HUT52550A - Process for production of a new, tgf-betha 1/betha 2 chimera betha transformating increasing factor - Google Patents

Description

AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

I

1. BEVEZETÉS

A találmány új, kiméra béta transzformáló növekedési fák* torral foglalkozik, amelyet TGF-^l^>2-nek nevezünk, foglalkozik továbbá: a TGF-^l/^>2-t ,kódoló nukleotid szekvenciákkal és kifejező vektorokkal, valamint a TGF-^>l/^>2 előállítására szolgáló eljárásokkal. A találmány példái egy kiméra TGF-^l/^>2 prekurzor gént kódoló kifejező vektorral átfertőzött CHO sejtek által végzett termeléssel és kiválasztással foglalkoznak. A kiméra gén termék a TGF-^ biológiai aktivitásával bír.

A találmányt a jobb megértés érdekében az alábbiak szerint rendszerezzük :

Bevezetés

A technika állása

2.1. A TGF-^1 intracelluláris feldolgozása A találmány rövid összefoglalása.

Az ábrák ismertetése

A találmány részletesebb leírása.

TGF-^1/^,2 kódoló szekvencia megalkotása.

TGF-^l/£>2 kódoló szekvenciát tartalmazó vektorok megalkotása.

TGFy!>l/^>2-t kifejező transzfektánsok azonosítása.

5.1

5.2.

5.3.

A kiméra

A kiméra kifej ező

A kiméra

6.

Példa: TGF-^1/^2 előállítása kínai hörcsög petefészek sejtekben történő kifejezéssel.

*

6.1. Anyagok és módszerek.

6.1.1. DNS átfertőzések.

6.1.2. A metotrexát-rezisztens sejtek kiválasztása.

6.1.3. Növekedés-gátiási vizsgálatok.

6.1.4. Peptid szintézis és antitestek előállítása.

6.1.5. Immunfolt-képzés.

6.1.6. A TGF-^l//>2 szintézisét programozó -plazmid megalkotása.

6.2. A TC-F-^1^>2 kifejeződése CHO sejtekben.

7. A mikroorganizmusok deponálása·

8. Szabadalmi igénypontok.

2. A TECHNIKA ÁLLÁSA

A béta transzformáló növekedési faktor /TGF-^/ a polipeptidek egy nemrég leirt családjának tagja, amely szabályozza a celluláris differenciációt és burjánzást. Ennek a családnak további tagjai között találjuk a Mullerian gátló anyagot [Cate és munkatársai: Cell 45, 685-698/198677 , az inhibineket

Qíason és munkatársai: Natúré 318. 659-663 /1985$ és egy, a /1987/J

A TGP-Anak eddig négy típusát azonosították,

TG?-^ -nek, TGF-/^- nek,. TGP-^'jf'ls TGP-^-nak első leirt típus, a TGP-^ két azonos, díszülfi ezeket nevezték el

Az karc solt séget tartalmazz, amelyek molekulatömege

13000 [Assoian /1983/; Prolik és munkatársai;#

Bioi. Chem. 260, 1O995-11OOO /19S4/J cent át[prolik és munkatársai * · » • · · a vérlemezkéket^Childs és munkatársai : Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79,5312-5316 /1982/ ; Assoian és munkatársai : J. Bioi · Cheri. 258,7155-7160 /1.983/J , a vesét ^Roberts és munkatársai : Biochemistry 22 , 5692-5698 / 1983 /J , és az ásványment esi tett csontot / Seyedin és munkatársai : Proc. Natl. Acad. Scii USA 82.,119-123 /1985/J. Humán ^Dérynék és munkatársai : Natúré 316 , 701-705 /1985/J, egér [jDerynck és munkatársai : J.Biol. Chem . 261,4377-4379 /1986/J és majom £sharples és munkatársai:DNA 6., 239-244 /1987/J TGF-^l-et kódoló cDNS kiónokat izolálták. Ezeknek a kiónoknak a DNS szekvenciaelemzése azt jelzi hogy a TGF-^A nagy prekurzor polipeptidként szintetizálódik, amelynek karboxi terminálisa lehasad, hogy az érett TGF-β- monomer termelődjék. Erős szekvencia homológiát találtak végig a TGF-^61 prekurzor fehérje mentén az összes fenti forrásból származó TGF-/J,! prekurzornál.

% szérum és epidermális növekedési faktor jelenlétében a TGF-^1 támogatja a normális patkányvese fibroblasztok rögzítéstől független növekedését [^Roberts és munkatársai : Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 78, 5339-5343 /1981/ ; Roberts és munka1982/ ; Twardzik és munkatársai

28, 289-297 /1985/J; egyedül 10 % szérum j eAKR-2B fibroblasztok telepképzétársai: Natúré 295, 417-419 /

J. Cell. Biochem; lenlétében ez képes indukálni sét ^Tucker és munkatársai: Cancer Rés. 43, 1518-1586 /1983/] _t

A TGF4j51-ről kimutatták, hpgy a patkányembrió - izom mezenhimális sejteknél differenciálódást idéz elő , és porc-fajlagos makromolekulákat termel [Jseyedin és munkatársai : J. Bioi. Chem. 261,5693-5695 / 1986/J

A sejtburjánzásra való hatásával ellentétben a humán vérι '· .··.’*· • · - · ♦ · .....· · lemezkékből tisztított TGF-^l-rol kimutatták, hogy gátolják bizonyos sejtek növekedéc-ét tenyészetben {Tucker és munkatársai

705-707 /1984$ . A TGF-£L-ről azt is kimutatták,

Science 226, hogy gátolja munkatársai, több humán rák sejtvonal növekedését [Róberts és Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 , 119-123 /198 5./J. A

TGF-/81-nek ez a gátló / stimuláló hatása számos tényez utal függhet, beleértve a sejt típusát és a sejtek fiziológiai állapctát [ezzel kapcsolatban lásd Sporn és munkatársai munkáját : Science 233, 532-534 /1985/].

A TGF-/>2 , a TGF-/Jl-hez hasonlóan, 25000 dalton tömegű polipeptid, amely két azonos, 13000 daltonos molekulamunkatársai : Cell 48,409-415 /1987/; Ikeda és munkatársai :

Biochemistry 26, 2405-2410 /1987$. A TGF-^P-t izolált ák á sv ány i anyagoktól mentesített szarvasmarha csontból £Seydin és munkatársai : J.Biol.Chem. 252 , 1946-1949 /1987$,sert·®8 óvárié ’ezkékbői [” Cheifetz és munkatársai : Cell 48, 409-415 /1987/ prosztata adenokarcinóma sejtvonalból [[ikeda

Biochemistry 25, 2405-2410 /1987/J, és humán gliosejtvonalból [Wrann és munkatársai : ELíBO 6., 16331635 /1987/]. Humán és majom TGF-^2-t kódoló cDNS kiónokat is izoláltak már [lladisen és munkatársai : D1TA 7,1-8 /1988/ ; 77 e

PC-3 humán kát ár sa.i :

e s mun* két nagyobb prekurzor polipeptid egyikéből hasad le, emel urekurzor polipeptidek roRRS-ei differenciált összefonód /”splicing”/ alakulhatnak ki β'/ebb és munkatársai : DnA 7, 493 ····

A TGF-y^l-nek és TGF-^2-nek 71 %-os aminosav szekvencia azo nossága van érett területeikben, és 41 %-os azonosságuk van prekurzor áj át c sak úgv t üni k erett

Acad a ;ol a^l β'2. alegységeket tartalmazza di szül fid- kötések! (Cheifetz és munkatársai : Cell 43, 409-415 /2 el összekötve

2.1

A TGF-ffL INTHAOELLULÁRTS FELDOLGOZÁSA prekurzor területének amino-része nagyfokú mutat [Deryncl ; Dérvnek ez:

el a rés ével jelentős b amelyek a ornak ez a

4379 ••sl 6 _ — - . >

CvJSharol es demonstrálj ' társul.

hogy a van, támogatj

J. υ ea vállaljo

V'.

Z.J z ri sónak rer tások prekurzor dimerizációj óhoz , vagy ezek azt sugallja, hogy a p.

kurzor erett társai sejten kívülre való szállításában (jPurchio és munJ.Biol.Chem. 263,14211-14215 /1988/J .

- r • ·

a. n?. ,j óra

Beszámoltak olyan anyag létezéséről, amely vagy

mák, vagy a feldolgozásban érdekelt köztes prekurzor komplex ^Gentry és munkatársai : Mól. Cell. Bioi. 8, 4162-4168 /1988/, nyomtatás alatt ; Gentry és munkatárséi : Mól. Cell. Bioi. 7, 3418-3427 /1987^. Ezek a tanulmányok feltárják, hogy az átfertőzőtt CHO sejtek által szintetizált TGF-^1 prekurzor tartalmazza a pro-TGF-βΙ -et, az érett TGFgól-et, és a prekurzor proterületét, egymás között diszulfid kötésekkel összekapcsolva. Ilyen diszulfiddal összekapcsolt prekurzor- komplexeket megfigyeltek a TGF-βΐ izolált látens formáiban is [^Miyazano és munkatársai : J. Cell. Biochem. Suppl. 12/k/ , 200 /1988/J 7/akefield és munkatársai : J.Biol.Chem. Suppl. 11/A/, 46 /1987/J .

Gentry és munkatársai [Gentry és munkatársai : Mól. Cell.

Bioi, 8, 4162-4168 /1988/ az alábbi reakció_jnenet et javasolják a pre-pro-TGF-/61 feldolgozásához átfertőzött CHO sejtekben. [A hivatkozott aminosav helyszámok a majom TGF-y31 publikált szekvenciájából valók, lásd Sharples és munkatársai :DNA 6., 239-244 /1987/J · A javasolt reakciómenet szerint az első lépés a szignál peptid lehasadása a Gl-y-2-9/Leu-30 peptidkötés között. Ez a hasitási esemény nagyon valószínűen a transzláci óval együtt történik a prekurzor átvitele során a durva endoplazmatikus retikulum membránon keresztül [Blobel és Dobberstein : J. Cell. Bioi. 67, 835-851 /1975/ ; 'Valter és munkatársai : Cell. 38, 5-8 /1984/J· A szignál pepiid lehasadását követően belső-/core/ glikozilező egységek Qtothnan és munkatársai ; Cell 15,1447-1454 /1978/j adódnak a pro-TGF-^l-hez • ···· • · ·· ·· a három jósolt N-glikozilező hely mindegyikénél, amelyek az dolgozód!

a Golgi apparátuson való áthaladás során, és igy egy foszforilezett glikoprotein tartalmú komplex, sziálozott oligoaz átvitel valamelyik fázisónál proteolitikus hasítás megy v s diszulfid-izomerizáció történik, amely érett badit fel

Egy másik nem régi tanulmányban raannóz-6-foszfátot azonofoszforilezett cukoranalóg, úgy tűnik, alapvető szerepet játszik a lizoszórnális enzimek célhoz irányuló szállít ásóban és intracelluláris cseréjében [von Figura, Ann. Rév. Biochem.

55,

167-193 /1985./] . Azonosítottak olyan fajlagos receptorokat gyö

IxO z

-(h nknt árε oc. Kati > A.

981/ ;

a TG?-£l prekurzor fát gyökei irányitjá

j.

ót?

í ir3n; itják elbontás céljából nevezett kin πennyi s Γ7 ρΙί Őt'Ó -^uo ~ · fej eze st szabályozó ve kt orokkal át xd értőzott rí ót ·:.

ne sav ~' kk

9 ~	□unkát a
ett	TGF-βΙ
eit	kódoló

-λ-.·.-- ·

19., 25 nukleotidókat olyan nukleotidokkal

TG?-fi2 szerkezet megfelelő aminosavait kódolják. A majom kodon alkalmazást fenntartjuk.

TGF-p 1/^2 pre urzort a 40. máj omvirus [^Simian

Vírus se a latt kódoló ki

Olyan és választanak ki r e ΰΰ sokszorozzál

Cl rj

1Ö szintjei k kondicionált savasitás bioaktiv 'c.

TG?·

Hasra nr oroteoliti vekedett feldől

AZ re anirosav szel· jelen ítél tel ál ók ···♦ i

Γ-α··?

♦ ¹ · *

Ι·:;:;·· '· ..·

TGF-β szerkezet amino-terminálís tartományában

RA otid és következtetett aninosavsze.kver.ciája rm-azó kondicionált időköze·;

kondicionált szérummentes tápközeget 24 órán át dialízáljuk 0,2 ,_’v

VJ.

Standard növekedésgát1 be TGF-^l-hez.

n

RA .Az 5/41,2.5 sej jtek ál

V;

redukáló körülmények /2.esik/ között anti TGV-ől.,,-* ’jyel, amint ezt a későbbiekben, a 6.1 fokkal.

.:10-^1/^2 pre.kurzort kódoló nukleotid szekvenci

2J?-/)1//? előállítására vonatkozik rekombináns

A TGF-y&l/^2, amely új kiméra béta transzformáló növekedési faktor, biológiailag aktív a TGF-/31 bioaktivitás méréséhez alkalmazott standard vizsgálatban és imr.iunre aktív a TGF-$1 fajlagos anti testekkel. Egy kínéra, amely szerkezetileg tartalmazza a TGF-/71 TGF-/2 kombinációját, vagyis a találmány szerinti TGF-/?1^2 _r va lószinüleg a biológiai aktivitások új készletét hordozza, amelyek ··· ·♦·# közül néhány hasonló vagy közel azonos lehet azokkal, amelyeket szülő-molekulái mutatnak, mig mások egyedileg jellemzőek lehet nek a TGF-'^l/^2-re. Azokkal a bioaktivitásokkal kapcsolatban , amelyek hasonlók vagy közel azonosak a TGF-/31 vagy TGFy?2 bioaktivitásaival, ez a faktor hatásosabb eszközöket nyújthat a megfelelő biológiai válaszok indukálásóban, használata ennek megfelelően kívánatos változás a TGF-/^l-hez és TGFy22-hez viszonyítva különböző orvosi alkalmazásokban, amelyek TGF-^-kat igényelnek. Az ilyen alkalmazások közt találjuk /de nem csak ezekre korlátozódnak / a sejtburjánzás é^Éifferenciálódás indukálását vagy meggyorsítását, és a sejtosztódás gátlását. így a TGF-^1/^2 alkalmazást nyerhet pl. a rák kezelésében vagy a sebgyógyulás elősegítésében.

A találmány szerinti eljárás az alábbi stádiumokra oszthat tó a leírás jobb megértése céljából : /a/ a TGF-/ÍL //$2 prekurzor kódoló szekvenciájának kialakítása ; /b/ olyan kifejező vektor megalkotása, amely irányítja a TG?-/fL^2 kódoló szekvencia kifejeződését; /c/ megfelelő gazdase.jtek átfertőzése, ame lyek képesek replikáiédósra, a gén kifejezésére és a géntermék feldolgozására /'’processing ”/, hogy, a JPGP-y^L/^2 és/ vagy a TGF^>1/(62 prekurzorok érett formáját termeljék; és /d/ a TGP-/21/A2 prekurzor és az érett, bjclógiailag aktív TGF-^1/^2 azonosítása és tisztítása.

Amikor egy transzfektánsról megállapítottuk, hogy magas szinten fejez ki TGF-^>l//í>2 prekurzort és /vagy érett TGF-/l/^2-t_z a jelen találmány eljárásának gyakorlati kivitelezése magában foglalja ennek a kiónnak a szaporítását és a kifejezett géntermék elkülönítését.

···· ···

A jelen találmány szerinti eljárást itt olyan példák segítségével mutatjuk ki, amelyben ajtáajom TGF-^1 prekurzor cDNS-t [sharples és munkatársai : DNS 6_, 239-2 44 /1987/] úgy módosítjuk, hogy az érett majom TGF-yll szekvencia 9-13», 17·, 19. , 2 5. és 26. számú aminosavgyökeit kódoló nukleotidokat olyan nukleotidokká változtatjuk, amelyek az érett TGF-^2 szerkezetben levő megfelelő aminosavakat kódolják, miközben a majom kodon felhasználás fennmarad. Az igy létrejövő kiméra TGF-^1/^2 prekurzor kódoló szekvenciát azutáa olyan kifejező vektorok megalkotására használjuk fel, amelyek képesek az érett TGF-/^1^42termék szintézisének irányítására.

A jelen találmány szerinti eljárás különböző szempontjait a későbbi alfejezetekben és az azt követő példákban részletesebben leírjuk.

5.1. A KIMÉRA TGF-^1/^2 KÓDOLÓ SZEKVENCIA KIALAKÍTÁSA

A kiméra TGF-Á1//12 nukleotid kódoló--szekvenciáját az 1.ábrában mutatjuk be. A jelen találmány eljárása gyakorlati kivitelezésében ezt a nukleotid szekvenciát vagy funkcionális ekvivalensét alkalmazhatjuk olyan rekombináns molekulát kialakítására, amelyek irányítják a TGF-^1/^2 termék kifejezését. A nukleotid kódoló szekvenciák degenerációja következtében az 1. ábrában bemutatott DNS szekvenciától eltérő DNS szekvenciákat is alkalmaz hatunk a jelen találmány gyakorlati kivitelezésében. Az 1.

nukleotid szekvenciájához képest történő változások között juk a kihagyásokat / deléció /, hozzáadásokat / addició / ábra találvagy eltérő nukleotidokkal történő helyettesítést, ahol ezek a válto zások olyan szekvenciát eredményeznek, amely<-j ugyanolyan vagy funkcionálisan ekvivalens génterméket kódol. A géntermék tartHí·· ··*· _β·· ···· ν««· : . ·. ··· · .· ··· .*· · · * -*

- 13 ·· mazhat kihagyásokat, hozzáadásojcat vagy helyettesítéseket az aminosavgyökökben egy adott szekvencián belül, amelyek csak csendes” változásokat eredményeznek, igy bioaktiv termék kép^.. ződik. Az ilyen aminosav-helyettesitéseket elvégezhetjük a szóban forgó gyökök hasonlósága alapján polaritásban, töltésben, oldhatóságban, hidrofobicitásban, hidrofilicitásban és / vagy amfipatikus természetben. így pl. a negatívan töltött aminosavak közt találjuk az aszparaginsavat és glutaminsavat ; a pozitívan töltött aminosavak közt találjuk a lizint és arginint ; azok között az aminosavak között, amelyek töltetlen dipoláris főcsoportokat vagy nem poláris főcsoportokat tartalmaznak azonos hidrofilicitási értékekkel, találjuk az alábbiakat :

leucin, izoleucin, valin, glicin, alanin, aszparagin, glutamin szerin, treonin, fenil-alanin, tirozin.

A majom TGF-/J1 nukleotid szekvenciáját majomsejt forrásokból kaphatjuk meg [^Sharples és munkatársai : DNA 6., 239244 /1989/J. Az 1. ábrában levő kiméra TGF-fil/£2 nukleotidszekvenciáját a szakterületen ismert eljárásokkal állíthatjuk elő, ide számítva, de nemcsak ezekre korlátozva, a DNS restrikciós enzimek, szintetikus oligonukleotidok és. DNS ligázok használatát

Bgy másik eljárás szerint az 1 ábra kódoló szekvenciáját részben vagy egészben szintetizálhatjuk a szakterületen jól ismert kémiai eljárásokat alkalmazva.

A jelen találmány egyik speciális kiviteli módjában a majom TGF-^l-et kódoló szekvenciát egy afrikai zöld majom sejtvonalból, a BSC-4O sej tvonalból [^Sharples és munkatársai, fentebb idézett munka /1987/] kapott teljes hosszúságú cDNS kiónból kapjuk. A kiméra TG?-^l/^2 1.ábrában ábrázolt kódoló szekvenciáját

- 14 Λ 2* t

azután a majom TGF-βΐ cDNS-ből eredeztetjük az éyett TGFytL molekula 9., 10., 11., 12., 13., 17., 19., 25., és 26., számú aminosavait kódoló szekvenciák eltávolításával és az érett TGFyí2 molekula £Madisen ésmunkatársai : DIJA 2» 1-8 /1988/J 9., 10., 11., 12., 13., 17., 19., 25., és 26., számú aminosavait kódoló szekvenciákkal való helyettesítésével gén-konstrukciós technikákat alkalmazva.

5.2. A KIMÉRA TGF-^l//j»2 KÓDOLÓ SZEKVENCIÁT TARTALMAZÓ KIFEJEZŐ VEKTOROK MEGALKOTÁSA

Abból a célból, hogy biológiailag aktív, érett 5?GF-/l/^2-t fejezzünk ki, olyan kifejező- vektor / gazdaszervezet rendszert kell kiválasztanunk, amely nem csupán a transzkripció és transzláció magas szintjét biztosítja, hanem a géntermék korrekt feldolgozását is. Ez különösen akkor fontos, amikor a kiméra TGFpi/^>2 prekurzor teljes kódoló szekvenciáját biztosítjuk a kife& jező konstrukcióban, mivel a TGF-/^l-hez és -a TGF-/^2-höz viszonyítva az érett kiméra TGF-^l/^-ről is úgy véljük, hogy egy prekurzor molekulából vagy molekulák komplexumából bocsátódik ki celluláris feldolgozási folyamatok segítségével. Ezen kívül egy olyan kifejező / gazdasejt rendszer kívánatos, amely a termék kiválasztódását / szekrécióját/biztositja.

Úgy tűnik, hogy az érett TGF-/?l/^2 egy diszulfiddal összekapcsolt alegységenként 112 aminosavas homodimer, amely celluláris feldolgozással keletkezik, amely feldolgozásról úgy véljük,hogy hasonló azokhoz, amelyek az érett TGF-^i-et és TGF-^2-t alakítják ki. A TGlMl/^2 prekurzornak három potenciális N-glikozilezési helye van pro-tartományában ^Sharples és munkatársai DNA 6, 239-244 /1987/J.

*4»

A TGF-^l-gyel kapcsolatos tanulmányok azt határozzák meg, hogy az

N-glikozilezés és a foszforilezés a TGF-^>1 pro-tartoraányában átfertőzött CHO sejtekben megy végbe, alátámasztva a prekurzor fontos funkcionális szerepét a celluláris szintézisben és az érett mole- .

kula kibocsátásában vagy szekréciójában [Jirunner és munkatársai :

Hol

Cell. Bioi. 8, 2229-2232 /1988/J . A nannóz-6-főszfát jelenléte a a prekurzornak független funkcionális aktivitása van [purchio és munkatársai : J. Bioi. Cheri. 263. 14211-14215 /1988/J . Mivel a kifunkcionálisan aktiv és fontos az érett TGF-^1/^2 molekula korrekt nek az a képessége hogy korrekt módon fejezi ki és dolgozza fel a kiméra TGF-^l/^2-t előállításához.

fontos egy érett, biológiailag aktiv termék speciális kiviteli módban sikeresen állítunk elő érett, biológiailag aktiv TGF-βΐ/β 2-t 40. majom vírus /SV40/ kifejezést szabályozó elemekkel kínai hörcsög petefészek /CHO/ gazdasejt rendszerben. Egy sor más-állati gazdaszervezet/ kifejező vektor rendszert/ azaz olyan vektorokat, amelyek a TGF-fll^>2 replikációjának, transzkripciójának és transzlációján gy megfelelő jazdasejtben való irányításához szükséges elemeket tartalmazzák/ <*s 'O korlátozódik/ a vírus kifejező vektor /emlős gazdasejt rendszerek

- 16 rovar-virus kifejező vektor / rovarsejt rendszerek /pl. Baculovirus /; vagy emlős sejtek genomjaiból származó nem-virus promoter kifejező rendszerek /pl. egér metallotionein promoter /.

Ezeknek a vektoroknak a kifejező elemei váltakozók erősségükben és fajlagosságukban. Az alkalmazott gazdaszervezet / vektor rendszertől függően egy sor alkalmas transzkripciós és transzlációs elem bármelyike alkalmazható. így pl. amikor emlős sejt-rendszerekben klónozunk, az emlős sejtek genomjából izolált promotorokat /pl. egér met®llotionein promotort / vagy ezekben a sejtekben növekedni képes vírusokból izolált promotorokat /pl. Vaccinia vírus 7,5 K promotor/ alkalmazhatunk. Alkalmazhatunk rekombináns DNS technikával vagy szintetikus technikákkal előállított promotorokat is, hogy a beiktatott szekvenciák átírásához rendelkezésre álljanak.

Szükségesek speciális iniciációs szignálok is a beiktatott kódoló szekvenciák megfelelő transzlációjához. Ezek között a szignálok között találjuk az ATG iniciációs kodont és szomszédos szekvenciákat. így pl. abban az esetben, amikor a TGF-/íl^Z2 kódoló szekvenciának csak egy részét iktatjuk be, ezogén transzlációs kontroll szignálokat, beleértve az ATG iniciációs kodont, is kell szolgáltatnunk. Ezen kívül az iniciációs kodonnak fázisban kell lennie a T^F-/ol^l>2 kódoló szekvenciák leolvasó keretével, hogy biztosítsuk a teljes beiktatás transzlációját. Ezek az ezogén- transzlációs kontroll - szignálok iniciációs kodonak sokféle eredetűek lehetnek, mind természetesek, mind szintetikusak. A kifejezés hatékonysága fokozható átírást gyengítő szekvenciák, fokozó elemek, stb beékelésével.

- 17.A korábban a DNS fragmentumoknak valamely vektorba való be iktatásához leirt eljárásnak bármelyiket alkalmazhatjuk, hogy TGF-/^l/^2 kódoló szekvenciát és megfelelő transzkripciós /transzlációs kontroll szignálokat tartalmazó kifejező vektorokat alkossunk meg. Ezek az eljárások magukban foglalhatják az in vitro rekombináns DNS technikákat, szintetikus technikákat, és in vivő rekombinációkat / genetikai rekombinációk /.

Azokban az esetekben, ahol kifejező vektorként valamely adenovirust alkalmazunk, a TGF-AL//22 kódoló szekvenciát egy adenovirus transzkripciós / transzlációs kontroll komplexhez, pl. a késői' promotorhoz és háromrészes vezető szekvenciához ligálhatjuk. Ezt a kiméra gént iktathatjuk be azután az adenovirus genomba in vitro vagy in vivő rekombinációval. A beiktatás a virus-genom nem esszenciális területébe /pl. El vagy E3 terület/ egy olyan rekombináns vírust eredményez, amely életképes és képes kiméra TGF-^1/^2 kifejezésére fertőzött gazdaszervezetben. Hasonlóképpen alkalmazhatjuk a Vaccinia 7,5 K- proiaotoft is.

Egy másik megoldást jelentő kifejező rendszer, amelyet TGF^l//i2 kifejezésére alkalmazhatunk, valamely rovar rendszer. Az egyik ilyen rendszerben Autographa-ealif-ornica nukleáris polihedrózis vírust / AcNPV / alkalmazunk vektorként idegen gének ki fejezésére. A vírus növekszik Spodoptera frugiperda sejteken

A TGF-^1/^2 kódoló szekvenciát klónozhatjuk a vírus ciális területeibe nem esszen/pl. a polihedrin génbe/ és egy AcNPV promotor / szabályozása alá

TGF-^1/^2 kódoló szekvencia sikeres beiktatása rekombináns vírus /pl. olyan vírus, / pl. a polihedrin promotor helyezhetjük. A ' _z , VHoi3 inaktiválása? es nem-bezárt a polihedrin gén amelyről a polihedrin gén által kódéit fehérjeszerü burkolat hiányzik / keletkezéséhez vezet. Ezeket a rekombináns vírusokat alkalmazzuk azután Spodoptera frugiperda sejtek fertőzésére, amelyekben a beiktatott gén kifejeződik.

Ezen kívül olyan gazdasejt-törzset választhatunk, amely módosítja a beiktatott szekvenciák kifejeződését, vagy módosítja és feldolgozza a génterméket a kívánt speciális módon. A kifejeződést bizonyos promotorokkal növelhetjük bizonyos induktorok jelenlétében /pl. cink- és kadmium - ionok metallotionein promotorokhoz kifej eződéEnnek megfelelően a genetikailag manipulált TG sét szabályozni lehet. Ez fontos akkor, ha a klónozott idegen gén fehérje-terméke letális/a gazdasejtre. Ezen kívül transzláció utáni módosítások, pl. glikozilezés, és feldolgozási események, pl. fehérje-termékek proteolitikus hasítása is fontosak lehetnek

fajlagos mechanizmusokkal bírnak a fehérjék transzláció utáni feldolgozásához. Megfelelő sejtvonalakat vagy gazdaszervezeteket választhatunk abból a célból, hogy biztosítsuk a kifejezett idegen fehérje korrekt módosítását és feldolgozását.

A jelen találmány egyik speciális kiviteli módjában olyan olyan kifejező vektort alkothatunk meg, amely a TGB-f2>l//>2 szekvenciát az egér dihidrofolát reduktáz génnel /dhfr/ tandem / egymás utáni / elrendezésben tartalmazza az SV4O szabályozó szekvenciák ellenőrzése alatt, és ezt a vektort dhfr-hiányos CHO sejtek átfertőzésére alkalmazzuk. A dhfr fenotipust kifejező CHO transzfektánsokat szelektív tápközegben való szaporítással izoláljuk. Abból a célból, hogy a TGF-jg//^2 kifejeződés szintjét növeljük, a transzfektánsokat metotrexát növekvő koncentrációinak

- 19 vetjük alá abból a célból, hogy TGFy! 1^4>2 mRNS sokszorozott szintjeit átíró kiónokat izoláljunk. Mérhetjük a TGFyá'l/_/Á2 mRNS

lássál £ Uhler és munkatársai : Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 , 1300-1304 /1986/J.

5.3. A KIMÉRA TGF-fa/^»2-T KIFEJEZŐ TRANSZFEKTÁNSOK AZONOSÍTÁSA

Azokat a gazdasejteket, amelyek tartalmazzák a TGF-^1^42 kódoló szekvenciákat és amelyek kifejezik a biológiailag aktív, érett terméket, legalább négy általános megközelítéssel azonosíthatjuk : /a/ DNS-DNS hibridizálás ; /b/ marker” gén funkciók jelenléte vagy távolléte ; /c/ a transzkripció szintjének becslése, ahogyan a TGF-/sl//l2 mRNS átiratok kifejeződésével mérjük a gazdasejtben ; és /d/ az érett géntermék kimutatása, amint ezt iromunoassay-val mérjük, és végül biológiai aktivitásával is azonosíthatjuk.

Az első megközelítésben a kifejező vektorba beiktatott TGFβ1/^>2 kódoló szekvencia jelenlétét DNS-DNS hibridizálásfial mutathatjuk ki vizsgáló mintákat alkalmazva, amelyek olyan nukleotid szekvenciákat tartalmaznak, amelyek, homológok lényegében az 1.ábrában bemutatott TGF kodolo szekvenciához vagy ennek részeihez vagy származékaihoz.

A második megközelítésben a rekombináns kifejező vektor / gazdaszervezet rendszert bizonyos marker gén funkciók /pl. timidin kináz aktivitás, rezisztencia antibiotikumokra, reziszten cia metotrexátra, transzformációs fenotipus, burkoló test képző dés baculovirusban, stb./ jelenlétére vagy távollétére alapozva azonosíthatjuk és szelektálhatjuk. Igy pl. ha a TGF-/11//12 kódoló

- 20 szekvenciát beiktatjuk a vektor egy marker génjén belül, a TGF¢.1/^2 kódoló szekvenciát tartalmazó rekombinánsokat a marker gén funkció távollétével azonosíthatjuk.

Egy másik eljárás sze« rint egy marker gént tandem elrendezésben helyezhetünk el a TGF β>1/β»2 szekvenciával a TGF-/^l/^2 kódoló szekvencia kifejeződésének szabályozásakor alkalmazott promotorral azonos vagy attól -y különböző proraotor szabályozása alatt . A marker kifejeződése az indukcióra vagy szelekcióra adott válaszban jelzi a TGF-y^L/^2 kódoló szekvencia kifejeződését.

A harmadik megközelítésben a TGF-β-Ι/β 2 kódoló terület transzkripciós aktivitását hibridizációs vizsgálatokkal becsüljük meg. így pl· poliadenilezett RNS-t izolálhatunk és elemezhetünk Nort hern folt elemzéssel , olyan vizsgáló mintát alkalmazva, amely homológ a TGF-^1/^.2 kódoló szekvenciával vagy adott részeivel. Egy másik eljárás szerint a gazdasejt összes nukleinsavait kivon hatjuk és átvizsgálhatjuk hibridizálásra ilyen vizsgáló mintákhoz.

A negyedik megközelítésben afc, érett fehérje-térmék kifejeződését immunoiógiailag becsülhetjük meg, pl. Western-foltképzés-sel, immunoassayval, pl. immunfoltképzéssel, radio-immunkicsapással, enzimmel kapcsolt immunassayval, stb. A kifejező rendszer sikerének végső vizsgálata azonban magában foglalja a biológiailag aktív TGF-Al/^2 géntermék kimutatását. Amikor a gazdasejt kiválasztja a génterméket, a tenyésztett transzfektáns gazdasejtből kapott sejtmentes tápközeget vizsgálhatjuk meg TGF-/^l/^2 aktivitásra. Amikor nem választódik ki a géntermék, sejtlizátumokat vizsgálhatunk ilyen aktivitásra. Bármelyik esetben biológiai vizsgálatokat alkalmazhatunk, pl. az itt leirt növekedésgátlási vizsgálatokat vagy hasonlókat.

Amikor azonosítottunk egy érett TGF-/íl/^2-t magas szinten termelő kiónt, ezt a kiónt szaporíthatjuk és a TGF-^l//s 2-t tisztíthatjuk a szakterületen jól ismert technikákat alkalmazva. Az ilyen eljárások közt találjuk az immunaffinitásos tisztítást, a kromatográfiás eljárásokat, beleértve a nagy teljesítményű folya dekkromatográfiát és hasonlókat.

6. PÉLDA: TGF-M/p>2ELŐÁLLÍTÁSA KÍNAI HÖRCSÖG PETEFÉSZEK

SEJTEKBEN TÖRTÉNŐ KIFEJEZÉSSEL

Megalkotunk egy TGF-pl^prekurzort, amelyben az érett TGF-/21 szekvencia 9., 10., 11., 12., 13., 17., 19., 25., és 26., amino savai az érett TGF-^2 szekvencia megfelelő aminosavaival vannak helyettesítve, kódoló rekombináns plazmidot. Pontosabban az érett TGF-(S1 9 .ami no savat /szerin/ argininnel helyettesítjük, lO.aai/ / nosavat /szerin/ aszparaginnel helyettesítjük, 11.aminosavat /treonin/ valinnal helyettesítjük, 12.aminosavat /glütaáinsav / glu / taminnal helyettesítjük, 13·aminosavat /lizin / aszparaginsawal /

helyettesítjük, 17.aminosavat /valin/ leucinnal helyettesítjük, 19 .aminosavat /glutamin/ prolinnal helyettesítjük, 25.aminosavat /arginin/ lizinnel helyettesítjük és 26.aminosavat /lizin/ argi ninnel helyettesítjük. Ezt a konstrukciót CHO sejtek átfertőzésére alkalmazzuk. Izoláljuk azokat a transzfektánsokat, amelyek é rett, biológiailag aktív, kiméra TGF-/^1^2-t termelnek és válasz tanak ki.

6.1. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

6.1.1. DNS ÁTFERTŐZÉSEK

Mintegy 24 órával azután, hogy 10 dhfr- hiányos CHO sejtet 100 mm-es lemezekre oltottunk, a tenyészeteket átfertőzzük 1 yfyg, Ndel-gyel linearizált p5^»/dhfr plazmiddal és hordozóként 19/<-g

- 22 borjú timusz DNS-sel, az átfertőzést kalcium^oszfátos csapadékként végezve [Wigler M. és munkatársai : Proc. Natl. Acad. Sci . USA 76, 1373-1376 /1979/J . Röviden ismertetve 20/^ plazmid +<? hordozó DNS-t adunk ml 250 mmól / literes steril CaClj- hoz. A DNS oldatot / 1 ml / cseppekként hozzáadjuk 2 x HEPES oldat /280 mmól / 1 NaCl, 50 mmól /1 HEPES, 1,5 mól / 1 nátrium-foszfát, pH 7,1/ 1 ml-es részletéhez buborékoltatás közben, majd jégen hagyjuk ülepedni 30 percen át. A csapadékot azután cseppenként diszpergáljúk a 10 ml Pl 2 tápközegben / Gibco / levő sejtekre. 37° C hőmérsékleten 4 órán át végzett inkubálás után a tápközeget eltávolítjuk és 10 ml olyan F12 tápközeggel helyettesítjük, amely 25% glicerint is tartalmaz, és ebben hagyjuk állni 90 másodpercen át szobahőmérsékleten. A sejteket egyszer Öblítjük 20 ml F12 tápközeggel, majd további 48 órán át inkubáljuk nem szelektív F12 tápközegben / 20 ml/. A szelektálást a dhfr-t kifejező transzfektánsokra úgy hajtjuk végre, hogy a tápközeget 10 % dializált FBS-sel /borjuembrió—szérum, GIBCO / és 150j'ts/iAL L-prolinnal kiegészített tápközeggel helyettesítjük. A sejtek tenyésztésének 10-14. napja után figyelünk meg telepeket a szelekciós tápközegben.

6.1.2. A METOTREKÁT-REZISZTENS SEJTEK KIVÁLASZTÁSA Dihidrofolát reduktázzal /dhfr/ sokszorozott sejtek származnak a primer transzfektánsokból lényegében úgy, ahogyan ezt már korábban leírták [Gasser C. S. és Schimke R. T. : J. Bioi. Chem. 261,6938-6946 /1986/J. Szaporítás után 10⁹ sejtet oltunk 100 mm-es lemezekre és adaptáljuk metotrexát növekvő koncentrációihoz / 100 nmól/1; 500 nmól/1; 2500 nmól/1 ; 1000Ό nmól/1 ; 20000 nmól/1 /.

V »·»· ·· ·*·· ··*· • · > · · · ·

- 23 A metotrexát kiindulási koncentrációja 100 nmól/1. A látható telepeket tartalmazó lemezeket'tripszinezzük és metotrexát adott koncentrációjához adaptáljuk legalább két további 1:5 paszszálassal. Ezután sejteket /10 / oltunk 100 mra-es lemezekre, amelyek metotrexát következő legmagasabb koncentrációját tartalmazzák. A látható telepeket tartalmazó lemezeket ismét tripszinezzük és adaptáljuk metotrexátot tartalmazó tápközegben. A sokszorozás különböző stádiumainál sejteket fagyasztunk vissza 4o % FBS-t, 10 % dinetil-szülfoxidót és 50 % DMEM-et tartalmazó tápközegben. A fagyasztó tápközeg metotrexátot nem tartalmaz.

6.1.3. NÖVEKEDÉS-GÁTLÁSI VIZSGÁLATOK

Mv 1 Lu nyérc-tüdő epitéliális sejteket / CCL-64 deponálási szám , Araerican Type Culture Collection /, amelyek különösen érzékenyek TGF-/£-ra, alkalmazunk a növekedés-gátlási vizsgálatokhoz. A vizsgálatot az 5^lj“jód-2’-dezoxi-uridin tinidin analógot alkalmazva hajtjuk végre, hogy felbecsüljük a DNS szintézist. Az aktivitás egy egységét úgy határozzuk meg, mint azt a mennyiséget, amely a I’dU beépülésének 50 %-os gátlásához szükséges a kezeletL<n CCL-64 sejtekkel összehasonlítva.

Abból a célból, hogy az aktiv -TGF-^-l/^2 kiválasztására megvizsgáljuk az átfertőzött sejteket, szérűimértes felüluszókat gyűjtünk sejtek összefolyó tenyészetein levő 24 órás gyűjteményéből és erőteljesen dializáljuk 0,2 mól/literes ecetsav ellen. A vizsgálathoz a mintákat steril teljes tenyésztő tápközeggel hígítjuk.

6.1.4. PEPTID SZINTÉZIS ÉS ANTITESTEK ELŐÁLLÍTÁSA Peptideket szintetizálunk szilárd fázisú technikákkal Beck- nan 990 készüléken, és lehasitjuk a gyantáról, amint ezt korábban

- 24 már leírták fGentry L* E. és munkatársai : J. Bioi. Chem. 253, 11219 -11228 /1983/ ; Gentry L. E. és Lawton A. : Virology 152, 421 - 431 /1986/J. Tisztítást végzünk preparativ nagyteljesítményű folyadék-kromatográfiával. A peptidek összetételét aminosav elemzéssel igazoljuk.

Szintetikus peptideket konjugálunk szarvasmarha gamma-globulinhoz a cisztein gyökön keresztül. A kapcsolási reakciókat lényegében úgy hajtjuk végre, amint ezt korábban már leírták £Gentry és Lawton, fentebb idézett munka /1986/1. A peptid konjugálások hatékonysága 8-26 kovalensen kötött peptid molekula közti tartományban van gamma-globulin molekulánként.

Uj-zélandi fehér nyulakat oltunk három-hat kombinált szubkután intradermális inokulálással a Freund-féle komplett adjuvánsban emuigeált peptid-konjugátummal / 100jug pepiiddel ekvivalens mennyiségben /. 2-3 hetes időközönként emlékeztető oltásokat adunk. Az emlékeztető oltások után 7-14 nappal vérmintákat veszünk.

A TGF-^1 molekulán belüli peptid szekvenciákra irányuló antipeptid antitesteket alakítunk ki nyulakban, immunogénként szintetikus peptideket alkalmazva ^Gentry és munkatársai : Hol. Cell. Bioi. 7, 3418 - 3427 / 1987 /J . Az antitestek egyike /anti-TGF/^369-381/ ^a ^^Z^övekedési faktor érett formáján belül jelenlevő epitópok ellen irányul. A másik két antitest / anti-TGF^81-94 ^{as an}^^“^^^“^225-2 36 / prekurzor-fajlagosak és csak a TGF- 1 prekurzor molekulán belül jelenlevő peptid szekvenciák ellen irányulnak.

6.1.5. IMMŰNFOLT - KÉPZÉS

Fehérjéket frakcionálunk 7,5 % - 17,5 % gradiens SDS * · · poliakrilariid géleken és átvisszük nem módosított nitrocellulózra / 0,45^tm; Schleicher és Schuell / 1 órán át 24 volttal 4° C hőmérsékleten J^Burnette ’ff. N. : Anal Biochera. 112 , 195-2O3r/1981J A nitrocellulóz fölösleges kötőkapacitását inkubálással blokkoljuk 2,5 % BLOTTO-val [Johnson D. A. és munkatársai : Gene Anal. Technik. 1, 3-8 /1984/J foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasó oldatban /PBS/, amely 0,2 % NP-4O-et is tartalmaz. 1 : 75 arányban 2,5 %-os BLOTTO-valfhigitott nyúl anti-szérumot indukálunk a blokkolt nitrocellulóz lemezekkel 2 órán át szobahőmérséklétén. A fölösleges antitest kimosása után öt ^perces mosással 2,5 %-os BLOTTO-ban, a nitrocellulóz lemezeket alkálikus foszfa tázzal konjugált 2,5 % BLOTTO-ban 1 : 500 arányban hígított ”A fehérj ével inkub áljuk. Két órás inkubálás után a nitrocellulóz lemezeket ötször mossuk PBS-ben / 5 perces mosások /, amely 0,2% ΝΡ-40-et is tartalmaz, és előhívjuk Qleary és munkatársai : Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4045 - 4049 /1983/J .

6.1.6. A TGF-ftl/(?>2 SZINTÉZISÉT PROGRALT.IOZŐ PLAZLHD MEGALKOTÁSA

A kiméra TGF-^1/^2 fehérje szintézisét programozó plazmidot! a p5$/dhfr-t az alábbiak szerint, alkotjuk meg. A pAc^TGF-l-et, a pAc373-ból ^Lliyamoto és munkatársai : Hol. Cell. Bioi.5, 28602865 /1985/J Hadisen és munkatársai : Virology 153,248 -250 /1987/? származó baculovirus vektort, amely-tartalmazza a TGF-βΐ 1,4 kb-s Pstl-EcoRI kódoló szekvenciáját [Sharples és munkatársai : DNA 6., 239 - 244 /1987/J , a pAc611 £Miyanoto és munkatársai : Mól. Cell. Bioi. 5, 28&Q - 2865 /1985/ ; LIadisen és munkatársai : Virology 153, 243 - 250 /1987/J Pstl-EcoRI helyébe kódolva, BamHI-gyel és

EcoRI-gyel emésztjük és a TGF-^L kódoló szekvencia 375 bp-s fragmentumát izoláljuk /1. fragmentum/. A pSV2-^TGF-et í? Gentry és munkatársai : Mól. Cell. Bioi. 7,3418 - 3427 /1987/J Apai-gyei és EcoRI-gyel emésztjük és a 3,5 kb-s fragmentumot izoláljuk /2. fragmentum /

Az alább bemutatott szekvenciával bíró komplementer szintetikus oligonukleotidokat szintetizálunk Applied Biosystems Oligonucleotide Synthesizer berendezésen és akrilamid gélről tisztítjuk. Foszfátokat adunk hozzájuk T4 kinázzal^és ekvimoláris mennyiségű kinázzal kezelt oligonukleotidot forrasztunk hozzájuk. Az összeforrasztott kettős szálú szintetikus DNS-t azután a fentebb leirt l..ps:>2í^ fragmentumokhoz ligáljuk. A ligációs keveréket E. coli transzformálásához alkalmazzuk, és 5ApSV2 /Hpa~Eco⁺,4-t izolálunk.

5’ “ CAA CAT CTG CAA AGC

CTG GAC ACC AAC TAC

GAT AAT TGC TGC CTA

TTC AAG AGG GAT CTA

5’ - GAT CCA TTT CCA CCC

AAT GTA AAG CGG ACG

CAC ATT TCT GAA GCA

TCG GCG G'TG CCG GGA

TCC CGG CAC CGC CGA GCC

TGC TTC AGA AAT GTG CAG

CGT CCG CTT TAC ATT GAT

GGG TGG AAA TG - 3’

TAG ATC CCT CTT GAA ATC

TAG GCA GCA ATT ATC CTG

GTA GTT GGT GTC CAG GGC

GCT TTG CAG ATG TTG GGC C - 3*

5^pSV2 /Hpa~Eco⁺/-t emésztünk EcoRI-gyel, betöltjül: Klenow enzimmel, HindlII-mal emésztjül: és a kiméra TGF-y^l ^>2 kódoló •4» • · · ·

- 27 szekvenciát tartalmazó 1,4 kb-s fragmentumot izoláljuk /3. fragmentum /. Az 5/£pSV2-t úgy alkotjuk meg, hogy a harmadik fragmentumot pSV2',neo-ba ligáljuk, amelyet előzőleg HindlII-mal és Hpalgyel emésztettünk, hogy a neo gént eltüntessük.

5^pSV2-t emésztünk EcoRI-gyel, Klenow enzimmel betöltjük, emésztjük Ndel-gyel, és a 2,6 kb-s Ndel-EcoRI /tompa/fragmentumot izoláljuk és pSV2/dhfr-be £üentry és munkatársai : Mól. Cellt Bioi. 7, 371S - 3727 /1987/], amelyet előzőleg Ndel-gyel és PvuIIvel emésztettünk, ligáljuk. A ligálási keveréket E. coli transzformálására alkalmazzuk, és a p5//dhfr-t izoláljuk. A pőyá/dhfr által kódolt kiméra TGF-/Sl/^2 molekula nukleotid- és következtetett aninosavszekvenciáit az 1. ábrában mutatjuk be.

6.2. A TGF-fa/^2 KIFEJEZŐDÉSE CHO SEJTEKBEN

A p5/3/clhfr-t CHO sejtekbe fertőzzük át és egyedi kiónokat sokszorozunk metotrexáttál, amint^ezt fentebb a 6.1. fejezetben leírtuk. Az egyik ilyen sokszorozott kiónt, a CHO-5^41,2.5^-öt választjuk ki a további jellemzéshez.

CHO-5y$41,2.5 sejteket összefolyásig növesztünk 2,5^mól/l metotrexátbán. A tápközeget szérummentes tápközegre · cseréljük ki,, majd 24 óra múlva ezt összegyűjtjük„ és 4S órán át dializáljuk ‘ 0,2 mól/1 ecetsav ellen. A dializált, kondicionált tápközegeket biológiai aktivitásra megvizsgáljuk a CCL-64 sejtek DNS szintézisének gátlásával, amint ezt fentebb a 6.1.3. fejezetben leírtuk. A CHO-5/s41,2.5 sejtak mintegy 2mg /1 biológiailag aktív kiméra TGF-^1/^2-t választanak ki / 2.ábra /.

Az ezen sejtek által kiválasztott TGF-/i-rokon fehérjéket immunfolt-elemzéssel elemezzük az érett TGFySl ellen irányuló anti-peptid. antitesteket alkalmazva., amint ezt fentebb a 6.1.5.

« *··0 «· ···· ««·« ·· 4 · · * * • ♦ ··· ♦ · i · · · ♦ · · ♦ ·« ·· ·· *· · fejezetben leírtuk. A 3· ábra azt mutatja, hogy a CHO-5^41,2.5 sejtek olyan immunreaktiv fehérjéket választanak ki, amelyek 90-100 kilodaltónnál és 24 kilodalt ónnál vándorolnak , amikor e zeket SDS-PAGE-val elemezzük nem redukáló körülmények között /3. ábra, 1. vonal/. A 24 kilodaltonos esik az érett TGF-^l^2 dinert képviseli, és a 90 - 100 kilodaltonos fehérje valószínű leg az érett :TGF^1^> 2-t képviseli diszulfí-d-híddal a prekurzor szekvenciákhoz kötve LGentry és munkatársai : Hol. Cell. Bioi..7,

3418 - 3427 /1987/J.

Redukáló körülmények között /3. ábra, 2. vonal / a fehérjék nagy része 12 kilodaltonnal vándorol, az érett 2 monomert képviselve. Meg kell jegyeznünk az immunreaktiv anyag hiányát a 45 - 55 kilodaltonos tartományban, amely pedig a majom

TGF-j&f gént kódoló pl a zni dokkal átfertőzött CHO sejtekben kifejezett rekombináns fehérjék hasonló elemzésénél megfigyelhető ^Gentry és munkatársai: Hol. Cell. Elöl. 7, 3418 - 3427 /1987/J; ez azt sugallja, hogy a kiméra TGF-^1/^2 proteolitikusan sokkal hatékonyabban, dolgozódik fel, mint szülő-molekulája, a TGE»0>1 . Ezen kívül a CH0-^>41,2.5 sejtek mintegy 2,5-ször több biológiailag aktív érett terméket választanak ki, mint amennyit a TGF-βίet kifejező CHO sejtek kiválasztanak ^Gentry és munkatársai : fentebb idézett munka /1987/J. Bár ezeknek a megfigyeléseknek az alapja jelenleg még nem ismert, a kiméra TGF-βΙ/ρ 2 prekurzor szekunder szerkezete jelentősen különbözhet a szerkezetétől, amely szekunder szerkezet a

szekunder kiméra TG?-pl//⁵2.y-t különböző intenzitású és természetű molekuláris feldolgozási e s eménye k t ár gy ává teszi.

így pl.

a TGP-^L/^2 prekurzor sokkal kedvezőbb szubsztrátuma lehet, a TGF- feldolgozásban érintett’ r i 4 faktoroknak. EJgy másik eljárásban a TGF-Al/^>2 szekunder szerkezeti jellemzői lehetővé teszik ezek számára, hogy kölcsönhatásba lépjenek más feldolgozó faktorokkal vagy biokémiai utakkal, amelyek a TGF-^1 számára nem hozzáférhetőek.

7. A MIKROORGANIZI.KJSOK DEPONÁLÁSA

Az alábbi transzfektánst deponáltuk az American Type Culture

Collectiom-mál / ATCC, Rockville, Maryland / kel, névvel, és számmal :	az alábbi jellemzők-
Transzfektáns	Plazmid	Deponálási szám
CHO-5^41,2.5 CL 5	p5/?/dhfr

A jelen találmány nem korlátozódik a nevezett deponált sejtvonalra vagy az ismertetett kiviteli módokra ; ezek csupán bizonyos illusztrációt nyújtanak a jelen találmány egyik lehetséges eljárására. Bármely, ezzel funkcionálisan egyenértékű eljárás a találmány oltalmi körén belül van. A jelen találmány:, különböző változatai az itt bemutatottakon és leírtakon kívül azok számára, akik a szakterületen járatosak, nyilvánvalóak e leírás alapján. Az ilyen változatok is a mellékelt-igénypontok oltalmi körén belülre esnek.

Azt is világosan kell látni hogy az összes nukleotidóknál és pepti délénél megadott bázispárz es szám és méret csak hozzávetőleges és csak a leírás jobb megértése érdekében alkalmazzuk ezeket.

Claims (19)

1., /il/^>2 kiméra transzformáló növekedési faktor azzal jellemezve, hogy lényegében az 1. ábrában bemutatott aminosav szekvencia mintegy 279. aminosav számú gyökétől a mintegy 390. aminosavszámu gyökéig terjedő szakaszát tartalmazza.

2., ^,1/^2 kiméra transzformáló növekedési faktort kódoló nukleotid-szelcvencia azzal jellemezve, hogy lényegében az 1.ábrában bemutatott nukleont idszekvencia mintegy 836. nukleotidszámú gyökétől a mintegy 1170. nukleotidszámú gyökéig terjedő szakaszt tartalmazza.

3.» ^1/^2 kiméra transzformáló növekedési faktort kódoló nukleotidszekvencia azzal jellemezve, hogy lényegében az 1. ábrában bemutatott nukleotidszekvencia mintegy 1. nukleotidszámú gyökétől a mintegy 1170. nukleotidszámú gyökéig terjedő szakaszt tartalmazza.

4., Sejt azzal jellemezve, hogy ^l/^>2 kiméra transzformáló növekedési faktort kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely lényegében az 1. ábrában bemutatott nukleotidszekvencia mintegy

836. nukleotidszámú gyökétől a mintegy 1170. nukleotidszámú gyökéig terjedő szakasznak felelzneg.

5., Sejt azzal jellemezve, hogy ^1^>2 kimára transzformáló növekedési faktort kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely lényegében az 1. ábrában bemutatott nukleotidszekvencia mintegy

1. nukleotidszámú gyökétől e. mintegy 1170. nukleotidszámú gyökéig terjedő szakasznak felel meg.

6., Sejt azzal jellemezve, hogy ^>l/^>2 kiméra transz formáló növekedési faktort kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely lényegében az 1. ábrában bemutatott nukleotidszekvencia mintegy ·· ···· • · ··· * • · * • · 9· ···».

* « » ·· ···* *

836. nukleotidszámú gyökétől á mintegy 1170 mukleotidszámú gyökéig terjedő szakasznak felel meg és egy olyan második mukleotid szekvencia ellenőrzése alatt áll, amely úgy szabályozza a gén kifejeződését, hogy a sejt ^>1/^2 kínéra transzformáló mövekedé sí faktort termeljen

7., Sejt azzal jellemezve, hogy ^>1/^2 kínéra transzformáló növekedési faktort kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely lényegében az 1. ábrában bemutatott nukeotidszekvencia mintegy

1. nukleotidszcímú gyökétől a mintegy 1170. nukleotidszámú gyö kéig terjedő szakasznak felel meg és olyan második· nukleotidszektort

8., A 7 va gy ,£ igénypont szerinti sejt azzal jellemezve, hogy ez kínai hőre sög petefészeksejt a második nukleotid szekvencia, amely szabályozza a génkife jezodést, tartalmaz egy SV4-0 promotort

10., A 6. vagy 7. igénypont szerinti sejt azzal jellemezve, hogy a második nukleotidszekvencia-tartalmaz egy promotort és egy szelektálható narkarhez szolgáló kódoló szekvenciát

11., A 10. igénypont szerinti sejt azzal jellemezve, hogy a szelektálható narker dihidrofolát reduktázt tartalmaz

12., Sejtvonal azzal jellemezve, hogy ez a CH0-5/M-1,2.5 CL§ sejtvonal és deponálva van az Amehcan Type Culture Collection- nál a .......... deponálási számon.

13., Élj árás ^l/^>2 kiméra transzformáló növekedési faktor előállítására azzal jellemezve’, hogy ···· ·· ···· ···· i · · · · • ··· · · • · · · · · • ·· 99 ·· · /a/ egy gazdasejtet, amely ^>1/^2 kínéra transzformáló növekedési faktort kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz, ahol a nevezett nukleotidszekvencia lényegében az 1. ábrában bemutatott nukleotidszekvencia mintegy 836. nukleotidszámú gyökétől a mint egy 1170 nukleotidszámú gyükéig terjedő szakasznak felel meg, és egy második nukleotidszekvencia ellenőrzése alatt áll, amely úgy szabályozza a gén kifejeződését, hogy^>1/^2 kínéra transzformáló növekedési faktor aktivitású peptid vagy fehérje képződjék a gazdasejt révén, tenyésztünk $·.'és /b/ a ^»1/^,2 kiméra transz formáló növekedési faktort a tenyészetből kinyerjük.

14.» Eljárás ‘^1/^2 kiméra transzformáló növekedési faktor előállítására azzal jellemezve, hogy /a/ egy gazdasejtet, amely ^l/^>2 kiméra transzformáló növekedési faktort kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz, ahol a ne vezeti nukleotidszekvencia lényegében az 1. ábrában bemutatott nukleotidszekvencia mintegy 1. nukleotidszámú gyökétől a mintegy

1170. nukleotidszámú gyökéig terjedő szakasznak felel meg, és egy második nukleotidszekvencia ellenőrzése alatt áll, amely úgy szabályozza a gén kifejeződését, hogy 1/^2 kiméra transzformáló növekedési faktor aktivitású peptid vagy fehérje képződjék a gazdasejt révén, tenyésztünk ; és /b/ a jhl/p 2 kínéra transzformáló növekedési faktort a tenyészetből kinyerjük.

15., A 13,és 14., igénypont szerinti eljárás azzal jellemez zunk.

• · · «·· • ··

16., A 13. és 14., igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy második nukleotidszekvenciáként, amely a gén kifejeződést szabályozza, SV40 promotort tartalmazó.szekvenciát alkalmazunk.

17., A 13. és 14·, igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy második nukleotidszekvenciaként olyan nukleotidszekvenciát alkalmazunk, amely tartalmaz egy promotort és egy olyan szelektálható markerhez szolgáló kódoló szekvenciát, amely mar kerre nézve a gazdasejt hiányos, úg kiméra transzformáló növekedési faktort kódoló szekvenciát tartalmazó gazdasejt azonosítható legyen,

18., A 17. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a szelektálható marker dihidrofolát reduktázt tartalmaz.

19., A 18. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet metotrexátnak tesszük ki úgy, hogy kiválasztjuk azokat a rezisztens telepeket, amelyek a dihidrofolát reduktázt és a β1/^>2 kiméra transzformáló növekedési faktort kódoló szekvenciák megnövekedett szintjeit tartalmazzák.

imára transzformáló növekedési faktor előállítására azzal jellemezve, hogy /a/ az American Type Gulture Collection-nál deponált,

........ számú CHO-5^41,2.5 CL5 transzfektánst tenyésztjük ; és kiméra transzformáló növekedési faktort a te nyészetből kinyerjük.

21., A 2o. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a transzfektánst metotrexát jelenlétében tenyésztjük.