CN1518597A - 新的成纤维细胞生长因子 - Google Patents
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Abstract
本发明鉴别了新的核酸序列，多肽序列，及其核酸调节元件，其编码成纤维细胞生长因子(FGF)，优选FGF－20或FGF－23，这是参与发育、分化和形态发生例如细胞之间信号传导及细胞增殖的一类多肽。本发明的FGF、其片段及衍生物具有一或多种以下生物学活性，例如促进伤口愈合；促进神经元存活；刺激如下细胞增殖，例如干细胞，成纤维细胞，神经元，神经胶质细胞，少突胶质细胞，神经膜细胞或其祖细胞增殖；调节细胞分化；诱导胚胎发育；刺激神经突生长；增强神经损伤或神经元损伤恢复；刺激髓鞘形成；刺激血管发生；受体结合活性；调节肿瘤发生等。
Description
本申请要求申请日为2000年12月8日的美国临时申请60/251，837的优先权，该申请全文引入本文作参考。
发明背景
成纤维细胞生长因子在许多生物学功能包括例如细胞增殖和分化以及发育中发挥重要作用。
发明描述
已经鉴别了编码成纤维细胞生长因子(FGF)、优选FGF-20(在与本申请相应的临时申请中称为FGF-21)或FGF-23(与公布的FGF-22相同)的新的核酸，多肽序列，及其核酸调节因子，这是一类参与发育、分化和形态发生(例如细胞之间信号传导及细胞增殖)的多肽。本发明的一种FGF，其片段及其衍生物，具有一或多种以下生物学活性，包括但非限于；FGF活性；及FGF特异性免疫原性活性。根据本发明，鉴别了至少两类新FGF，例如FGF-20和FGF-23。
“FGF活性”是指例如促进伤口愈合；促进神经元存活；刺激细胞增殖，例如干细胞、成纤维细胞、神经元、神经胶质细胞、少突胶质细胞、神经膜细胞或它们的祖细胞增殖；调节细胞分化；诱导胚胎发育；刺激神经突长出；增强神经或神经元损伤恢复；刺激髓鞘形成；刺激血管发生；受体结合活性；调节肿瘤发生等。
“FGF特异性免疫原性活性”是指例如FGF多肽激发针对FGF的选择性免疫应答，例如针对哺乳动物FGF-20的选择性免疫应答。因此，由选自哺乳动物FGF(例如图1和图2中的FGF)的氨基酸序列刺激抗体、T细胞、巨噬细胞、B细胞、树突细胞，是一种特异性免疫原性活性。这些应答可以常规测定。
FGF，如FGF-20或FGF-23，是全长哺乳动物多肽，其具有可得自天然来源的氨基酸序列，并具有一或多种上述活性。其可以具有图1和图2所示序列，序列中具有起自起始密码子止于终止密码子的一个开放读框。其包括天然发生的正常序列，天然发生的突变序列，及天然发生的多态性序列，包括单核苷酸多态性(SNP)等序列。天然来源包括例如活细胞，例如得自组织或完整有机体，培养细胞系，包括原代及无限增殖化细胞系，活检组织等。
本发明还涉及哺乳动物FGF的片段。所述片段优选是“生物活性的”。“生物活性的”是指所述多肽片段在活系统或活系统成分中具有活性。生物活性包括那些提及的活性，例如FGF活性，如FGF受体结合活性，及FGF免疫原性活性。片段可以根据任何所需方法制备，包括化学合成，遗传工程，裂解产物等。FGF的生物学片段包括这样的多肽，其在蛋白质的羧基或氨基端的氨基酸序列被除去或修饰。
FGF-20和FGF-23的任何可公开获得的核酸片段及多肽片段，或其同源片段，均不包括在本发明内，例如g5762262，其是从Xenopus laevis中鉴别的相似序列。可公开获得的核酸的核苷酸及氨基酸序列可以通过查询公共数据库而鉴别。
本发明还涉及一种FGF-20，其具有图1所示的第1-211位推导氨基酸序列，及一种FGF-23，其具有图2所示的第1-169位推导氨基酸序列。推断FGP-20的分子量为大约23.5kdal，pI为大约9.25。推断FGF-23的分子量为大约19.6kdal，pI为大约12.32。
蛋白质的相同性程度是指蛋白质中相同的氨基酸数目与氨基酸残基总数的比值：相似性程度是指相同的氨基酸残基数加上保守取代的氨基酸数(如用V取代L等)与氨基酸残基总数的比值。对于DNA，相同性与相似性相同，均是指相同核苷酸数与总长度的比值。
本发明的FGF多肽，例如具有图1和图2所示氨基酸序列，可以通过任何适当方法分析以鉴别所述多肽中其它结构和/或功能结构域，包括跨膜区域，疏水区域。例如FGF多肽可以通过例如以下所述方法分析；Kyte和Doolittle，分子生物学杂志157：105，1982；EMBL Protein Predict；Rost和Sander，蛋白质19：55-72，1994。
本发明FGF的其它同源物可以根据不同方法得自哺乳动物和非哺乳动物来源。例如，可利用与衍生自图1和图2的寡核苷酸杂交选择同源物，例如Sambrook等，分子克隆1989，第11章所述。这种同源物可以具有与GENE不同数量的核苷酸及氨基酸序列相同性和相似性。哺乳动物生物体包括例如啮齿动物，小鼠，大鼠，仓鼠，猴子，猪，牛等。非哺乳动物生物体包括例如脊椎动物，无脊椎动物，斑马鱼，鸡，果蝇，C.elegans，Xenopus，酵母如S.pombe，S.cerevisiae，蛔虫，原核生物，植物，Arabidopsis，病毒，artemia等。
本发明还涉及FGF特异性氨基酸序列，例如见于图1和图2的特定序列中的一个指定氨基酸序列，见于本发明FGF中的保守氨基酸基序。可以使用相关蛋白质之间的对比，如其它相关FGFs(见例如Venkataraman等，美国科学院院报96：3658-3663，1999)，以选择特异于FGF的序列。
例如，对比FGF-20和FGF-23的蛋白质序列，并基于与图1和图2所示同源的保守区域产生氨基酸基序。本发明涉及任何核酸或其多肽序列，例如包含三或多个保守或同源残基的多肽，例如LYGS，HFLP，VQGTR，RIEENGHNTY，QFEENWYNTY，AGTPSA，AAERSA等。其它特异性和/或保守氨基酸序列可以常规发现，例如通过使用BLAST计算机程序查询基因/蛋白质数据库而发现。FGF特异性氨基酸序列或基序可以用于产生作为抗原的肽，以产生特异性免疫应答。通过这种免疫获得的抗体可以用作哺乳动物FGF蛋白的特异探针以进行诊断或研究。
正如所论及的，本发明多肽可以包含FGF的不同氨基酸序列(例如全长序列，即具有图1和图2所示起始和终止密码子，成熟氨基酸序列，即FGF多肽是作为前体产生，所述前体被加工成成熟多肽，或这些序列的片段)。有用的片段包括例如包含或基本由任何前述结构域及特异的和保守的氨基酸序列组成的片段。
本发明FGF多肽的片段可以加以选择以具有特异生物活性，例如FGF受体结合活性或免疫原性活性。
这些活性的测定见于下文及实施例所述。这些多肽也可以如EP496 162所述鉴别和制备。一个有用片段可包含或基本上由例如图1和图2所示的大约9个连续氨基酸，优选大约10，15，20，30，40个连续氨基酸组成。
本发明的多肽也可以与图1和图2所示氨基酸序列具有100％或略低的氨基酸序列相同性。针对以下论述；序列相同性是指在对比序列的相应位置发现与图1和图2所示序列相同的核苷酸或氨基酸。与图1和图2所示氨基酸序列具有低于100％序列相同性的多肽，可以含有与天然发生序列不同的取代，包括同源和非同源氨基酸取代。同源氨基酸取代实例见以下所述。基于FGF多肽序列对比，相同和同源残基总和除以残基总数等于序列相似性百分率。为计算序列相同性和相似性，将对比序列进行序列对比，并根据任何所需方法，公式，计算机程序等计算，包括例如FASTA，BLAST。与图1和图2所示氨基酸序列具有低于100％氨基酸序列相同性的多肽，可以具有大约99％，98％，97％，95％，90.5％，90％，85％，70％或低如大约60％序列相同性。
本发明还涉及FGF-21和FGF-23的FGF多肽突变蛋白，即具有与得自天然来源的氨基酸序列不同的氨基酸序列的任何多肽(哺乳动物FGF的片段与天然发生的FGF尽管氨基酸数目不同但在氨基酸序列上没有差异)。因此，FGF多肽突变蛋白包含氨基酸取代，插入和缺失，包括非天然发生的氨基酸。
本发明FGF氨基酸序列的突变蛋白还可以基于从基因数据库(例如Genbank，EMBL)中进行同源性查询而制备。序列同源性查询可以通过各种方法实现，包括BLAST计算机程序，Smith-Waterman公式等。通过鉴别及对比多肽之间一个结构域内的相同和/或同源氨基酸，然后基于这种序列对比修饰一个氨基酸，可以将突变蛋白导入一个序列中。例如，本发明的FGF与各种已知FGF呈现序列相同性，例如Venkataraman等，美国科学院院报96：3658-3663，1999所述。这些多肽之间的序列对比，尤其在Venkataraman等氨基酸取代的表1中鉴别的保守氨基酸残基对比，可以鉴别修饰后预期会降低、减少或消除FGF生物活性如受体结合活性的残基。例如，当序列对比揭示出在两或多个结构域之间保守的相同氨基酸时，预计所述氨基酸的消除或取代会负面影响其生物活性。
氨基酸取代可以通过用一个同源氨基酸取代另一个氨基酸而产生。同源氨基酸可以基于侧链的大小和极化程度限定，包括小型非极性氨基酸；半胱氨酸，脯氨酸，丙氨酸，苏氨酸；小型极性氨基酸；丝氨酸，甘氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺；大型极性氨基酸；谷氨酸，谷氨酰胺，赖氨酸，精氨酸；中等极性氨基酸；酪氨酸，组氨酸，色氨酸；大型非极性氨基酸：苯丙氨酸，甲硫氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸。同源氨基酸还可以如下分组：无电荷的极性R组，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；酸性氨基酸(负电荷的)，天冬氨酸和谷氨酸；碱性氨基酸(正电荷的)，赖氨酸，精氨酸，组氨酸。同源氨基酸还包括如下所述那些氨基酸：Dayhoff，蛋白质序列和结构图5，1978，及Argos，EMBO杂志8，779-785，1989。
本发明涉及突变蛋白多肽及编码这种多肽的突变蛋白核酸。因此，本发明涉及图1和图2所示核苷酸序列，其中所述编码多肽及一或多个氨基酸位置的核酸被取代或缺失，或既取代又缺失，并且由所述核酸编码的多肽具有一种生物活性，例如增强神经或神经元损伤恢复。一种多肽突变蛋白及其相应核苷酸编码序列可以具有图1和图2所示氨基酸序列，但在一或多个位置由同源氨基酸取代，例如具有1，5，10，15或20个取代。修饰怎样影响所述活性可以根据上述，下述及本领域技术人员已知的方法测定。例如本领域已知许多分析FGF活性的方法，包括例如测定神经元存活及其它神经营养活性的分析，如实施例中所述及例如Kanda等，li7t.J.Devl.Neuroscie7tce，12(3)：191-200，1999所述，及FGF受体结合活性分析。
正如所述的，氨基酸取代也可以基于与相关其它FGF的相似性而产生。其它突变可以通过修饰或突变图1和图2所示核苷酸序列，及选择那些影响其一或多种活性的突变的而常规选择，例如根据以下所述方法和实施例通过测定活性选择。
本发明的哺乳动物FGF，其片段或取代的多肽还可以包含各种修饰，其中这类修饰包括脂质修饰，甲基化，磷酸化，糖基化，共价修饰(例如R组氨基酸)，氨基酸取代，氨基酸缺失，或氨基酸添加。对所述多肽进行修饰可以根据多种方法实现，包括重组，合成，化学法等。
本发明多肽(例如全长多肽，其片段，其突变体)可以以多种方式应用，例如在分析中作为针对抗体的免疫原，作为生物活性剂(例如具有一或多种与本发明FGF相关的活性)。
编码本发明FGF的多肽，其衍生物，或其片段，可以与一或多个结构结构域，功能结构域，可检测结构域，抗原结构域，和/或感兴趣的所需多肽组合，以非天然存在的方式排列，即它们是非天然发生的。包含这种特征的多肽是一种嵌合或融合多肽。这种嵌合多肽可以根据多种方法制备，包括化学，合成，准合成，和/或重组方法。编码嵌合多肽的一种嵌合核酸在一个连续(例如具有多个N-末端结构域以稳定或增强活性)或间断的开放读框中，可以含有连续的多个结构域或所需的多肽，例如含有内含子，剪接位点，增强子等。所述嵌合核酸可以根据多种方法生产。见例如美国专利No.5,439,819所述。结构域或所需多肽可以具有任何所需性质，包括一种生物功能如信号传导，生长促进，细胞定向(例如信号序列，靶向序列，如定向至内质网或核)等，一种结构功能如疏水性，亲水性，跨膜等，受体-配体功能，和/或可检测功能，例如与酶，荧光多肽，绿荧光蛋白组合(Chalfie等，科学263：802，1994；Cheng等，自然生物技术14：606，1996；Levy等，自然生物技术14：610，1996)等。另外，一种多肽，或其一部分，当导入宿主细胞中时可以用作检测标记。例如编码本发明氨基酸序列的核酸，可以在读框中融合一个所需编码序列，作为进行纯化，选择或生产的标记。所述融合区域可以编码一个切割位点以易于表达，分离，纯化等。
本发明多肽可以在一个表达系统中生产，例如在根据本发明的体内、体外、无细胞、重组、细胞融合等表达系统中。通过这种系统对所述多肽进行的修饰包括糖基化，氨基酸取代(例如通过使用不同密码子)，多肽加工如消化，切割，内肽酶或外肽酶活性，附加化学组分，包括脂质和磷酸等。
本发明多肽可以根据常规方法从天然来源，转化的宿主细胞(培养基或细胞)中回收，包括去污剂提取(例如非离子型去污剂，TritonX-100，CHAPS，octylglucoside，Igepal CA-630)，硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，羟磷灰石层析，凝集素层析，凝胶电泳。需要时在完成成熟蛋白质构型中可以使用蛋白质重折叠步骤。最后，可以使用高效液相层析(HPLC)进行纯化。FGF多肽也可以用本领域已知的其它FGF分离方法分离，例如以下所述多种FGF分离方法：美国专利5,604,293，5,395,756，5,155,214，4,902,782及Santos-Ocampo等，生物化学杂志271：1726-1731，1996(从细菌宿主中纯化FGF，如从大肠杆菌中纯化)。另一种方法是与一个亲和标记(Flag表位，HA表位，myc表位，6×组氨酸，麦芽糖结合蛋白，壳多糖酶等)一起重组表达FGF，然后通过抗标记抗体缀合的亲和层析纯化。
本发明还涉及核酸，如编码本发明FGF多肽及其片段的DNA和RNA。FGF核酸(如FGF-20或FGF-23)或其片段，是具有可得自天然来源的核苷酸序列的核酸。其因此包括天然发生的序列，正常序列，天然发生的突变体，及天然发生的多态等位基因(例如SNP)等。天然来源包括例如得自组织和完整生物体的活细胞，肿瘤，培养的细胞系，包括原代和无限增殖的细胞系。
本发明的核酸序列可以含有如图1和图2所示完整编码序列，其简并序列和片段。本发明的核酸序列还可以包含一个核苷酸序列，其与上述和下述任何核苷酸序列均100％互补，例如是它们的反义序列。
本发明的核酸序列可以得自许多不同来源。其可以得自DNA或RNA，如聚腺苷酸化mRNA，例如分离自组织，细胞或整个生物体。所述核酸可以直接得自DNA或RNA，或得自cDNA文库。所述核酸可以得自特定发育阶段的细胞或组织(例如得自胚胎或成人心脏或骨骼肌细胞或组织)，具有所需基因型，表型等。
如以上关于FGF多肽的论述，包含编码本发明多肽的核苷酸序列的核酸，可以包括仅编码序列；编码序列和附加的编码序列(例如编码前导肽，分泌性肽，导向肽，酶促肽，荧光肽或其它诊断性肽的序列)，编码序列和非编码序列，例如在5’或3’末端或分散于编码序列中的非翻译序列，例如内含子。包含不间断编码多肽的核苷酸序列的核酸，是指所述核苷酸序列含有一个FGF氨基酸编码序列，所述编码序列不被非编码核苷酸中断或介于其间，例如没有内含子。这种核苷酸序列还可以称为是连续的。编码人，小鼠，或其它哺乳动物FGF等的基因组DNA可以常规获得。
本发明的核酸还可以包含一个表达控制序列，其可操纵地连接于上述核酸。术语“表达控制序列”是指一个核酸序列，其调节由与其可操纵连接的核酸编码的多肽表达。表达可以在mRNA或多肽水平调节。因此，所述表达控制序列包括mRNA元件和蛋白质相关元件。这种元件包括启动子，增强子(病毒或细胞的)，核糖体结合序列，转录终止子等。当所述表达控制序列的定位方式使得实现或达到所述编码序列表达时，表达控制序列就是可操纵地连接于所述核苷酸编码序列。例如，当一个启动子可操纵地连接于编码序列的5’时，该编码序列的表达由该启动子驱动。表达控制序列可以异源于正常基因或者可以是其内源性的。
本发明的核酸可以基于核酸杂交而选择。两个单链核酸制备物杂交在一起的能力是其核苷酸序列互补性的测定标准，例如核苷酸之间的碱基配对如A-T，G-C等。本发明因此还涉及与包含图1和图2所示核苷酸序列的核酸杂交的核酸及其互补体。与图1和图2的序列杂交的核苷酸序列具有互补核酸链，或在存在聚合酶(即一种适当的核酸合成酶)的情况下作为模板。本发明包括核酸的两条链，例如有义链和反义链。
可以选择杂交条件以选择与图1和图2所示核苷酸序列具有所需量核苷酸互补性的核酸。能与这种序列杂交的核酸，优选序列之间具有例如大约85％，更优选90％，92％，及特别优选95％，97％或100％互补性。本发明特别涉及与图1和图2所示核苷酸序列在低或高严格条件下杂交的核酸序列。
可以用多种方式选择与FGF序列杂交的核酸。例如，印迹(即含有核酸的基质)，芯片阵列，及其它包含感兴趣核酸的基质，可以在预杂交溶液(6×SSC，0.5％SDS，100μg/ml变性的鲑精DNA，5×Denhardt′s溶液，和50％甲酰胺)中于30℃温育过夜，然后根据已知程序与可检测寡核苷酸探针(见下文)在杂交溶液(例如6×SSC，0.5％SDS，100μg/ml变性鲑精DNA和50％甲酰胺)中于42℃杂交过夜。在高严格条件下洗涤印迹，以使例如碱基对错配少于5％(例如在65℃在0.1％SSC和0.1％SDS中洗涤两次各30分钟)，即选择具有95％或更高序列相同性的序列。高严格条件的其它非限制实例包括在含有30mM NaCl和0.5％SDS的水相缓冲液中于65℃最后洗涤一次。另一种高严格条件例如是在7％SDS，0.5M NaPO4，pH7，1mM EDTA中于50℃杂交例如过夜，随后在42℃用1％SDS溶液洗涤一或多次。
高严格性洗涤可以使错配少于5％，而不严格或低严格性洗涤条件(例如在37℃在0.2％SSC和0.5％SDS中洗涤两次各30分钟)可以使错配接近20％。低严格条件的另一个非限制性实例包括在42℃在含有30mM NaCl和0.5％SDS的缓冲液中最后洗涤一次。洗涤和杂交也可以如Sambrook等，分子克隆，第9章所述进行。
杂交也可以基于计算所述探针与其靶位之间形成的杂交体的解链温度(Tm)而进行，如Sambrook等所述。通常地，解链温度Tm是在此温度短寡核苷酸(含有18个核苷酸或更少)将从其靶序列中解链，该温度如下计算：Tm＝(A和T的数目)×2℃+(C和G的数目)×4℃。针对较长的分子，Tm＝81.5+16.61og10[Na+]+0.41(％GC)-600/N，其中[Na+]是钠离子的摩尔浓度，％GC是探针中GC碱基对的百分率，N是长度。杂交可以在低于该温度的一些温度进行，以保证所述探针和靶位可以杂交。通过进一步降低温度可以允许错配。。
可以选择严格条件以分离在探针(例如FGF的寡核苷酸)和靶核酸之间具有例如至少大约95％，优选97％核苷酸互补性的序列及其互补体。
根据本发明，核酸或多肽在图1和图2所示核苷酸或氨基酸序列中可以包含一或多个不同之处。对核苷酸和/或氨基酸序列进行改变或修饰可以通过任何适当方法实现，包括定点或随机诱变。。
本发明的编码哺乳动物FGF如FGF-20或FGF-23的核酸，可以包含在天然发生的基因中存在的核苷酸，例如天然发生的多态性，正常或突变等位基因(核苷酸或氨基酸)，在哺乳动物自然群体如人，猴子，猪，小鼠，大鼠或兔子中发现的突变。例如，人FGF核酸或多肽包含在自然人群中出现的核苷酸或氨基酸。术语“天然发生的”是指所述核酸可得自天然来源，例如动物组织和细胞，体液，组织培养细胞，法医样品。天然发生的突变可以包括核苷酸序列的缺失(例如截短的氨基或羧基端)，取代，倒置，或添加。这些基因可以根据本领域技术人员已知方法通过核酸杂交而检测和分离。编码本发明哺乳动物FGF的核苷酸序列可以含有在天然发生的基因，转录物，或cDNA中发现的密码子。例如图1和图2所示，或者其可以含有编码相同氨基酸序列的简并密码子。例如，可以改变序列中的密码子以优化所述序列以在所需宿主中表达。
本发明的核酸可以包含例如DNA，RNA，合成的核酸，肽核酸，修饰的核苷酸，或混合物。DNA可以是双链或单链的。包含核酸的核苷酸可以根据所需目的通过许多已知键结合，所述键例如酯，sulfamate，sulfamide，硫代膦酸酯，氨基膦酸酯，甲基膦酸酯，氨基甲酸等，所述目的例如对核酸酶如RNAase H的抗性，改良体内稳定性等。见例如美国专利No.5,378,825所述。
可以对所述核酸进行多种修饰，如附着可检测标记(抗生物素蛋白，生物素，放射性元素)，改良杂交，检测或稳定性的组分。所述核酸分子还可以根据所需方法附于固体支持物，例如硝基纤维素，磁性或顺磁性微球体(例如美国专利No.5,411,863；美国专利No.5,543,289所述；例如包含铁磁性，超磁性，顺磁性，超顺磁性，氧化铁和多糖微球体)，尼龙，琼脂糖，重氮化纤维素，乳胶固体微球体，聚丙烯酰胺等。见例如美国专利No5,470,967；5,476,925；5,478,893所述。
本发明的另一方面涉及寡核苷酸或核酸探针。这种寡核苷酸或核酸探针可以用于例如检测，定量或分离测试样品中哺乳动物FGF核酸，或鉴别FGF同源物。在一个优选实施方案中，所述核酸可以用作寡核苷酸探针，例如在PCR，差异展示，基因芯片(例如Affymetrix GeneChips；美国专利No.5,143,854，美国专利No,5,424,186；美国专利No.5,874,2 19；PCT WO92/10092；PCT WO90/15070)和其它所用方法中。针对包括研究，诊断和法医学目的在内的许多不同目的，需要进行检测。针对诊断目的，需要鉴别样品中核酸序列的存在或数量，其中所述样品得自组织，细胞，体液等。在一个优选方法中，本发明涉及一种检测核酸的方法，包括将测试样品中靶核酸与一种寡核苷酸在有效实现所述靶核酸与所述寡核苷酸杂交的条件下接触；及检测杂交情况。本发明的寡核苷酸还可以用于合成核酸的扩增中，如PCR(例如Saiki等，科学241：53，1988；美国专利No.4,683,202；PCR方案：方法和应用指导，Innis等编辑，学术出版社，纽约1990)；差异展示(见例如Liang等，核酸研究21：3269-3275，1993；美国专利No.5,599,672；WO97/18454)。
可以与针对其它基因的寡核苷酸组合完成检测，所述其它基因例如参与信号转导，生长，癌症，细胞程序死亡的基因，或上述或下述任何基因等。寡核苷酸还可以用于测试突变，例如使用错配DNA修复技术，如美国专利No.5,683,877；美国专利No.5,656,430；Wu等，美国科学院院报89：8779-8783，1992所述。
本发明的寡核苷酸可以包含图1和图2的任何连续核苷酸序列或其互补序列，或者任何所述序列或其互补序列。本发明的这些寡核苷酸(核酸)可以是任何所需大小，例如大约10-200个核苷酸，12-100个核苷酸，优选12-50个，12-25个，14-16个，至少大约15个，至少大约20个，至少大约25个核苷酸等。所述寡核苷酸可以具有非天然发生的核苷酸，例如肌苷，AZT，3TC等。所述寡核苷酸与图1和图2所示序列可以具有100％相同性或互补，或者其可以具有错配或核苷酸取代，例如1，2，3，4或5个取代。例如，所述寡核苷酸与图1和图2所示序列可以具有70-99％相同性，例如90，95或97％相同性。根据本发明，所述寡核苷酸可以包含一个试剂盒，其中所述试剂盒包括一种所需的缓冲液(例如磷酸盐缓冲液，tris缓冲液等)，检测成分等。所述寡核苷酸可以用本领域已知放射性或非放射性标记加以标记。
本发明的另一方面是哺乳动物FGF独有的一个核苷酸序列。FGF独有的一个序列，是指FGF中出现的一特定顺序的核苷酸，例如在图1和图2的核苷酸序列中，但在其它核酸中很少或不常见，尤其在动物核酸优选哺乳动物如人，大鼠，小鼠等核酸中不存在。独特的核苷酸序列包括编码图1和图2所示氨基酸的序列或其互补序列。这种序列在本文所述的及并入参考的任何方法中均可用作探针。包括有义和反义核苷酸序列。本发明的独特核酸可以常规测定。包含这个独特序列的核酸可以用作杂交探针，以鉴别包含核酸混合物的样品中例如人或小鼠FGF的存在情况，例如在Northern印迹中。杂交可以在高严格条件(如上述)下进行，以选择与所述探针具有至少95％相同性(即互补性)的核酸(及其可含有编码序列的互补体)，但也可以使用较低严格条件。独特的FGF核苷酸序列也可以在其5’或3’末端与本专利提及的各种核苷酸序列在读框内融合，所述序列包括FGF其它部分，酶，GFP等的编码序列，表达控制序列等。
正如已经论述的，杂交可以根据所需选择性在不同条件下进行，例如Sambrook等，分子克隆1989所述。例如，为特异性检测本发明的FGF，可以将寡核苷酸与靶核酸在所述寡核苷酸只与其杂交的条件下杂交，例如其中所述寡核苷酸与靶核酸100％互补。如果需要选择低于100％核苷酸互补性的靶核酸，可以使用不同条件，所述互补性例如是至少大约99％，97％，95％，90％，86.4％，85％，70％，67％。
本发明的核酸可以根据任何所需方法标记。所述核酸可以使用放射性示踪物标记，常用的示踪物如32P，35S，125I，3H或14C。放射标记可以根据任何方法进行，例如在3’和5’末端用放射标记的核苷酸，多核苷酸激酶(有或无磷酸酶去磷酸作用)或连接酶(根据欲标记的末端而定)末端标记。也可以使用非放射性标记，将本发明核酸与具有以下性质的残基组合，所述性质为免疫学性质(抗原，半抗原)，对某些试剂(配体)的特异亲和性，使可检测酶反应完成的性质(酶或辅酶，酶底物，或参与酶反应的其它物质)，或特征性物理性质如荧光性或发射或吸收所需波长的光等。
本发明的核酸，包括寡核苷酸，反义核酸等，可以用于在所有器官，组织，细胞等中检测FGF的表达，这通过多种方法进行，包括Northern印迹，PCR，原位杂交，差异展示，核酸阵列，斑点印迹等。这种核酸可以特别用于检测FGF的扰乱表达，例如细胞特异性和/或亚细胞改变。FGF的水平可以单独或与其它基因产物特别是参与神经元生理的其它基因产物组合测定。
本发明的核酸可以在许多不同系统中表达，根据所需目的在体内或在体外表达。例如，核酸可以插入表达载体中，导入所需宿主中，并在有效实现由所述核酸编码的多肽表达的条件下培养。有效条件包括适于所述宿主细胞产生所述多肽的任何培养条件，包括有效温度，pH，培养基，培养宿主细胞的培养基中的添加剂(例如如果所述编码核酸毗邻dhfr基因，则为增强或诱导表达的添加剂，如丁酸盐或氨甲蝶呤)，环己酰亚胺，细胞密度，培养皿等。核酸可以通过任何有效方法导入细胞中，包括例如裸DNA，磷酸钙沉淀，注射，DEAE-葡聚糖介导的转染，与脂质体融合，与增强细胞对其摄取的制剂缀合，病毒转染。导入本发明核酸的细胞是一种转化的宿主细胞。所述核酸可以在宿主细胞染色体外或整合入染色体中。其可以是稳定或瞬时的。根据与宿主细胞的相容性选择表达载体。宿主细胞包括哺乳动物细胞例如COS，CV1，BHK，CHO，HeLa，LTK，NIH 3T3，293，PAE，人成纤维细胞，人原位肿瘤细胞，睾丸细胞，神经胶质细胞，神经原，少突胶质细胞，成神经细胞瘤细胞，神经胶质瘤细胞等，昆虫细胞如Sf9(S.frugipeda)和果蝇，细菌如大肠杆菌，链球菌，芽孢杆菌，酵母如Sacharomyces，S.cerevisiae，真菌细胞，植物细胞，胚胎干细胞(例如哺乳动物，如小鼠或人)，神经元干细胞，成纤维细胞，肌细胞，心肌细胞，和T细胞。
表达控制序列根据与宿主相容性及所需目的相似选择，例如高拷贝数，高数量，诱导，扩增，控制表达。可以应用的其它序列包括增强子如来自SV40，CMV，RSV的增强子，诱导型启动子，细胞类型特异性元件，或允许选择性或特异性细胞表达的序列。可以用于驱动表达的启动子包括例如内源性启动子，细胞信号转导途径中其它基因的启动子，针对细菌宿主的MMTV，SV40，trp，lac，tac或T7启动子；或针对酵母的α因子，醇氧化酶，或PGH启动子。RNA启动子可以用于产生RNA转录物，如T7或SP6。见例如Melton等，核酸研究19(18)：7035-7056，1984；Dunn和Studie，分子生物学杂志166：477-435，1984；美国专利No.5,891,636；Studier等，基因表达技术，酶学方法85：60-89，1987。
本发明的核酸或多肽在核酸或蛋白质电泳，层析等中可以用作大小标记。指定的限制片段可以通过扫描限制位点序列，计算大小，及进行相应限制消化而确定。
本发明的FGF多肽和核酸可以是“分离的”。术语“分离的”是指在其原始环境或自然状态中未发现的形式，例如更浓缩的，更纯化的，从组分中分离的，存在于表达异源FGF基因的细胞裂解物中。当FGF在转染的细胞系中作为异源基因表达时，将本发明基因在基因表达的条件下导入细胞中。术语“异源”是指基因已经通过“人工”导入细胞系中。基因导入细胞系中的方法如上述。表达FGF基因的转染(或转化)的细胞可以如实施例所述裂解及作为裂解物(即“分离的”)使用，或可以使用完整细胞系。
通常地，术语“有效条件”是指例如可以达到所需结果的一种环境。这种环境包括例如缓冲液，氧化剂，还原剂，pH，辅因子，温度，离子浓度，所用细胞的合适时期和/或阶段(如在细胞周期的特定部分，或在特定基因被表达的特殊阶段)，培养条件(包括底物，氧，二氧化碳等)。
为增强稳定性，可以修饰施用的核酸，例如使其对细胞酶，氧化，还原，核酸酶等有抗性，或增强细胞对其的摄取。可以使用任何适当修饰，包括例如连接于吖啶嵌入剂和/或疏水尾部的硫代磷酸酯，甲基磷酸酯，磷酸二酯寡核苷酸，补骨脂素衍生物，2-核糖修饰，戊糖衍生物，氮碱基衍生物等。见例如美国专利No.5,576,208和美国专利No.5,744,362所述。在本发明中可以使用的其它衍生物，修饰等见上述。一般地，本发明的反义核酸可以包含天然发生核苷酸、非天然发生核苷酸的单体及其组合，以增强细胞摄取和/或稳定性。
反义核酸可以作为裸核酸，与促进细胞对其摄取的其它制剂复合或形成胶囊，注射入细胞中，或任何适当输送方式而施用。
本发明还涉及本发明FGF如FGF-20和FGF-23的使用方法。这种方法包括针对以下一或多种目的为宿主施用有效量的本发明FGF或编码该FGF的核酸：促进以下细胞存活和/或增殖，例如神经元，少突胶质细胞，神经膜细胞，干细胞，尤其神经干细胞，内皮细胞，角化细胞，及能应答FGF-20或FGF-23的任何细胞类型，例如在细胞表面表达其关联受体(如FGFR 1-4)的细胞，或其祖细胞；促进伤口愈合；调节细胞分化；诱导胚胎发育；刺激神经突生长；增强神经或神经元损伤恢复；刺激髓鞘形成；刺激血管发生；受体结合活性。
本发明还涉及本发明FGF如FGF-20和FGF-23或编码该FGF的核酸的使用指导和方法。这种方法包括针对以下一或多种目的为宿主施用有效量的本发明FGF：增强神经和轴突损伤恢复；刺激髓鞘形成，血管发生，伤口愈合，溃疡愈合，诱导骨缺失修复，促进移植物存活及诱导胚胎发育。上述应用是FGF促进细胞存活和/或增殖，抑制和/或刺激某些细胞分化的潜在活性结果。FGF可以诱导以下来源的干细胞，祖细胞，前体细胞和成熟细胞的存活/增殖：神经元，少突胶质细胞，神经膜细胞，内皮细胞，角质细胞及表达任何FGF受体的其它类型细胞。另外，FGF可以通过诱导神经突生长/延伸而诱导神经元祖细胞分化。
可以进行以下体外和体内分析以测定FGF对上述细胞功能的活性。
体外分析：
在体外诱导少突胶质细胞增殖：用于测定FGF对细胞增殖作用的少突胶质细胞是建立的细胞系如N20.1或初级啮齿动物少突胶质细胞。初级啮齿动物(大鼠)少突胶质细胞和少突胶质细胞祖细胞可以通过以下一种技术分离和纯化：示差粘附技术(Mitrovic等，1994)；Percol梯度离心(Mattera等，神经化学研究1984，6(1)41-50及Kim等，神经科学杂志1983年12月；62(1-3)：295-301)及免疫分离。不管少突胶质细胞的来源(初级细胞或细胞系)或其分离和纯化方法如何，均可以进行少突胶质细胞增殖分析，时间为3，5和7天。阳性对照物是FGF家族的其它成员如FGF-2或FGF-9。通过MTT分析和3H-胸苷掺入分析测定细胞增殖。少突胶质细胞增殖分析也见于Danilenko等，Arch Biochem Biophys.1999 Jan 1：361(1)：34-46。
诱导神经突生长：
PC 12分析：可以在PC-12细胞系(衍生自大鼠嗜铬细胞瘤)(Rydel，1987 Greene，1976)中测试FGF家族新成员诱导分化和神经突生长情况。另外，由于示出一部分NGF诱导应答是由于自分泌NGF诱导的FGF-2产生所致，因此可以检测新FGF对PC12细胞产生NGF正调节的作用(Chevet等，生物化学杂志1999 Jul 23：274(3)：20901-8)。
后根神经节(DRG)中的神经突生长：DGR通过解剖大鼠胎儿DRG并将其在神经培养基中培养而分离；DRG中神经突生长程度通过肉眼评价并与未处理的对照组比较确定神经突的数量和长度而加以量化。
可以对源于成纤维细胞和内皮细胞的细胞进行分析。针对成纤维细胞，可以使用加以修改的NIH 3T3增殖分析而进行分析。为确定FGF诱导内皮细胞增殖的作用，可以使用以下细胞：HUVEC细胞，微血管内皮细胞和主动脉内皮细胞。可如文献中所述进行相关体外分析，以确定FGF作为治疗剂治疗创伤，溃疡或骨损伤的治疗潜力。
与CNS再生相关的其它分析包括激活生长相关或存活相关的基因表达的分析(Meiners等，发育生物学1993 Dec：160(2)：480-93)，在体内调节其它生长因子的分析(Yoshida，1992)，调节神经元电生理学的分析(Terlau，1990)，作为少突胶质细胞，神经膜细胞或星形胶质细胞促有丝分裂原或分化因子的活性的分析(Genburger，1987；Stemple，1988；Kalcheim，Dev Biol.1989 Jul：134(1)：1-10；Murphy，1990)，促进皮质神经元，海马神经元，运动神经元，感觉神经元，交感神经元或副交感神经元体外存活的分析(Eckstein，1994；Unsicker等，Ann N.Y Acad Sci.1991：638：300-5；Grothe等，Int JDev Biol.1996 Feb：40(1)：403-10)，体外促进运动神经元存活的分析等。
体内分析：
可例如在以下模型中检测新FGF再形成髓鞘的潜力：a)缺乏髓磷脂的动物模型，如将来自用FGF处理的供体动物的SVZ细胞移植入髓磷脂缺乏的小鼠中，并测定少突胶质细胞在体内的延伸；b)去髓鞘动物模型，如PLT诱导的CR-EAE及MBP过继转移诱导的CR-EAE。也见于Gumpel，1992和Hinks等，分子细胞神经学1999Aug：14(2)：153-68所述分析。
可在以下体内模型中测试FGF诱导神经再生神经保护的能力：机械损害/损伤模型(横断伞形穹(fimbria fornix)途径，坐骨神经，脊髓，视神经及横断DRG)；由于脑血管损害而造成的神经元损害模型，如颈动脉闭塞，短暂MCAO闭塞，及缺氧-缺血性脑损伤；及由于MPTP产生的损害或KA产生的癫痫发作而化学诱导的神经变性模型。
典型的体内分析包括例如在海马局部缺血后测定神经元损失减少(Sasaki，1992；MacMillan等，Can J Neurol Sci 1993 Feb：20(1)：37-40)，在传导途径损伤后促进皮质神经元存活(Gomez-Pinilla，1992；Peterson等，神经学杂志1996 Feb 1：16(3)：886-98)，保护前脑基底胆碱能神经元免于创伤引起的变性，及减少MPTP引起的或损害引起的黑质神经元损失(Anderson等，自然1998 Mar 24：332(6162)：360-1；Otto，1989；Gomez-Pinilla，1992；Otto，1990)；及在体外作为“神经球”的神经祖细胞的长期生长(参见Svendsen等，神经学趋势1999Aug：22(S)：357-64)。使用的创伤模型也见于如视神经横断(Sievers，1987)；坐骨神经横断(Cordeiro等，Plast Reconstr Surg.1989 June：83(6)：1013-9；Khouri等，显微外科1989：10(3)：206-9)，横断的DRG(Aebischer等，神经学研究杂志1989 Jul.？3(3)：282-9)，脊髓横断(Cheng等，科学1996 Jul 26：273(5274)：510-3 1996)，及面神经损伤(Kuzis 1990)；使用的脑血管损伤模型如缺氧-局部缺血性脑损伤模型(MacMillen，1993)和MCA闭塞模型(Kawamata等，美国科学院院报1997 Jul 22：94(15)：8179-84；Schabitz，1999)；及其它神经变性模型如kianic acid(KA)处理(Liu等，Brain Res 1993 Oct 29：626(1-2)：335-8)或摇摆小鼠中MND(Ikeda等，神经学研究1995 Dec：17(6)：445-8)。
术语“施用”是指将FGF，编码FGF的核酸，或其它活性剂，输送至靶位，例如创伤，损伤的组织等。FGF可以施用于任何靶位(例如在体内，在体外或原位)，包括培养细胞和具有要治疗的创伤，病变或疾病的宿主，通过适于达到上述作用的有效途径施用，例如FGF配方可以通过直接注射入靶位或附近而施用。也可以如下施用，如局部，肠道，非肠道，静脉内，肌内，皮下，口服，鼻内，脑内，心室内，池内，颅内，植入所需部位，例如在凝胶泡沫中，胶原充填的神经中等，例如根据所处理的靶位位置确定。FGF也可以使用渗透泵持续施用。FGF还可以作为由细胞摄取的核酸而施用。施用核酸的方法包括上述那些方法，及本领域已知其它常规技术。
将有效量的FGF施用于靶位。有效量是这样的数量，其能够达到所需作用，优选有益或治疗作用。这种数量可以常规确定，例如通过进行剂量应答实验，其中为靶细胞施用不同剂量以确定达到所需目的的有效量，例如刺激神经突生长或促进神经元存活。基于许多因素选择数量，包括施用FGF的环境(例如脑部损伤的患者，动物模型，组织培养细胞等)，处理的细胞的位置，处理的患者或动物的年龄，健康状态，性别和体重等。
一方面，本发明涉及治疗神经元损伤的方法，如神经损伤或创伤，脊髓损伤或创伤，由例如发生局部缺血，梗塞，出血和动脉瘤导致的神经组织损伤，本发明还涉及治疗神经元疾病的方法，例如神经元变性疾病如Alzheimer′s病，Parkinson′s病，Huntington′s病，多发性硬化症，脊髓病，脊髓炎和脊髓空洞症等，所述方法包括施用有效量的本发明FGF。
本发明的FGF可以用于治疗特征在于破坏神经元和少突胶质细胞的CNS和PNS神经变性和脱髓鞘病变。FGF可用作再生髓鞘治疗剂以治疗多发性硬化症及其它初级和/或二级CNS或PNS脱髓鞘病变。CNS初级脱髓鞘病变包括肾上腺性脑白质营养不良，脑白质病(如渐进性多病灶脑白质病)，脑脊髓炎(如急性播散性静脉周脑脊髓炎)。二级CNS脱髓鞘表示CNS创伤，中毒(氰化物，六氯酚)或局部缺血(中风)中脱髓鞘损伤形成。PNS脱髓鞘病变包括初级功能失调如Guillian-Barre综合征(GBS)，异型球蛋白血症，慢性炎症性脱髓鞘多神经病变(CIDP)。另外，FGF用于治疗CNS和PNS神经变性病变，其中神经损伤由于损伤/创伤(机械性，化学性，脑血管损伤及由于感染和自身免疫应答引起的炎症)所致，及用于治疗其它神经变性病变。
本发明的FGF还可以用于促进移植物存活。例如，FGF可用于刺激多种细胞，组织或器官的移植物存活(例如异基因的，等基因的或自体移植物)，所述细胞，组织或器官如皮肤，肌束，骨，肾脏，角膜等。本发明还涵盖了细胞移植物进入源于神经元，神经胶质细胞或干细胞的CNS或PNS中。移植物可以制备自天然来源或通过移植的细胞或组织在体外扩展或通过使用分化的或未分化的干细胞制备。术语“促进”是指与未处理的细胞，组织或器官相比，增强经FGF处理的移植的细胞，组织或器官存活。分析移植物存活的方法是常规方法。
测定移植物存活的分析是本领域常规进行及熟知的。常规体外分析包括例如MTT，MTS，Thy掺入，存活/死亡细胞分析(例如用钙黄绿素AM和溴乙锭同源二聚体-EthD-1双重染色)，测定总细胞数，例如通过使用显微镜评估或通过计数细胞的物理方法如使用血细胞计数仪。常规体内方法包括例如CNS指征，神经学功能改善检测，或成像技术如MTR，MRS，CT或MRI，有或无Gd增进。
可以根据本发明进行治疗的其它情况包括预防因MI所致心肌损伤，诱导血管发生，伤口愈合，溃疡愈合，预防骨破坏及诱导新骨形成，促进移植物存活及诱导胚胎发育。
在治疗上述疾病/状况中有用的FGF活性包括：促进细胞存活和/或增殖，抑制和/或刺激以下类型细胞分化：诱导以下来源的干细胞，祖细胞，前体细胞和成熟细胞存活/增殖：神经元，少突胶质细胞，神经膜细胞，内皮细胞，角质细胞，成骨细胞及表达任何FGF受体的其它细胞。另外，FGF通过诱导神经突生长/延伸而诱导神经元祖细胞分化的作用在治疗任何类型神经元损伤/损害中均有用。
术语“治疗”是指引起所述损伤或疾病改善的任何作用，如促进神经元，神经胶质细胞，少突胶质细胞，星形细胞，神经膜细胞等存活，刺激髓鞘形成，刺激细胞增殖等，如上所述。为治疗这种损伤和疾病，FGF可以配制为组合物，或核酸，并应用于损伤或病变区域，例如使用外科技术。
本发明的FGF还可以针对本文揭示的任何治疗方法通过施用核酸而施用，例如在基因治疗中。基因输送载体可以源于病毒或非病毒来源(见Jolly，癌症基因治疗1：51-64(1994)；Kimura，人体基因治疗5：845-852(1994)；Connelly，人体基因治疗1：185-193(1995)；及Kaplitt，自然遗传学6：148-153(1994))。输送包含本发明治疗剂编码序列的构建体的基因治疗载体可以局部或系统应用。这些构建体可以利用病毒或非病毒载体方法。这种编码序列的表达可以施用内源哺乳动物启动子或异源启动子诱导。所述编码序列的表达可以是组成型或调节性的。
本发明可以应用携带或表达选择的感兴趣核酸分子的重组逆转录病毒。可以应用的逆转录病毒载体包括如下所述那些载体：EP 0415 731；WO90/07936；WO94103622；WO93/25698；WO93/25234；美国专利5,219,740；WO93/11230；WO93/10218；Vile和Hart，癌症研究53：3860-3864(1993)；Vile和Hart，癌症研究53：962-967(1993)；Ram等，癌症研究53：83-88(1993)；Takamiya等，神经学研究杂志33：493-503(1992)；Baba等，神经外科杂志79：729-735(1993)；美国专利No.4,777,127；GB专利No.2,200,651；及EP 0 345 242。优选的重组逆转录病毒包括WO91/02805所述那些。
适于与上述逆转录病毒载体构建体一起使用的包装细胞系可易于制备(见PCT出版物WO95/30763和WO92/05266)，并用于产生生产细胞系(也称为载体细胞系)，以生产重组载体颗粒。在本发明特别优选的实施方案中，包装细胞系从人体(如HT1080细胞)或水貂亲代细胞系中生产，从而产生在人体血清中可以免于失活的重组逆转录病毒。
本发明还应用基于α病毒的载体，其可以作为基因输送载体。这种载体可以从众多α病毒中构建，包括例如新培斯病毒载体，Semliki森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)，Ross River病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250 ATCC VR-1249；ATCC VR-532)。这种载体系统的代表性实例包括以下所述那些载体系统：美国专利Nos.5,091,309；5,217,S79；和5,185,440；及PCT出版物Nos.WO92/10578；WO94/21792；WO95/27069；WO95/27044；和WO95107994。
本发明的基因输送载体还可以应用细小病毒如腺伴随病毒(AAV)载体。代表性实例包括AAV载体，由Srivastava在WO93/09239，Samulski等，病毒杂志63：3822-3S28(1989)；Mendelson等，病毒学166：154-165(1988)；及Flotte等，P.N.A.S.90：10613-10617(1993)所揭示。
腺病毒载体的代表性实例包括以下所述那些载体：Berkner，生物技术6：616-627(1988)；Rosenfeld等，科学252：431-434(1991)；WO93/19191；Kolls等，P.N.A.S.915-219(1994)；Kass-Eisler等，P.N.A.S.90：11498-11502(1993)；Guzman等，循环88：2838-2848(1993)；Guzman等，循环研究73：12021207(1993)；Zabner等，细胞75：207-216(1993)；Li等，人体基因治疗4：403-409(1993)；Cailaud等，欧洲神经学杂志5：1287-1291(1993)；Vincent等，自然遗传学5：130-134(1993)；Jaffe等，Abat.Gebiet 1：372-378(1992)；及Levrero等，基因101：195-202(1992)。可应用于本发明的腺病毒基因治疗载体例如还包括以下所述那些：WO94/12649，WO93/03769；WO93/19191；WO94/28938；WO95/11984和WO～95/00655。可以采用连接于灭活腺病毒的DNA，如Curiel，人体基因治疗3：147-154(1992)所述。
可以应用其它基因输送载体和方法，包括连接于或未连接于灭活腺病毒的聚阳离子浓缩DNA，例如Curiel，人体基因治疗3：147-154(1992)所述；配体连接的DNA，例如Wu，生物化学杂志264：16985-16987(1989)；真核细胞输送载体细胞，例如见1994年5月9日提请的美国专利申请No.08/240,030，和美国专利申请No.08/404,796；光聚合的水凝胶材料的沉积；手握式基因转移粒子枪，如美国专利No.5,149,655所述；电离辐射，如美国专利No.5,206,152和WO92/11 033所述；用细胞膜中和或融合核电荷。其它方法如Philip，分子细胞生物学14：2411-2418(1994)及Woffendin，美国科学院院报91：1581-1585(1994)所述。
也可以应用裸DNA。裸DNA导入方法例如WO90/11092和美国专利No.5,580,859所述。使用可生物降解的乳胶珠可改善摄取效力。DNA包被的乳胶珠在珠被胞吞开始后有效转运至细胞中。进一步改进所述方法可以通过对所述珠进行处理以提高疏水性，从而促进内涵体的破坏及所述DNA释放入胞质中。可作为基因输送载体的脂质体见于美国专利No.5,422,120，PCT专利出版物Nos.WO95/13796，WO94/23697和WO91/14445，及EP No.0 524 968所述。
适合使用的其它非病毒输送系统包括机械输送系统，如Woffendin等，美国科学院院报91(24)：11581-11585(1994)所述方法。另外，这种的编码序列和表达产物可以通过光聚合水凝胶材料的沉积输送。可用于输送编码序列的其它常规基因输送方法，包括例如使用手握式基因转移粒子枪，如美国专利No.5,149,655所述；使用电离辐射以激活转移的基因，如美国专利No.5,206,152和PCT专利出版物No.WO92/11033所述。
本发明还涉及一种刺激细胞增殖的方法，包括施用有效量的FGF-9(例如Kanda等，如前)，FGF-20或FGF-23，或其生物活性片段。术语“刺激细胞增殖”是指施用的FGF导致细胞分裂或有丝分裂。FGF可以以任何有效形式(核酸或多肽)施用于任何适当宿主。
例如，在一个实施方案中，该方法可用于鉴别FGF的兴奋剂和拮抗剂。在这种情况中，将FGF施用于细胞系、包括建立的和初级细胞如脊髓运动神经元可以是有用的。建立细胞系包括例如美国组织培养物保藏中心(atccc.org)中贮存的任何细胞系，包括例如DBTRG-OSMG，PFSK-1，MSTO-211H，NCI-H378，NCIN41/，NCI-H526，HCN-1A，HCN-2，CATH.a，NG108-15，NCI-H446，NCI-H209，NCI-H146，NCI-H82，NCI-H345，NCI-H510A，D283 Med，D341 Med，C6，IMR-32，Neuro-2a，NB41A3，BC3H1，A172，Mpf，T98G[T98-G]，SCP，CCF-STTG1，DI TNCI，CTX TNA2，PG-4(S+L-)，G355-5，SW 598[SW-598；SW598]，C6/LacZ，9L/lacZ，NIE-115，SH-SY5Y，BE(2)-M17，BE(2)-C，MC-IXC，SK-N-BE(2)，CHP212，C6/IacZ7，M059K，M059J，F98，RG2[D74]，NCI-H250，NCI-H1915，OAl，TE 615.T，SVG p12，TE671亚系No.2，MBr C11，SK-N-MC，SW1088[SW-1088；SW1088]，SW 1783[SW-1783；SW1783]，U-87 MG，U-118 MG，U-138 MG，MDA-MB-361，DU 145，Hs 683，H4，293，PC-12，P19，NTERA-2cl.D1[NT2/D1]，BCE C/D-1b，SK-N-AS，SK-N-FI，SK-N-DZ，SK-N-SH，Daoy，优选N20.1细胞。
FGF的推定兴奋剂和拮抗剂可以在体外施用于已经施用FGF的细胞，如上述细胞系，或者推定的制剂可以在体外或体内施用于天然产生FGF的细胞。这种制剂的兴奋或拮抗作用可以用任何本领域公认的分析测定，如本文所述那些分析。
也可以用本发明FGF刺激神经干细胞以增殖。所得细胞可以用作移植回其所衍生的同一患者中的神经细胞来源(即自体的)，排除了与异基因移植相关的任何典型问题，如排斥。因此，本发明方法涉及施用有效量的FGF以刺激神经干细胞增殖和分化，并将所述干细胞移植回去。
本发明还涉及特异识别本发明FGF的抗体。特异于FGF的抗体是指所述抗体识别在FGF内或包括其的一个限定氨基酸序列，如图1和图2所示序列。因此，一种特异性抗体一般与图1和图2中发现的一个氨基酸序列即一个表位的结合亲和性比与例如通过免疫印迹分析或其它常规免疫分析检测/测定的一个不同表位的结合亲和性高。因此，特异于人FGF-21的一个表位的抗体可用于检测样品中所述表位的存在情况，例如含有人FGF-21基因产物的组织样品，将其与没有所述表位的样品区分。这种抗体见于Santa Cruz，生物技术公司研究产品目录并可据此配制。
抗体，例如多克隆抗体，单克隆抗体，重组抗体，嵌合抗体，人化抗体，可以根据任何所需方法制备。也见于筛选重组免疫球蛋白文库(例如Orlandi等，美国科学院院报86：3833-3837，1989；Huse等，科学256：1275-1281，1989)；体外刺激淋巴细胞群，Winter和Milstein，自然349：293-299，1991。例如，针对单克隆抗体的生产，可以将图1和图2的多肽以有效量经皮下和/或腹膜内施用于小鼠，山羊或兔，有或无佐剂，以激发免疫应答。所述抗体也可以是单链或Fab片段。所述抗体可以是IgM，IgG，亚型，IgG2a，IgGI等。抗体和免疫应答也可以通过施用裸DNA而产生。见例如美国专利Nos.5,703,055；5,589,466；5,580,859所述。
用于诱导抗体的FGF或其片段不需要具有生物活性；然而，其在单独或与载体组合的情况下必需具有免疫原性活性。用于诱导FGF特异性抗体的肽可以具有由至少5个氨基酸，优选至少10个氨基酸组成的氨基酸序列。FGF氨基酸的短序列，例如5个氨基酸，可以与另一种蛋白质如匙孔嘁血蓝蛋白融合，或与另一种有用载体融合，所述嵌合分子用于抗体生产。在生产抗体中有用的FGF区域可以凭经验选择，或者可以分析例如从cDNA中推导的GENE氨基酸序列，以确定高免疫原性区域。选择适当表位的分析例如Ausubel FM等(1989，分子生物学通用方案，第2卷，John Wiley &Sons)所述。
产生抗体的有用序列包括例如图1和图2所示顺序的序列。这种序列的抗体可用于区分FGF的不同转录物。见上述。
特定的FGF抗体可用于诊断特征在于FGF数量或分布不同的前病理改变状态，及慢性或急性疾病。针对FGF的诊断测试包括利用抗体和标记以检测人(或小鼠等，如果在使用小鼠的情况中)体液，组织或这种组织的提取物中的FGF。
本发明的多肽和抗体可以加以修饰或不加修饰而使用。通常地，可以将所述多肽和抗体与提供可检测信号的物质共价或非共价结合而标记。本领域已知并且在科技和专利文献中均广泛报道过众多标记和缀合方法。适当的标记包括放射性核素，酶，底物，辅因子，抑制剂，荧光剂，化学发光剂，磁性粒子等。教导使用这种标记的专利包括美国专利Nos.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。
结合FGF的抗体及其它配体可以通过各种方式使用，包括作为治疗，诊断和商业研究手段，以在Western印迹，ELISA，免疫沉淀，RIA中例如确定动物，组织，细胞等中FGF多肽的水平，鉴别其细胞定位和/或分布，纯化或包含其一部分的多肽，调节其功能。本发明涉及这种分析，进行这种分析的组合物和试剂盒。利用这些和其它方法，本发明的抗体可以用于检测各种样品中的FGF多肽或其片段，所述样品包括组织，细胞，体液，血液，尿液，脑脊髓液。
另外，也可以制备结合本发明FGF多肽的配体或其衍生物，例如使用合成的肽文库或aptamers(例如Pitrung等，美国专利No.5,143,854；Geysen等，免疫学方法杂志102：259-274，1987；Scott等，科学249：386，1990；Blackwell等，科学250：1104，1990；Tuerk等，1990，科学249：505)。
本发明还涉及一种根据所需方法制备的FGF多肽，例如美国专利No.5,434,050中所揭示方法。例如在结合分析中可以使用一种标记的多肽，以鉴别结合或附于FGF的物质，追踪在细胞，体外，体内或原位系统中FGF的运动等。
本发明的核酸，多肽，抗体，配体等可以是分离的。术语“分离的”是指物质处于在其原始环境或自然中未发现的形式，即更浓缩，更纯化，从成分中分离等。分离的核酸包括例如具有分离自活动物体中发现的染色体DNA的FGF序列的核酸，例如作为完整基因，转录物或cDNA。这种核酸可以是载体的一部分或插入染色体中(通过在其正常位置之外的位置通过特异基因定向或通过随机整合)，而且仍是分离的，不是其自然环境中发现的形式。本发明的核酸或多肽还可以是基本纯化的。基本纯化是指核酸或多肽是分离的，而且基本没有其它核酸或多肽，即所述核酸或多肽是主要的及活性组分。
本发明还涉及一种包含FGF的转基因动物，例如非人哺乳动物如小鼠转基因动物可以根据已知方法制备，包括例如通过将重组基因原核注射入单细胞胚的原核中，将人工酵母染色体掺入胚胎干细胞中，基因定向方法，胚胎干细胞方法学。见例如美国专利Nos.4,736,866；4,873,191；4,873,316；5,082,779；5,304,489；5,174,986；5,175,384；5,175,385；5,221,778；Gordon等，美国科学院院报77：7380-7384，1980；Palmiter等，细胞41：343-345，1985；Palmiter等，Ann.Rev.Genet.，20：465-499，1986；Askew等，分子细胞生物学13：4115-4124，1993；Games等，自然373：523-527，1995；Valancius和Smithies，分子细胞生物学11：1402-1408，1991；Stacey等，分子细胞生物学14：1009-1016，1994；Hasty等，自然350：243-246，1995；Rubinstein等，核酸研究21：2613-2617，1993。本发明的核酸可以导入任何非人哺乳动物中，包括小鼠(Hogan等，操纵小鼠胚胎实验指南，冷泉港实验室，冷泉港，纽约1986)，猪(Hammer等，自然315：343-345，1985)，绵羊(Hammer等，自然315：343-345，1985)，牛，大鼠或灵长类动物。也见于例如Church，1987，生物技术趋势5：13-19；Clark等，生物技术趋势5：20-24，1987)；及DePamphilis等，生物技术6：662-680，1988。另外，例如特定的转基因大鼠和小鼠具有商业价值。这些转基因动物是测试GENE功能，作为蛇的食物，作为遗传标记以检测株系起源(即其中已经插入FGF-21，FGF-23或其片段)等的有用动物模型。这种转基因动物还可以包含其它转基因。转基因动物可以根据任何适当方法制备及应用。
所述核酸的其它方面参考分子生物学标准教材。见例如Davis等，分子生物学基本方法，Elsevir科学出版公司，纽约，1986；Hames等，核酸杂交，IL出版社，1985；Sambrook等，分子克隆，CSH出版社1989；Howe，基因克隆和操纵，Cambridge大学出版社，1995。
附图简述
图1示出FGF-20的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO：1和2)。
图2示出FGF-23的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO：3和4)。
图3示出FGF-20蛋白与已知FGF家族成员的氨基酸序列对比。xfgf-20来自Xenopus laevis。
图4示出少突胶质细胞增殖。图4A示出少突胶质细胞增殖。图4B示出活性通过煮沸所述蛋白质而废除。
图5示出FGF-20对N20.1少突胶质细胞增殖的作用。
图6示出FGF对初级大鼠少突胶质细胞(PRO)增殖的作用。图6A示出用FGF-2处理的细胞。图6B示出用FGF-20处理的细胞。
图7示出FGF对神经元起源的细胞系存活/增殖的作用。图7A示出FGF-20的作用。图7B示出FGF-2，FGF-9，和FGF-20的作用。
图8示出神经突生长。培养的PC12细胞用重组FGF-20加肝素(左侧)或只用肝素(右侧)处理6天。固定细胞并针对βIII微管蛋白进行染色，细胞核用7-AAD成象。在只用肝素处理的细胞中未观测到神经突生长。
图9示出FGF-20是皮质神经元的强有力存活因子。
实施例
实施例1：少突胶质细胞增殖和存活
用于测定生长因子(GF)对细胞增殖作用的少突胶质细胞是建立的细胞系如N20或初级啮齿动物少突胶质细胞。初级啮齿动物(大鼠)少突胶质细胞和少突胶质细胞祖细胞通过差示粘附技术(Mitrovic，1994)和Percol梯度离心(Mattera等，神经化学研究1984，6(1)41-50；Kim等，神经学杂志1983 Dec：62(1-3)：295-301)分离和纯化。将2.5×104个细胞/ml铺板于96孔平板中进行少突胶质细胞增殖分析。用生长因子刺激细胞3，5和7天。阳性对照物是FGF家族的其它成员，如FGF-2或FGF-9。细胞增殖通过MTT分析和3H胸苷掺入分析测定。
图4，5和6示出FGF20以时间和剂量依赖方式刺激N 20.1少突胶质细胞系的少突胶质细胞增殖。N20.1细胞用FGF-20的部分纯化的肝素琼脂糖层析样品处理。增殖通过MTT染色确定。FGF-20诱导少突胶质细胞增殖(图4A)，而且该活性通过煮沸所述蛋白质而废除(图4B)。
上述观测通过从肝素和S柱中制备部分纯化的物质而证实(图5)。N20.1细胞用来自肝素或S柱的FGF-20处理。将所述细胞与FGF-20温育5天，并通过MTT染色确定相对于未处理对照组的增殖的增加。FGF-9用作阳性对照，并使用适当的相应缓冲液(H和S)作为阴性对照。部分纯化的物质的活性与FGF-9活性相当。
另外，FGF-20诱导初级大鼠少突胶质细胞增殖(图6B)。少突胶质细胞用FGF-2(图6A)和FGF-20(图6B)处理。将细胞与GF温育3天，并通过MTT染色确定超过未处理对照组的增殖增加。部分纯化的物质的活性与FGF-2相当。FGF-20是少突胶质细胞增殖的强有力诱导因子，而且其活性与FGF家族其它成员如FGF-2和FGF-9相当。
实施例2：诱导神经元存活
通过将2.5×104个细胞/ml铺板于96孔平板的低浓度血清培养基中进行神经元存活分析。在这些条件下，神经元由于生长因子的除去而发生细胞程序死亡。将细胞用生长因子刺激不同时间，3天-12天。阳性对照是FGF家族的其它成员如FGF-2或FGF-9。神经元存活通过MTT测定。
图7和图9示出FGF-20是强有力的神经营养因子，可刺激神经元起源细胞存活。
将PC 12细胞铺板于存在低浓度血清(1％Nu血清)的96孔平板中。将包括FGF-20在内的不同生长因子以0.0025-2500ng/ml浓度加入。在7和10天后，用MTT分析测定相对存活率，并与未处理的对照组对比。FGF-20的数据示于图7A，FGF-2，FGF-9和FGF-20的数据示于图7B。
实施例3：诱导神经突生长
FGF-20呈现对PC 12细胞生长有作用。这种作用不依赖于NGF预处理(见表1和图9)。
在此分析中部分纯化的FGF-21的表现与观测到的FGF-9表现相似，它们的序列非常相似。另外，对比FGF家族不同成员在PC 12细胞中诱导神经突生长的活性(FGF-1，FGF-2，FGF-4，FGF-6，FGF-7，FGF-8，FGF-9，FGF-10，FGF-16，FGF-16，FGF17，FGF-18，见表2)。在此系统中诱导神经突生长的最强有力的FGF是FGF-2和FGF-9及FGF-20/21。发现两个FGF，即FGF-7和FGF-10，在该系统中不论肝素存在与否均无活性。
从大鼠胚胎脑(E16)中分离初级大鼠胚胎脑皮质细胞。在显微镜下切下皮质层，并用Hanks溶液洗6次，不用酶处理而机械性解离。将神经元在由以下成分组成的培养基中培养：补加10％马血清，10％FCS，2mM L-谷氨酰胺，HEPES缓冲液的DMEM。在24小时后，加入由10μM FdU和1μM胞嘧啶阿拉伯糖苷组成的抑制剂混合物培养3天，以抑制除了神经元之外所有其它细胞增殖。在培养8天后，收获神经元并铺板于含有低浓度血清(2％Nu血清)培养基的96孔平板中。加入浓度范围在0.0025-2500ng/ml的不同生长因子，包括FGF-20。5天后，用MTT分析测定相对存活率并与未处理的对照对比。
表1：FGF-20在PC 12细胞中是神经突延伸的强有力诱导因子：
如图7所示实验铺板并处理PC 12细胞。加入浓度范围为0.0025-2500ng/ml的FGF-9和FGF-20。在处理7和12天后，神经突延伸通过将所述细胞用Wright染色随后用显微镜检测而确定。％生长(outgrowth)表示估算的细胞数目。
由于FGF-9和FGF20/21处理所诱导的神经突生长的观测概况如下所示。最高浓度的部分纯化的物质对细胞有毒性，其影响存活(见图7B)和神经突生长(如下)。
在PC 12细胞中神经突延伸
生长因子 浓度 ％生长
ng/ml
7天
12天
FGF-9 0 0 0
0.025 ＜5 5
0.25 5 10-20
2.5 5-10 20-30
25 60 60
250 90 100
2500 90-100 100
FGF-21 0 0 0
0.025 ＜5 5
0.25 10 10
2.5 20-30 30
25 50 60
250 90 80
2500 0 0
表2：神经突生长-不同FGF家族成员之间的对比：
培养的PC 12细胞用FGF处理并目测记录神经突生长。FGF 20是测试的FGF家族成员中最强有力的神经营养GF。
加入的FGF 应答
FGF-1(酸性FGF) ++
FGF-2(碱性FGF) ++++
FGF-4 +
FGF-6 +
FGF-7 -
FGF-8 ++
FGF-9 +++
FGF-10 -
FGF-16 +
FGF-17 ++
FGF-18 ++
FGF-21 +++
Claims (33)
1.一种治疗脊髓损伤；脊髓创伤；由缺血发作、梗塞、出血或动脉瘤引起的神经组织损伤；Huntington′s病；脊髓病；脊髓炎；脊髓空洞症的方法，包括为需要治疗的患者施用有效量的FGF-20多肽或其生物活性片段。
2.权利要求1的方法，其中所述FGF-20多肽来源于人。
3.权利要求2的方法，其中所述多肽具有FGF-20特异性免疫原性活性。
4.权利要求1的方法，其中所述多肽包含图1所示第1-211位氨基酸。
5.权利要求1的方法，其中所述多肽与图1所示人FGF-20的第1-211位氨基酸具有95％序列相同性，且所述FGF-20具有FGF活性。
6.权利要求2的方法，其中所述多肽与图1所示人FGF-20的第1-211位氨基酸具有95％序列相同性，且所述FGF-20具有FGF活性。
7.一种治疗脊髓损伤；脊髓创伤；由缺血发作，梗塞，出血或动脉瘤引起的神经组织损伤；Huntington′s病；脊髓病；脊髓炎；脊髓空洞症的方法，包括为需要治疗的患者施用有效量的具有编码FGF-20多肽或其生物活性片段的核苷酸序列的核酸。
8.权利要求7的方法，其中所述核酸来源于人。
9.权利要求8的方法，其中所述核苷酸序列不间断地编码FGF-20。
10.权利要求7的方法，其中所述核苷酸序列与图1所示核苷酸序列具有95％序列相同性。
11.权利要求8的方法，其中所述核苷酸序列与图1所述核苷酸序列具有95％序列相同性。
12一种治疗肾上腺脑白质营养不良，渐进性多病灶脑白质病，脑脊髓炎，Guillian-Barre综合征，异型球蛋白血症，或慢性炎症性脱髓鞘多神经病变的方法，包括为需要治疗的患者施用有效量的具有编码FGF-20多肽或其生物活性片段的核苷酸序列的核酸。
13.权利要求12的方法，其中所述FGF-20多肽来源于人。
14.权利要求13的方法，其中所述多肽具有FGF-20特异性免疫原性活性。
15.权利要求12的方法，其中所述多肽包含图1所述第1-211位氨基酸。
16.权利要求12的方法，其中所述多肽与图1所示人FGF-20的第1-211位氨基酸具有95％序列相同性，且所述FGF-20具有FGF活性。
17.权利要求13的方法，其中所述多肽与图1所示人FGF-20的第1-211位氨基酸具有95％序列相同性，且所述FGF-20具有FGF活性。
18.一种治疗肾上腺脑白质营养不良，渐进性多病灶脑白质病，脑脊髓炎，Guillian-Barre综合征，异型球蛋白血症，或慢性炎症性脱髓鞘多神经病变的方法，包括为需要治疗的患者施用有效量的具有编码FGF-20多肽或其生物活性片段的核苷酸序列的核酸。
19.权利要求18的方法，其中所述核酸来源于人。
20.权利要求19的方法，其中所述核苷酸序列不间断编码FGF-20。
21.权利要求18的方法，其中所述核苷酸序列与图1所示核苷酸序列具有95％序列相同性。
22.权利要求19的方法，其中所述核苷酸序列与图1所示核苷酸序列具有95％序列相同性。
23.一种促进移植物存活的方法，包括为需要治疗的患者施用有效量的FGF-20多肽或其生物活性片段。
24.权利要求23的方法，其中所述FGF-20多肽来源于人。
25.权利要求24的方法，其中所述多肽具有FGF-20特异性免疫原性活性。
26.权利要求23的方法，其中所述多肽包含图1所示第1-211位氨基酸。
27.权利要求23的方法，其中所述多肽与图1所示人FGF-20的第1-211位氨基酸具有95％序列相同性，且所述FGF-20具有FGF活性。
28.权利要求24的方法，其中所述多肽与图1所示人FGF-20的第1-211位氨基酸具有95％序列相同性，且所述FGF-20具有FGF活性。
29.一种促进移植物存活的方法，包括为需要治疗的患者施用有效量的具有编码FGF-20多肽或其生物活性片段的核苷酸序列的核酸。
30.权利要求29的方法，其中所述核酸来源于人。
31.权利要求30的方法，其中所述核苷酸序列不间断编码FGF-20。
32.权利要求29的方法，其中所述核苷酸序列与图1所示核苷酸具有95％序列相同性。
33.权利要求30的方法，其中所述核苷酸序列与图1所示核苷酸序列具有95％序列相同性。
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