). En outre, le précurseur de TGF-B2 contient trois sites potentiels de N-glycosylation non trouvés dans la forme mature. La glycosylation 10 appropriée du précurseur peut, être importante pour . la synthèse cellulaire et la libération ou la sécrétion de la molécule mature. En outre, la forme mature de TGF-B2 comprend un dimère à liai-sons 1 disulfure mettant en jeu 9 résidus de cystéine par 15 sous-unité. Certains de ceux-ci sont impliqués dans les ponts disulfure intercaténaires et d'autres dans les ponts disulfure intracaténaires qui modifient la structure et la configuration tertiaires de la molécule mature ^t donc son 20 activité biologique. Ainsi, la capaoité d'une cellule hôte utilisée dans le système d'expression d'exprimer et de transformer correctement le produit du gène de TGF-B2 est importante pour la production d'un TGF-B2 mature biologiquement actif. 25 Une variété- de systèmes hôte animal/vecteurs d'expression (c'est-à-dire des vecteurs qui contiennent les éléments nécessaires pour diriger la réplication, la transcription et la traduction de la séquence de codage de TGF-32 dans une cellule 30 hôte appropriée) peuvent être utilisés aussi bien par l'homme du métier. Ils comprennent mais sans être limités à ceux-ci, les systèmes vecteurs d'expression de virus/cellules hôtes de mammifères (par exemple, cytomégalovirus, virus de vaccine, 4 v 21 adénovirus, et analogues) ; les systèmes vecteurs d'expression de virus d'insectes/cellules d'insectes (par exemple, baculovirus) ; ou des systèmes d'expression de promoteurs non viraux 5 dérivés des génomes de cellules de mammifères (par exemple le promoteur de la métallothionine de souris).
Les éléments d'expression de ces vecteurs varient en ce qui concerne leur force et leurs 10 spécificités. Selon le système hôte/vecteur utilisé, l'un quelconque parmi un certain nombre d'éléments de transcription et de traduction . appropriés peut être utilisé. Par exemple,- lors du • clonage dans des systèmes cellulaires de 15 mammifères, des promoteurs isolés à partir du génome de cellules de mammifères, (par exemple le promoteur de métallothionine de souris) ou à partir de virus qui se développent dans ces cellules, (par ) exemple le promoteur 7,5K du virus de la vaccine) 20 peuvent être utilisés. Des promoteurs produits par des techniques d'ADN recombinant ou par des techniques synthétiques peuvent également être ‘ utilisés pour pourvoir à la transcription des séquences insérées.
25 Des signaux^d'initiation spécifiques sont i également nécessaires pour une traduction suffisante des séquences insérées de codage des protéines. Ces signaux comprennent le codon ATG d'initiation et les séquences adjacentes. Dans les 30 cas où le gène de TGF-B2 entier y compris son propre codon d'initiation et les séquences adjacentes est inséré dans les vecteurs d'expression appropriés, des signaux de commande de traduction supplémentaires peuvent ne pas être « 22 nécessaires. Cependant, dans les cas où seule une partie de la séquence codante est insérée, des signaux de commande de traduction exogènes, comprenant le codon d'initiation ATG; doivent être 5 fournis. En outre, le codon d'initiation doit être en phase avec le cadre de lecture des séquences de codage de TGF-B2 pour assurer la traduction de la séquence d'insertion entière. Ces signaux de commande de traductions exogènes et les codons 10 d'initiation peuvent être d'origine variée, naturelle ou synthétique. L'efficacité de l'expression peut être améliorée par inclusion de séquences d'atténuation de transcription, _ '•d'éléments d'amélioration, etc.
15 L'un quelconque des procédés décrits précédemment pour l'insertion de fragments d'ADN dans un vecteur peut être utilisé pour construire des vecteurs d'expression contenant le gène de TGF-ß et les signaux de commande -de transcription/ 20 traduction appropriés. Ces procédés peuvent comprendre des techniques d'ADN recombinant in vitro, des techniques synthétiques et des recombinaisons in vivo (recombinaison génétique).
Dans les cas où un adénovirus est utilisé 25 comme vecteur d'expression, la séquence de codage de TGF-B2 peut être ÎLiée à un complexe de commande de transcription/traductiond'adénovirus, par exemple le dernier promoteur et la séquence leader tripartite. Ce gène chimérique peut ensuite être 30 inséré dans le génome de 1'adénovirus par recombinaison in vitro ou in vivo. L'insertion dans une région non essentielle du génome viral (par exemple, la région El ou E3) va entraîner la formation d'un virus recombinant qui est viable et < 23 capable d'exprimer TGF-B2 dans des hôtes affectés.
De façon similaire, le promoteur 7,5K de la vaccine peut être utilisé.
Un autre système d'expression qui pourrait 5 être utilisé pour exprimer TGF-B2 est un système d'insecte. Dans un tel système, le virus de la polyhedrose nucléaire de Autographe californica (AcNPV) est utilisé en tant que vecteur pour exprimer des gènes étrangers. Le virus se développe 10 dans les cellules de Spodoptera frugiperda. La séquence de codage de TGF-B2 peut être clonée dans des régions non essentielles (par exemple le gène de polyhedrine) du virus et placée sous le»contrôle
A
'.d'un promoteur de AcNPV (par exemple le promoteur 15 de polyhedrine). L'insertion réussie de la séquence de codage de TGF-B2 va entraîner l'inactivation du gène de polyhedrine et la production de virus recombinant non occlus (c'est-à-dire un virus dépourvu du revêtement protéique pour lequel code 20 le gène de polyhedrine). Ces virus recombinants sont ensuite utilisés pour infecter des cellules de Spodoptera frugiperda dans lesquelles le gène -inséré est exprimé.
En outre, on peut choisir une souche de 25 cellules hôtes qui,module l'expression des séquences insérées, bu qui modifie et transforme le produit de gène de la façon spécifique souhaitée. L'expression de certains promoteurs peut être augmentée en présence de certains inducteurs, (par 30 exemple les ions zinc et cadmium pour les promoteurs de métallothionine). Ainsi, l'expression du TGF-B2 obtenu par génie génétique peut être contrôlée. Ceci est important si le produit de protéine du gène étranger cloné est léthal « 24 vis-à-vis des cellules hôtes. En outre, les modifications (par exemple glycosylation) et les transformations (par exemple clivage) de produits de protéines sont importantes pour la fonction de 5 la protéine. Différentes cellules hôtes ont des mécanismes caractéristiques et spécifiques pour la transformation et la modification post-traduction des protéines. Des lignées cellulaires ou des systèmes hôtes appropriés peuvent être choisis pour 10 assurer la modification et la, transformation correctes de la protéine étrangère exprimée.
Les cellules hôtes qui contiennent la séquence de codage de TGF-B2 recombinant et qui 4 expriment le produit mature biologiquement actif 15 peuvent être identifiées par au moins quatre approches générales : (a) hybridation ADN-ADN ; (b) présence ou absence de fonctions de gène • "marqueur" ; (c) estimation du niveau de transcription tel que mesuré par 4'expression des 20 séquences de transcription d'ARNm de TGF-B2 dans la cellule hôte et (d) détection du produit de gène mature tel que mesuré par immunoessai et, -finalement, par son activité, biologique.
Dans la première approche, la présence de la 25 séquence de codage,de TGF-B2 insérée dans le vecteur d'expression*peut être détectée par hybridation ADN-ADN à l'aide de sondes comprenant les séquences nucléotidiques qui sont homologues de la séquence de codage de TGF-B2 sensiblement comme 30 montré à la figure la, ou de parties ou de dérivés de celle-ci.
Dans la seconde approche, le système vecteur d'expression recombinant/hôte peut être identifié et choisi sur la base de la présence ou de « 25 l'absence de certaines fonctions de gène "marqueur" (par exemple, activité de thymidine kinase, résistance aux antibiotiques, résistance au méthotrexate, phénotype de transformation, 5 formation d'un corps d'occlusion dans le baculo-virus, etc.). Par exemple, si la séquence de codage de TGF-Î32 est insérée dans une séquence de gène marqueur du vecteur, les recombinants contenant la séquence de codage de TGF-B2 peuvent être 10 identifiés par l'absence de la fonction de gène marqueur. Ou bien encore, un gène marqueur peut être placé en tandem avec la séquence de TGF-B2 sous le contrôle du même promoteur ou d'un-'promoteur différent utilisé pour commander 15 l'expression de la séquence de codage de TGF-B2. L'expression du marqueur en réponse à l'induction ou à la sélection indique l'expression de la séquence de codage de TGF-B2.
Dans la troisième approche7 l'activité de 20 transcription pour la région de codage de TGF-B2 peut être évaluée par des essais d'hybridation. Par exemple, l'ARN polyadénylé peut être isolé et analysé par Northern blot à l'aide d'une sonde homologue de la séquence de codage de TGF-D2 ou de 25 parties particulières de celle-ci. Ou bien encore, * les acides nucléiques totaux de la cellule hôte peuvent être extraits et testés en ce qui concerne l'hybridation avec de telles sondes.
Dans la quatrième approche, l'expression de 30 la protéine mature produite peut être estimée de façon immunologique, par exemple par des Western blots, des immunoessais tels que la.radioimmunoprécipitation, des immunoessais liés à- des enzymes et analogues. Cependant, le test ultime quant au 4 26 succès du système d'expression inclue la détection du produit de gène de TGF-B2 biologiquement actif. Lorque la cellule hôte secrète le produit de gène, le milieu dépourvu de cellules obtenu à partir de 5 la cellule hôte transfectante cultivée peut être testé pour l'activité de TGF-B2. Lorsque le produit de gène n'est pas secrété, des lysats cellulaires peuvent être testés pour une telle activité. Dans chacun des cas, les essais biologiques tels que 10 l'essai d'inhibition de croissance décrit ici ou la. stimulation de la croissance indépendante de l'ancrage dans des cellules cibles (Twardzik et Sherwin, 1985, J. Cell. Biochem. 28:289-297; '· Delarco et Todaro, 1978, Proc. Natl. Acad. Sei.
15 U.S.A. 75:4001-4005) ou analogues peuvent être utilisées.
Un clone produisant des niveaux élevés de TGF-B2 mature biologiquement actif étant identifié, le clone peut être étendu et le TGF-B2' peut être 20 purifié à l'aide de procédés bien connus dans la technique. De tels procédés comprennent la purification par immunoaffinité, les procédés • Chromatographiques comprenant la chromatographie liquide à haute performance, et analogues.
25 Les exemples suivants décrivent le clonage par ADNc de séquences de codage de précurseur de TGF-B2 provenant de la lignée cellulaire de l'adénocarcinome de la prostate humain, PC-3, de laquelle le TGF-B2 a été isolé précédemment.
30 Les modes opératoires suivants, illustrant les matériaux et méthodes, ont été utilisés pour cloner des ADNc codants pour le précurseur de TGF-B2 humain.
4 27
La lignée cellulaire de l'adénocarcinome de prostate humain, PC-3, a été cultivée dans un milieu complété au tamoxifen comme décrit (Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26:2406-2410). Des cellules 5 de MCF-7 ont été cultivées dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco contenant 10 % de sérum de foetus de veau et 6 unités/ml d'insuline. Toutes les autres lignées cellulaires ont été cultivées dans le même milieu sans insuline. L'ARN 10 polyadénylé a été isolé par chromatographie sur oligo [[dT]-cellulose comme décrit (Purcbio et Fareed, 1979, J. Virol. 29:763-769).
Un ADNc double brin a été synthétisé à '•partir d'ARN polyadénylé isolé à partir de cellules 15 de PC-3 traitées par le tamoxifen pendant 24 heures comme décrit (Maniatis et al., 1982, dans Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York). Des fractions d'ADNc supérieures à 1000 paires de bases ont été 20 clonées dans lambda gtlO comme décrit (Webb et al., 1987, DNA 6:71-79). La bibliothèque a été tout d'abord criblée en double avec une sonde 24 fois q p •dégénérée marquée au [_ Pj complémentaire d'acides aminés WKWIHEP codant pour l'ADN (sonde 1) qui sont 25 conservés entre TGF-ßl et TGF-B2 : l· 4 28 [5'-GGTTCGTGTATCCATTTCCA-3 ']
C A G C A
Les clones positifs ont ensuite été criblés avec 5 une seconde sonde dégénérée 128 fois complémentaire d'acides aminés CFRNVQD codant pour 1'ADN (sonde 2); cinq de ces sept acides aminés sont spécifiques de TGF-B2 : [5'TCTTGAACGTTTCTGAAGCA-3 ']
10 C C A C A A
G
\ T
L'hybridation a été réalisée à 42°C dans 6X de SSC, dans 5X de solution de Denhart, dans le 15 pyrophosphate 0,15 mM, dans 100 microgrammes/ml d'ADN de Îhymus de veau dénaturé,-dans 100 microgrammes/ml d'ARNt de levure et ImM d'EDTA (Maniatis et al., 1982, dans Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold 20 -Spring Harbor, New York). Les filtres ont été lavés à 42°C dans 2XSSC, NaDodSO^ à 0,1 %, quatre fois pendant 30 minutes. On a isolé plusieurs clones d'ADNc qui s'hybridaient aux deux sondes et qui ont été sous-clonés dans pEMBL (Dante et al., 1983, 25 Nucleic Acids Res. 11:1645-1654). Un clone (pPC-21) contenant une séquence d'insertion de 2,6kb a été séquencé sur les deux brins par la réaction de terminaison au didésoxy nucléotide (Sänger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463-5467) à 30 l'aide de différents fragments de restriction et de délétion d'exonucléase III combinés à un amorçage « 29 d'oligonucléotide spécifique (Henikoff, 1984, Gene 28:351-359). Un autre clone (pPC-14) contenant une séquence d'insertion de 2,2kb a été partiellement séquencé. L'analyse par matrice de points a été 5 réalisée sur un PCAT IBM à l'aide du logiciel Gene Pro de Riverside Scientific Enterprises (Seattle, WA).
L'ARN polyadénylé a été fractionné sur un gel agaroseformaldéhyde à 1 % (Lehrach et al., 10 1977, Biochemistry 16:4743-4751), transféré sur une.
membrane de nylon (Hybond, Amersham), et hybridé avec une sonde marquée au L pl· L'hybridation a été réalisée à 42°C dans du formamide à 50*% 'contenant 0,9 M de NaCL, 50 mM de phosphate de 15 sodium (pH 7), 5mM d'EDTA, 0,1% de NaDodS04, 4X de solution dé Denhardt, 0,4 mg/ml d'ARNt de levure, et 0,25mg/ml d'ADN de thymus de veau dénaturé. Les filtres ont été lavés à 65°C dans 0,25X de SSC, 0,1 % de NaDodSO^, séchés et exposés à un film de 20 rayons X Cronex-4 (DuPont) à l'aide d'écrans d'intensification Lightening Plus (DuPont).
Une bibliothèque d'ADNc a été construite à •l'aide d'ARN polyadénylé isolé à partir de cellules de PC-3 traitées au tamoxifen. Des observations 25 précédentes indiquaient que le traitement au tamoxifen provoquait*un accroissement de deux à cinq fois la sécrétion de TGF-B2 (Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26-2406-2410). La bibliothèque a été criblée avec les sondes 1 et 2 comme décrit 30 ci-dessus. On a obtenu cinq clones qui se sont hybridés aux deux sondes. Un clone, pPC-21, contenant une séquence d'insertion de 2,6kb, a été choisi pour le séquençage. Un autre clone, pPC-14 4 30 contenant une séquence d'insertion de 2,2kb, a été partiellement séquencé. L'ADN et les séquences d'acides aminés déduites sont montrés à la figure 1.
pPC-21 contient un seul cadre de lecture 5 ouvert codant pour un polypeptide déduit de 442 acides aminés ; les 112 acides aminés de l'extrémité carboxy comprennent le monomère de TGF-ß2 mature (encadré à la figure la). La première méthionine codée par le cadre de lecture ouvert est 10 immédiatement suivie par une-étendue d'acides aminés hydrophobes et non chargés (surmontée d'un trait à la figure la) caractéristique d'un peptide signal. Ni la séquence nucléotidique codant pour '-cette méthionine ni celles codant pour les deux 15 méthionines suivantes présentes dans le cadre de lecture ouvert ne sont homologues de la séquence de consensus pour la séquence de méthionine d'initiation (kozak, 1986, Cell 44:283-292). Du fait que la traduction débute habituellement avec 20 la première méthionine dans un cadre de lecture ouvert et du fait que des régions homologues de TGF-ßl, comme discuté ci-dessous, surviennent en amont de la seconde méthionine, on a tenté d'attribuer à la première méthionine le site du 25 début de la traduction. Il apparaît alors que TGF-ß2, de même que TGF-ßl, est exprimé en tant que partie d'un précurseur sécrété de bien plus grande taille. Le clone de pPC-21 contient 467 bp en amont de la méthionine supposée d'amorçage et une région 30 non traduite en 3' d'approximativement 800 bp incluant une terminaison poly [A], quinze bases en amont de laquelle est située une séquence signal de polyadénylation (Proudfoot et Brownlee* 1976,
Nature 263:211-214).
4 31 L'homologie de séquences de nucléotides à l'intérieur des régions codantes du clone d'ADNc pPC-21 de TGF-ßl et TGF-B2 a été déterminée comme étant de 53 %. Les régions codant pour les 5 protéines matures ont 57 % d'homologie tandis que les régions précurseurs en amont ont 48 % d'homologie. Après alignement optimal des deux séquences, plusieurs insertions de nucléotides ont été notées dans la région précurseur de TGF-ß2, 10 l'une d'elles s'étendant sur.75 nucléotides. On ignore si ces insertions sont dues à la présence d'exons supplémentaires dans TGF-B2. Aucune homologie significative n'a été détectée entre les '.séquences d'ADN dans les régions non codantes des 15 deux clones. En fait, tandis que TGF-ßl comportait des régions étendues non codantes riches en G-C, TGF-ß2 comportait des régions extensives non codantes riches en A-T. Les deux clones d'ADNc contiennent des motifs structuraux répétitifs dans 20 la région non codante en 3', les motifs répétitifs dans TGF-ßl consistant en CCCC (purine) (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244) et dans TGF-B2 en ATG •ou A(pyrimidine) (purine).
La localisation des sites de restriction de 25 nombreux clones a révélé qu'un clone, pPC-14, manquait d'un site dé restriction Kpnl situé dans la partie amine de la séquence de codage de TGF-B2. Les sites de restriction de pPC-14 et de pPC-21 sont montrés à la figure ld. pPC-14 a été séquencé 30 sur une étendue d'environ 100 nucléotides correspondant à cette région de la molécule par amorçage spécifique avec un oligonucléotide de 20-mer complémentaire des nucléotides 277 à 296 dans la figure la. Les résultats montrent que le 4 32 clone pPC-14 contient une délétion de 87 nucléotides (positions de nucléotides 346 à 432 dans la figure la ; voir aussi figure le) qui explique le site Kpnl manquant et qui est remplacé 5 par la séquence AAT, le codon pour l'asparagine.
Les résultats suggèrent que le clone pPC-14 code pour un précurseur de TGF-B2 plus court de 414 acides aminés différent de la séquence pour laquelle code pPC-21 seulement en ce que les 10 résidus d'acides aminés 116 à 144 sont supprimés et. remplacés par un seul résidu d'asparagine.
Bien que la région codante entière de pPC-14 n'ait pas été déterminée, elle est probablement en * accord parfait avec la séquence de codage de pPC-21 15 puisque, à l'exception du site Kpnl, les sites de restriction des deux clones se recouvrent parfaitement (figure ld). En outre, un clone simien codant pour un précurseur de TGF-ß à 414 acides aminés coritenant la même délétion-de 29 acides 20 aminés et le même remplacement a été identifié comme décrit dans la section 7 en exemple ci-dessous. Ce clone simien a une séquence codante •qui est à peu près identique à celle du clone pPC-21 humain dans les régions 5' et 3' par rapport 25 à la délétion.
La figure 2A foontre la séquence protéique déduite de TGF-ßl humain (Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705) comparée à celle de TGF-B2-442 humain. On a déterminé que TGF-B2 est homologue à 30 71 % de TGF-ßl humain dans toute la partie mature de la molécule comme décrit précédemment (Marquardt et al. 1987, J. Biol. Chem., sous presse). La partie amine du précurseur en amont de. la molécule mature montre une homologie de 31 % entre TGF-ßl 33 et TGF-ß2-442. La comparaison d'homologie par matrice de points montrée à la figure 2B révèle qu'une homologie significative existe dans plusieurs zones spécifiques des protéines. La 5 comparaison des séquences d'acides aminés N-terminales dans la région supposée de peptide signal ne révèle pas d'homologie significative.
Dans TGF-B2, le site de clivage de séquence signal est prédit comme étant situé après l'acide 10 aminé 20 (sérine) et après 1.'acide aminé 29 (glycine) dans TGF-ßl (Von Heijne, 1983, Eur. J Biochem. 133:17-21). Ce site de clivage précède directement le premier bloc d'homologie entre \ TGF-ßl et TGF-B2 qui s'étend sur 34 acides aminés 15 en aval. Après élimination des séquences de signal, les précurseurs de TGF-ßl et TGF-ß2 partageraient des terminaisons N identiques sur les quatre premiers acides aminés, y compris la cystéine en position 4. Quatorze acides aminée en aval de cette 20 extrémité N supposée, 19 acides aminés parmi les 21 acides aminés suivants sont conservés entre TGF-ßl et TGF-B2, un bloc d'homologie plus important que ‘tous ceux déjà vus même dans, la région C-terminale contenant la protéine de TGF-ß mature. Plusieurs 25 autres blocs de forte homologie existent à l'intérieur de la région en amont de la protéine mature comme représenté aux figures 2A et 2B. Ces domaines sont séparés par de longues étendues d'acides aminés non homologues.
30 Le précurseur de TGF-ß2 comporte trois sites potentiels de N-glycosylation (situés au niveau des résidus 72, 168 et 269 à la figure la). Seul le premier site est conservé dans TGF-ßl,.et est situé à l'intérieur d'un bloc plus important de résidus 4 34 conservés, suggérant que ce site potentiel de glycosylation a des caractéristiques structurales et/ou fonctionnelles importantes.
Après élimination de la séquence signal, le 5 précurseur de TGF-B2 contiendrait 31 ou 59 acides aminés de plus que sa contrepartie.de TGF-ßl. Un résidu de cystéine supplémentaire dans TGF-62 est situé juste en amont d'une région de grande taille d'acides aminés non homologues qui précède la 10 séquence mature. Comme avec TGF-ßl, le site de clivage de la protéine de TGF-ß2 mature se situe juste après une région de 4-5 acides aminés basiques comme montré à la figure 2A. La région '•mature contient neuf cystéines. La conservation de 15 7 des 9 cystéines est caractéristique des différents membres de la famille de TGF-ß. Les analyses d'hydropathie de TGF-ßl et de TGF-ß2 révèlent des motifs semblables dans le précurseur et dans lès régions matures, les -deux protéines 20 étant généralement de nature hydrophile (données non représentées).
La figure 3A montre une analyse par Northern ‘blot à l'aide de pPC-21 pour tester l'ARN polyadénylé provenant de BSC-40 (une lignée 25 cellulaire du rein,du callitriche africain) et de cellules de pPC-3 traitées au tamoxifen. Les cellules de PC-3 contiennent trois espèces majeures d'ARNm spécifiques de TGF-B2 ayant une taille de 4,1, 5,1 et 6,5 kb (figure 3A, bande 2) ; les 30 cellules de BSC-40 contiennent de façon prédominante les séquences de transcription de 4,1 et 6,5 kb et des quantités moindres de l'ARN de 5,1 kb (figure 3A, bande 1). Il est à noter que la sonde de pPC-21 ne détecte pas l'espèce d'ARNm spécifique 4 35 de TGF-ßl de 2,5 kb présente dans cette lignée cellulaire dans les conditions d'hybridation utilisées ici. Ces résultats et des observations antérieures (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244) 5 suggèrent que les cellules de BSC-40 contiennent les ARNm spécifiques de TGF-ßl et de TGF-ß2. Afin de démontrer ceci plus clairement, des Northern blots ont été Hybridés à un mélange contenant des quantités égales de sondes de TGF-ßl et de TGF-ß2 10 radio-marquées à la même activité spécifique. La bande 1 de la figure 3B montre que les cellules de BSC-40 contiennent l'ARNm spécifique de TGF-ßl de 2.5 kb de même que les espèces d'ARNm de TGF-ß2 de 4 ^ 4,1 et 6,5 kb : la bande 2 de la figure 3B montre 15 que les cellules de PC-3 traitées au tamoxifen contiennent aussi l'ARNm spécifique de TGF-ßl de 2.5 kb. La figure 3B démontre aussi que les cellules de PC-3 traitées au tamoxifen contiennent davantage'de message spécifique de TGF-ßl que de 20 message spécifique de TGF-B2.
L'identification des clones d'ADNc spécifiques de TGF-B2 nous a permis de cribler pour -l'ARNm de TGF-ß2 dans différentes lignées cellulaires. Le Northern blot montré à la figure 4, 25 montre que des séquences de transcription spécifiques de TGF-ß*2 pourraient être détectées dans HBL100 (une lignée cellulaire épithéliale normale dérivée du lait humain, obtenue du Dr. Greg Schultz), MCF-7 (une lignée cellulaire de carcinome 30 mammaire humain), SK-MEL 28 (une lignée cellulaire de mélanome) et de cellules de KB (une lignée cellulaire de carcinome nasopharyngien) contenant de très faibles niveaux d'ARNm de TGF-.B2.
« 36
Les exemples suivants décrivent le clonage par ADNc de séquences de codage de TGF-B2 provenant de la lignée cellulaire du rein du callitriche africain, BSC-40, qui s'est révélée contenir des 5 ARNm spécifiques de TGF-B2 (section 6 ci-dessus). Les résultats indiquent que le TGF-B2 simien, de même que le TGF-B2 humain, est synthétisé comme l'un d'au moins deux précurseurs plus longs desquels est dérivée la molécule de TGF-B2 mature 10 par clivage protéolytique.
Les modes opératoires suivants ont été utilisés pour cloner les ADNc codant pour le précurseur de TGF-B2 simien.
\ Des cellules de BSC-40 ont été cultivées 15 dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco contenant 10 % de sérum de foetus de veau. L'ARN polyadénylé a été isolé par chromatographie sur oligoLdT]-cellulose comme décrit (Purchio et Fareed, 1Ö79, J Virol. 29:763-769^.
20 Un ADNc double brin a été synthétisé à partir d'ARN polyadénylé de BSC-40 comme décrit (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning : A • Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 371-372) et, après 25 traitement avec EcoRI méthylase, a été lié à des liants d'oligonucléotide contenant un site de reconnaissance d'enzyme de restriction de EcoRI (liants de EcoRI). L'ADNc a été soumis a une digestion avec EcoRI et a été fractionné par 30 chromatographie sur Sephacryl S-1000. Les fractions d'ADNc supérieures à 750 paires de bases ont été rassemblées et liées dans lambda gtlO qui avait été coupé avec EcoRI (Davis et al., 1980, A Manual for Genetic Engineering : Advanced Bacterial Genetics ; « 37
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sring Harbor, NY), emballées (Grosveld et al., 1981, Gene 13:227-237) et plaquées sur E. coli 0ΟΛΛ rK_mK+hfl.
................- OÜU
La bibliothèque a été criblée par hybridation sur 5 plaque (Bentonet et al., 1977, Science 196:180-182) à des sondes de pPC-21 et de pPC-14 marquées au L P}. Le clone pBSC-40-16, qui a hybridé la sonde pPC-21, et le clone pBSC-40-1, qui a hybridé la sonde pPC-14, ont été isolés et sous-clonés dans 10 pEMBL. La séquence de codage, de TGF-B2 de pBSC-40-1. a été déterminée par séquençage des deux brins à l’aide de la réaction de terminaison au didésoxy nucléotide (Sänger et al., 1977, Proc. NatJ.. Acad.
é \ Sei. USA 74:5463-5467). pBSC-40-16 a été 15 partiellement séquencé.
Deux clones ont été obtenus à partir d’une bibliothèque d'ADNc de BSC-40 qui se sont hybridés tour à tour avec des sondes construites à partir des séquerices de codage de précurseur de TGF-B2-442 20 et de TGF-B2-414 humain.
Le clone pBSC-40-16 qui s'est hybridé à la sonde de TGF-B2-442, a été séquencé sur une étendue • de 150 nucléotides (nucléotides 300 à 450 à la figure la) supposée contenir la séquence codante 25 pour le segment de,29 acides aminés depuis la position 346 jusqu'à la position 432 à la figure la. Les résultats montrent que, dans cette région, pBSC-40-16 code pour une séquence d'acides aminés qui est identique à la séquence correspondante du 30 clone d'ADNc de TGF-B2-442 humain, pPC-21, et suggèrent que pBSC-40-16 code pour un précurseur de TGF-B2 de 442 acides aminés.
4 38
Le clone pBSC-40-1, qui s'est hybridé à la sonde de TGF-B2-414, a été séquencé sur toute la région codante. Les résultats montrent que ce clone code pour un précurseur de TGF-B2 de 414 acides 5 aminés qui est identique au précurseur de TGF-B2-442 humain sauf que les résidus d'acides aminés 116 à 144 de TGF-B2-442 humain sont supprimés et remplacés par un seul résidu d'asparagine. Au niveau du nucléotide, pBSC-40-1 diffère 10 de TGF-B2-442 humain dans la région de délétion : .
les nucléotides 346 à 432 à la figure la sont supprimés et remplacés par le codon pour l'asparagine, AAT. A l'exception de 13 changements, silencieux de bases, les deux structures sont 15 autrement parfaitement homologues sur le reste de la séquencé codante.
Les exemples suivants, décrivent l'expression de TGF-B2 mature biolçgiquement actif dans les cellules ovariennes de Hamster chinois (cellules 20 de CHO) transfectées avec un plasmide recombinant contenant la séquence codant pour le TGF-B2 humain mature lié en aval et par encadrement avec la • séquence codant pour le précurseur de TGF-ßl simien, sous le contrôle régulateur des séquences 25 de promoteur de SV40. La séquence de construction a dirigé la synthèse e‘t la sécrétion de TGF-B2 mature biologiquement actif à un niveau d'environ 0,5 mg/L.
Des cellules ovariennes de Hamster chinois 30 (CHO) déficientes en dihydrofolate réductase (dhfr) (Urlaub et Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei.
U.S.A. 77:4216) ont été propagées dans un milieu F-12 de Ham (Gibco Laboratories, NY) complété par « 39 10 % de sérum bovin foetal (FBS) et 150 μ£/πι1 de L-proline. De la pénicilline et de la streptomycine ont été incorporées à raison de 100 U/ml et lOOjag/ml, respectivement. Les transfectants de CHO 5 ont été cultivés dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco contenant les mêmes compléments que ceux énumérés ci-dessus. Les cellules de CHO et leurs dérivés ont été séparés de leurs supports par trypsination de façon routinière à un rapport de 10 séparation de 1:5.
Le Méthotrexate (Sigma, MO) a été préparé à une concentration de réserve de 10 mg/ml dans l'eau. NaOH dilué (0,2 M) a été ajouté afin de \ solubiliser le médicament (pH final de 6). La 15 réserve a été stérilisée par filtration et stockée à - 20°C. Des solutions mères de méthotrexate dans un milieu (100 jiM) ont été maintenues à 4°C pendant pas plus d'un mois.
Deb enzymes de restrictions, l'ADN ligase 20 T4, la phosphatase intestinale de veau, le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I et d'autres réactifs d'ADN ont été achetés auprès de Bethesda • Research Laboratories, MD. Des manipulations standards d'ADN ont été réalisées comme décrit dans 25 Maniatis, T., et al., 1982, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
Le plasmide pSV2 (Bl-TGF-dhfr) qui contient l'ADNc de TGF-ßl et le gène dhfr de souris en 30 tandem de même que des séquences intervenantes de SV40, a été construit comme décrit (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3418)'.
« 40
Le plasmide pSV2/ßl-ß2/dhfr a été construit comme décrit plus loin aux pages 37, 38 et 39 premier paragraphe.
Environ 24 heures après 1'ensemencement de 5 10 cellules de CHO déficientes en dhfr dans des bacs de 100mm, les cultures ont été transfectées avec 20 μg de plasmide pSV2-(ßl-TGF-dhfr) linéarisé par Ndel sous forme d'un précipité de phosphate de calcium (Wigler, M., et al., 1979, Proc. Natl.
10 Acad. Sei. U.S.A. 76:1373-1376). Brièvement, 20jng d'ADN linéarisé ont été ajoutés à 1 ml de CaClg stérile 250 mM. Une portion de 1 ml de solution 2X HEPES (280 mM de NaCl, 50 mM de HEPES, 1,4 mM de ·, phosphate de sodium, pH 7,1) a ensuite été ajoutée 15 goutte à goutte, et on a laissé reposer le mélange sur la glace pendant 30 minutes. Puis le précipité a été dispersé goutte à goutte sur les cellules contenant 10 ml du milieu F12. Après incubation à 37°C pendant 4 heures, le milieu_a été éliminé et 20 remplacé par 10 ml de milieu F12 contenant 25 % de glycérol pendant 90 secondes à la température ambiante. Les cellules ont été rincées une fois . avec 20 ml de milieu F12 et· ont été mises à incuber dans le milieu F12 non sélectif (20 ml) pendant 25 encore 48 heures. La sélection des transfectants exprimant dhfr a été accomplie en remplaçant le milieu par DMEM complété par 10 % de FBS dialysé (Gibco, N.Y.) et 150 /ag/ml de L-proline. Des colonies ont été observées après culture des 30 cellules pendant 10-14 jours dans le milieu de sélection. Dix colonies ont été aspirées au moyen d'une pipette pasteur et étalées.
« 41
Des cellules amplifiées à la dihydrofolate réductase (dhfr) ont été dérivées des transfectants primaires essentiellement comme décrit (Gasser, C.S. et Schimke, R.T., 1986, J. Biol. Chem.
5 261:6938-6946). Après étalement, 105 cellules ont été ensemencées dans des bacs de 100 mm et adaptées à des concentrations croissantes de méthotrexate.
La plaque contenant des colonies visibles à la concentration la plus élevée en méthotrexate a été 10 trypsinée et adaptée à cette concentration de méthotrexate pendant au moins deux autres séparations 1:5 de cellules. Des cellules (10 ) ont alors été ensemensées dans des bacs de 100^ mm à 5 Λ ·. fois la concentration de méthotrexate. Le bac 15 contenant des colonies visibles a de nouveau été trypsiné et adapté au milieu contenant le méthotrexate. Les cellules ont été figées de nouveau à différents stades d'amplification dans des milieüx contenant 40 % de FBSL, 10 % de diméthyl 20 sulfoxyde et 50 % de DMEM. Le méthotrexate n'a pas été ajouté au milieu de figeage.
Des cellules épithéliales de poumons de - visons, Mv 1 Lu (numéro matricule CCL-64, American Type Culture Collection), qui sont extrêmement 25 sensibles à TGF-ßl, ont été utilisées pour l'essai d'inhibition de croissance. L'essai a été réalisé à -1 ΛΕ l'aide de l'analogue de thymidine 5'-C lJ-iodo-2' desoxyuridine ( IdU) pour estimer la synthèse d'ADN. Une unité d'activité a été définie comme 30 étant la quantité nécessaire pour inhiber 50 % 125 d'incorporation de IdU comparée à des cellules de CCL-64 non traitées.
« 42
Pour tester les cellules transfectées en ce qui concerne la sécrétion de TGF-B2 actif, les surnageants dépourvus de sérum ont été recueillis à partir d'une récolte de 24 heures sur les cultures 5 confluentes de cellules et dyalisés largement contre de l'acide acétique 0,2 M . L'acide acétique a été éliminé par lyophilisation et l'échantillon a été redissous dans le milieu de culture complet stérile pour les essais.
10 Un gène précurseur de TGF-ß hybride consistant en codage de précurseur de TGF-ßl simien et en séquences non traduites en 5' jointes par encadrement avec le codage mature de TGF-432 humain λ v et avec des séquences non traduites en 3' a été 15 construit comme illustré à la figure le.
pPC-21 a d'abord subi une digestion avec EcoRI, rempli avec l'enzyme de Klenow, le fragment 2,3 kb lié à pEMBL ayant subi une digestion avec HincII, et utilisé pour transformer E; coli. Deux 20 clones, pPC-21/HincII+ et pPC-21/HincII~, ayant des séquences d'insersion dans des orientations opposées, ont été utilisés pour produire des fragments de digestion de ExoIII se recouvrant par digestion avec SstI et BamHI puis par digestion par 25 ExoIII, réparation de Klenow, reliaison de 1'ADN, et transformation d<ÿ E. coli. Deux clones, Exo 5,9 et Exo 25c se sont révélés contenir différentes longueurs des séquences 5' et 3' respectivement, et ont été sous- clonés dans pEMBL pour produire pEMBL 30 5,9 et pEMBL 25C. pEMBL 5,9 a été mis à digérer avec HinduI, coupé avec des bords francs par l'enzyme de Klenow, mis à digérer avec Kpnl, et le fragment 0,6 kb (fragment l) a été isolé. Exo 25C a été mis à digérer avec EcoRI et Kpnl et le fragment < 43 1,1 kb (fragment 2) a été isolé. pGS62 a été mis à digérer avec BamHI, rempli avec l'enzyme de Klenow, mis à digérer avec EcoRI et lié aux fragments 1 et 2 (pGS62 a été dérivé de pGS20 (Mackett et al, 5 1984, J. Virol. 49:857) par délétion d'un seul site
EcoRI). Le mélange a été utilisé pour transformer E. coli et pGS62/CIFB a été isolé.
pGS62/CIFB a été mis à digérer avec PstI et EcoRI et le fragment de 1600 bp a été isolé et 10 encore mis à digérer avec XhoII. Le fragment XhoII-EcoRI de 400 bp a été isolé (fragment 3). pSV2-beta-TGF (Gentry et al., 1987, Mol. Cell.
Biol. 7:3418) a été mis à digérer avec Apàl et 4 * EcoRI et le grand fragment de 3000 bp a été isolé 15 (fragment 4).
Deux brins complémentaires d'ADN avec les séquences montrées ci-dessous ont été synthétisés, phosphorylés, fusionnés et liés aux fragments "3" et "4" débrits ci-dessus. _
20 '5 CAA CAT CTG CAA AGC TCC CGG CAC CGC CGA GCT TTG
GAT GCG GCC TAT TGC TTT AGA AAT GTG CAG GAT AAI
TGC TGC CTA CGT CCA CTT TAC· ATT GAT TTC AAG AGG 3'
5' GATC CCT CTT GAA ATC AAT GTA AAG TGG ACG TAG GCA
GCA ATT ATC CTG CAC ATT TCT AAA GCA ATA GGC CGC
25 ATC CAA AGC TCG GCG GTG CCG GGA GCT TTG CAG ATG
TTG GGCC 3'
Le mélange de liaison a été utilisé pour transformer Ε^_ coli et pßl/B2 a été isolé.
Le plasmide pßl/ß2 a été mis à digérer avec 30 EcoRI, rempli avec le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I, coupé avec HindlII et le fragment de i 44 1600bp a été isolé : pSV2,ßl/ß2 a été construit en insérant ce fragment dans pSV2, neo qui avait été préalablement mis à digérer avec HindlII et Hpal pour éliminer le neo gène.
5 pSV2,ßl/ß2 a été mis à digérer avec Pvul et
EooRI, rempli avec l'enzyme de Klenow, mis à digérer avec Ndel et le fragment Ndel-EcoRI de 2,6 kb (approximativement) a été isolé et lié à pSV2, dhfr qui avait été mis à digérer avec Ndel et 10 Pvull. Le mélange de liaison a été utilisé pour transformer E. coli et pSV2/ßl/ß2/dhfr a été isolé.
PSV/ßl-ß2/dhfr a été utilisé pour transfecter des cellules de CHO déficientes en dhfr ^ et des cellules amplifiées en dhfr ont été dérivées 15 des transfectants primaires décrits dans matériaux et méthodes ci-dessus.
Les clones positifs ont été identifiés par bioessai (inhibition des cellules épithéliales de poumons dfe visons (CCL-64) comme ^décrit (Gentry et 20 al. 1987, Mol. Cell, Biol. 7:3418). Des protéines recombinantes ont également été détectées en pratiquant un Western blot à l'aide d'anti-sérums - anti-peptides préparés contre la séquence NH2-YNTINPEASASPC-C00H (Gentry et al., 1987, Mol.
25 Cell, Biol. 7:3418) qui est présente dans le TGF-B2 mature. *
Une bande, 1B9, 12,5, s'est révélée secréter 240 ng/ml de TGF-B2 (figure 5). Cette bande a ensuite été clonée en limitant la dilution dans 96 30 plaques à cuves. Un clone, 1B9, 12,5, cl 36, a produit approximativement 500 ng/ml (figure 5).
L'analyse de la protéine secrétée par ce clone à l'aide d'un Western blot en utilisant un anti-sérum anti-peptide est présentée à la figure « 45 6, montrant la présence du dimère de TGF-B2 mature de 24 kd de même que la forme précurseur de plus grande taille (approximativement 96 kd).
Les micro-organismes suivants ont été 5 déposés auprès de la collection de culture de recherche en agriculture (Agricultural Research Culture Collection), Northern Regional Research Center (NRRL) et les numéros de dépôt suivants leurs ont été attribués.
10 Microorganisme Plasmide N° de dépôt
Escherichia coli HB101 pPC-21 _ B-18256 % Escherichia coli HB101 pPC-14 B-18333
Escherichia coli HB101 pBSC-40-1 B-18335
Escherichia coli HB101 pBSC-40-16 B-18334 15 Ovaire d'hamster chinois pSV/ßl-ß2/dhfr
J
4
Claims (25)
- 46
- 1. Séquence nucléotidique codant pour le précurseur du facteur de croissance transformant 62, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence 5 codante de nucléotides sensiblement telle que représentée à la figure la depuis environ le résidu de nucléotide numéro 1 jusqu'à environ le résidu de nucléotide numéro 1326.
- 2. Séquence nucléotidique codant pour le 10 précurseur du facteur de croissance transformant 62, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence codante de nucléotides sensiblement telle .que 4 \ représentée à la figure la depuis environ le résidu de nucléotide numéro 1 jusqu'à environ le résidu de 15 nucléotide*numéro 1326 dans laquelle la séquence de nucléotide depuis le résidu de nucléotide numéro 346 jusqu'au résidu de nucléotide numéro 432 est supprimée’et remplacée par la séquence de nucléotide "AAT". 20 3. Séquence nucléotidique codant pour le facteur de croissance transformant 62 mature, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence de ^nucléotides sensiblement telle que représentée à la figure la depuis environ le résidu de nucléotide 25 numéro 991 jusqu'à environ'le résidu de nucléotide numéro 1326.
- 4. Précurseur du facteur de croissance transformant 62 caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés sensiblement telle que 30 représentée à la figure la depuis environ le résidu d'acide aminé numéro 1 jusqu'à environ le résidu d'acide aminé numéro 442. 4 47
- 5. Précurseur du facteur de croissance transformant ß2, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés sensiblement telle que représentée à la figure la depuis environ le résidu 5 d'acide aminé numéro 1 jusqu'à environ le résidu d'acide aminé numéro 442 dans laquelle la séquence d'acides aminés depuis le résidu numéro 116 jusqu'au résidu numéro 144 est supprimée et remplacée par un seul résidu d'asparagine.
- 6. Précurseur du facteur de croissance transformant B2, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés sensiblement telle que représentée à la figure la depuis environ JLe résidu Λ \ d'acide aminé numéro 20 jusqu'à environ le résidu 15 d'acide aminé numéro 442.
- 7. Précurseur du facteur de croissance transformant B2, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés sensiblement telle que représentée à la figure la depuis^environ le résidu 20 d'acide aminé numéro 20 jusqu'à environ le résidu d'acide aminé numéro 442 dans laquelle la séquence d'acides aminés depuis le résidu numéro 116 au - résidu numéro 144 est supprimée et remplacée par un seul résidu d'asparagine.
- 8. Facteur de croissance transformant ß2, caractérisé en ce qd'il comprend la séquence d'acides aminés sensiblement telle que représentée à la figure la depuis environ le résidu d'acide aminé numéro 331 jusqu'à environ le résidu d'acide 30 aminé numéro 442.
- 9. Séquence nucléotidique codant pour le précurseur du facteur de croissance transformant ßl/facteur de croissance transformant ,B2 hybride, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence « 48 codante de nucléotides sensiblement telle que représentée à la figure lb depuis environ le résidu de nucléotide numéro -70 jusqu'à environ le résidu de nucléotide numéro 1755.
- 10. Précurseur du facteur de croissance transformant ßl/facteur de croissance transformant B2 hybride, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés sensiblement telle que représentée à la figure lb depuis environ le résidu 10 d'acide aminé numéro 1 jusqu'à environ le résidu d'acide aminé numéro 390.
- 11. Précurseur du facteur de croissance transformant ßl/facteur de croissance transformant x ß2 hybride caractérisé en ce qu'il comprend la 15 séquence d'acides aminés sensiblement telle que représentée à la figure lb depuis environ le résidu d'acide aminé numéro 30 jusqu'à environ le résidu d'acide aminé numéro 390.
- 12. Procédé de production jle facteur de 20 croissance transformant B2, caractérisé en ce qu'il comprend : (a) la culture d'une cellule eucaryote - contenant une séquence de nucléotides codant pour le facteur de croissance transformant B2 sous le 25 contrôle d'une seconde séquence de nucléotides qui règle l'expression des gênés de sorte qu'un peptide ou une protéine ayant une activité de facteur de croissance transformant ß2 est produit par la cellule eucaryote ; et 30 (b) l'obtention du facteur de croissance transformant ß2 à partir de la culture.
- 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour le facteur de croissance transformant i 49 ß2 comprend la séquence de nucléotides sensiblement telle que représentée à la figure la depuis le nucléotide numéro 1 jusqu'au nucléotide numéro 1339.
- 14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour le facteur de croissance transformant B2 comprend la séquence de nucléotides sensiblement telle que représentée à la figure 1b depuis le 10 nucléotide numéro -70 jusqu'au nucléotide numéro 1755.
- 15. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la cellule eucaryote^ comprend à , une cellule ovarienne de hamster chinois. 15 16, Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la seconde séquence de nucléotides qui contrôle l'expression du gène comprend un promoteur de SV40.
- 171 Procédé selon la revendication 12, 20 caractérisé en ce que la seconde séquence de nucléotides comprend un promoteur et une séquence codant pour un marqueur pouvant être choisi pour .lequel la cellule eucaryote est déficiente, de sorte que la cellule eucaryote contenant la 25 séquence codant pour le facteur de croissance transformant ß2 peut* être identifiée.
- 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que le marqueur susceptible d'être choisi comprend la dihydrofolate réductase. 30 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'exposition de la cellule eucaryote au méthotrexate, de sorte que des colonies résistantes qui contiennent des niveaux amplifiés des séquences « 50 de codage pour la dihydrofolate réductase et le facteur de croissance transformant ß2, sont sélectionnées.
- 20. Procédé selon la revendication 19, 5 caractérisé en ce que la cellule eucaryote comprend une cellule ovarienne de hamster chinois déficiente en dihydrofolate réductase.
- 21. Procédé de production du facteur de croissance transformant ß2, caractérisé en ce qu'il 10 comprend (a) la culture du transfectant 1B9, 12,5, clone 36 tel que déposé auprès de la ATCC ; et (b) l'obtention du facteur de croissance A s transformant ß2 à partir de la culture.
- 22. Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que le transfectant est mis en culture en présence de méthotrexate.
- 23. Cellule eucaryote, caractérisée en ce qu'elle côntient une séquence nucléotidique codant 20 pour le facteur de croissance transformant ß2 sous le contrôle d'une seconde séquence de nucléotides qui règle l'expression du gène de sorte que la . cellule eucaryote produit le facteur de croissance transformant ß2 actif.
- 24. Cellule eucaryote selon la revendication 23, caractérisée en fce que la séquence nucléotidique codant pour le facteur de croissance transformant B2 comprend la séquence de nucléotides sensiblement telle que représentée à la 30 figure lb depuis le nucléotide numéro -70 jusqu'au nucléotide numéro 1755.
- 25. Cellule eucaryote selon la revendication 23, caractérisée en ce qu'il s'agit d'.une cellule ovarienne de hamster chinois. 4 51
- 26. Cellule eucaryote selon la revendication 23, caractérisé en ce que la seconde séquence de nucléotides qui contrôle l’expression du gène comprend un promoteur de SV40. 5 27, Cellule eucaryote selon la revendication 23, caractérisée en ce que la seconde séquence de nucléotides comprend un promoteur et une séquence codant pour un marqueur pouvant être choisi pour lequel la cellule eucaryote est déficiente, de IQ sorte que la cellule eucaryote contenant la séquence codant pour le facteur de oroissance transformant 82 simien peut être identifiée.
- 28. Cellule eucaryote selon la revendication 27, caractérisée en ce que le marqueur pouvant être 15 choisi comprend la dihydrofolate réduotase. PC. fiel lui e Atjcaryctô selon la revendication 28, caractérisée en ce qu’il s'agit d'une cellule ovarienne de hamster chinois déficiente en dihydrofolate réduotase. 20 30, Lignée cellulaire, caractérisée en ce qu’il s’agit de la lignée 189, 12,5, olone 36 telle que déposée auprès de l'ATCC» sons le numéro d’accès CRL 9800,
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-
1988
- 1988-10-10 LU LU87361A patent/LU87361A1/fr unknown
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