NO300464B1 - Nukleotidsekvens som koder for chimerisk transformerende vekstfaktor <beta>1/<beta>2, celle og fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktiv chimerisk transformerende vekstfaktor <beta>1/<beta>2 - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en mikleotidsekvens som koder for chimerisk transformerende vekstfaktor-pi/P2 , celler som er i stand til å uttrykke chimerisk TGF-P1/P2 og fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktiv chimerisk transformerende vekstfaktor-pi/p2.

Transformerende vekstfaktor-beta (TGF-p) er ..et medlem av en familie polypeptider som nylig er blitt beskrevet og som regulerer cellulær differensiering og proliferasjon. Andre medlemmer av denne familien omfatter Mullerian hemmende forbindelse (Cate et al., 1986, Cell. 45:685-698), inhibiner (Mason et al., 1985, Nature 318:659-663) og et protein bestemt fra et transkript av dekapentaplegiske genkomplekset til Drosophila (Padgett et al., 1987, Nature 325:81-84).

Fire typer TGF-p er blitt identifisert og betegnet TGF-pl, TGF-P2, TGF-P1.2 og TGF-P3. TGF-pl, den første beskrevne typen, består av to identiske disulfidbundne subenheter med molekylvekter på 13.000 (Assoian et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:7155-7160; Frolik et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:3676-3680; Frolik et al., 1984, J. Biol. Chem. 260:10995-11000). Den er blitt renset fra flere vevskilder omfattende morkaker (Frolik et al., 1983, Nature 325:81-84), blodplater (Childs et al., 1982, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:5312-5316; Assoian et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:7155-7160), nyre (Roberts et al., 1983, Biochemistry 22:5692-5698) og demineralisert ben (Seyedin et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:119-123). cDNA-kloner kodende for human (Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705), muse (Derynck et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:4377-4379) og simian (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244) TGF-pl er blitt isolert. DNA-sekvensanalyser av disse klonene tyder på at TGF-pl blir syntetisert som et stort forløper polypeptid og karboksy-terminale enden blir spaltet til den modne TGF-B monomeren. Sterk sekvenshomologi er blitt oppdaget i hele TGF-pl forløperproteinet fra alle overnevnte kilder.

I nærvær av 10$ serum og epidermal vekstfaktor fremmer TGF—el forankringsuavhengig vekst av normale rottenyre-fibroblaster (Roberts et al., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78:5339-5343; Roberts et al., 1982, Nature 295:417-419; TVardzik et al., 1985, J. Cell. Biochem. 28:289-297); i nærvær av bare 10$ serum kan den indusere kolonidannelse av AKR-2B fibroblaster (Tucker et al., 1983, Cancer Res..^ 43:1518-1586). TGF-pl er også blitt vist å forårsake at fetale rottemuskel-mesenchymale celler differensierer og produserer brusk-spesifikke makromolekyler (Seyedin et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:5693:5695).

I kontrast til dens effekt på celleproliferasjon er TGF-pl renset fra humane blodplater blitt vist å hemme veksten av visse celler i kultur (Tucker et al., 1984, Science 226:705-707 ). TGF-pl er også blitt vist å hemme veksten av flere humane cancer-cellelinjer (Roberts et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:119-123). Denne hemmende/stimulerende effekten til TGF-pl kan være avhengig av flere faktorer omfattende celletype og fysiologisk tilstand til cellene (for en oversikt se Sporn et al., 1986, Science 233:532-534).

TGF-P2, som TGF-pl, er et polypeptid med molekylvekt på 26.000 sammensatt av to identiske 13.000-dalton subenheter som er disulfidkoblet (Chiefetz et al., 1987, Cell. 48:409-415; Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26:2406-2410) og er blitt isolert fra bovint demineralisert ben (Seydin et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:1946-1949), griseblodplater (Cheifetz et al., 1987, 48:409-415), en human prostatisk adenocarcinoma cellelinje PC-3 (Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26:2406-2410) og en human glioblastoma cellelinje (Wrann et al., 1987, EMBO 6:1633-1636). cDNA-kloner kodende for human og simian TGF-P2 er blitt isolert (Madisen et al., 1988, DNA 7:1-8; Webb et al., 1988, DNA 7:493-497 ). Moden TGF-P2 monomer blir spaltet fra en av de to store forløper polypeptidene og mRNA derav kan oppstå via differensiell spleising (Webb et al., 1988, DNA 7:493-497).

TGF-pl og TGF-P2 har 71% aminosyre-sekvensidentitet i de modne regionene og 41$ identitet i forløperstrukturene. Aminosyresekvensen til TGF-P3 er nylig blitt avledet fra cDNA-kloner og ser ut til å inneholde en C-terminal 112 aminosyresekvens med omtrent 80$ homologi med de modne monomerene av TGF-pl og TGF-P2 (Dijke et al., 1988, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:4715-4719). TGF-<p>l.2 er en hetero-dimerisk form omfattende en pl og P2 subenhet bundet med disulfidbindinger (Cheifetz et al., 1987, Cell. 48:409-415).

Intracellulær prosessering av TGF- pl

Aminodelen av forløperregionen til TGF-pl fra humane, gnager og simian kilder viser en høy grad av homologi (Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705; Derynck et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:4377-4379; Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244) og dette tyder på at en viktig biologisk funksjon kan være knyttet til denne delen av molekylet. Senere studier som demonstrerer at denne delen av TGF-pl forløperen er glyko-sylert og fosforylert understøtter dette på grunn av at det kan antas at en celle ikke ville gå gjennom utføring av disse sekundære modifikasjonene dersom det ikke hadde en spesifikk funksjon (Brunner et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:2229-2232). Disse modifikasjonene kan være viktig for dimerisering av forløperen eller for å lede forflytningen ut av cellen. Det tyder på at glykosylering av forløperen er innbefattet ved transport av moden TGF-pl ut av cellen (Purchio et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:14211-14215).

Tilstedeværelse av noe som enten kan være mellomforløper-komplekser involvert i prosessering eller ekspresjons-hendelser i CHO-celler som uttrykker simian TGF-pl genet er blitt rapportert (Gentry et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:4162-4168 press; Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427). Disse studiene viste at TGF-Pl forløperen syntetisert av transfekterte CHO-celler består av pro-TGF-pl, moden TGF-pl og pro-regionen av forløperen bundet sammen av disulf i db i ridinger . Slike disulf id-bundne f orløperkomplekser er også blitt observert i isolerte latente former av TGF-pl (Miyazano et al., 1988, J. Cell. Biochem. Suppl. 12(Å):200; Wakefield et al., 1987, J. Biol. Chem. Suppl. 11(A):46).

Gentry et al. (Gentry et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8:4162-4168)-har foreslått følgende vei for prosessering av pre-pro-TGF-pl i transfekterte CHO-celler. (Aminosyre-posisjons-nummerne som blir referert er fra den publiserte sekvensen til simian TGF-pl (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244)). Ifølge denne foreslåtte veien omfatter det første trinnet signalpeptid-spaltning ved Gly-29/Leu-30 peptidbindingen. Denne spaltningshendelsen oppstår sannsynligvis co-trans-lasjonelt i løpet av gjennomgangen av forløperen gjennom den grove endoplasmatiske retikulum-membranen (Blobel og Dobber-stein, 1975, J. Cell. Biol. 67:835-851; Walter et al., 1984, Cell. 38:5-8). Etter spaltning av signalpeptidet blir kjerne-glykosyleringsenheter (Rothman et al., 1978, Cell. 15:1447-1454 ) satt på pro-TGF-pl ved hver av de tre antatte N-glykosyleringssetene beliggende ved Asn-82, Asn-136 og Asn-176. Kjerneglykosylert pro-TGF-pl blir deretter sekvensielt prosessert i løpet av gjennomgangen gjennom Golgi for å tilveiebringe et fosforylert glykoprotein inneholdende komplekse, sialerte oligosakkarider. Ved et punkt i løpet av syntesen eller gjennomgangen oppstår proteolytisk spaltning ved det dibasiske residiet og disulfid-isomerisasjon som frigjør moden TGF-pl.

I en annen senere studie ble mannose-6-fosfat identifisert i TGF-pl forløperen. Mannose-6-fosfat er en fosforylert sukkeranalog og spiller en fundamental rolle i den målrettede transporten og intercellulær utveksling av lysosomale enzymer (von Figura, 1986, Ann. Rev. Biochem. 55:167-193). Spesifikke reseptorer som gjenkjenner mannose-6-fosfat residiene til lysosomale enzymer er blitt identifisert og er vesentlige komponenter til transportsystemet. Utskilte lysosomale proteiner inneholdende mannose-6-fosfat er blitt identifisert i det kondisjonerte mediet til vevskultur-cellene (Gal og Gottesman, 1986, J. Biol. Chem. 261:1760-1765; Capony et al., 1981, J. Cell. Biol. 104:253-262; Baumbach et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:2985-2989; Sahagian og Gottesman, 1982, J. Biol. Chem. 257:11145-11150). Det er mulig at mannose-6-fosfat residiene til TGF-pl forløperen kan lede -pro-TGF-pl til lysosomer for proteolytisk prosessering for å tilveiebringe moden TGF-pl. Alternativt kan mannose-6-fosfat residiene virke på en slik måte at de fanger opp spaltet TGF-pl forløper til lysosomer for degradering.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig nukleotidsekvens som koder for chimerisk transformerende vekstfaktor-pl/p2, kjennetegnet ved at den omfatter nukleotidkodende sekvensen angitt i Fig. 1 fra nukleotidresidie nummer 836 til nukleotidresidie nummer 1170.

Det er også beskrevet celler som er i stand til å uttrykke chimerisk TGFP1/P2, kjennetegnet ved at den inneholder en nukleotidkodende sekvens for chimerisk transformerende vekstfaktor-<p>l/<p>2-forløper som angitt i Fig. 1 fra nukleotid nummer 1 til nukleotid nummer 1170, under kontroll av en annen nukleotidsekvens som regulerer genekspresjonen slik at cellen produserer chimerisk transformerende vekstfaktor-Pl/p2, og en kodende sekvens for en selekterbar markør som vertcellen mangler slik at vertcellen inneholdende den chimerisk transformerende vekst-faktor-<p>l/<p>2 kodende sekvensen kan bli identifisert.

Oppfinnelsen vedrører også fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktiv chimerisk transformerende vekstfaktor-<p>i/<p>2 kjennetegnet ved at man: (a) dyrker en vertscelle inneholdende en nukleotidkodende sekvens for chimerisk transformerende vekstfaktor-Pl/<p>2-forløper, som angitt i Fig. 1 fra nukleotid nummer 1 til nukleotid nummer 1170, under kontroll av en annen nukleotidsekvens som regulerer genekspresjonen, og i kombinasjon med en sekvens som koder for en selekterbar markør slik at peptid eller protein med chimerisk transformerende vekstfaktor-P1/P2 aktivitet blir produsert av vertscellen; og

(b) utvinner chimerisk transformerende vekstfaktor-Pl/p2

fra kulturen.

Det blir følgelig produsert store mengder av en ny chimerisk TGF-p, betegnet TGF-P1/P2, ved eukaryote vertsceller trasfektert med rekombinante DNÅ-vektorer inneholdende TGF-P1/P2 forløperkodende sekvens kontrollert av regulatori ske elementer for ekspresjon. Simian TGF-pl cDNA (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244) ble modifisert slik at nukleotidene som koder for aminosyre-residienummerne 9-13, 17, 19, 25 og 26 til den modne TGF-pl sekvensen ble forandret til nukleotider som koder for de korresponderende aminosyrene til den modne TGF-P2 strukturen. Simian kodon anvendelsen ble opprettholdt.

Ekspresjonsvektorer som koder for chimerisk TGF-P1/P2 forløper under regulatorisk kontroll av Simian Virus 40 (SV 40) regulatoriske elementer for ekspresjon ble konstruert og anvendt for å transfektere kinesisk hamsterovarie (CHO) celler. CHO-transfektanter ble syntetisert og utskiller høye nivåer moden TGF-pl/p2. TGF-pl/P2 ekspresjon ble amplifisert med metotreksat og amplifiserte transfektanter utskilte 1 mg/L moden TGF-<p>l/P2. Surgjøring av det kondisjonerte mediet til CHO-transfektantene resulterte i maksimale nivåer av biologisk aktiv TGF-P1/P2. Det antas at høye nivåer moden TGF-pl/P2 utskilt av transfekterte CHO-celler er et resultat av en uvanlig effektivitet ved den proteolytiske prosess-eringen av det chimeriske forløperproteinet. En slik øket prosesserings-effektivitet kan igjen være et resultat av strukturelle kjennetegn tilveiebragt ved foreliggende søknad ved kombinasjon av TGF-pl og TGF-P2 aminosyresekvenser i den amino-terminale domenen av den modne TGF-p strukturen.

Beskrivelse av figurene

Fig. 1. Nukleotid- og avledet aminosyre-sekvens til TGF-31/32 hybridproteinet kodet av ekspresjonsplasmid p53/dhfr. Fig. 2. Bioaktivitet til kondisjonert medium fra 5341,2.5 celler. Bioaktiviteten ble målt ved veksthemmende analyse av CCL-64 lungeepitelceller fra mink. (A) Serum-fritt medium kondisjonert med 5341,2.5 celler i 24 timer ble dialysert mot 0,2 M eddiksyre og analysert som beskrevet i Seksjon 6.1.3., nedenfor. (B) Standard veksthemmende kurve for TGF-31. Fig. 3. Immunoblot-analyse av proteiner utskilt av 5341,2.5 celler. 5341,2.5 celler ble dyrket til konfluens og mediet ble dialysert mot 0,2 M eddiksyre og analysert ved immunoblotting under ikke-reduserende (kolonne 1) eller reduserende (kolonne 2) betingelser med anti-TGF-3l36g_3gi som beskrevet i Seksjon 6.1.5., nedenfor.

TGF-31/32 er en ny chimerisk transformerende vekstfaktor-beta som er biologisk aktiv i standard analyse anvendt for å måle TGF-31 bioaktivitet og er immunoreaktiv med TGF-31-spesifikke antistoffer. En chimer som strukturelt omfatter en kombinasjon av TGF-31 og TGF-32 aminosyresekvenser, hvor TGF-31/32 sannsynligvis har nye biologiske aktiviteter og noen av disse kan være lignende eller nesten identiske med de til foreldre-molekylene mens andre igjen kan være unike for TGF-31/32. Med hensyn på disse bioaktivitetene som er lignende eller nesten identiske med de til TGF-31 eller TGF-32 kan denne faktoren tilveiebringe en mer effektiv måte for indusering av korresponderende biologiske responser og anvendelsen derav kan derfor være et ønskelig alternativ til TGF-31 og TGF-32 i forskjellige medisinske anvendelser som er foreslått for TGF-3'ene. Slike anvendelser omfatter men er ikke begrenset til indusering eller aksellerering av celleproliferasjon og differensiering og hemming av celle-delingen. TGF-31/32 kan dermed for eksempel anvendes for behandling av cancer og bedre leging av sår.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er demonstrert heri ved hjelp av eksempler hvori simian TGF-pl forløper cDNA (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244) blir modifisert slik at nukleotidene som koder for aminosyre-residienummerne 9-13, 17, 19, 25 og 26 til moden simian TGF-pl sekvensen blir forandret til nukleotider som koder for de korresponderende aminosyrene i den modne TGF-P2 strukturen med opprettholdelse av anvendelse av simian kodoner. Den resulterende chimeriske TGF-P1/P2 forløperkodende sekvensen blir deretter anvendt for å konstruere ekspresjonsvektorer som kan lede syntesen av det modne TGF-<p>l/P2 produktet.

Forskjellige aspekter av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er beskrevet i mere detalj nedenfor og i eksemplene som følger.

Dannelse av den chimeriske TGF- P1/ P2 kodende sekvensen Nukleotidkodende sekvensen for chimerisk TGF-P1/P2 er angitt i Fig. 1. Ved utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan denne nukleotidsekvensen eller dens funksjonelle ekvivalent bli anvendt for å danne de rekombinante molekylene som vil lede ekspresjonen av TGF-P1/P2 produktet. På grunn av degenerasjonen av de nukleotidkodende sekvensene kan andre DNA-sekvenser som angitt i Fig. 1 bli anvendt ved utførelse av foreliggende oppfinnelse. Slike endringer av nukleotidsekvensen i Fig. 1 omfatter delesjoner, addisjoner eller substitusjoner av forskjellige nukleotidresidier som resul-terer i en sekvens som koder for det samme eller et funksjonelt ekvivalent genprodukt. Genproduktet kan inneholde delesjoner, addisjoner eller substitusjoner av aminosyre-residier innenfor en sekvens som er et resultat av en stum forandring som dermed produserer et bioaktivt produkt. Slike aminosyre-substitusjoner kan bli laget på basis av likhet i polaritet, ladning, oppløselighet, hydrofobisitet, hydro-filisitet og/eller den amfipatiske naturen til de involverte residiene. Negativt ladede aminosyrer omfatter for eksempel asparaginsyre og glutaminsyre; positivt ladede aminosyrer omfatter lysin og arginin; aminosyrer med uladede polare hodegrupper eller upolare hodegrupper som har lignende hydrofilisitets-verdier omfatter følgende: leucin, isoleucin, valin; glycin, alanin; asparagin, glutamin; serin, treonin; fenylalanin, tyrosin.

Nukleotidsekvensen for simian TGF-31 kan bli tilveiebragt fra simian cellekilder (Sharples et al., 1989, DNA 6:239-244). Nukleotidsekvensen til chimerisk TGF-31/32 i Fig. 1 kan bli fremstilt ved kjente fremgangsmåter og omfatter men er ikke begrenset til anvendelse av DNA-restriksjonsenzymer, syntetiske oligonukleotider og DNA-ligaser. Alternativt kan den kodende sekvensen i Fig. 1 bli syntetisert helt eller delvis ved anvendelse av kjemiske metoder som er velkjente innenf or området..

I en spesifikk utførelsesform ble den kodende sekvensen for simian TGF-31 tilveiebragt fra en full-lengde cDNA-klon tilveiebragt fra en afrikansk grønn apecellelinje, BSC-40 (Sharples et al., 1987, ovenfor). Den kodende sekvensen til chimerisk TGF-31/32 angitt i Fig. 1 ble deretter avledet fra simian TGF-31 cDNA ved fjerning og erstatning av de kodende sekvensene til aminosyre-residienummerne 9, 10, 11, 12, 13, 17, 19, 25 og 26 til det modne TGF-31 molekylet med kodende sekvenser for aminosyre-residienummerne 9, 10, 11, 12, 13, 17, 19, 25 og 26 til det modne TGF-32 molekylet (Madisen et al., 1988, DNA 7:1-8) ved anvendelse av genkonstruksjons-teknikker.

Konstruksjon av ekspresjonsvektorer inneholdende

chimerisk TGF- 31/ 32 kodende sekvens

For å uttrykke biologisk aktiv, moden TGF-31/32 bør et ekspresjonsvektor/vertssystem velges som tilveiebringer ikke bare høye transkripsjons- og translasjonsnivåer, men også riktig prosessering av genproduktet. Dette er spesielt viktig når hele den kodende sekvensen til chimerisk TGF-31/32 forløperen blir anvendt i konstruksjonene for ekspresjon på grunn av at som TGF-pl og TGF-P2, er det antatt at moden chimerisk TGF-P1/P2 blir frigjort fra forløpermolekylet eller komplekset av molekyler via cellulære hendelser ved prosessering. I tillegg kan et ekspresjons/vertscellesystem som tilveiebringer utskilling av produktet være ønskelig.

Moden TGF-P1/P2 ser ut til å være en disulfidbundet homodimer på 112 aminosyrer pr. subenhet dannet ved cellulære proses-ser ingshendelser som antas å ligne de som danner moden TGF—pl og TGF-P2. TGF-<p>l/P2 forløperen har tre potensielle N-glykosyleringsseter i pro-domenen (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244). Studier omfattende TGF-pl har vist at N-glykosylering og fosforylering i pro-domenen til TGF-pl oppstår i transfekterte CHO-celler og dette impliserer at forløperen har en viktig funksjonell rolle i den cellulære syntesen og frigjøringen og utskillingen av det modne molekylet (Brunner et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:2229-2232). Tilstedeværelse av mannose-6-fosfat i TGF-pl forløperen understøtter også hypotesen om at forløperen har uavhengig funksjonell aktivitet (Purchio et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:14211-14215). På grunn av at den chimeriske TGF-<p>l/<p>2 forløperen inneholder simian TGF-pl pro-domenen antas det som sannsynlig at TGF-P1/P2 forløperen er funksjonelt aktiv og viktig for riktig prosessering av det modne TGF-P1/P2 molekylet. Evnen en vertscelle anvendt i ekspresjonssystemet har for riktig uttrykking og prosessering av chimerisk TGF-<p>l/P2 er viktig for produksjon av et modent, bioaktivt produkt.

I en spesifikk utførelsesform beskrevet heri blir moden, bioaktiv TGF-P1/P2 riktig produsert ved anvendelse av simian virus 40 (SV40) ekspresjonskontrol1-elementer i et kinesisk hamsterovarie (CHO) vertscellesystem. Derimot kan en mengde andre verts/ekspresjonsvektor-systemer fra dyr (dvs. vektorer som inneholder de nødvendige elementene for leding av replikasjon, transkripsjon og translasjon av TGF-P1/P2 kodende sekvens i en hensiktsmessig vertscelle) bli anvendt på lik linje av en fagmann. Disse omfatter, men er ikke begrenset til, virusekspresjonsvektor/pattedyrvertscelle-systemer (f.eks. cytomegalovirus, vaccinia-virus, adenovirus og lignende); insektvirus-ekspresjonsvektor/insektcelle-systemer (f.eks. baculovirus ); eller ikke-virale promoter-ekspresjonssystemer avledet fra genomet til pattedyrceller (f.eks. musemetallotionein-promoteren).

Ekspresjonselementene til disse vektorene varierer i styrke og spesifisitet. Avhengig av verts-/vektorsystemet anvendt kan et antall egnede transkripsjons- og translasjonselementer bli anvendt. Ved for eksempel kloning i pattedyrcellesystemer kan promotere isolert fra genomet til pattedyrcellene (f.eks. musemetallotionein-promoteren) eller fra virus som vokser i disse cellene (f.eks. vaccinia-virus 7,5 K promoter) bli anvendt. Promotere produsert av rekombinant DNA eller syntetiske teknikker kan også bli anvendt for å tilveiebringe transkripsjon av de innskutte sekvensene.

Spesifikke initieringssignaler er også nødvendige for tilstrekkelig translasjon av innskutte proteinkodende sekvenser. Disse signalene omfatter ATG-initieringskodonet og tilstøtende sekvenser. For eksempel i tilfeller hvor bare en del av den TGF-pi/32 kodende sekvensen blir innskutt må eksogene translasjonskontroll-signaler, innbefattende ATG-initieringskodonet bli tilveiebragt. Initieringskodonet må videre være i fase med leserammen til TGF-P1/P2 kodende sekvenser for å forsikre translasjon av hele innskudddet. De eksogene translasjonene kontrollsignalene og initierings-kodonene kan ha forskjellige opprinnelser og omfatter både naturlige og syntetiske. Effektiviteten av ekspresjonen kan forbedres ved å innbefatte attenueringssekvenser for transkripsjon, enhancer-elementer og lignende.

Metodene som er beskrevet for innskudd av DNA-fragmenter inn i en vektor kan bli anvendt for konstruksjon av ekspresjonsvektorer inneholdende TGF-P1/P2 kodende sekvenser og hensiktsmessige transkripsjonelle/translasjonelle kontroll-signaler. Disse metodene kan omfatte in vitro rekombinante DNA-teknikker, syntetiske teknikker og in vivo rekombi-nasjoner (genetisk rekombinasjon).

I tilfeller hvor et adenovirus blir anvendt som en ekspresjonsvektor kan TGF-P1/P2 kodende sekvensen bli ligert til et adenovirus transkripsjons-/translasjonskontroll-kompleks, f.eks. sen promoter og tripartitt-ledersekvensen. Dette chimeriske genet kan deretter bli skutt inn i adenovirus-genomet ved in vitro eller in vivo rekombinasjon. Innskudd i en ikke-essensiell region av det virale genomet (f.eks. region El eller E3) vil resultere i et rekombinant virus som er levedyktig og som kan uttrykke chimerisk TGF-P1/P2 i infiserte verter. På lignende måte kan vaccinia 7,5 K promoter bli anvendt.

Et alternativt ekspresjonssystem som kan bli anvendt for å uttrykke TGF-ei/32 er et insektsystem. I et slikt system blir Autographa californica nukleær polyhedrosis-virus (AcNPV) anvendt som en vektor for å uttrykke fremmede gener. Viruset vokser i Spodoptera frugiperda-celler. TGF-P1/P2 kodende sekvensen kan bli klonet inn i ikke-essensielle regioner (for eksempel polyhedrin-genet) til viruset og plassert under kontroll av en AcNPV-promoter (for eksempel polyhedrin-promoteren). Vellykket innskudd av TGF-P1/P2 kodende sekvensen vil resultere i inaktivering av polyhedrin-genet og produksjon av ikke-bekappede rekombiante virus (dvs. virus som mangler den proteinholdige kappen kodet av polyhedrin-genet). Disse rekombinante virusene blir deretter anvendt for å infisere Spodoptera frugiperda-celler hvori det innskutte genet blir uttrykt.

I tillegg kan en vertscelle-stamme bli valgt som modulerer ekspresjonen av de innskutte sekvensene, eller modifiserer og prosesserer genproduktet på den ønskede spesifikke måten. Ekspresjon fra visse promotere kan bli forhøyet i nærvær av visse indusere (f.eks. zink og kadmium-ioner for metallo-tionein-promotere). Derfor kan ekspresjon av genetisk omkonstruert TGF-<p>l/P2 bli kontrollert. Dette er viktig dersom proteinproduktet til det klonede fremmede genet er dødelig for vertscellene. Videre kan post-translasjonelle modifikasjoner så som glykosylering og prosesseringshendelser så s.om proteolytisk spaltning av proteinproduktene være viktig for funksjonaliteten til proteinet. Forskjellige vertsceller har karakteristiske og spesifikke mekanismer for post-translasjonell prosessering og modifikasjon av proteiner. Hensiktsmessige cellelinjer eller vertssystemer kan bli valgt for å forsikre korrekt modifikasjon og prosessering av det fremmede proteinet som blir uttrykt.

I en spesifikk utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir en ekspresjonsvektor inneholdende TGF-P1/P2 kodende sekvensen i tandem med muse-dihydrofolat-reduktasegenet (dhfr) under kontroll av SV40 regulatoriske sekvenser kontruert og anvendt for å transfektere dhfr-minus CHO-celler. CHO-transfektantene som uttrykker dhfr-fenotypen blir isolert ved propagering i selektivt medium. For å øke nivået av ekspresjonen av TGF-Pl/32 kan transfektantene bli utsatt for økende konsentrasjoner metotreksat for å isolere kloner som transkriberer amplifiserte nivåer TGF-P1/P2 mRNA. TGF-pl/32 mRNA nivåene kan bli analysert i forskjellige trinn av ampiifikasjonen ved oppløsnings-hybridisasjon (Uhler et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:1300-1304).

Identifikasjon av transfektanter som uttrykker chimerisk TGF- el/ P2

Vertsceller som inneholder TGF-<p>l/32 kodende sekvens og som uttrykker det biologisk aktive, modne produktet kan bli identifisert på minst fire generelle måter: (a) DNA-DNA hybridisering; (b) tilstedeværelse eller fravær av "markør"-genfunksjonene; (c) vurdering av transkripsjonsnivået, målt ved ekspresjon av TGF-P1/P2 mRNA transkripter i vertscellen; og (d) påvisning av det modne genproduktet målt ved immuno-analyse og ved biologiske aktiviteter.

I den første måten kan tilstedeværelse av TGF-P1/P2 kodende sekvens innskutt i ekpresjonsvektoren bli påvist ved DNA-DNA hybridisasjon ved anvendelse av prober omfattende nukleotidsekvenser som er homologe med TGF-pl/p2 kodende sekvensen vesentlig som vist i Fig. 1 eller deler eller derivater derav.

I en annen måte kan rekombinant ekspresjonsvektor/vertssystem bli identifisert og valgt basert på tilstedeværelse eller fravær av visse "markør" genfunksjoner (f.eks. tymidinkinase-aktivitet, resistens overfor antibiotika, resistens overfor metotreksat, fenotype med transformasjon, okklusjon-kropps-dannelse i baculovirus, osv.). Dersom for eksempel TGF-P1/P2 kodende sekvensen blir innskutt innenfor en markør-gensekvens til vektoren kan rekombinanter som er innbefattet i TGF-P1/P2 kodende sekvensen bli identifisert ved fravær av funksjonen til markørgenet. Alternativt kan et markørgen bli plassert i tandem med TGF-pl/p2 sekvensen under kontroll av den samme eller en annen promoter anvendt for å kontrollere ekspresjon av TGF-pl/P2 kodende sekvensen. Ekspresjon av markøren i respons til induksjon eller seleksjon tyder på ekspresjon av TGF-P1/P2 kodende sekvensen.

I en tredje måte kan transkripsjonen aktivitet for TGF-P1/P2 kodende regionen bli vurdert ved hybridiserings-analyser. For eksempel kan polyadenylert RNA bli isolert og analysert ved Northern blot ved anvendelse av en plrobe som er homolog med TGF-pl/P2 kodende sekvensen eller spesielle deler derav. Alternativt kan totale nukleinsyrer til vertscellen bli ekstrahert og analysert for hybridisasjon til slike prober.

I den fjerde måten kan ekspresjon av det modne proteinproduktet bli vurdert immunologisk, for eksempel ved Western blot, immunoanalyser så som immunoblotting, radioimmuno-presipitasjon, enzym-bundne analyser og lignende. Test for vellykket ekspresjonssystem omfatter påvisning av det biologisk aktive TGF-31/32 genproduktet. Når vertscellen utskiller genproduktet kan det cellefrie mediet tilveiebragt fra den dyrkede transfektant-vertscellen bli vurdert for TGF-31/32 aktivitet. Når genproduktet ikke blir utskilt kan cellelysatene bli analysert for slik aktivitet. I begge tilfeller kan biologiske analyser så som veksthemmende analyse beskrevet heri eller lignende bli anvendt.

Når en klon som produserer høye nivåer moden TGF-31/32 er identifisert kan klonen ekspanderes og TGF-31/32 kan bli renset ved anvendelse av velkjente teknikker. Slike metoder omfatter immunoaffinitets-rensning, kromatografiske metoder omfattende høy ytelse væskekromatografi (HPLC) og lignende.

Eksempel: Produksjon av TGF- 31/ 32 ved ekspresjon i kinesisk hamsterovarie- celler

Et rekombinant plasmid som koder for TGF-31 forløperen hvori aminosyrene 9, 10, 11, 12, 13, 17, 19, 25 og 26 i den modne TGF-31 sekvensen ble erstattet med de korresponderende aminosyrene til den modne TGF-32 sekvensen ble konstruert. Aminosyre 9 i moden TGF-31 (serin) ble erstattet med arginin, aminosyre nummer 10 (serin) ble erstattet med asparagin, aminosyre nummer 11 (treonin) ble erstattet med valin, aminosyre nummer 12 (glutaminsyre) ble erstattet av glutamin, aminosyre nummer 13 (lysin) ble erstattet av asparaginsyre, aminosyre nummer 17 (valin) ble erstattet med leucin, aminosyre nummer 19 (glutamin) ble erstattet med prolin, aminosyre nummer 25 (arginin) ble erstattet med lysin og aminosyre nummer 26 (lysin) ble erstattet med arginin. Konstruksjonen ble anvendt for å transfektere CHO-celler. Transfektanter som produserte og utskilte moden, bioaktiv, chimerisk TGF-31/32 ble isolert.

Materialer og metoder

DNA- transf eks. i oner

Omtrent 24 timer etter utsåing av IO<6> dhfr-minus CHO-celler på 100 mm skåler ble kulturene transfektert med 1 jjg Ndel linearisert p5<p>/dhfr plasmid og 19 jjg kalvetymus-DNA som bærer som et kalsiumf osfat-presipitat (Wigler, M. , et al., 1979,, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76 :1373:1376.):. 20 pg plasmid pluss bærer-DNA ble tilsatt til 1 ml 250 mM steril CaClg-DNA-oppløsningen (1 ml) ble dråpevis tilsatt til en 1 ml porsjon 2X HEPES-oppløsning (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM natriumfosfat, pH 7,1) med bobling og blandingen ble latt stå på is i 30 minutter. Presipitatet ble deretter dispergert dråpevis over cellene inneholdende 10 ml F12 media (Gibco). Etter inkubasjon ved 37° C i 4 timer ble mediet fjernet og erstattet med 10 ml F12 medium inneholdende 25% glycerol i 90 sekunder ved romtemperatur. Cellene ble skylt en gang med 20 ml F12 medium og inkubert i ikke-selektivt F12 medium (20 ml) i ytterligere 48 timer. Seleksjon for dhfr ut-trykkende transfektanter ble tilveiebragt ved erstatning av mediet med DMEM supplementert med 10$ dialysert FBS (Gibco) og 150 pg/ml L-prolin. Kolonier ble observert etter dyrking av cellene 10-14 dager i seleksjonsmediet.

Utskilling av metotreksat- resistente celler

Dihydrofolat reduktase (dhfr) amplifiserte celler ble avledet fra primære transfektanter hovedsakelig som beskrevet (Gasser, C.S. og Schimke, R.T., 1986, J. Biol. Chem. 261:6938-6946). Etter ekspansjon ble IO<5> celler sådd ut på 100 mm skåler og adaptert til økende konsentrasjoner metotreksat (100 nM; 500 nM; 2.500 nM; 10.000 nM; 20.000 nM). Den opprinnelige konsentrasjon av metotreksat var 100 nM. Platen inneholdende synlige kolonier ble trypsinert og adaptert til den konsentrasjonen av metotreksat i minst to ytterligere 1:5 cellerunder. Cellene (IO<5>) ble deretter sådd ut på 100 mm skåler i den nest høyeste konsentrasjonen metotreksat. Skålen inneholdende synlige kolonier ble igjen trypsinert og adaptert i medium inneholdende metotreksat. Cellene ble frosset tilbake i forskjellige trinn av ampiifikasjonen i medium inneholdende 40% FBS, 10 dimetylsulfoksid og 50% DMEM. Metotreksat ble ikke inkludert i frysemediet.

Veksthemmende analyse

Minklunge epiteliske celler, Mv 1 Lu (aksesjonsnummer CCL-64, American Type Culture Collection) som er ekstremt følsomme for TGF-p ble anvendt for veksthemmende analyse. Analysen ble utført ved anvendelse av tymidinanalog 5'-[<125>I]-iod-2'-deoksyuridin (<125>IdU) for å vurdere DNA-syntesen. En enhet aktivitet ble definert som mengden som er nødvendig for å hemme 50% inkorporering av ^^^ IdJ] sammenlignet med ube-handlede CCL-64 celler.

For å analysere transfekterte celler for utskilling av aktiv TGF-P1/P2 ble serum-frie supernatanter samlet fra en 24 timers kolleksjon av konfluente kulturer av celler og omfattende dialysert mot 0,2 M eddiksyre. Prøver ble fortynnet i sterile fullstendige kulturmedier for analyser.

Peptidsyntese og produksjon av antistoffer

Peptider ble syntetisert ved fastfase-teknikker på et Beckman 990 instrument og spaltet fra harpikset som tidligere beskrevet (Gentry, L.E., et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:11219-11228; Gentry, L.E. og Lawton, A., 1986, Virology 152:421-431). Rensingen ble tilveiebragt ved preparativ høy ytelse væskekromatografi (HPLC). Sammensetningen av peptidene ble bekreftet ved aminosyre-analyser.

Syntetiske peptider ble konjugert til bovint gammaglobulin gjennom cystein-residiet. Koblingsreaksjonene ble hovedsakelig utført som beskrevet (Gentry og Lawton, 1986, ovenfor). Effektivitetene til peptid-konjugatene varierte fra 8 til 26 peptidmolekyler kovalent bundet pr. molekyl gammaglobulin.

New Zealand hvite kaniner ble primet på tre til seks steder ved kombinert subkutane og intradermale inokulasjoner med peptidkonjugatene (100 pg ekvivalenter peptid) emulgert i Freunds fullstendige adjuvant. Booster-inokulasjoner ble administrert i 2-3 ukers intervaller. Tappinger ble utført 7—14 dager etter boostene.

Anti-peptid antistoffer rettet mot peptidsekvensene innenfor TGF-pl molekylet ble dannet i kaniner ved anvendelse av syntetiske peptider som immunogener (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427). Et av antistoffene (anti-TGF-pl369-381) var rettet mot epitoper tilstede i den modne formen av TGF-p vekstfaktoren. To andre antistoffer (anti-TGF-P<l>si_g4 og anti-TGF-<p>l225-236) er forløper-spesifikke og er rettet mot peptidsekvensene som bare er tilstede innenfor forløpermolekylet TGF-pl.

Immunoblotting

Proteinene ble separert på 7, 5%- 17, 5% gradient SDS-polyakryl-amidgeler og overført til umodifisert nitrocellulose (0,45 pm; Schleicher og Schuell) i 1 time ved 24 volt ved 4°C (Burnette, W.N., 1981, Alal. Biochem. 112:195-203). Bindings-kapasitet i overskudd på nitrocellulosen ble blokkert ved inkubasjon med 2,5$ BLOTTO (Johnson, D.A., et al., 1984, Gene Anal. Techn. 1:3-8) i fosfat-bufferet saltvann (PBS) inneholdende 0,2$ NP-40. Kanin anti-serum fortynnet 1:75 i 2,5$ BLOTTO ble inkubert med blokkerte nitrocellulose-ark i 2 timer ved romtemperatur. Etter at antistoff i overskudd ble vasket bort ved fem 5-minutt vaskinger i 2,5$ BLOTTO ble nitrocellulose-arkene inkubert med alkalisk fosfatase-konjugert Protein A fortynnet 1:500 i 2, 5% BLOTTO. Etter inkubasjon i to timer ble nitrocellulose-arkene vasket 5 ganger i PBS (5 minutt vaskinger) inneholdende 0, 2% NP-40 og utviklet (Leary et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80 :4045-4049 ).

Konstruksjon av plasmid som programmerer syntese av TGF- pl/ P2 Plasmid med programmering av syntesen av chimerisk TGF-P1/P2 protein, p5p/dhfr ble konstruert som følger. pAcPTGF-1 som er en baculovirus-vektor avledet fra pAc373 (Miyamoto et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:2860-2865; Madisen et al., 1987, Virology 158:248-250), som inneholder 1,4 Kb Pstl- EcoRI kodende sekvensen til TGF-pl (Sharples et .jai. , 1987, DNA 6:239-244) klonet inn i Pstl- EcoRI setet til pAc611 (Miyamoto et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:2860-2865; Madisen et al., 1987, Virology 158:248-250), ble spaltet med BamHI og EcoRI og 375 bp fragmentet til TGF-pl kodende sekvensen ble isolert (Fragment l). pSV2-pTGF (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427) ble spaltet med A_p_al og EcoRI og 3,5 Kb fragmentet ble isolert (Fragment 2).

Komplementære syntetiske oligonukleotider med sekvensene vist nedenfor ble syntetisert på en Applied Biosystems oligo-nukleotid-syntesemaskin og renset fra en akrylamidgel. Fosfater ble tilsatt med T4 kinase og ekvimolare mengder kinasebehandlede oligonukleotider ble smeltet sammen. Sammensmeltet dobbelt-trådet syntetiske DNA ble deretter ligert til fragmentene ' 1' og '2' beskrevet ovenfor. Ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli og 5ppSV2( Hpa~ Eco+) ble isolert.

5ppSV2( Hpa" Eco+) ble spaltet med EcoRI, fylt i med Klenow-enzym, spaltet med HindiII og 1,4 Kb fragmentet inneholdende

den chimeriske TGF-P1/P2 kodende sekvensen ble isolert (Fragment 3). 5<p>pSV2 ble konstruert ved ligering av Fragment 3 inn i pSV2,neo som tidligere var blitt spaltet med Hindlll og Hpal for å eliminere neo-genet.

5<p>pSV2 ble spaltet med EcoRI. fylt i med Klenow-enzym, spaltet med Ndel og 2,6 Kb Ndel- EcoRI (butt ^ f ragmentet ble isolert og ligert til pSV2/dhfr (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3718-3727) som var blitt spaltet med Ude I og PvuII. Ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere E. coli og p5<p>/dhfr ble isolert. Nukleotidet og de avledede aminosyre-sekvensene til chimerisk TGF-pl/32 molekylet kodet av p5p/dhfr er vist i Fig. 1.

Ekspresjon av TGF- P1/ P2 i CHO- celler

p5<p>/dhfr ble transfektert inn i CHO-celler og enkelte kolonier ble amplifisert med metotreksat som beskrevet ovenfor. En slik amplifisert klon, CH0-5P41, 2.5, ble valgt for ytterligere karakterisering.

CH0-5P41.2.5 cellene ble dyrket til konfluens i 2,5 pM metotreksat. Mediet ble erstattet med serum-fritt medium og etter 24 timer ble det samlet og dialysert i 48 timer mot 0,2 M eddiksyre. Dialyserte, kondisjonerte supernatanter ble analysert for bioaktivitet ved hemming av DNA-syntesen til CCL-64 cellene som beskrevet ovenfor. CH0-5<p>41,2.5 cellene utskilte omtrent 2 mg/L bioaktiv chimerisk TGF-P1/P2 (Fig. 2).

TGF-p relaterte proteiner utskilt av disse cellene ble analysert ved immunoblotting ved anvendelse av anti-peptid antistoffer rettet mot moden TGF-pl som beskrevet ovenfor. Fig. 3 viser at CH0-5P41.2.5 cellene utskilte immunoreaktive proteiner som migrerer ved 90 til 100 kilodalton og ved 24 kilodalton ifølge analyser ved SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser (Fig. 3, kolonne 1). 24 kilodalton-båndet representerer moden TGF-<p>l/<p>2 dimer og 90 til 100 kilodalton proteinet representerer sannsynligvis moden TGF-P1/P2 disulfid-bundet til forløpersekvenser (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427).

Under reduserende betingelser (Fig. 3, kolonne 2) migrerer hovedmengden av proteinene ved 12 kilodalton og dette representerer moden TGF-<p>l/32 monomer. Mangel på immuno-reaktivt materiale i 45 til 55 kilodalton-området observert i en lignende analyse av rekombinante proteiner uttrykt i CHO-celler transfektert med plasmider kodende for simian TGF-pl genet (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427) er å bemerke og dette tyder på at chimerisk TGF-P1/P2 blir proteolytisk prosessert mer effektivt enn foreldremolekylet TGF-pl. I tillegg utskiller CH0-5<p>41,2.5 cellene omtrent 2,5 ganger mer bioaktivt modent produkt enn CHO-cellene som uttrykker TGF-pl (Gentry et al., 1987, ovenfor). Til tross for at basisen for disse observasjonene for tiden er ukjent kan den sekundære strukturen til chimerisk TGF-P1/P2 for-løperen være betraktelig forskjellig fra den sekundære strukturen til TGF-pl, og den sekundære strukturen gjør at chimerisk TGF-P1/P2 blir utsatt for molekylære prosesseringshendelser med forskjellig intensitet eller natur. For eksempel kan TGF-P1/P2 forløperen være et mer ønskelig substrat for faktorer involvert i TGF-P prosessering. Alternativt kan sekundære strukturelle karaktertrekk til TGF—<p>l/<p>2 muliggjøre at den reagerer med andre prosesserings-faktorer eller veier som ikke er tilgjengelige for TGF-pl.

Deponering av mikroorganismer

Følgende transfektant er blitt deponert til American Type Culture Collection, Rockville, MD, og er blitt tildelt det angitte aksesjonsnummer.

Alle basepar og aminosyre-residienummere og størrelser angitt for nukleotider og peptider er omtrentlige og anvendt for å lette beskrivelsen.

Claims (13)

1. Nukleotidsekvens som koder for chimerisk transformerende vekstfaktor-<g>l/<p>2, karakterisert ved at den omfatter nukleotidkodende sekvensen angitt i Fig. 1 fra nukleotidresidie nummer 836 til nukleotidresidie nummer 1170.

2. Nukleotidsekvens kodende for chimerisk transformerende vekstfaktor-<g>l/<p>2-forløper, karakterisert ved at den omfatter nukleotidkodende sekvensen som angitt i Fig. 1 fra nukleotidresidie nummer 1 til nukleotidresidie nummer 1170.

3. Celle i stand til å uttrykke chimerisk TGF31/32, karakterisert ved at den inneholder en nukleotidkodende sekvens for chimerisk transformerende vekstfaktor-Bl/p2-forløper som angitt i Fig. 1 fra nukleotid nummer 1 til nukleotid nummer 1170, under kontroll av en annen nukleotidsekvens som regulerer genekspresjonen slik at cellen produserer chimerisk transformerende vekstfaktor-<p>l/32, og en kodende sekvens for en selekterbar markør som vertcellen mangler slik at vertcellen inneholdende den chimerisk transformerende vekst-faktor-pi/p2 kodende sekvensen kan bli identifisert.

4 . Celle ifølge krav 3, karakterisert ved at den omfatter en kinesisk hamsterovarie-celle.

5 . Celle ifølge krav 3,karakterisert ved at den andre nukleotidsekvensen som regulerer genekspresjonen omfatter en SV40-promoter.

6. Celle ifølge krav 3, karakterisert ved at den selekterbare markøren omfatter dihydrofolat reduktase.

7 . Celle ifølge krav 3, karakterisert ved at den omfatter CHO-5341,2.5 CL5 som deponert til American Type Culture Collection med aksesjons-nummer CRL 9959.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktiv chimerisk transformerende vekstfaktor-pl/p2, karakterisert ved at man: (a) dyrker en vertscelle inneholdende en nukleotidkodende sekvens for chimerisk transformerende vekstfaktor-pl/32-forløper, som angitt i Fig. 1 fra nukleotid nummer 1 til nukleotid nummer 1170, under kontroll av en annen nukleotidsekvens som regulerer gen-ekspres j onen , og i kombinasjon med en sekvens som koder for en selekterbar markør slik at peptid eller protein med chimerisk transformerende vekstfaktor-P1/P2 aktivitet blir produsert av vertscellen; og (b) utvinner chimerisk transformerende vekstfaktor-3l/<p>2 fra kulturen.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at vertscellen som anvendes omfatter en kinesisk hamsterovarie-celle.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at den andre nukleotidsekvensen som anvendes og som regulerer genekspresjon omfatter en SV40-promoter.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at den selekterbare markøren som anvendes omfatter dihydrofolat reduktase.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved, at man videre utsetter vertscellen .f or metotreksat slik at resistente kolonier som inneholder amplifiserte nivåer av den kodende sekvensen for dihydrofolat reduktase og chimerisk transformerende vekstfaktor-ei/32 blir valgt.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 8 for produsering av chimerisk transformerende vekstfaktor-gl/p2, karakterisert ved at man: (a) dyrker transfektant CH0-5g41,2.5 CL5, deponert til American Type Culture Collection og med aksesjons-nummer CRL 9959; (b) isolerer chimerisk transformerende vekstfaktor-gl/p2 fra kulturen.