BG107888A

BG107888A - Нови "ибробла''ни ра''...жни "ак'ори

Info

Publication number: BG107888A
Application number: BG107888A
Authority: BG
Inventors: Peter W. Bringmann; Daryl Faulds; Branislava Mitrovic; Subha Srinivasan; James Onuffer
Original assignee: Schering Aktiengesellschaft
Priority date: 2000-12-08
Filing date: 2003-06-06
Publication date: 2004-08-31
Also published as: IL156259A0; WO2002046424A3; ZA200305236B; KR20040052442A; HUP0400657A1; RU2329058C2; BR0116507A; US20080057076A1; WO2002046424A2; EE200300269A; NO20032573L; SK7012003A3; NO20032573D0; CA2431374A1; AU2002226034A2; CN1518597A; JP2005506275A; AU2603402A; PL366158A1; EP1389237A2

Description

Фибробластните растежни фактори играят важна роля при голям брой биологични действия, включително, например, клетъчната пролиферация и диференциация, и развитието.

ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Идентифицират се нови нуклеинови киселини, полипептидни последователности и тяхни регулатори от нуклеинови киселини, които кодират за фибробластен растежен фактор (FGF), за предпочитане FGF-20 (наричан FGF-21 във временната заявка, съответстваща на настоящата

FGF-21 във временната заявка, съответстваща на настоящата заявка) или FGF-23 (който е същия, като публикувания FGF22), един клас полипептиди, включени в развитието, диференциацията, и морфогенезата, например, в клеткаклетка предаването на сигнали и клетъчната пролиферация. FGF от настоящото изобретение, негови фрагменти и негови производни, имат една или повече от следните биологични активности, включително, но без да се ограничават до: FGF активност; и FGF-специфична имуногенна активност. В съответствие с настоящото изобретение са били Q идентифицирани най-малко два нови класа, например, FGF-20 и FGF-23.

“FGF акгивонст” означава например, спомагане на зарастването на рани; промотиране на невралното преживявяне; стимулиране на клетъчната пролиферация, например, пролиферация на стволови клетки, фибробласти, неврони, глия, олигодедрити, клетки на Schwann,илина тяхни родителски клетки; модулиране на клетъчната диференциация; индуциране на ембрионалното развитие; стимулиране на невритния продукт; засилване на

О възстановяването от нервно или неврално нараняване;

стимулиране на миелинизирането; стимулиране на ангиогенезата; рецептор свързваща активност; модулиране на туморигенезата, и др.

“FGF-специфична имуногенна активност” означава например, че един FGF полипептид предизвиква имунологичен отговор, който е селективен за FGF, например,имунологичен отговор, който е селективен за FGF20 на бозайници. Следователно, стимулирането на антитела,

Т-клетки, макрофаги, В-клетки, дендритни клетки, и други, от аминокиселинна последователност, избрана от FGF на бозайници, например, FGF от фигури 1 и 2, е специфична имуногенна активност. Този отговор може да се измери рутинно.

FGF, като FGF-20 или -23 е полипептид на бозайник в пълната си дължина, който притежава аминокиселинна последователност, която се получава от природен източник, и която притежава една или повече от горе-посочените активности. Той може да притежава последователности, както посочените на фигури 1 и 2, като притежава отворена рамка на разчитане, която започва с кодон за иницииране и завършва със стоп кодон. Той включва една естествено срещана в природата нормална, една естествено срещана в природата мутантна и естествено срещана в природата полиморфна, включително единичен нуклеотиден полиморфизъм (SNP), и т.н., последователност. Естественият източник включва, например, жими клетки, например, получени от тъкани или цели организми, културални клетъчни линии, включително първични и имортализирани клетъчни линии, тъкани от биопсии и т.н.

Насатоящото изобретение се отнася, също така, до фрагменти на FGF от бозайници. Фрагментите са, за предпочитане, “биологичноактивни”. Под “биологичноакгивни” се има предвид, че полипептидният фрагмент притежава активност в жива система или с компоненти на жива система. Биологичните активности включват тези, вече споменати, например FGF-активност, като FGF-рецептор свързваща активност, и FGF-имуногенна активност. Фрагменти могат да се получат съгласно който и да е желан метод, включително химичен синтез, генно инженерство, продукти на разпадане и др. Биологичен фрагмент на FGF включва полипептиди, които притежават аминокиселинни последователности, отстранени или модифицирани или карлокси- или в амино-терминуса на протеина.

Който и да е, известен на общественоста, фрагмент нуклеинова киселина и фрагмент на полипептид на FGF-20 и на FGF-23, или на тяхни хомоложни фрагменти, се изключват от настоящото изобретение, например, д5762262, което е подобна последователност, идентифицирана от Xenopus laevis. Нуклеотидните и аминокиселинните последователности на достъпните, публикувани аминокиселинни последователности могат да се идентифицират чрез търсене в достъпни за обществото бази данни.

Настоящото изобретение се отнася, също така до FGF20, който притежава изведена последователност на аминокиселини 1 до 211, както е посочено на фигура 1, и FGF23, който притежава изведана последователност на аминокиселини 1 до 169, както е посочено на фигура 2. FGF20 има предполагаемо молекулно тегло от приблизително 23,5 kDal и предполагаемо pl от приблизително 9,25. FGF-23 има предполагаемо молекулно тегло от приблизително 19,6 kDal и предполагаемо pl от приблизително 12,32.

За протеините, степен на идентичност означава известен брой идентични аминокиселини/общия брой аминокиселинни остатъци в протеина. Степен на иденетичност означава (известен брой идентични аминокиселинни остатъци плюс известен брой консервативно заместен аминокиселини (като V за L, и т.н.)/общия брой аминокиселинни остатъци. За идентичността на ДНК е същото, както подобоността и означава брой идентични нуклеотиди/общата дължина.

FGF полипептид от изобретението, например, който притежава имуногенна активност, както посочената на фигури 1 и 2, може да бъде анализиран чрез който и да е подходящ метод за идентифициране на други структурни и/или функционални домени в полипептида, включително, области, разпростиращи се на повърхноста на мембраната, хидрофобни области. Напаример, FGF полипептид може да се © анализира чрез методи, описани в, например, Kyte and

Doolittle, Mol. Bio., 157:105,1982; EMBL Protein Predict; Rostand Sander, Proteins, 19:55-72, 1994.

Други хомолози на FGF-и от настоящото изобретение могат да се получат от източници бозайници и не-бозайници, съгласно многобройни методи. Например, хибридизиране с олигонуклеотиди, произлезли от фигури 1 и 2, могат да се използуват за избор на хомолози, например, както е описано в Sambrook et al., Molecular Cloning, Chapter 11, 1989. такива хомолози могат да притежават варираща степен на © идентичност и подобност на нуклеотидна и аминокиселинна последователности към GENE. Организмите бозайници включват, например, гризачи, мишки, хамстери, маймуни, прасета, крави и т.н. Организмите не-бозайници включват, например, гръбначни, безгръбначни, риба зебра, пилета, Drosophila, С. elegans, Xenopus, дрожди, като S. pombe, S. cerevisiae, кръгли червеи, прокариоти, растения, вируси Arbabidopsis, artemia и т.н.

Изобретението се отнася, също така, до FGFспецифичени аминокиселинни последователности, например, дефинирана аминокиселинна последователност, която се открива в определената последователност от фигури 1 и 2, консервативни аминокиселинни мотиви, открити в FGF-и от настоящото изобретение. Сравнения между свързаните протеини, като други свързани FGF-и (виж например, Venkataraman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96:3658-3663, 1999), могаат да се използуват за избор на специфични за FGF-и последоваотел ности.

Напаример, протеиновите последователности на FGF-20 и FGF23 са линеаризирани, и се генерират аминокиселинните мотиви на осоновата на консервативини области на хомоложност, както е посочено на фигури 1 и 2. Настоящото изобретение се отнася до която и да е последователност на нуклеинова киселина или на полипептид, например, полипептиди, които включват три или повече консервативни или хомоложни остатъци, като например, LYGS, HFLP, VQGTR, RIEENGHNTY, QFEENWYNTY, AGTPSA, AAERSA, и т.н.други специфични и/или консервативни аминокиселинни посредователности могат рутинно да се открият, например, чрез търсене на ген/протеин база данни, при използуване на BLAST комплект за компютърна програма. Една FGFспецифична аминокиселинна последователност или мотив може да е полезен за продуциране на пептиди, като антигени за генериране на имунен отговор, специфичен към него. Антителата, получени чрез такова имунизиране могат да се използуват, като специфична проба за FGF протеин от базайник за диагностични или изследователски цели.

Както е споменато, полипетидите от настоящото изобретение могат да включват различни аминокиселинни последователности за FGF (например, последователност в пълна дължина, т.е., притежаваща стартовкодон и стоп кодон, както е показано на фигури 1 и 2, зряла аминокиселинна последователност (т.е., където FGF полипептидът се продубира като предшественик, който се преработва в зрял полипептид, или негов фрагмент). Полезните фрагменти включват, например, фрагменти, съдържащи или състоящи се по същество от, който и да е от горе-посочените домени и © специфични и консервативни аминокиселинни последователности.

Фрагмент на FGF полипептид от настоящото изобретение може да се избира да притежава специфична биологична активност, например, FGF рецептор-свързваща активност или имуногенна активност.

Измерването на тези активности е описано по-долу и в примерите за изпълнение на изобретението. Тези пептиди могат, също така, да се идентифицират и да се получат, както е описано в ЕР 496 162. един полезен фрагмент воже да С съдържа, или да се състои по същество от, например, приблизително девет съседни аминокиселини, за предпочтане приблизително 10, 15, 20, 30, 40, и т.н., съседни аминокиселини от фигури 1 и 2.

Полипептидът от настоящото изобретение може, също така, да има 100% или по-малко аминокиселинна идентичност за аминокиселинните последователности посочени на фигури 1 и 2. за целите на следващото разглеждане: Идентичност на последователности означава, че същата нуклеотидна или аминокиселинна последователноста, която се открива в последователността, установена на фигури 1 и 2, си жгкршво но съответната позиция в последователността, с коя(и)то се сравнява(т). Полипептид, който притежава по-малко от 100% идентичност на последователностите спрямо аминокиселинните последователности, посочени на фигури 1 и 2 може да съдържа разлиични замествания от естествено съществуващата в природата последователност, включително хомоложни и не-хомоложни аминокиселинни замествания. Виж по-долу за примери на хомоложни аминокиселинни 0 замествания. Сумата от идентичните и хомоложните остатъци, разделена на общия брой остатъци в последователността спрямо която се сравнява FGF полипептида е равна на процента на подобност на последователностите. С цел да се изчисли идентичността и подобността на последователности, сравняваните последователности могат да се линеаризират и да се изчисли съгласно който и да е желан метод, алгоритъм, компютърна програма и т.н., включително, например, FASTA, BLAST. Порлипептид, който притежава по-малко от 100% идентичност на последователностите спрямо аминоС киселинните последователности от фигури 1 и 2 може да притежава приблизително 99%, 98%, 97%, 95%, 90,5%, 90%, 85%, 70% или толкова ниско, до 60% идентичност на последователностите.

Настоящото изобретене се отнася, също така, до мутеини на FGF полипептида на FGF-21 и FGF-23, т.е., полипептид, който има аминокиселинна последователност, която се отличава по аминокиселинна последователност от аминокиселинна последователноста, която може да се получи природен източник (фрагмент на FGF от бозайник не се различава по аминокиселинна последователност от естествено съществуващия в природата FGF, въпреки че се различава по брой на аминокиселини). Следователно, мутеини на FGF полипептида включват аминокиселинни замествания, инсерции, и делеции, включително не срещани естествено в природата аминокиселини.

Мутеини на FGF аминокиселинна последователност от изобретението могат, също така, да се получат на основата на търсене на хомоложност от база данни на генна банка, ф наапример, Genbank, EMBL. Търсенето на хомоложност на последователности може да се извърши при използуване на различни методи, включително алгоритми, описани в BLAST семейството от компютърни програми, Smith-Waterman алгоритъм, и др. Мутеинът(ите) може да се въведе в последователност чрез идентифициране и линеаризиране на амнокиселините в домен, които са идентични и/или хомоложни между полипептиди и след това да се модифицира една аминокиселина, основана на такова линеаризиране. В действителност, FGF от настоящото изобретение споделя С идентичност на последователности с различни известни

FGFn, например, Venkataraman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96:3658-3663, 1999. Линеаризирането между тези полипептиди, по-специално при консервативните аминокисерлинни остатъци, идентифицирани в таблица 1 на Venkataraman et al., аминокиселинни замествания, могат да идентифицират остатъци, чиято модификация би се очаквало да редуцира, да намалява, или да елиминира биологичната активност на FGF, като рецептор-свързваща активност, и т.н.

В действителност, когато линеаризирането разкрива идентични аминокиселини запазени (консервирани) между два или повече домена, може да се очаква елиминиране или заместване на аминокиселината(ите), за да се въздейства противоположно на неговата биологична активност.

Аминокиселинното заместване може да се проведе чрез заместване на една хомоложна аминокиселина с друга.хомоложните аминокиселини могат да се идентифицират на основата на размера на страничната верига и степента на поларизация, включително, малки Q неполярни: цистеин, пролин, аланин, треонин; малки полярни:серин, глицин, аспартат, аспарагин; големи полярни: глутамат, глутамин, лизин, аргинин; междинна полярност: тирозин, хистидин, триптофан; големи неполярни: фенилаланин, метионин, левцин, изолевцин, валин. Хомоложните киселини могат, също така, да се групират както следва: незаредени полярни R групи, глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин, глутамин; кисели аминокиселини (негативно заредени), аспартатна киселина и глутаматна киселина; базични аминокиселини (положително заредени), С лизин, аргинин, хистидин. Хомоложни аминокиселини включват, също така, тези описани от Dayhoff в Atlas of Protein Sequences and Structure 5, 1978 и от Argos в ЕПФД Тлр 8, 779785, 1989.

Изобретението се отнася до мутеен на полипептиди и мутеин на нуклеинови киселини, кодиращи за такива полипептиди. Следователно, настоящото изобретение се отнася до нуклеотидни последователности от фигури 1 и 2, където посочените нуклеинови киселини кодират за полипептид и една или повече аминокиселининни позиции са заместени или делетирани, или и двете, и кодираният полипептид от нуклеиновите киселини притежава биологична активност, като усилване възстановяването от нерво или неврално нарушение. Мутеин на полипептид и съответстващите му нуклеотидни кодиращи последователности, може да притежава аминокиселинна последователност, както е показано на фигури 1 и 2, с изключение на това, че една или две позиции са заместени от хомоложни аминокиселини, например, където те са 1, 5,10,15 © или 20 замествания. По какъв начин модификациите влиаят върху посочените активности, се измерва съгласно гореописаните методи, по-долу, и каквито познават специалистите в областа. Например, мнвогобройни методи за изпитване на FGF активност са известни от предшестващото състояние на техниката, например, опити, които измерват преживяемоста на неврона и други невропатични активности, като описаните в примерите и от Kanda et al., Int. J. Devi. Neuroscience, 12(3): 191-200, 1999, и FGF рецептор-свързваща активност.

Както е споменато, аминокиселинните замествания © могат, също така, да се осъществят на основата на аналогия със свързани други FGF-и. Други мутациии могат да се подберат рутинно чрез модифициране или мутиране на нуклеотидна последователност от фигури 1 и 2, и селекциониране на тези мутации, които засягат една или повече от неговите активности, например, чрез измерване на активноста съгласно методите и примерите, описани по-долу.

FGF от бозайник от настоящото изобретение, негови фрагменти или заместен полипептид могат да включват, също така, многобройни модификации, като такива модификации включват модификация на липиди, метилиране, фосфорилиране, гликозилиране, ковалентни модификации (например, на R-група на аминокиселина), замествания на аминокиселини, делетиране на аминокиселини или прибавяне на аминокиселини. Модификации на полипептида могет да се осъществят съгласно многобройни методи, включително рекомбинантни, синтетични, химични, и т.н.

Полипептиди от настоящото изобретение (например,в пълна дължина, тяхни фрагменти, тяхни мутации и др.) могат да се използуват по многобройни начини, например, при изследвания, като имуногени за антитела, както е описано подолу, като биологичноакгивни средства (например, които притежават една или повече активности асоциирани с FGF от настоящото изобретение).

Полипептид, който кодира за FGF от настоящото изобретение, негово производно или негов фрагмент, може да се комбинира с един или повече структурни домени, функционални домени, откриваеми домени, антигенни домени, и/или желан полипептид представляващ интерес, при едно подреждане, което не се среща в природата, т.е., не е естествено срещано. Полипетид, включващ такива характеристики е химерен или слят полипептид.един такъв химерен полипептид може да се получи съгласно многобройни методи, включително, химични, синтетични, полусинтетични и/или рекомбинантни методи. Химерна нуклеинова киселина, кодираща за химерен полипептид може да съдържа различните домени или желани полипептид в непрекасната (непример, с множество N-терминални домени за стабилизиране или засилване на активноста) или прекъсната отворена рамка на разчитане, например, която да съдържа интрони, сайтове на снаждане, енхансери и др.химерната нуклеинова киселина може да се получи съгласно многобройни методи. Виж, например, патент на САЩ № 5,439,819. домен или желан полипептид може да притежава която и да е желана способност, включително, биологична функция, като подаване на сигнал, спомагане на растежа, клетъчно насочване (например, сигнална последователност, насочваща последователност, като насочване към © ендоплазматичния ретикулум или ядрото), и т.н., структурна функция, като хидрофобност, хидрофилност, мембранаразпростиране, и др., комбинирано с ензим, флуоресцентен полипептид, зелен флуоресцентен протеин, (Chalifie et al., Science, 263:802, 1994; Cheng et al., Nature Biotechnology, 14:606, 1996; Levy et al., Nature Biotechnology, 14:610, 1996), и т.н. В допълнение, полипептид или негова част, може да се използува като селекционен маркар, когато се въведе в клетка гостоприемник. Например, нуклеинова киселина, кодираща за една аминокиселинна последователност съгласно настоящото © изобретение може да се слее в рамка към желана кодираща последователност и да действа като tag за целите на пречистване, селекция, маркиране. Областта на сбиване може да кодира сайт на разцепване, за улесняване експресията, изолирането, пречистването и т.н.

Полипептид, съгласно настоящото изобретение може да се получи в експресионна система, например, in vitro, in vivo, безклетъчно, рекомбинантно, клетъчно сливане, и др., съгласно настоящото изобретение. Модификации на полипептида, придадени от такива системи включват гликозилиране, аминокиселинно заместване (например, чрез разннобразяване на използуването на кодони), преработване на полипептида, като смилане, разцепване или екзопептидазна активност, прикрепяне на химични части, включително липиди и фосфати, и др.

Полипептид съгласно настоящото изобретение може да се извлече от естествени източници, трансформирани клитки гостопримници (културална среда и клетки) съгласно обичайните методи, включително, екстрахиране с детергент (например, не-йонен детергент, Triton Х-100, CHAPS, окгилглюкозид, Igepal СА-630), преципитация с амониев сулфат или с етанолн, киселинна екстракция, анйонно или катйонно обменна хроматография, фосфоцелулозна хроматография, хроматография на хидрофобно взаимодействие, хидроксипатитна хроматография, пектинова хроматография, гел електрофореза.етапите на пренагъване на протеина могат да се използуват, при необходимост, при завършване на зрелия протеин. Накрая, високоефективна течна хроматография (ВЕТХ) може да се използува за етапа на пречистване. FGF полепептид може, също така, да се изолира, както е описано за други FGF протеини, както е известно на специалистите в областа, например, както е описано в следното, в което се описва изолирането на различни FGF-и, патент на САЩ № 5,604,923; 5,395,765; 5,155,214; 4,902,782 и Santos-Ocampo et al., J. Biol. Chem., 271:1726-1731, 1996 (пречистване на FGF от гостоприемник бактерия, като Е. coli). Друг подход е да се експресира FGF рекомбинантно с афинитентна tag (Flag епитоп, -НА епитоп, myc епитоп, 6xHis, малтоза-свързващ протеин, хитиназа, и т.н.), с последващо пречистване чрез анти-tag антитялоконюгирана афинитетна хроматография.

Настоящото изоберетение се отнася, също така, до нуклеинови киселини, като ДНК и РНК, кодиращи за FGF полипептиди, и тяхни фрагменти, от настоящото изоберетине. FGF нуклеинова киселина (като FGF-20 или -23), или нейни фрагменти е нуклеинова киселина, която притежава нуклеотидна последователтост, която може да се получи от естествен източник. Тя включва, следователно, естествено © срещани в природата, нормални, естествено срещани в природата мутантни, и естествено срещани в природата полиморфни алели (например, SNPs) и др. Естествените източници включват, например, живи клетки, получени от тъкани и цели организми, тумори, култивирани клетъчни линии, включително първични и имортализирани клетъчни линии.

Последователност на нуклеинови киселини от изобретението може да включва пълната кодираща последователност, както е показано на фигури 1 и 2, тяхната © последователност в разпад и нейни фрагмент. Нуклеинова киселина, съгласно настоящото изобретение може да включва, също така, нуклеинова последователност, която е 100% комплементарна, например, анти-сенс, спрямо който и да е нуклеотид споменат по-горе или по-долу.

Нуклеинова киселина, съгласно настоящото изобретение, може да се получи от голям брой различни източници. Тя може да се получи от ДНК или РНК, като полиаденилирана иРНК, например, изолерана от тъкани, клетки или цял организм. Нуклеиновата киселина може да се получи директно от ДНК или РНК, или от сДНК библиотека. Нуклеиновата киселина може да се получи от клетка или тъкан (например, клетки от сърце на ембрион или на възрастен или скелетни клетки или тъканни) в определен етап на развитие, притежаващи желан генотип, фенотип и т.н.

Както е описано по-горе за FGF полипептида, нуклеинова киселина, съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща за полипептид съгласно настоящото изобретение може да включва единствено кодираща последователност © кодираща последователност и допълнителна кодираща последователност (например, кодираща за лидерен, секреторен, насочващ, ензимен, флуоресцентен или други диагностични пептиди), кодиращи последователности и некодиращи последователности, например, нетранслирани последователност или в 3’ или в 5’ края, или разпръснати в кодиращата последователност, например, интрони. Нуклеинова киселина, съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща без прекъсване за полипептид означава, че нуклеотидната последователност съдържа С аминокиселинна кодираща последователност за FGF, с некодиращи нуклеотиди прекъсващи или взимащи участие в кодиращата последователност, например, липсващ(и) интрон(и). Такава нуклеотидна последователност може да се опиши, също така, като съседна. Геномна ДНК, кодираща за FGF ген на човек, мишка или друг бозайник и т.н., може да се получи рутинно.нуклеинова киселина съгласно настоящото изобретение може да съдържа контролираща експресията последователност, операционно свързана към нуклеинова киселина, както е описано по-горе. Изразът “последователност контролираща експресията“ означава последователност на нуклеинова киселина, която регулира експресията на полипептида, кодиран от нуклеинова киселина, към която е операционно свързан. Експресията може да се регулира на нивото на иРНК или на пептида. Следователно, последователността контролираща експресията включва иРНК-свързани елементи и протеин-свързани елементитакива елементи включват промотори, енхансери (вирусни или клетъчни), последователност за свързване на рибозомата, ф терминатори на транскрипцията и др. Последователност контролираща експресията е операционно свързана към последователност нуклеотидна кодираща последователност, когато последователността контролираща експресията е позиционирана така, че да влияе върху или да осъществява експресия на кодиращата последователност.например, когато промотор е операционно свързан в 5’ към кодираща последователност, експресията на кодиращата последователност се насочва от промотора. Последователността контролираща експресията може да е С хетероложна или ендогенна за нормалния ген.

Нуклеинова киселина, съгласно настоящото изобретение може да се избере на основата на хибридизацията на нуклеиновите киселини. Способността на препарати на две еденоверижни нуклеинови киселини да хибридизират една с друга е измерение на комплементарността на тяхните последователности, например, сдвояване на бази (образуване на базови двойки) между нуклеотиди, както А-Т, G-С и т.н. Следователно, изобретението се отнася, също така, до нуклеинови киселини и до тяхните комплементи, които хибридизират към нуклеинови киселини, включващи нуклеотидна последователност, както е посочено на фигури 1 и 2. Нуклеотидна последователност, която хибридизира с последната последователност има комплементарна верига на нуклеинова киселина, или действа, като матрица за някой в присъствие на полимераза (т.е., подходящ ензим за синтез на нуклеинова киселина). Насатоящото изобретение включва и двете вериги на нуклеинова киселина, например, сенсверигата и анти-сенс веригата.

ф Условията на хибридизацията могат да се подберат за избор на нуклеинови киселини, които да имот желано количество на комплементарност на нуклеотиди с нуклеотидна последователност, както е посочено на фигури 1 и 2. Нуклеинова киселина, способна да хиибридизира към такава последователност, за предпочитане има, например, приблизително 85%, по-придпочитано 90%, и найпредпочитано 95%, 97% или 100% комплементарност между последователностите. Настоящото изобретение се отнася поспециално до последователности на нуклеинови киселини, © които хибридизират към нуклеотидни последователност, както е посочено на фигури 1 и 2. при слаби или високи условия на стррогост.

Нуклеиновите киселини, които хибридизират към FGF последователности могат да се изберат по различни начини. Напаример, блот (т.е., матрица, съдържаща нуклеинова киселина), chip пространства, и други матрици, съдържащи нуклеинови киселини, представляващи интерес, могат да се инкубират в разтвор за хибридизиране (6 х SSC, 0,5% SDS,

100 pg/ml денатурирана ДНК от сперма на сьомга , 5 х разтвор на Denhart и 50% формамид) при 30°С през цялата нощ, с последващо хибридизиране с проба на откриваеми олигонуклеотиди, (виж по-долу) в разтвор за хибридизиране (6 х SSC, 0,5% SDS, 100 pg/ml денатурирана ДНК от сперма на сьомга , 5 х разтвор на Denhart и 50% формамид) при 42°С през цялата нощ, съгласно известни процедури. Блотовете (петната) могат да се промият при условия на висока строгост, които позволяват, например, по-малко от 5% Ьр грешка (наапример, промиване двукратно с 0,1% SSC и 0,1% SDS за 30 минути при 65°С), т.е., избиране на последователности, които притежават 95% или повече на идентичност на последователности. Друг, неограничаващ пример за условия на висока строгост включва крайно промиване при 65°С във воден буфар, съдържащ 10 mM NaCI и 0,5% SDS. Друг пример за услоавия на висока строгост е хибридизиране в 7% SDS, 0,5 М NaPO₄, pH 7,1 mM EDTA при 50°С, например, цяла нощ, следвано от едно или повече промивания с 1% SDS при 42°С.

Докато промиванията при висока строгост позволавят помалко от 5% грешка, условия на по-мека строгост или на ниска строгост (например, двукратно промиване в 0,2%SSC и 0,5% SDS за 30 минути при 37°С) може да позволи до 20% грешка. Друг неограничаващ пример на условия на ниска строгост включва крайно промиване при 42°С във бюфер, съдържащ 30 mM NaCI и 0,5% SDS. Промиването и хиибридизирането могат да се осъществят, също така, както е описано в Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989, Chapter 9.

Хибридизирането може да се базира, също така, върху изчислявено на температурата на топене (Тт) наобразувания хибрид между пробата и нейната мишена, както е описано в Sambrook et al. Обикновено, Тт температурата, при която къс олигонуклеотид (съдържащ 18 нуклеотида или по-малко) ще се разтопи от неговата последователност-цел се дава чрез следното уравнение: Тт = (броя на А-та и Т-та) х 2°С + (броя на С-та и G-та) х 4°С. За по-дълги молекули, Тт = 81,5 + 16,61 log 10 [Na+] + 0,41 (%GC) - 600/N, където [Na+] е моларната концентрация на натриеви йони, %GC е процента на GC базови двойки в проба, а N е дължината. Хибридизацията може да се осъществи на няколко градуса под тази температура, за да се осигури пробата и целта да могат да хибридизират. Грешките биха могли да се позволят чрез намаляване на температурата даже повече.

Могат да се изберат условия на строгост за изолиране на последователности и тяхните комплементи, които имат, например, на-малко 95%, за предпочитане 97% комплементарност на нуклеотиди между пробата (например, един олигонуклеотид на FGF и нуклеинова киселина мишена).

Съгласно настоящото изобретение, нуклеинова киселина или полипептид може да съдържа един или повече различни нуклеотидни или аминокиселинни последователности, показани на фигури 1 и 2. Промяната или модифицирането на нуклеотидна и/или аминокиселинна последователност може да се осъществи чрез който и да е възможен метод, включително насочен или случаен мутагенез.

Нуклеинова киселина, която кодира за FGF на бозайник, като FGF-20 или -23, съгласно изобретението, може да включва нуклеотиди, които се срещат в естествено срещани в природата гени, например, естествено срещани в природата полиморфизми, нормални или мутантни алели (нуклеотид или аминокиселина), мутации, които се откриват в естествено срещани в природата популации на бозайници, като хора, маймуни, прасета, мишки, плъхове или зайци. Например, човешка нуклеинова киселина или полипептид включва нуклеотиди или аминокиселини, които се срещат в естествено срещана в природата човешке популация. Под термина естествено срещан в природата се разбира, че нуклеиновата 0 киселина се получава от природен източник, например, животински тъкани и клетки, телесни течности, тъканни клетъчни култури, съдебно-медицински проби. Естествено срещани в природата мутации могат да включват делеции (например, съкратен амино- или карбокси край), замествания, инверсии или прибавяне на нуклеотидна последователност. Тези гени могат да се открият и да се изолират чрез хибридизиране на нуклеинови киселини, съгласно методи, които са извескни на специалистите в областа. Нуклеинова последователност, която кодира за FGF на бозайник може да С съдържакодони, открити в естествено срещан в природата ген, транскрипт или сДНК, например, както е посочено на фигури 1 и 2, или може да съдържа кодони от разпада на генетичния код, които кодират за същите аминокиселинни последователности. В действителност, може да се окаже желателно да се променят кодоните в последователността, за да се оптимизира последователноста за експресиране в желания гостоприемник.

Нуклеинова киселина, съгласно настоящото изобретение, може да включва например, ДНК, РНК, синтетична нуклеинова киселина, пептид нуклеинова киселина, модифицирани нуклеотиди или смеси. ДНК-а може да е двуверижна или едноверижна. Нуклеотиди, които включват нуклеинова киселина могат да се присъединят чрез различни известни начини за прикрепяне), например, естер, сулфамид, фосфоротиоат, фосфорамидат,, метилфосфонат, карбамат, и др. според желаната цел за постигане, например, резистентност на нуклеази, като РНаза Н, подобрена in vivo стабилност, и т.н. Виж например, патент на САЩ № 5,378,825.

Многобройни модификации могат дасе осъществят върху нуклеиновите киселини, като прикрепяне на откриваеми маркери (авидин, биотин, радиоактивни елементи), частици, които подобряват хибридизиацията, откриването или стабилноста. Нуклеиновите киселини могат да бадът, също така, прикрепени към твърди подложки, например, нитроцелулоза, магнитни или парамагнитни микросфери (например, както е описано в патент на САЩ № 5,411,863; САЩ № 5,543,289, съдържащи феромагнитни, супермагнитни, поромагнитни, суперпарамагнитни, железен оксид и пализахарид), найлон, агароза, диазотизирана целулоза, твървди латексови микросфери, пориакриламиди, и др., съгласно един желан четод. Виж например, патенти на САЩ № 5,470,967; 5,476,925; 5,478,893.

Един друг аспект на настоящото изобретение се отнася до олигонуклеотиди или проби на нуклеинови киселини. Такива олигонуклеотиди или проби нуклеинови киселини могат да се използуват, например, за откриване, или изолиране на FGF нуклеинова киселина от бозайници в тестова проба, или за идентифициране на FGF хомолози. При един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, нуклеиновите киселини могат да се използуват, като олигонуклеотидни проби, например при PCR, диференциирано изображение, генни chips (например, Affytmetrix GeneChips; U.S. Pat. No 5,143,854; U.S. Pat. No 5,424,186; U.S. Pat. No 5,874,219; PCT WO 92/10092; PCT WO 90/15070;), и други достъпни методи. Откриването може да е желателно по многобройни различини причини, включително 0 за изследвания, диагностициране и съдебна медицина. За диагностични цели може да е желателно да се идентифицира наличието или количеството на последователност на нуклеинова киселина в проба, когато пробата се получава от тъкан, клетки, телесни течности и др. При един предпочитан метод, настоящото изобретение се отнася до метод за откриване на нуклеинова киселина, като включва привеждането в контакт на нуклеинова киселина мишена в тест-проба с олигонуклеотид, при условия, ефективни за постигане на хибридизация между мишената и © олигонуклеотида;и до откриване на хибридизация.

Един олигонуклеотид, в съответствие с изобретението може, сащо така, да се използува при синтетичното амплифициране на нуклеинова киселина, като PCR (например Saiki et al., Science, 241:53, 1988; U.S. Pat. No 4,683,202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, New York, 1990); диференциално изображение (виж например, Liang et al., Nucl. Acad. Res., 21:3269-3275; U.S. Pat. No 5,599,672; WO 97/18454).

Откриването може да се проведе в комбинация с олигонуклеотиди за други гени, например, гени включени в трансдукцията на сигнали, растежа, рак, апоптоза, или който и да е от гените, цитирани по-горе, или по-долу. Олигонуклеотидите могат, също така, да се използуват за тестване на мутации, например, при използуване на технология за поправане на ДНК грешки, както е описано в U.S. Pat. No 5,683,877; U.S. Pat. No 5,656,430; Wu et al., Poc. Natl. Acad. Sci., 89:8779-8783, 1992.

Олигонуклеотидите от настоящото изобретение могат да Q включват която и да е непрекъсната нуклеотидна последователност от фигури 1 и 2 или нейн комплемент, или който от последователностите или нейните комплементи. Тези олигонуклеотиди (нуклеинови киселини), съгласно настоящото изобретение, могат да са с какьвто и да е желан размер, например, приблизително 10-200 нуклеотида, 12-100, за предпочитане 12-50, 12-25, 14.16, най-малко приблизително15, най-малко приблизително 20, най-малко приблизително 25, и т.н. олигонуклеотидите могат да притежават нуклеотиди, не срещани естаствено в природата, С например, инозин, AZT, ЗТС, и др. Олигонуклеотидите могат да притежават 100% идентичност или комплементарност с последователностите от фигури 1 и 2, или да има грешки или замествания на нуклеотиди, например, 1, 2, 3, 4, или 5 замествания, например, олигонуклеотидите могат да притежават 70-99% идентичност, например90, 95 или 97% идентичност с последователностите от фигури 1 и 2.съгласно настоящото изобретение, олигонуклеотидът може да включва набор, при което наборът съдържа желан буфер (например, фосфатен, tris и др.), състави за откриване, и др. Олигонуклеотидът може да е маркиран или да не е маркиран, с радиоактивни или нерадиоактивни маркери, както е известно от предшестващото състояние на техниката.

Друг аспект на настоящото изобретение е нуклеотидна последователност, която е уникална за FGF на бозайници. Под уникална последователност се има предвид определено подреждане на нуклеотиди, който се срещат в FGF, например, нуклеотидни последователности от фигури 1 и 2, но рядко или не често, при други нуклеинови киселини, по-специално не в © животинска нуклеинова киселина, за предпочитане бозайник, като човек, плъх, мишка и др. уникална нуклеинова последователност включва последователностите, или тяхните комплементи, кодиращи за аминокиселини, както са посочени на 1 и 2 и на фигури 1 и 2. Такива последователности могат да се използуват като проби в който и да е от методите , описани в настоящото, или да се инкорпорират като справка. Включват се и двете, сенс и антисенс нуклеотидните последователности. Уникална нуклеинова киселина съгласно настоящото изобретение може да се определи рутинно. © Нуклеинова киселина, която притежава такава уникална последователност може да се използува като проба за хибриздизиране за идентифициране наличието на .например, FGF от човек или от мишка, в проба, съдържаща смес от нуклеинови киселини, напримен, Norterthern blot. Хибридизирането може да се осъществи при много стори условия (виж по-горе), за да се изберат нуклеинови киселини (и тяхните комплементи, които могат да съдържат кодиращата последователност), които притежават най-малко 95% идентичност (т.е., комплементарност) към пробата, но по-меки условия могат да се използуват, също така. Уникална FGF нуклеотидна последователност също може да е слята в рамка, или в нейния 5’ или 3’ край, към различни нуклеотидни последователности, както е споменато в патента, включително кодиращи последователности за други участъци на FGF, ензими, GFP, и др., последователности за контрол на експресията и др.

Както вече бе обдъждано, хибридизирането може да се проведе при различни условия, сдпоред желаната С' селективност, например, както е описано в Sambrook et al.,

Molecular Cloning, 1989. например, за специалното откриване на FGF от настоящото изобретение, един олигонуклеотид може да се хибридизира към нуклеинова киселина мишена, при условия, при които олигонуклеотидът единствено се хибридизира с него, например, когато олигонуклеотидът е 100% комплементарен на мишената. Могат да се използуват различни условия, ако това е желателно за избора на муклеинова киселина мишена, която да има най-малко 100% комплементарност на нуклеотидите, най. малко © приблизително, например, 99%, 97%, 95%, 90%, 86,4%, 85%,

70%, 67%.

Нуклеиновата киселина, съгласно настоящото изобретение, може да се маркира в съответствие с който и да е желан метод. Нуклеиновата киселина може да се маркира при използуване на радиоактивни маркери, като ³²Р, ³³S, ¹²⁵1, ³Н или ¹⁴С, за да се споменат някои често използувани маркери. Радиоактивното белязане може да се проведе съгласно който и да е метод, като например, терминално белязане на 3’ или 5’ края, при използуване на радиобелязан нуклеотид, полинуклеотид киназа (със или без дефосфорилиране с фосфатаза) или лигаза (според края, който трябва да се маркира). Може да се използува, също така, и не-радиоактивно белязане, като се комбинира нуклеинова киселина от настоящото изобретение с остатъци, притежаващи имунологични свойства (антигени, хептени), специфичен афинитет към някои реагенти (лиганди), свойства, позволяващи откриваеми ензимни реакции да се завършат (ензими или коензими, ензимни субстрати, или други © вещества, въвлечени в една ензимна реакция), или характерни физични свойства, като флуоресценция или емисия (излъчване) или абсорбция на светлина с желана дължина на вълната, и др.

Нуклеинова киселина, съгласно настоящото изобретение, включително олигонуклеотиди, антисенс нуклеинови киселини, и др., могат да се използуват за откриване на експресия на FGF в цели органи, тъкани, клетки, др., чрез различни техники, включителноМогИпегп blot, PCR, in situ хибридизиране, диференциално изображение, области на © нуклеинови киселини, дот-блот (точкова накапване), и др.

Такива нуклеинови киселини могат да бъдат изключително полезни за откриване на нарушена експресия, например, клетъчно специфични и/или субклетъчни изменения, на FGF. Нивата на FGF могат да се определят самостоятелно или в комбинация с други генни продукти, по-специално други генни продукти, включени в невралната физиология.

Нуклеинова киселина, съгласно настоящото изобретение може да се експресира в голямо разнообразие от различни системи, in vitro и in vivo, съгласно желаното предназначение. Например, нуклеинова киселина може да се инсерири в експресионен вектор, въведен в желания гостоприемник, и да се култивира при условия, ефективини за постигането на експресия на полипептид, кодиран от нуклеиновата киселина. Ефективните условия включват което и да е културално условие, което е подходящо за постигане на продукция на полипептида от клетката гостоприемник, включително ефективни температури, pH, среда, добавки към средата, в която се култивира клетката гостоприемник (например, ф добавки, които ампбифицират или индуцират експресията, като бутират, или метотрексат, ако кодиращата нуклеинова киселина е съседна на dhfr гена), ;иклохексимид, клетъчни плътности, културални съдове, и др. Нуклеинова киселина може да се въведе в клеткътъ чрез който и да е ефективен метод, например, оголена ДНК, калциево фосфатно утаяване, елекгропорация, инжектиране, DEAD-Dextran медиирано трансфекция, сливане с липозоми, асоцииране със средства, които усилват неговото приемани от клетките, вирусна трансфекция. Клетка, в която е въведена нуклеинова © киселина, съгласно настоящото изобретение, е трансформирана клетка гостоприемник. Нуклеиновата киселина може да е екстрахромозомална или интегрирана в хромозома(и) на клетката гостоприемник. Може да е стабилен или преходен.експресионен вектор се избира за неговата съвместимост с клетката гостоприемник. Клетките гостоприемник включват клетки на бозайници, например, COS, CV1, ВНК, СНО, HeLa, LTK, NIH ЗТЗ, 293, РАЕ, човешки, мовешки фибробласти, човешки първични туморни клетки, тестиси, глия„ неврони, олигодендрити, глия, невробластома, глиома, и др. клетки от насекоми, като Sf9 (S. frugipeda) и Drosophila, бактерии, като Е. coli, Streptococcus, bacillus, дрожди, като Sachaeomyces, S. cerevisiae, клетки от гъби, растителни клетки, стволови клетки на ембриони (например, от бозайници, като мишка или човек), невронни стволови клетки, фибробласти, мускулни клетки, и Т-клетки.

Последователностите за контрол на експресията се избират подобно за съвместимост с гостоприемника и за желаната цел, например, голям брой копия, големи количества, индукция, амплифициране, контролирана експресия.други последователности, които могат да се използуват включват енхансери, като от SV40, CMV, RSV, индуцируеми промотори, елементи специфични за типа клетки, или последователности, които позволяват селективна или специфична клетъчна експресия. Промотори, които могат да се използуват за насочване на неговата експресия включват, например, ендогенни промотори, промотори от други гени в клетъчния биосинтетичен път за трансдукция на сигнали, MMTV, SV40, trp, lac, tac, или Т7 промотори за бактериални гостоприемници; или алфа фактор, алкохол оксидаза, или PGH промотори за дрожди. РНК промотори могат да се използуват за продуциране на РНК транскрипти, като Т7 или SP6. Виж например, Melton et al., Nucleic Acid Res., 12(18):7035-7056, 1984; Dunn and Studier, J. Mol. Bio., 166:477435p 1984; U.S. Pat. No. 5,891,636; Studier et al., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, 85:60-89, 1987.

Нуклеинова киселина или полипептид от настоящото изобретение може да се използува като маркер за размер при електрофореза, хроматография и др. на нуклеинови киселини или протеини. Дефинираните рестрикционни фрагменти могат да се определят чрез сканипане на последователността за рестрикционни сайтове, изчисление на размера, и получаване на съответния продукт на рестрикционно смилане.

FGF полипептидът и нуклеиновата киселина от настоящото изобретение могат да се “изолират”. Под термина “изолиран” се има предвид, че са под форма, която не се открива в нейната естествена заобикаляща среда или в природата, например, по-концентрирана, по-пречистена, отделена от други компоненти, присъстваща в лизат на клетка, в която се експресира хетероложен FGF ген. Когато FGF се експресира като хетероложен ген в трансфекгирана клетъчна линия, ген, в сйответстви с настоящото изобретение, се въвежда в клетка, както е описано по-горе, при условия, при които генът се експресира.терминът “хетероложен” означава, че генът е бил въведен в клетъчната линия чрез “човешка ръка”.въвеждането на ген в клетъчна линия е разгледано погоре. Трансфекгираната (или трансформирана) клетка, експресираща FGF ген, може да се лизира, както е описано в примерите за изпълнение на изобретението и да се използува в метода, като лизат (т.е., “изолат”) или клетъчната линия може да се използува интакгна.

Обикновено, терминът “ефективни условия” означава например, среда, в която се постига желания ефект.такава среда включва, например, буфери, окисляващи средства, редуциращи средства, pH, со-факгори, температури, концентрация на йони, подходяща възраст и/или състояние на клетките (като, опоределен етоп от клетучния цикъл, или определен етоп, когато се експресират определени ген), когато се използуват клетки, културални условия (включително, субструт, кослород, въглероден диоксид, и др.).

За да се усили стабилноста, приложената нуклеинова киселина може да се модифицира, например, за да се направи резистентна на клетъчните ензими, на окисление, на редукция, на нуклеази и др., или за да усили нейното приемане в клетките. Може да се използува която и да е подходяща модификация, включително например, фосфоротиоати, метилфосфонати, фосфодиестерен 0 олигонуклеотид прикрепен към акридин интеркалиращо средство и/илихидрофобна опашка, производно на псорален, 2’-робозни модификации, производни на пентозни захари, производни на азотни бази, и др. Виж например, U.S. Pat. No. 5,576,208 и U.S. Pat. No. 5,744,362. Виж по-горе други производни, модификации и др., които могат да са полезни за изобретението. Най-общо, една антисенс нуклеинова киселина, съгласно настоящото изобретение, може да включва мономери на естествено съществуващи в природата нуклеотиди, не-естествено съществуващи в природата 0 нуклеотиди, и тяхни комбинации за усилване на клетъчното приемане и/или стабилност.

Антисенс може да се приложи като оголена нуклеинова киселина, в комплекс със или инкапсулирана със и от други средства, които улесняват нейното приемане в клетката, при инжектиране в клетки, или който и да е подходящ начин за доставяне.

Настоящото изобретение се отнася, също така, до методи за използуване на FGF от настоящото изобретение, като FGF-20 или FGF23. Такива методи включват прилагане на ефективно количества FGF или нуклеинова киселина, кодираща FGF съгласно настоящото изобретение, върху гостоприемник, за една или повече от следните цели: спомагане преживяването и/или пролиферацията, например, на неврони, олигодентдрити, клетки на Schwann, стволови клетки, по-дпециално неврални стволови клетки, ендотелни клетки, кератиноцити, и който и да е клетъчен тип, който е способен да отговаря на FGF-20 или FGF23, например, клетки, коитоекспресират познатия рецептор (като FGFR 1-4) върху С тяхните клетъчни повърхности, или тяхни родителски клетки;

спомагане зарастването на рани; модолиране диференциацията на клетките; индуциране на ембрионалното развитие; стимулиране на невритния продукт; усилване на възстановяването на нервни или неврални нарушения; стимулеране на процеса на миелиназиция; стимулеране на ангиогенезата; рецептор-свързваща активност.

Настоящото изобретение се отнася, също така, до инидикациите и методите за използуване на FGF, съгласно настоящото изобретение, като FGF-20 и FGF-23, или О нуклеинова киселина, кодираща FGF. Такива методи включват прилагане на ефективно количество FGF, съгласно настоящото изобретение, върху гостоприемника, поради една или повече от следните причини: усилване на възстановяването от нервно и аксонно нараняване; стимулиране на процеса на миелинизиране, ангиогенеза, заздравяване на рани, заздравяване на язви, индуциране възстановяването на дефекти по костите, спомагане на преживяването на присадък и индуциране на ембрионалното развити. Горе-споменатите приложения се явяват като резултат от потенциална FGF активност, спомагане на клетъчното преживяване и/или пролиферация, инхибиране и/или стимулиране на диференциацията на някои типове клетки. FGF може да индуцира клетъчното преживяване/пролиферация на стволовите клетки, родителски, предшественици и зрял и клетки от следния произход: неврони, олигодендрити, клетки на Schwann, ендотелни клетки, кератиноцити и други типове клетки, които експресират който и да е от FGF рецепторите. Освен това, С FGF-ите могат да индуцират диференциацията на новронните родителски клетки чрез индуциране на невритен продукт/разпространение.

Следващите in vivo и in vitro изследвания могат да се осъществят с цел да се измериактивноста на FGF-ите спрямо горе-описаните клетъчни фенкции:

In vitro ИЗСЛЕДВАНИЯ:

• Индуциране на олигодедроцитна пролиферация in vitro: Олигодедроцити, използувани за измерване на ефектите на О GF върху клетъчната пролиферация са или установени клетъчни линии, като N 20.1 .или първични олигодедроцити от гризачи. Първични олигодедроцит от гризачи (плъхове) и родителски олигодедроцити могат да се изолират и да се пречистят чрез една т следните техники: диференциална адхезионна техника (Mitrovic et al., 1994); центрофугиране в градиент на Percol (Mattera et al., Neurochem. Int. 1984, 6(1) 4150 и Kim et al., J. Neurol Sci 1983 Dec:62(1-3):295-301) и имуносепарация. Без значение от източника на олигодендроцитните клетки (първични клетки или клетъчна линия) или от методите на тяхното изолиране и пречистване, опитите за олигодендроцитната пролиферация могат да се проведат за период от време от 3, 5 и 7 дни.позитивните контроли са други членонве на FGF семейството, като FGF-20 или FGF-23. кленъчната пролиферация се измерва като МТТ изследване и изследване за ³Н-тимидин инкорпориране. Виж, също така, изследванията за олигодедроцитна пролиферация в Danilenko, et al., Arch BiochemBiophys.1999 Jani :361 (1):34-46.

• Индуциране на невритен растеж продукт: PC 12 © изследвания: Нови членове на FGF семейството могат да се тестват за индуциране на диференциация и невритния продукт в РС-12 клетъчна линия (произлизаща от плъши феохромоцитомен тумор) (Rydel, 1987 Greene, 1976). Допълнително, тъй като е показано за участък от NGF индуциран отговор, че се дължи на автокринното NGFиндуцирано производство на FGF-2, могат да се разгледат ефектите от нови FGF-и върху горното регулиране на NGF производството чрез PC 12 клетки (Chevet et al., J. Biol. Chem. 1999 Jul 23:274(3): 20901-8).

DRG се изолират чрез дисекция на DRG от фетус на плъх и се култивират в невробазална среда; разпространение на продукта на неврита в DRGs се изследва визуално и количествено чрез определяне на броя и дължината на невритите, като се сравняват с нетретирани контнтроли.

Изследванията могат да се осъществят върху клетки с фибробластен и ендотилен произход. За фибробластите може да се използуа модификация на NIH ЗТЗ изследване на пролиферация. За определяне ефектите на FGFs върху индукцията на ендотелна клетъчна пролиферация могат да се използуват следните клетки: HUVEC клетки, микроваскуларни ендотелни клетки и аортни ендотелнй клетки. Едно in vitro изследване, релевантно за определяне на терапевтичния потенциал на FGFs, като потенциално терапевтично средство за лечение на рани, язви или костни нарушения може да се проведе, както е описано в литературата.

Други изследвония, които са в корелация с регенерирането на ЦНС включват активиране на генната Q експресия (Meiners et al., Dev Biol. 1993 Dec: 160(2): 480-93) свързана c растежа или c преживяването, на модолирането на други растежни фактори (Yoshida, 1992), на модулирането на невронна елекгрофизиология (Terlau, 1990), на активността на митогени върху диференцииращите фактори за олигодендроцити, клетки на Schwann или астроцити (Genburger, 1987; Stemple, 1988; Kalcheim, Dev Biol. 1989 Jul:134(1 ):1-10; Murphy, 1990), на спомагането на in vitro преживяемост на кортикални, хипокампални, моторни, сензорни, симпотикови, или парасимпатикови неврони © (Eckstein, 1994; Unsicker, et al., Ann N.Y. Acad Sci.

1991:638:300-5; Groth, et al. Int J Dev Biol. 1996 Feb:40(1 ):40310), на спомагането на преживяването на моторен неврон in vitro, или други подобни.

In vivo ИЗСЛЕДВАНИЯ:

• Потенциал на ремиелинизиране на нови FGFs може да се разгледа, например, при следващия модел: а) животински модели с дефицит на миелин, като трансплантация на SVZ

клетки от животно донор, третирано с FGF в мишки с дефицит на миелин и измерване на разпространението на олигодендроцити in vivo; b) животински модеби с демиелинизация, като PLT индуцирани CR-EAE и МВР основен трансфер, индуцирани CR-EAE. Виж, също така изследванията, описани в Gumpel, 1992 и Hinks, et al., Mol Cell Neurosci. 1999 Aug: 14(2): 153-68.

• FGFs могат да се тестват за тяхната способност да индуцират неврорегенерация невропротекция при следните in vivo модели: механични нарушения/наренявания (напречен разрез на fimbria fornix биосинтетичен път, седалишния нерв, гръбначен мозък, оптичен невр и напречен разрез на DRG); модели на невронно нараняване, дължащи се на цереброваскуларен инсулт, като запушване на каротидната артерия, временно МСАО запушване и хипокси-исхемичен церебрален инсулт; и при химическ индуцирана невродегенерация, дължаща се на МРТР индуцирани лезии или «А индуцирани атаки.

Типични in vivo изследвания включват, например, измерване на редуцирането на невронна загуба след хипокампална исхемия (Sasaki, 1992; MacMillan, et al., Can J Neuro Sci Feb:20(1): 37-40, спомагане на преживяването на кортикалните неврони, следващо perforant path лезии (GomezPinilla, 1992; Peterson, et al., J. Neurosci. 1996 Feb 1:16(3): 88698), предпазване на базалните предните холинергични неврони от наранявани, индуцирани от дегенерация и редукция на МРТР-индуцирани или лезия-индуцирани на субстанция нигра неврони (Anderson, et al., Nature 1998 Mar 24:332(6162):360-1: Otto, 1989; Gomez-Pinilla, 1992; Otto, 1990);

и дълговременен растеж на нервни родителски клетки in vitro като “невросфери” (преглед в Svendsen, et al., Trends Neurosci. 1999 Aug:22(8):357-64. виж, също така, използуването на модели за травматичен инсулт, като напречен разрез на оптичния нерв (Silvers, 1987); напречен разрез на седалищен нерв (Cordeiro, et al., Plast Reconstr. 1989 June:83(6): 1013-9; Khouri, et al., Microsurgery 1989:10(3): 206-9), напречен разрез на DRG (Aebischer, et al., J. Neurosci. Res. 1989 Jul. 23 (3):2829), напречен разрез на гръбначен мозък (Cheng, et al., Science 1996 Jul 26:273 (5274):510-3 1996) и смазване на фациален нерв (Kuzis 1990); използуването на модели за цереброваскуларен инсулт, като хипоксимичен-исхемичен церебрален инсулт (MacMillan, 1993) и МСА запушване (Kawamata, et al., Proc. Natl. Acad.. Sci. U.S.A. 1997 Jul 22:94(15): 8179-84; Schabitz, 1999); и други невродегенеретивни модели, като лечение с кианова киселина (KA) (Liu, et al/. Brain Res 1993 Oct 29:6261(1-2):355-8) или MND в треперища мишка (Ikeda, et al., Neurol Res. 1995 Dec:17(6): 445-8).

Под термина “прилагане” се разбира, че FGF, кодираща FGF нуклеинова киселина, или друго активно средство се предоставя на мишената, например, наранената, увредената тъкан, и др. FGF може да се прилага на която и да е мишена (например, in vivo, in vitro, или in situ), включително и клетки в култура и гостоприемници, които имат увреждания, състояние, или заболяване, което трябва да се лекува по ефективен начин, подходящ за постигане на ефект, както е описан погоре, например, лекарствена форма на FGF може да се приложи чрез енжектиране директно във или близо до сайта мишена.може, също така, да се приложи топологично (на определено място), изцуло, парентерално, интравенозно, интрамускулно, подкожно, орално, назално, интрацеребрално, интравентрикулярно, интрацистернално, интракраниално, да се имплантира на желано място, например, под формата на гелообразна пяна, водач на нерв от колагенови нишки, и др, според локализирането на сайта мишена, който трябва да се лекува. FGF може, също така, да се прилага непрекъснато, при използуване на осмотична помпа. Един FGF може да се © прилага също, катр нуклеинова киселина за примане от © клетки.методи за прилагане на нуклеинова киселина включват тези, описани по-горе, и други конвенционни от нивото на техниката техники.

Ефективно количество FGF се ппилага върху мишената. Ефективни количества са такива количества, които се използуват за постигане на желания ефект, за предпочитане благоприятен или терапевтиченн ефект. Таково количество може да се определи рутинно, например, чрез провеждане на доза-отговор експеримент, при който са прилагат вариращи © дози върху клетки мишени, за определяне ефективното *** количество за постигане на желаната цел, например, стимулиране на невритния растеж или спомагане на невралното преживяване. Количествата се избират на основата на различни фактори, включително средата, към която се прилага FGF (например, пациент с нараняване на мозака, животински модел, тъканни клетъчни култури, и др.), сайта на клетките, които трябва да се третират, възраста, пола, и теглото на пациента или животното, което трябва да се лекува, и др.

При един аспект, настоящото изобретение се отнася до методи за лечение на неврални увреждания, като увреждане на нерв и травми, увреждане на гръбначен мозък и травми, увреждане на нарвна тъкан, получено чрез, например исхемична атака, инфаркт, хеморагия, и аневризма; лечение на нарвни заболявания, например, заболявания на дегенерация на нерви, като болест на Alzhaimer, болест на Parkinson, болест на Hunigton, мултиплена склероза,миелопатия, миелитис, и сирингомиелия, и др., включващо прилагане на ефективно количество FGF от настоящото изобретение.

FGFs от настоящото изобретение могат да се използуват за лечение на нервнодегенеративни и демиелинизиращи заболявания на ЦНС и ПНС, характеризиращи се с разрушаване на неврони и олигодендроцити. FGF може да се използува, като ремиелинизиращ терапевтик за Мултиплена Склероза и други първични и/или вторични демиелинизиращи заболявания на ЦНС или ПНС. Първични демиелинизиращи заболявания на ЦНС включват адренолевкодистрофия, левкоенцефалопатии (като, прогресивна мултифокусна левкоенцефалопатия), енцефаломиелит (като остър десиминиран перивенозен енкафаломиелит). Вторична демиелинезация на ЦНС се представя, като образуване на демиелинезиращи лезии на ЦНС травми, токсичност (цианид, хексахлорфан) или исхемия (удар). Демиелинезиращи заболявания на ПНС включват първични нарушения, като Синдром на Guillian-Barre (GBS), парапротеинемии, Хронична Заразна Демиелинезираща Полиневропатия (CIDP). Допълнително, FGF се използува и за лечение на невродегенеративни заболявания на ЦНС и ПНС, където невронното увреждане се дължи на нараняване/травма (механично, химично, цереброваскуларен инсулт и дължащ се на заразна инфекция и автоимунен отговор) и за лечение на други невродегенеративни заболявания.

FGFs от настоящото изобретение може, също така, да се използува за спомагане на преживяване на присадък. Например, FGF може да се използува за спомагане на преживяването на присадки (например, алогенни, изогенни © или автогенни) на голямо разнообразие от клетки, тъкани или © органи, като кожа, фасции, сухожилия, кости, бъбреци, корниа, или други подобни. Трансплантите на клетки върху ЦНС или ПНС на клетки с невронен, глиен или стволов произход също се обхващат от изобретението. Присаденият материал може да се получи от естествени източниици или чрез in vitro разпространение на клетки или тъкан, които да се присадат или чрез използуване на диференциирани или недиференциирани столови клетки. Под терминът “спомагане” се разбира да са засили преживяемоста и/или

С пролиферацията на присадените клетки, тъкани или органи, *** които са лекувани с FGF, в сравнение с клетки, тъкани или органи, които не са лекувани по този начин. Методите за изпитване за преживяемост на присадъци са конвенционни.

Изследванията за измерване на преживяемоста н априсадките са рутинни и са добре известни на специалистите в областа. Конвенционално in vitro изследване включва, например, МТТ, MTS, Thy инкорпориране, жива/мъртва клетка изследване (например, двойно оцветяване с калцеин АМ и етидиев хомодимер-EthD-l), измерване на общ брой на клетки, например, чрез използуване на микроскопско отчитане или чрез физични методи на преброяване на клетки, като използуване на броячи на кръвни клетки. Конвенционни in vivo методи включват, например, за инидикации на ЦНС, откриване подобрена неврологична фенкия, или техники на изобрезяване, като MTR, MRS, СТ или MRI, със или без Gd усилване.

Други състояния, които могат да се лекуват, в съответствие с настоящото изобретение включват © предпазване от увреждания на миокарда, дължащи се на Ml, © индикация за ангиогенеза, зарастване на рани, зарастване на язви, предпазване от разрушаване на кости и индикация за новообразуване на кости, спомагане прежижуемост на присъдки и инсдуциране на ембрионално развитие.

Действията на FGF, които са полезни при лечението на горе-посочените заболявания/състояния включват: спомагане на клетъчното преживяване и/или пролиферация, инхибиране и/или стимулиране на диференциацията на следващите типове клетки: индукция на клетъчното преживяване/ © пролиферация на стволови клетки, родителски, предшестваници ш зряли клетки от следния произход: неврони, олигодендрити, клетки на Schwann, ендотелни клетки, кератиноцити, остеобласти и други типове клетки, експресиращи който и да е от FGF рецепторите. В допълнение, действията на FGF върху индуцирането на диференциацията на невронни родителски клетки чрез индуциране на невритен продукт/разпространение се считат полезни при лечението на какъвто и да е вид невронно нараняване/увреждане.

Под терминът “лечение” се разбира, че резултатите при подорението на увреждането или заболяването, като спомагане на преживяването на невроните, на глията, на олигодендритите, астроцитите, клетките на Schwann, и др., стимулират невритния продукт, като стимулират миелинизацията, стимулират пролиферацията на клетки, и др., както е посочено по-горе. За лечението на такива увреждания и заболявания, FGF може да се приведе в лекарствена форма, като състав, или нуклеинова киселина, и 0 да се приложи върху увредения или заболял участък, (У например, при използуване на хирургични техники.

FGFs от изобретението могат, също така, да се прилагат за който и да е метод на лечение1 описани в настоящото, чрез прилагане на нуклеинова киселина, например, при методите на генна терапия. Носителят за доставяне на гени може да е от вирусен произход (виж най-общо Jollyq Cancer Gene Therapy 1:51-64 (1994) Kimura, Human Gene Therapy 5:845-852 (1994); Connelly, Human Gene Therapy 1:185-193 (1995); и Kaplit, Nature Genetics 6:148-153 (1994). Носителите, при генна 0 терапия, за доставяне на структури включващи кодираща © последователност на терапевтичното средство от изобретението могат да се прилагат или локално или систематично. Тези структури могат да използуват вирусни или невирусни векторни подходи. Експресията на такива кодиращи последователности може да е или конструктивна или регулирана.

Настоящото изобретение може да използува рекомбинантни ретровируси, които се конструират, така че да пренасят избрани . молекули на нуклеинови киселини,

представляващи интерес. Ретровирусни вектори, които могат да се използуват включват, тези описани в ЕР 0 415 731; WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25234; U.S. Patent No. 5,219,740; WO 93/11230; WO 93/10218; Vile and Hart, Cancer Res. 53:3860-3864 (1993); Vile arid Hart, Cancer Res. 53:962-967 (1993); Ram, et al., Cancer Res. 53:83-88 (1993); Takamiya et al., J. Neurosci. Res. 33:493-503 (1992); Baba et al., J. Neurosurg. 79:729-735 (1993); U.S. Patent No. 4,777,127; GB Patent No. 2,200,651; и EP 0 345 242. предпочитани рекомбинантни ретровируси включват, тези които са описани в WO 91/02805.

Пакетирането на клетъчни линии, подходящи за използуване с горе-описаните ретровирусни векторни структури могат лесно да се приготвят (виж РСТ публикации WO 95/30765 и WO 92/05266, и да се използуват за създаване на продуциращи клетъчни линии (наричат се също векторни клетъчни линии) за пролучаването на частици на рекомбинантни вектори. Измежду най-предпочитаните варианти за изпълнение на изобретението, пакетиращите клетъчни линии са получени от човешки (като, НТ1080 клетки) или от родителски клетъчни линиина норка, като по този начин се позволява продуцирането на лесомбинантни ретровируси, които могат преживяват инактивирането в човешки серум.

Настоящото изобретение използува, също така, вектори, базирани на алфавирус, които могат да действат като носители за доставяне на гени. Такива вектори могат да се конструират от див тип алфавируси, включително, например, вектори от Sindbis вирус, Sdemliki горски вирус (ATCC VR1247), Ross River вирус (ATCC VR-373); ATCC VR-1246 и Venezuelan вирус на конския енцефалит (ATCC VR-923; АТСС

VR-1250; ATCC VR-532). Представителни примери за такива векторни системи включват тези, описани в U.S. Patent No. 5,091,309; 5,217,879; и 5,185,440; и РСТ публикация № WO 92/10578; WO 94/21792; WO 95/27069 и WO 95/07994.

Носителите за доставяне на гени от настоящото изобретение могат да използуват, също така, парвовируси, като адено-асоциирани вирусни (AAV) вектори.представителни примери включват AAV вектори, описани от Srivastava в WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. ц 63:3822-3828 (1989); Mendelson et al„ Virol. 166:154-165 (1988);

> и Flotte et al., P.N.A.S. 90:10613-10617 (1993).

Представителни примери за аденовирусни вектори включват тези, описани от Berkner, Biotechniques 6:616-627 (1988); Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); WO 93/19191; Kolls et al., P.N.A.S. 215-219 (1994); Kaas-Eisler et al., P.N.A.S. 90:11498-11502 (1993); Guzman et al., Circulation 88:2838-2848 (1993); Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207 (1993); Zabner et al., Cell 75:207-216 (1993); Li et al., Hum. Gene Ther. 4:403-409 (1993); Cailaud et al., Eur. J. Neirosci. 5:1287ф 1291 (1993); Vincent et al., Nat. Genet. 5:130-134 (1993); Jaffe et al., Nat. Genet. 1:372-378 (1992); и Levero et al., Gene 101:195202 (1992). Примерни аденовирусни вектори за генна терапия, които се използват в настоящото изобретение включват, сащо така, тези описани в WO 94/12549; WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 и WO 95/00655. Може да се използува прилагане на ДНК свързана към убити аденовируси, както е описано в Curiel, Hum. Gene. Ther. 3:147-154(1992).

Могат да се използуват и други носители за доставяне на гени и методи, включително поликатйонна кондензирана ДНК свързана или несвйрзана към убити аденовируси само, например, Curiel, Hum. Gene. Ther. 3:147-154 (1992); прикрепена към лиганда ДНК, нахпример, виж Wu, J. Biol. Chem., 264:16985-16987 (1989); еукариотни клетки носители за клетъчно доставяне, например, виж U.S. ругистров номер No. 08/404,796; отлагане на фотополимеризирани хидрогелни материали; пистолет за ръчен трансфер на генни частици, както е описано в U.S. Patent No. 5,149,655; йонизираща радиация, както е описано в U.S. Patent No. 5,206,152 и в WO 92/11033; неутрализиране на ядрения заряд или сливане с клетъчни мембрани. Допълнителни подходи са описани в Mol. Cell. Biol. 14:2411-2418 (1994) и Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:1581-1585, (1994).

Може да се използва също и оголена ДНК. Примери за въвеждане на оголена ДНК са описани в WO 90/11092 и U.S. Patent No. 5,580,859. Ефикастността на приема може да се подобри чрез използуване на биоразлагащи се латексови перли. Покрити с ДНК латексови перли се танспортират ефикасно в клетките след иницииране на ендоцитоза от перлите. Методът може още да се подобри чрез третиране на перлите, за увеличаване хидрофобносТа и по този начин да се улесни разкъсването на ендозома и освобождаване на ДНКата в цитоплазмата. Липозоми, които могат да действат като носители за доставяне на гени са описани в U.S. Patent No. 5,422,120, РСТ публикация № WO 95/13796, WO 94/23697 и WO 91/14445, и ЕР № 0 524 968.

Други подходящи за използуване невирусни системи за доставяне включват механични системи за доставяне, като подхода, описан в Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(24):1581-1585, (1994). Освен това, кодиращата последователност и продукта на експресията като такъв могат да се доставят чрез отлагане на фотополимеризирани хидрогелни материали. Други конвенционални методи за за доставяне на гени, които могат да се използуват за доставяне на кодиращи последователност включват, например, е използуване на пистолет за ръчен трансфер на генни частици, ф както е описано в U.S. Patent No. 5,149,655; използуване на йонизираща радиация за активиране на трансферирания ген, както е описано в U.S. Patent No. 5,206,152 и в WO 92/11033.

Настоящото изобретение се отнася, също така, до метод за стимулиране на клетъчна пролиферация, който се състои от прилагане на ефективно количество FGF-5 (например, Kanda et al., по-горе) FGF-20 или FGF-23, или на тяхни биологично активни, фрагменти. Под израза “стимулиране на клетъчна пролиферация” се разбира, че приложения FGF води до клетъчно делене или митоза. FGF може да се приложи под каквато и да е ефективна форма (нуклеинова киселина или *

полипептид) върху който и да е подходящ гостоприемник.

В действителност, при един вариант за изпълнение на изобретението, методът се използува за идентифициране на агонисти и антагонисти на FGF. При такива случаи може да е полезно да се приложи FGF върху клетъчни линии, включително установени и първични клетки, като мотоневрони от грюбначен мозък. Установените лини включват, например, която и да е от линиите, съхранени в American Tissue Culture

Collection (atcc.org) включително, например, DBTRG-05MG, PFSK-1, MSTO-21H, NCI-H378, NCI-N417, NCI-H526, HCN-1A, HCN-2, CATH.a, NG108-15, NCI-H209,NCJ-H146, HCI-H82, NCIH345, NCI-H510A, D283 Med, D341 Med, C6, IMR-32, Neuro-2a, NB41a3, BCH1, A172, Mpf, T98g[T98-G], SCP, CCF-STTG1, DI TNC1, CTX TNA2, PG-4 (S+L-), G355-5, SW 598 [SQ-598; SW598], C6/LacZ, 9L/lacZ, N1E-115, SH-SY5Y, BE(2)-M17, BE(2)-C, MC-IXC, SK-N-BE(2), CHP-212, C6/lacZ7, MO59K, MO59J, F98, RG2[D74J; NCI-H250, NCI-H1915, QA1, TE615QT, SVG p12, TE671 подлиния № 2, MBr Cl 1Q SK-N-MC, SW 1088 ® [SW-1088; SW1088], SW 1783 [SW-1783; SW1783], U-87 MG, U118 MG. U-138 MG, MDA-MB-361, DU 145, Hs 683, H4, 293, PC12, P19, NTERA-2 cl.D1[NT2/D1], BCE C/D-1b, SK-N-AS, SK-NFl, SK-N-DZ, SK-NSH, Daoy, за предпочитане, N20.1 клетки.

Предполагаеми агонисти и антагонисти на FGF могат да се прилагат in vitro върху клетки, на които е бил прилаган FGF, както клетъчните линии, описани по-горе, или предполагаемите средства могат да се прилагат in vitro или in vivo, върху клетки, които естествено продуцират FGF. Агонистичните или антагонистичните действия на такива средства могат да се измерят по който и да е от признатите от състоянието на техниката изследвания, като тези, описани навсякаде в настоящото.

Неврални стволови клетки могат да се стимулират, също така, да пролифирират чрез FGF от настоящото изобретение. Получените клетки могат да се използуват като източник на нервни клетки за обратано трансплантиране в същия пациент, от когото произлизат (т.е., автоложно), като се отстраняват класическите проблеми асоциирани с алогенното

трансплантиране, като отхвърлянето.следователно, методът на настоящото изобретение се отнася до прилагане на такова количество FGF, ефективно за стимулиране на пролиферация и диференциация на неврни стволови клетки, и обратно трансплантиране на посочените клетки.

Настоящото изобретение се отнася, също така, до аантитела, които специфично разпознават FGF от настоящото изобретение. Антитяло, специфично за FGF означава, че антитялото разпознава дефинирана последователност аминокиселини, във или включващи FGF, например, последователност от фигури 1 и 2. Следователно, специфичното антитяло най-често ще се свържи с по-голям афинитет към авинокиселинна последователност, т.е., епитоп, открита на фигури 1 и 2, отколкото към различен(и) епитоп(и), наапример, открит и/или измерен чрез изследване с имуноблотинг или-друго конвенционално имуноизследване. По този начин, антитялото, което е специфично за един епитоп на човешки FGF-21 е полузно за откриване присъствието на епитоп в проба, например, тъканна проба, съдържаща човешки FGF-21 генен продукт, като го отличава от проби, в които епитопът липсва.такива антитела са полезни, както е описано от Santa Cruz Biotechnolohy, Inc., Research Product Catalig, и може да се приведе в лекарствена форма в съответствие.

Антитела, например, поликлонални, моноклонални, рекомбинантни, химерни, хуманизирани, могат да се получат съгласно който и да е желан метод. Виж, също така, скрининг библиотеките на рекомбинантни имуноглобулини (например, Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:3833-3837, 1989; Huse

et al., Science, 256:1275-1281, 1989); in vitro стимулиране на лимфоцитни популации; Winter and Milstein, Nature, 349:293299, 1991. например, за получаването на моноклонални антитела, един полипептид, съгласно фигури 1 и 2, може да се приложи върху мишки, кози, или зайци подкожно и/или интраперитонеално, със или без помощно средство, в количество достатъчно да предизвика имунен отговор. Анатителата могат, също така, да са с единична верига или FAB фрагменти. Антителата могат да са IgM, IgG, подтипове lgG2a, lgG1, и др.антителата и имунните отговори могат също да се генерират .чрез прилагане на оголена ДНК, виж например, U.S. Patent No. 5,703,055; U.S. Patent No. 5,589,466; U.S. Patent No. 5,580,859.

t

FGF или HferoB фрагмент, за използуване при индуцирането на антитела, не се нуждае от това да притежава биологична активност; въпреки това, те трябва да притежават имуногенна активност, било то самостоятелно или в комбинация с носител. Пептиди за използуване при индуцирането на FGF-специфични антитела могат да притежават една аминокиселинна последователност, състояща се от най-малко пет аминокиселини, за предпочитане най-малко 10 аминокиселини. Къси разтеглени форми на FGF аминокиселини, например, пет аминокиселини, могат да се слеят с тези, на друг протеин, като хемоцианин от keyhole limpet, или друг полезен носител, и химерната молекула, използувана за получаване на антитела. Области на FGF, полезни за получаване на антитела, могат да се избират емпирично, или например, аминокиселинна последователност от GENE, както е изведено от сДНК-та, може да се анализира, за да се определят областите на висока имуногенност. Анализът за избор на подходящи епитопи е описан, например, от Aubel FM et al., (1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol 2, John Wiley & Sons).

Полезни последователности за генериране на антитела включват линеаризираните последователности, показани на фигури 1 и 2. Антителата за такива последователности могат да се използуват за да се отличават различните транскрипти на FGF. Виж по-горе.

ф Определени ·. FGF антитела са полезни за © диагностицирането на предпатологични състояния, и хронични или остри заболявания, . които се характеризират чрез различия в количеството или разпределението на FGF.диагностичните тестове за FGF включват методи, които използуват антитялото и маркер за откриване на FGF в човешки (или миши, и др., ако се използува мишка) телесни течности, тъкани или екстракти от такива тъкани.

Полипептидът и антителата от настоящото изобретение могат да се използуват със или без модификации. Често, полипептидите и антителата се маркират, като се I»/ присъединяват било то ковалентно или нековалентно, към вещество, което 'предоставя откриваем сигнал. Голямо разнообразие от маркери и техники на присъединяване са известни и са предадени подробно и в двете, научната, както и патентната литература. Подходящи маркери включват радионуклеотиди, ензими, субстрати, кофактори, инхибитори, флуоресцентни средства, магнитни частици и други подобни. Патентни, които обясняват използуването на такива маркери включват: U.S. Patent No. 3,817,837; U.S. Patent No. 3,850,752;

U.S. Patent No. 3,939,350; U.S. Patent No. 3,996,345; U.S. Patent No. 4,277,437; U.S. Patent No. 4,275,149; и U.S. Patent No. 4,366,241.

Антитела и други лиганди, които свързват FGF могат да се използуват по нй-разнообразни начини, включително като терапевтични средства, диагностични средства, и инструменти за търговски изследвания, например, за количествено определяне на нивата на FGFnonnnenTHfl при животни, тъкани, клетки, и др., за идентифициране на клетъчната локализация и/или разпределението му, за пречистването му, (у или полепептид, който съдържа част от него, за модулиране функциите му, при Western blots, ELISA, имуноутаяване, RIA, и др. Настоящото изобретение се отнася, също така, до такива изследвания, състави и комплекти, за провеждането им, и др. При използуване на тези и на други методи, едно антитяло, съгласно настоящото изобретение, може да се използува за откриване на FGF полипептид или негов фрагмент в различни проби, включително тъкани, клетки, телесни течности, кръв, урина, цереброспинална течност.

В допълнение, лиганди, които се свързват към FGF © полипептид, съгласно изобретението, или негови производни, също могат да се получат, например, при използуване на пептидни библиотеки или аптамери (например, Pitrung et al., U.S. Patent No. 5,143,854; Geysen et al., J. Immunol. Methods, 102:259-274, 1987; Scott et al., Science, 249:386, 1990; Blackwell et al., Science, 250:1104, 1990; Tuerk et al., 1990, Science, 249:505.).

Настоящото изобретение се отнася също до един FGF полипептид, получен съгласно желан метод, например, както е

описано в U.S. Patent No. 5,434,050. маркиран полипептид може да се използува, например, при изследвания за сварзване, за да се идентифицират веществата, които се свързват или се прикрепят към FGF, за да се проследи движението на FGF в клетките, при in vitro, in vivo или in situ система, и др.

Нуклеинова киселина, полипептид, антитяло, лиганда и др., съгласно настоящото изобретение, също могат да се изолират. Терминът “изолират” означава, че материалът е под форма, в която не се открива в неговата естествена среда или естество, например, по-концентриран, по-пречистен, отделен от други компоненти, и др. една изолирана нуклеинова киселина включва, например, нуклеинова киселина, която притежава последователноста на FGF, отделена от хромозомалната ДНК, открита при живи животни, например, като пълния ген, транскрипт, или сДНК. Нуклеиновата киселина може да е част от вектор или да се инсерира в хромозома (чрез специфично генно-насочване или случайно интегриране в позиция, различна от нейната нормална позиция) и все пак да се изолира, въпреки че не е във форма, в която се намира в естесвената й среда. Нуклеинова киселина или полипептид, съгласно настоящото изобретение, може да бъде пречистена по същество, също така. Под пречистена по същество се има предвид, че нуклеиновата киселина или полипептида се отделя и е свободен по същество от други нуклеинови киселини или полипептиди, т.е., нуклеиновата киселина или полипептидът е първична и активна съставка.

Настоящото изобретение се отнася, също така, до трансгенно животно, например, животно не-човек, като мишка, което съдържа FGF. Трансгенни животни могат да се получат съгласно известни методи, включително например, проядрено инжектиране на рекомбинантни гени в пронуклеите на 1клетъчен ембрион, включващ изкуствен дрождев хромозом в ембрионални стволови клетки, методи на генно насочване, методология на ембрионални стволови клетки. Виж, например, U.S. Patent No. 4,736,866; U.S. Patent No. 4,873,316; 0 U.S. Patent No. 5,082,779; U.S. Patent No. 5,304,489; U.S. Patent

V No. 5,175,385; U.S. Patent No. 5,221,778; Gordon et al., Proc.

Natl. Acad. Sci., 77:7380-7384, 1980; Palmiter et al., Cell, 41:343345, 1985; Palmiter et al., Ann. Rev. Genet., 20:465-499, 1986; Askew et al., Mol. Cell. Biol., 13:4115-4124, 1993; Games et al., Nature, 373:523-527, 1995; Valancius and Smithies, Mol. Cell. Biol., 11:1402-1408, 1991; Stacy et al., Mol. Cell. Biol., 14:10091016, 1994; Hasty et al., Nature, 350:243-246, 1995; Rubinstein et al., Nucl. Acid Res., 21:2613-2617, 1993. нуклеинова киселина, съгласно настоящото изобретение, може да се въведе в което 0 и да е животно бозайник не-човек, включително в мишка © (Hogan et al., Manipulating the Mouse Embrio: A Laboratory

Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1986), прасе (Hmmer et al., Nature, 315:343-345, 1985), овца (Hmmer et al., Nature, 315:343-345, 1985), добитък, плъх, или примат. Виж, също така, Churech, 1987, Trends in Biotech. 5:13-19; Clark et al., Trends in Biotech. 5:20-24; and DePamphilis et al., Biotechniques, 6:662-680, 1988). B допълнение, например, обикновено производство на трансгенен плъх е достъпно. Тези трансгенни животни могат да са полезнни животински модели за тестване на GENE функцията, като храна за змии, като генетичен маркер за откриване на щам за произход (т.е., когато един FGF-21, -23 или тяхни фрагменти са били инсерирани) и др. такива трансгенни животни включват, освен това, други трансгени. Трансгенните животни могат да се получат и да се използуват съгласно който и да е подходящ метод.

За други аспекти на нуклеиновите киселини се прави литературна справка със стандартни наръчници за молекулярна биология. Виж, например, Davis et al., Basic

V Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishng, Inc., New York, 1986; Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IL Press, 1985; Sambrook et al., Molecular Clining, CHS Press, 1989; Howe, Gene Cloning and Manipulation, Cambridge University Press, 1995.

КРАТКО ОПИСАНИЕ HA ФИГУРИТЕ

Фигура 1 показва нуклеотидна и аминокиселинна последователност на FGF-20 (SEQ ID NOS. 1 и 2)

Фигура 2 показва нуклеотидна и аминокиселинна

V последователност на FGF-23 (SEQ ID NOS. 3 и 4)

Фигура 3 показва линеаризирана последователност на FGF-20 протеин с членове на известно FGF-семейство xfgf-20 от Xenopus laevis.

Фигура 4 показва олигодендроцитна пролиферация. Фигура 1А показва пролиферацията на олигодендроцити. Фигура 1В показва, че активността е премахната чрез кипване на протеините.

Фигура 5 показва действието на FGF-20 мърху N20.1 олигодендроцитна пролиферация.

Фигура 6 показва действието на FGFs върху пролиферацията на пълвични олигодендроцити от плъх (PRO). Фигура 6А показва клетки, третирани с FGF-2n фигура 6В показва клетки, третирани с FGF-20.

Фигура 7 показва действието на FGFs върху преживяемоста/пролиферацията на клетъчна линия от невронен произход. Фигура 7А показва действието на FGF-20. Фигура 7В показва действието на FGF-2, FGF-9 и FGF-20.

V Фигура 8 показва невритния продукт. Култивирани РС12 клетки се третират в продължение на 6 дни с рекомбинантен FGF-20 плюс хепарин (ляв панел) или хепарин единствено (десен панел). Клетките се фиксират и се оцветяват за βΙΙΙтубулен, ядрата се изобразяват с 7-AAD. Невритният продукти е се наблюдава в клетки единствено с хепарин.

Фигура 9 показва, че FGF-20 е силен фактор на преживяемост за кортикални неврони.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО ПРИМЕР 1

Пролиферация и преживяемост на олигодендроцити:

Олигодендроцити, използувани за измерване на ефектите на растежни фактори (GF) върху клетъчната пролиферация са или установени клетъчни линии, като N20 или първични олигодендроцити на гризачи. Първични олигодендроцити на гризачи (плъх) и родителски олигодендроцити се изолират и пречистват чрез различнин техники на адхезия (Mitrovic, 1994) и градиент на Percol (Mattera et al., Neurochem. Int. 1984, 6(1) 41-50 и Kim et al., J. Neurol Sci 1983 Dec:62(1-3):295-301). Изследванията за пролиферация на олигодендроцити се провеждат чрез посяване 2,5 χ 10⁴ клетки/ml в 96-ямкови блюда. Клетките се стимулират с растежни фактори за период от 3, 5 и 7 дни. Позитивни контроли са други членове на FGF семейството, като FGF-2 или FGF-9. Клетъчната пролиферация се измерва чрез МТТ изследване и изследване за включване на ³Н-тимидин.

С Фигури 4, 5 и 6 показват, че FGF-20 стимулира пролиферацията на олигодендроцити на N20.1 олигодендроцитна клетъчна линия по нечин отговарящ на времето и дозата. N20.1 клетките се третират с частично пречистени проби на хепарин на агарозна хроматография на FGF-20. пролиферацията се определя чрез МТТ оцветяване. FGF-20 индуцира пролиферацията на олигодендроцити (фигура 4А) и активността се премахва чрез кипване на протеина (фигура 4В).

Горните наблюдения се потвърждават чрез препарати на частично пречистен материал от хепарин и S колони (фигура 5). N20.1 клетки се третират с FGF-20 от хепарин или S колони. Клетките се инкубират с FGF-20 в продължение на 5 дни и увеличението в пролиферацията над нетретираната контрола се определя чрез МТТ оцветуване. FGF-9 се използува като положителна контрола, а като негативна контрола се използува подходящ съответстващ буфер (Н и S). активността на частично пречистен материал е сравним с FGF-9.

Освен това, FGF-20 индуцира пролиферацията на първични олигодендроцити на плъх (фигура 6В). Олигодендроцитите се третират с FGF-2 (фигура 6А), и FGF20 (фигура 6В). Клетките се инкубират с GFs в продължение на 3 дни и увеличаването на пролиферацията над нетретираната контрола се определя чрез МТТ оцветяване. Активността на частично пречистен материал е сравнима с FGF-2. FGF-20 е силен индуктор на пролиферация на олигодендроцити и неговата активност е сравнима д други С членове на FGF семейството, като FGF-2 и FGF-9.

ПРИМЕР 2

Индуциране на нервната преживяемост:

Изследвания за нервната прлеживяемост се провеждат чрез посяване на 2,5 х 10⁴ клетки/ml в 96-ямкови блюда в ниско серумна среда. При тези условия нервните клетки претърпяват апоптозис, дължащ се на оттеглянето на растежния фактор.клетките се стимулират с растежни фактори за различен период от време в граници от 3 дни до 12 дни.позитивни контроли са други членове на FGF © семейството, като FGF-2 или FGF-9. Нервната прлеживяемост се измерва чрез МТТ.

Фигури 7 и 9 показват, че FGF-20 е мощен фактор, който може да стимулира преживяемоста на клетките с неврален произход.

PC 12 клетки се посяват в 96-ямкови блюда в присъствие на среда с ниско съдържание на серум (1% Nu серум). Различни фактори, включително FGF-20 се добавят при концентрации в граници от 0,0025-2500 ngs/ml. 7 и 10 дни по58 късно се измерва относителна преживяемост чрез МТТ изследвание, при сравнение с нетретирана контрола. Данни за FGF-20 са показани на фигура 7А, а за FGF-2, FGF-9 и FGF-20 на фигура 7В.

ПРИМЕР 3

Индуциране на невритния продукт

FGF-20 проявява активност върху продукта на PC 12 клетки. Тази активност не е зависима от NGF предварително третиране (виж таблици 1 и 2 и фигура 9).

Поведението на частично пречистен FGF-21 при това изследване е подобно на това, наблюдавано за FGF-9, с който е много подобен по последователност. В допълнение се сравняват активностите на различни членове на FGF семейството при индуцирането на продукта на PC 12 клетки (FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-16, FGF-17, FGF-18- (виж таблица 2). Най-мощните FGFs при индуцирането на невритния продукт в тази система са FGF-2 и FGF-9 и FGF-20/21. За два FGFs, FGF-7 и FGF-10 е открито, че са неактивни при това изследване, без значение от присъствието или отсътвието на хепарин.

Първични кортикални неврони от ембрион на плъх се изолират от мозъци на ембриони на плъх (Е16). Кортексът се дисектира под микроскоп и се промива 6-кратно с разтвор на Hanks и се разделя механично без ензиматично третиране. Нервите се култивират в среда, състояща се от следното: DMEM с прибавка на 10% конски серум, 15% FCS, 2 mM Lглутамин, HEPES буфер. След 14 часа, се прибавя коктейл от инхибитори, състоящ се от 10uM FdU и 1 иМ цитозин арабинозид за 3 дни, с цел де се инхибира пролиферацията на всичкти други типове клетки, с изключение на неврони. След 8 дни култивиране, невроните се събират и се посяват в 96-ямкови блюда в присъствие на ниско серумна среда (2% Nu серум). Прибавят се различни растежни фактори, включително FGF-20, в концентрация в граници от 0,0025-2500 ngs/ml. След 5 днисе измерва относителната преживяемост с МТТ изследване и се сравнява с нетретирана контрола.

ТАБЛИЦА 1:

FGF-20 е мощно индуциращо средство на нервното разпростиране в PC 12 клетки

PC 12 клетки се посяват и се третират, както в експериментите, показани на фигура 7. FGF-9 и FGF-20 се добавят в концентрация в граници от 0,0025-2500 ngs/ml.

Седем и 12 дни след третирането, невритното разпространението се определя чрез оцветяване на клетките с Writh багрило и последващ микроскопски оглед. Процентът на продукта представлява очкавния брой клетки с преработка.

Обобщението на наблюденията за индукцията на невритния продукт, в следствие на FGF-9 и FGF-20/21 третиране е показано по.долу. най-високата концентрация на частично пречистен материал е токсична за клетките, което действа както върху данните за преживяемоста (виж фигура 7В), така и върху невритния продукт (виж по-долу).

Невритен продукт в PC 12 клетки

GF	концентрация ngs/ml	% продукт
7 ДНИ	12 дни
FGF-9	0	0	0
	0,025	<5	5
	0,25	5	10-20
	2,5	5-10	20-30
	25	60	60
	250	90	100
	2500	90-100	100
FGF-21	0	0	0
	0,025	<5	5
	0,25	10	10
	2,5	20-30	30
	25	50	60
	250	90	80
	2500	0	0

ТАБЛИЦА 3

Невритен продукт	- сравнение с различни членове на
FGF семейството:
Култивирани PC	12 клетки се третират с FGFs и
невритния продукт се брои визуално. FGF-20 е един от най-
мощните тествани невротрофни членове на FGF семейството.
FGF прибавен:	отговор
FGF-1 (кисел FGF)	++
FGF-2 (основен FGF)	++++
FGF-4	+
FGF-6	+
FGF-7	-
FGF-8	++
FGF-9	+++
FGF-10	-
FGF-16	+
FGF-17	++
FGF-18	++
FGF-21	+++

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Използуване на FGF-20 за лечение на нараняване на гръбначен мозък; травма на гръбначен мозък; нараняване на нервна тъкан в следствие на исхемична атака, инфаркт, кръвоизлив или аневризма; болест на Hunigton; миелопатия; миелитис; или сирингомиелия, чрез прилагане върху пациент с необходимост от това на ефективно количество FGF-20 полипептид или негов биологичноакгивен фрагмент.
2. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 1, при което посоченият FGF-20 полипептид е човешки.
3. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 2, при което посоченият полипептид притежава FGF-20 специфична имуногенна активност.
4. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 1, при което посоченият полипептид включва аминокиселина 1 до аминокиселина 211, както е посочено на фигура 1.
5. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 1, при което посоченият полипептид притежава 95% идентичност на последователностите с аминокиселина 1 до аминокиселина 211 на човешки FGF-20, както е посочен на фигура 1, и където посоченият FGF-20 има FGF активност,
6. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 2, при което посоченият полипептид притежава 95% идентичност на последователностите с аминокиселина 1 до аминокиселина 211 на човешки FGF-20, както е посочен на фигура 1, и където посоченият FGF-20 има FGF активност.
7. Използуване на FGF-20 за лечение на нараняване на гръбначен мозък; травма на гръбначен мозък; нараняване на нервна тъкан в следствие на исхемична атака, инфаркт, кръвоизлив или аневризма; болест на Hunigton; миелопатия; миелитис; или сирингомиелия, чрез прилагане върху пациент с необходимост от това на ефективно количество нуклеинова киселина, имаща нуклеотидна последователност, кодираща за FGF-20 полипептид или за негов биологичноактивен фрагмент.
8. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 7, при което посочената нуклеотидна последователност е човешка.
9. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 8, при което посочената нуклеотидна последователност кодира без прекъсване за FGF-20.
10. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 7, при което посочената нуклеотидна последователност притежава 95% идентичност на последователностите с нуклеотидната последователност посочена на фигура 1.
11. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 8, при което посочената нуклеотидна последователност притежава 95% идентичност на последователностите с нуклеотидната последователност посочена на фигура 1.
12. Използуване на FGF-20 за лечение на надбъбречна левкодистрофия, прогресивна мултифокална левкоенцефалопатия, енцефаломиелит, синдром на GuillianВагге, парапротеинемия или хронична заразна демиелинезираща полиневропатия, чрез прилагане върху пациент с необходимост от това на ефективно количество нуклеинова киселина, имаща нуклеотидна последователност, кодираща за FGF-20 полипептид или за негов биологичноактивен фрагмент.
13. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 12, при което посоченият FGF-20 полипептид е човешки.
14. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 13, при което посоченият полипептид притежава FGF-20 специфична имуногенна активност.
15. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 12, при което посоченият полипептид включва аминокиселина 1 до аминокиселина 211, както е посочено на фигура 1.
16. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 12, при което посоченият полипептид притежава 95% идентичност на последователностите с аминокиселина 1 до аминокиселина 211 на човешки FGF-20, както е посочен на фигура 1, и където посоченият FGF-20 има FGF активност.
17. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 13, при което посоченият полипептид притежава 95% идентичност на последователностите с аминокиселина 1 до аминокиселина 211 на човешки FGF-20, както е посочен на фигура 1, и където посоченият FGF-20 има FGF активност.
18. Използуване на FGF-20 за лечение на надбъбречна левкодистрофия, прогресивна мултифокална левкоенцефалопатия, енцефаломиелит, синдром на GuillianВагге, парапротеинемия или хронична заразна демиелинезираща полиневропатия, чрез прилагане върху пациент с необходимост от това на ефективно количество нуклеинова киселина, имаща нуклеотидна последователност, кодираща за FGF-20 полипептид или за негов биологичноакгивен фрагмент.
19. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 18, характеризиращ се с това, че посоченият FGF-20 полипептид е човешки.
20. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 19, при което посочената нуклеотидна последователност кодира без прекъсване за FGF-20.
21. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 18, при което нуклеотидната последователност притежава 95% идентичност на последователностите с нуклеотидната

S последователност, посочен на фигура 1.
22. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 19, при което нуклеотидната последователност притежава 95% идентичност на последователностите с нуклеотидната последователност, посочен на фигура 1.
23. Използуване на FGF-20 за спомагане на преживяемост на присадък, характеризиращ се с това, че се прилага върху пациент с необходимост, ефективно количество FGF-20 полипептид или негов биологичноактивен фрагмент.
24. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 23, при което посоченият FGF-20 полипептид е човешки.

ij ^w
25. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 24, при което посоченият полипептид притежава FGF-20 специфична имуногенна активност.
26. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 23, при което посоченият полипептид включва аминокиселина 1 до аминокиселина 211, както е посочено на фигура 1.
27. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 23, при което посоченият полипептид притежава 95% идентичност на последователностите с аминокиселина 1 до аминокиселина

211 на човешки FGF-20, както е посочен на фигура 1, и където посоченият FGF-20 има FGF активност,
28. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 24, при което посоченият полипептид притежава 95% идентичност на последователностите с аминокиселина 1 до аминокиселина 211 на човешки FGF-20, както е посочен на фигура 1, и където «· посоченият FGF-20 има FGF активност.
29. Използуване на FGF-20 за спомагане на преживяемост на присадък, при което се прилага върху пациент с необходимост, ефективно количество FGF-20 полипептид или негов биологичноактивен фрагмент.
30. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 29, при което посочят FGF-20 полипептид е човешки.
31. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 30, при което посочената нуклеотидна последователност кодира без прекъсване за FGF-20.
32. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 29, при което нуклеотидната последователност притежава 95% идентичност на последователностите с нуклеотидната последователност, посочен на фигура 1.
33. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 30, при което нуклеотидната последователност притежава 95% идентичност на последователностите с нуклеотидната последователност, посочен на фигура 1.
34. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 1, за лечение на мултиплена склероза.
35. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 7, за лечение на мултиплена склероза.
36. Използване на FGF-9 за лечение на увреждане на гръбначния мозък; травми на гръбначния мозък; нараняване на нервна тъкан, причинени от исхемична атака, инфаркт, хеморагия или аневризма; болест на Hunigton; мултиплена склероза, миелопатия; миелитис; или сирингомиелия, чрез прилагане върху пациент с необходимост от това на ефективно количество FGF-9 полипептид или на негов биологичноактивен фрагмент.

®
37. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 36, при което посоченият FGF-9 полипептид е човешки.
38. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 37, при което посоченият полипептид притежава FGF-9 специфична имуногенна активност.
39. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 36, при което посоченият полипептид включва аминокиселина 1 до аминокиселина 208, както е посочено на фигура 3.
40. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 36, при © което посоченият полипептид притежава 95% идентичност на © последователностите с аминокиселина 1 до аминокиселина

208 на човешки FGF-9, както е посочен на фигура 3, и където посоченият полипептид има FGF активност.
41. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 37, при което посоченият полипептид притежава 95% идентичност на последователностите с аминокиселина 1 до аминокиселина 208 на човешки FGF-9, както е посочен на фигура 3, и където посоченият полипептид има FGF активност.
42. Използуване на FGF-9 за лечение на нараняване на гръбначен мозък; травми на гръбначен мозък; нараняване на нервна тъкан в следствие на исхемична атака, инфаркт, кръвоизлив или аневризма; болест на Hunigton; миелопатия; миелитис; или сирингомиелия, чрез прилагане върху пациент с необходимост от това на ефективно количество нуклеинова киселина, имаща нуклеотидна последователност, кодираща за FGF-9 полипептид или за негов биологичноактивен фрагмент.
43. Използуване на FGF-20, съгласно претенция 7, при което посочената нуклеотидна последователност е човешка.
44. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 43, при което посочената нуклеотидна последователност кодира без прекъсване за FGF-9.
45. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 42, при което посочената нуклеотидна последователност притежава 95% идентичност на последователностите с нуклеотидната последователност посочена на фигура 3.
46. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 43, при което посочената нуклеотидна последователност притежава 95% идентичност на последователностите с нуклеотидната последователност посочена на фигура 3.
47. Използуване на FGF-9 за лечение на надбъбречна левкодистрофия, прогресивна мултифокална левкоенцефалопатия, енцефаломиелит, синдром на GuillianВагге, парапротеинемия или хронична заразна демиелинезираща полиневропатия, чрез прилагане върху пациент с необходимост от това на ефективно количество нуклеинова киселина, имаща нуклеотидна последователност, кодираща за FGF-9 полипептид или за негов биологичноактивен фрагмент.
48. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 47, при което посоченият FGF-9 полипептид е човешки.
49. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 48, при което посоченият полипептид притежава FGF-9 специфична имуногенна активност.
50. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 47, при което посоченият полипептид включва аминокиселина 1 до аминокиселина 208, както е посочено на фигура 3.
51. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 47, при което посоченият полипептид притежава 95% идентичност на последователностите с аминокиселина 1 до аминокиселина 208 на човешки FGF-9, както е посочен на фигура 3, и където посоченият полипептид има FGF активност.
52. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 48, при което посоченият полипептид притежава 95% идентичност на последователностите с аминокиселина 1 до аминокиселина 208 на човешки FGF-9, както е посочен на фигура 3, и където посоченият полипептид има FGF активност.
53. Използуване на FGF-9 за лечение на надбъбречна левкодистрофия, прогресивна мултифокална левкоенцефалопатия, енцефаломиелит, синдром на GuillianВагге, парапротеинемия или хронична заразна демиелинезираща полиневропатия, чрез прилагане върху пациент с необходимост от това на ефективно количество нуклеинова киселина, имаща нуклеотидна последователност, кодираща за FGF-9 полипептид или за негов биологичноактивен фрагмент.
54. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 53, характеризиращ се с това, че посоченият FGF-9 полипептид е човешки.
55. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 54, при което посочената нуклеотидна последователност кодира без прекъсване за FGF-9.
56. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 53, при което нуклеотидната последователност притежава 95% идентичност на последователностите с нуклеотидната последователност, посочен на фигура 3.
57. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 54, при което нуклеотидната последователност притежава 95% идентичност на последователностите с нуклеотидната последователност, посочен на фигура 3.
58. Използуване на FGF-9 за спомагане на преживяемост на присадък, характеризиращ се с това, че се прилага върху пациент с необходимост, ефективно количество FGF-9 полипептид или негов биологичноактивен фрагмент.
59. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 58, при което посоченият FGF-9 полипептид е човешки.
60. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 59, при което посоченият полипептид притежава FGF-9 специфична имуногенна активност.
61. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 58, при което посоченият полипептид включва аминокиселина 1 до аминокиселина 208, както е посочено на фигура 3.
62. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 58, при което посоченият полипептид притежава 95% идентичност на последователностите с аминокиселина 1 до аминокиселина

211 на човешки FGF-9, както е посочен на фигура 3, и където посоченият пептид има FGF активност.
63. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 59, при което посоченият полипептид притежава 95% идентичност на последователностите с аминокиселина 1 до аминокиселина 208 на човешки FGF-9, както е посочен на фигура 3, и където посоченият полипептид има FGF активност.
64. Използуване на

FGF-9 за спомагане на при което се прилага ефективно количество преживяемост на присадък, пациент с необходимост, полипептид или негов биологичноактивен фрагмент.
65. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 64 , което посочят FGF-9 полипептид е човешки.
66. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 65, върху

FGF-9 което посочената нуклеотидна последователност кодира прекъсване за FGF-9.
67. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 64, при при без при което нуклеотидната последователност притежава 95% идентичност на последователностите с нуклеотидната последователност, посочен на фигура 3.
68. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 65, при което нуклеотидната последователност притежава 95% идентичност на последователностите с нуклеотидната последователност, посочен на фигура 3.
69. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 36, за лечение на мултиплена склероза.
70. Използуване на FGF-9, съгласно претенция 42, за лечение на мултиплена склероза.