ES2828505T3

ES2828505T3 - Composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos y enfermedades metabólicos

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Publication number: ES2828505T3
Application number: ES13857983T
Authority: ES
Inventors: Lei Ling; Darrin Lindhout
Original assignee: NGM Biopharmaceuticals Inc
Current assignee: NGM Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 2012-11-28
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2021-05-26
Anticipated expiration: 2033-11-26
Also published as: EP2925775A2; US20210169983A1; CA2892152A1; US20180362605A1; HK1214832A1; EP2925775A4; US20150291677A1; US10758590B2; AU2013352363B2; WO2014085365A2; NZ630484A; US9963494B2; AU2013352363A1; EP2925775B1; EP3798228A1; WO2014085365A3

Abstract

Un péptido quimérico, que comprende: (a) una región N-terminal que comprende al menos siete restos de aminoácido, teniendo la región N-terminal una primera posición de aminoácido y una última posición de aminoácido, en donde la región N-terminal comprende DSSPL (SEQ ID NO: 121), DASPH (SEQ ID NO: 122), o DAGPH (restos de aminoácido 7 a 11 de SEQ ID NO: 99 [FGF19]) y (b) una región C-terminal que comprende una primera posición de aminoácido y una última posición de aminoácido, en donde la región C-terminal comprende i. una primera secuencia de la región C-terminal que comprende WGDPIRLRHLYTSG (SEQ ID NO: 169), en donde el resto W corresponde a la primera posición de aminoácido de la región C-terminal; y ii. una segunda secuencia de la región C-terminal que comprende **(Ver fórmula)** en donde el péptido quimérico comprende la secuencia EILPD, EIRED, EILCD o EILED sustituida por secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188; y en donde el péptido quimérico (i) se une al receptor 4 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR4) con una afinidad igual o mayor que la afinidad de unión de FGF19 por FGFR4; (ii) activa FGFR4 en un grado o cantidad igual o mayor que FGF19 activa FGFR4; (iii) tiene al menos uno de formación reducida de carcinoma hepatocelular (CHC); mayor actividad reductora de glucosa, menor actividad de aumento de lípidos, menor actividad de triglicéridos, menor actividad de colesterol, menor actividad de no HDL o menor actividad de aumento de HDL, en comparación con FGF19, o en comparación con una secuencia variante de FGF19 que tenga cualquiera de GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP o FGDPI sustituido por la secuencia de WGDPI en los aminoácidos 16-20 de FGF19 (SEQ ID NO: 99); y/o (iv) tiene menos actividad reductora de masa magra en comparación con FGF21.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos y enfermedades metabólicos

Campo de la invención

La invención se refiere en general a variantes de proteínas y secuencias de péptidos del factor de crecimiento de fibroblastos 19 (FGF19) y fusiones de FGF19 y/o proteínas y secuencias de péptidos (y peptidomiméticos) del factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21), y variantes de fusiones de proteínas y secuencias de péptidos (y peptidomiméticos) FGF19 y/o FGF21 que tienen actividad reductora de glucosa, y al uso de las mismas en el tratamiento de la hiperglucemia y otros trastornos.

Introducción

La diabetes mellitus es una enfermedad metabólica debilitante causada por la ausencia de producción de insulina (tipo 1) o resistencia a la insulina o una producción insuficiente de insulina (tipo 2) de las células p pancreáticas. Las células p son células endocrinas especializadas que fabrican y almacenan insulina para su liberación después de una comida. La insulina es una hormona que facilita la transferencia de glucosa de la sangre a los tejidos donde se necesita. Los pacientes con diabetes deben controlar con frecuencia los niveles de glucosa en sangre y muchos requieren múltiples inyecciones diarias de insulina para sobrevivir. Sin embargo, estos pacientes rara vez alcanzan niveles ideales de glucosa mediante la inyección de insulina (Turner, R.C. et al. JAMA 281: 2005 (1999)). Además, la elevación prolongada de los niveles de insulina puede dar como resultado efectos secundarios perjudiciales tales como choque hipoglucémico y desensibilización de la respuesta del organismo a la insulina. En consecuencia, los pacientes diabéticos aún desarrollan complicaciones a largo plazo, tales como enfermedades cardiovasculares, enfermedad renal, ceguera, daño nervioso y trastornos de cicatrización de heridas (Grupo de Estudio Prospectivo de Diabetes del Reino Unido (UkPDS en sus siglas en inglés), Lancet 352:837 (1998)).

Se ha propuesto la cirugía bariátrica como un tratamiento potencial para la diabetes. Se ha postulado que los cambios en la secreción de hormonas intestinales después de la cirugía son responsables de la resolución de las afecciones diabéticas. El mecanismo molecular subyacente aún no se ha dilucidado, aunque se ha especulado con el péptido 1 similar al glucagón (GLP-1) como un posible candidato (Rubino, F. Diabetes Care 32 Supl 2:S368 (2009)). El FGF19 se expresa altamente en el intestino delgado distal y la expresión en exceso transgénica de FGF19 mejora la homeostasis de la glucosa (Tomlinson, E. Endocrinology 143(5): 1741 -7 (2002)). Los niveles séricos de FGF19 en seres humanos se elevan después de la cirugía de bypass gástrico. El aumento de la expresión y secreción de FGF19 podría explicar al menos parcialmente la remisión de la diabetes experimentada después de la cirugía.

El documento US 2011/0104152 A1 se refiere a polipéptidos del factor de crecimiento de fibroblastos quiméricos (FGF), ADN que codifica polipéptidos de FGF quiméricos y a métodos, composiciones y ensayos que utilizan polipéptidos de FGF quiméricos para el tratamiento terapéutico de trastornos relacionados con el metabolismo.

El documento US 2010/0323954 A1 se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos quiméricos (es decir FGF19, FGF21 y FGF23), polipéptidos quiméricos, composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos quiméricos y métodos para tratar trastornos metabólicos tales como la diabetes y la obesidad utilizando tales ácidos nucleicos, polipéptidos o composiciones farmacéuticas.

Wu et al. (The Journal of Biological Chemistry, vol. 285, 2010, páginas 5165-5170) se refieren a la proliferación de hepatocitos inducida por FGF19 que está mediada por la activación de FGFR4.

Wu et al. (PLoS One, vol. 6, núm. 3, 2011, página E17868) se refieren a la regulación de la proliferación celular, el metabolismo de la glucosa y los ácidos biliares por FGF19 a través de rutas independientes y dependientes de FGFR4.

Por consiguiente, existe la necesidad de tratamientos alternativos de afecciones hiperglucémicas tales como diabetes, prediabetes, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa o síndrome metabólico, y otros trastornos y enfermedades asociados con niveles elevados de glucosa, en seres humanos. La invención satisface esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas.

Compendio

La invención se basa generalmente, en parte, en variantes de secuencias de péptidos de FGF19, fusiones de secuencias de péptidos de FGF19 y/o FGF21 y variantes de fusiones (quimeras) de secuencias de péptidos de FGF19 y/o FGF21 que tienen una o más actividades, tales como actividad reductora de glucosa. Tales variantes y fusiones (quimeras) de secuencias de péptidos de FGF19 y/o FGF21 incluyen secuencias que no aumentan ni inducen la formación de carcinoma hepatocelular (CHC) o tumorigénesis de CHC. Tales variantes y fusiones (quimeras) de secuencias de péptidos de FGF19 y/o FGF21 también incluyen secuencias que no inducen una elevación o aumento sustancial en el perfil de lípidos.

La invención proporciona un péptido quimérico que comprende:

(a) una región N-terminal que comprende al menos siete restos de aminoácido, teniendo la región N-terminal una primera posición de aminoácido y una última posición de aminoácido, en donde la región N-terminal comprende DSSPL (SEQ ID NO: 121), DASPH (SEQ ID NO: 122), o DAGPH (restos de aminoácido 7 a 11 de SEQ ID NO: 99 [FGF19]) y

(b) una región C-terminal que comprende una primera posición de aminoácido y una última posición de aminoácido, en donde la región C-terminal comprende

i. una primera secuencia de la región C-terminal que comprende WGDPIRLRHLYTSG (SEQ ID NO:

169), en donde el resto W corresponde a la primera posición de aminoácido de la región C-terminal; y

ii. una segunda secuencia de la región C-terminal que comprende

PH G LSS C FLR IR A D G V V D C A R G Q S A H S LLE IK A V A LR TV A IK G V

H SVR YLC M G AD G KM Q G LLQ YSEEDC AFEEEIR PD G YN VYR SE

KHRLPVSLSSAKQ RQ LYKNRG FLPLSHFLPM LPM VPEEPEDLRG

HLESDMFSSPLETDSM DPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID

NO:188);

en donde el péptido quimérico comprende

la secuencia EILPD, EIRED, EILCD o EILED sustituida por la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188; y en donde el péptido quimérico

(i) se une al receptor 4 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR4) con una afinidad igual o mayor que la afinidad de unión de FGF19 por FGFR4;

(ii) activa FGFR4 en un grado o cantidad igual o mayor que FGF19 activa FGFR4;

(iii) tiene al menos uno de menor formación de carcinoma hepatocelular (CHC); mayor actividad reductora de glucosa, menor actividad de aumento de lípidos, menor actividad de triglicéridos, menor actividad de colesterol, menor actividad de no HDL o menor actividad de aumento de HDL, en comparación con FGF19, o en comparación con una secuencia variante de FGF19 que tenga cualquiera de GQV, GDI, WGPI , WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP o FGDPI sustituida por la secuencia WGDPI en los aminoácidos 16-20 de FGF19 (SEQ ID NO: 99); y/o

(iv) tiene menos actividad reductora de masa magra en comparación con FGF21.

En una realización, la región N-terminal del péptido quimérico comprende los restos de aminoácido (i) VHYG (SEQ ID NO: 101), (ii) DASPHVHYG (SEQ ID NO: 102), o (iii) DSSPLVHYG (SEQ ID NO: 103). En una realización, G corresponde a la última posición de la región N-terminal. En otras realizaciones, la región N-terminal comprende adicionalmente:

(i) RHPIP (SEQ ID NO: 106), en donde R es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal; (ii) HPIP (SEQ ID NO: 107), en donde H es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal; (iii) RPLAF (SEQ ID NO: 108), en el que R es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal; (iv) PLAF (SEQ ID NO: 109), en donde P es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal;

o

(v) R, en donde R es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal.

En otra realización, la región N-terminal del péptido quimérico comprende los restos de aminoácido DSSPLLQ (SEQ ID NO: 104), y en donde el resto Q es la última posición de aminoácido de la región N-terminal. En otras realizaciones, la región N-terminal comprende adicionalmente:

o

En otra realización, la región N-terminal del péptido quimérico comprende los restos de aminoácido DSSPLLQFGGQV (SEQ ID NO: 105), y en donde el resto V corresponde a la última posición de la región N-terminal.

En otra realización, los restos de aminoácido HPIP (SEQ ID NO: 107) son los primeros 4 restos de aminoácido de la región N-terminal.

En otra realización, la primera posición de aminoácido de la región N-terminal es un resto "M", un resto "R", un resto "S", un resto "H", un resto "P", un resto "L" o un resto "D".

En otra realización, la región N-terminal no tiene un resto "M" o un resto "R" en la primera posición de aminoácido de la región N-terminal.

En otra realización, la región N-terminal comprende cualquiera de las siguientes secuencias: MDSSPL (SEQ ID NO: 119), MSDSSPL (SEQ ID NO: 120) o SDSSPL (SEQ ID NO: 112). En realizaciones adicionales,

(i) la primera posición de la región N-terminal es un resto R o M;

(ii) la primera y segunda posiciones de la región N-terminal son una secuencia MR, RM, RD, DS, MD o MS; (iii) de la primera a la tercera posiciones de la región N-terminal son una secuencia MDS, RDS, MSD, MSS o DSS;

(iv) de la primera a la cuarta posiciones de la región N-terminal son una secuencia RDSS (SEQ ID NO: 115) o MDSS (SEQ ID NO: 116);

(v) de la primera a la quinta posiciones de la región N-terminal son una secuencia MRDSS (SEQ ID NO:

117);

(vi) de la primera a la sexta posiciones de la región N-terminal son una secuencia MDSSPL (SEQ ID NO:

119) ; o

(vii) de la primera a la séptima posiciones de la región N-terminal son una secuencia MSDSSPL (SEQ ID NO:

120) .

En otra realización, el péptido quimérico comprende una región N-terminal que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en cualquiera de:

RPLAFSDASPHVHYG (M1) (aminoácidos 1-15 de SEQ ID NO: 1);

RPLAFSDSSPLVHYG (M2) (aminoácidos 1-15 de SEQ ID NO: 2);

RPLAFSDAGPHVH (M16) (aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO: 16);

RPLAFSDAGPHVG (M17) (aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO: 17);

RPLAFSDAGPHYG (M18) (aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO: 18);

RPLAFSDAGPHVHG (M22) (aminoácidos 1-14 de SEQ ID NO: 22);

RPLAFSDAGPHHG (M23) (aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO: 23);

RPLAFSDAGPHHY (M24) (aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO: 24);

RPLAFSDAGPHVY (M25) (aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO: 25);

RPLAFSDSSPLVH (M26) (aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO: 26);

RPLAFSDAGPHV (M28) (aminoácidos 1-12 de SEQ ID NO: 28);

RPLAFSDAGPHVHY (M29) (aminoácidos 1-14 de SEQ ID NO: 29);

RPLAFSDAGPHVHYA (M30) (aminoácidos 1-15 de SEQ ID NO: 30);

RDSSPLLQ (M52) (aminoácidos 1-8 de SEQ ID NO: 52);

MDSSPLVHYG (M53) (aminoácidos 1-10 de SEQ ID NO: 53);

RDSSPLVHYG (M69) (aminoácidos 1-10 de SEQ ID NO: 69);

MRDSSPLVHYG (M70) (aminoácidos 1-11 de SEQ ID NO: 70);

RPLAFSDAGPHVHYG (M160) (aminoácidos 1-15 de SEQ ID NO: 196); o

cualquiera de las secuencias de péptidos anteriores, en donde se elimina el resto R amino terminal.

En otra realización, el péptido quimérico tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en:

(i) SEQ ID NO: 1 (M1) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO:

188;

(ii) SEQ ID NO: 2 (M2) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO:

188;

(iii) SEQ ID NO: 16 (M16) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID (iv) SEQ ID NO: 17 (M17) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(v) SEQ ID NO: 18 (M18) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(vi) SEQ ID NO: 22 (M22) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(vii) SEQ ID NO: 23 (M23) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(viii) SEQ ID NO: 24 (M24) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(ix) SEQ ID NO: 25 (M25) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(x) SEQ ID NO: 26 (M26) con al menos una sustitución de aminoácidos en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xi) SEQ ID NO: 28 (M28) con al menos una sustitución de aminoácidos en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xii) SEQ ID NO: 28 (M28) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xiii) SEQ ID NO: 29 (M29) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xiv) SEQ ID NO: 30 (M30) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xv) SEQ ID NO: 52 (M52) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xvi) SEQ ID NO: 53 (M53) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xvii) SEQ ID NO: 68 (M68) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xviii) SEQ ID NO: 69 (M69) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xix) SEQ ID NO: 70 (M70) con al menos una sustitución de aminoácidos en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

193 (M139);

194 (M140);

195 (M141); o

La invención proporciona adicionalmente un péptido quimérico que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 196. La invención proporciona adicionalmente un péptido quimérico que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 196.

En una realización, el péptido quimérico de la invención se fusiona con una región Fc de inmunoglobulina.

La invención proporciona adicionalmente una composición farmacéutica que comprende el péptido quimérico de la invención. En una realización, la composición farmacéutica comprende un agente reductor de glucosa.

La invención proporciona adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido quimérico de la invención, en donde la molécula de ácido nucleico comprende adicionalmente un elemento de control de la expresión en una conexión operable que confiere la expresión de la molécula de ácido nucleico in vitro, en una célula o in vivo.

La invención proporciona adicionalmente un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención. En una realización, el vector es un vector viral.

La invención proporciona adicionalmente una célula transformada o anfitriona que expresa el péptido quimérico de la invención.

La invención proporciona adicionalmente un péptido quimérico de la invención para su uso en un método para mejorar el metabolismo de la glucosa en un sujeto que lo necesite.

La invención proporciona adicionalmente un péptido quimérico de la invención para su uso en un método de tratamiento de un trastorno en un sujeto que lo necesite, en donde el trastorno es una afección hiperglucémica, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, síndrome metabólico, obesidad, masa corporal no deseable, EHGNA o EHNA. En una realización, la afección hiperglucémica comprende diabetes. En una realización, la diabetes es diabetes insulinodependiente (tipo I), diabetes tipo II, diabetes gestacional o prediabetes.

En otra realización, el sujeto tiene una afección hiperglucémica, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, síndrome metabólico, obesidad, masa corporal no deseable, enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA) o esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). En una realización, la afección hiperglucémica comprende diabetes. En una realización, la diabetes es diabetes insulinodependiente (tipo I), diabetes tipo II, diabetes gestacional o prediabetes.

En otra realización, el sujeto tiene (i) un nivel de glucosa plasmática en ayunas (GPA) superior a 100 mg/dl; (ii) tiene un nivel de GPA superior a 125 mg/dl; (iii) tiene un nivel de GPA de entre 100 y 125 mg/dl; o (iv) tiene un nivel de hemoglobina A1c (HbA1c) superior a 6%.

En otra realización, el método da como resultado un aumento de la sensibilidad a la insulina, una reducción de la resistencia a la insulina, una reducción del glucagón, una mejora de la tolerancia a la glucosa, una mejora del metabolismo u homeostasis de la glucosa, una mejora de la función pancreática, una reducción del nivel de triglicéridos, una reducción del nivel de colesterol, una reducción del nivel de IDL, una reducción del nivel de LDL, una reducción del nivel de VLDL, una reducción de la presión arterial, una reducción del engrosamiento de la íntima de los vasos sanguíneos, una reducción de la masa corporal o aumento de peso, o una reducción de los niveles de glucosa.

Como se describe en la presente memoria, una secuencia peptídica quimérica incluye o consiste en: a) una región N-terminal que comprende al menos siete restos de aminoácido, teniendo la región N-terminal una primera posición de aminoácido y una última posición de aminoácido, en donde la región N- terminal comprende un DSSPL (SEQ ID NO: 121) o DASPH (SEQ ID No : 122); y b) una región C-terminal que comprende una porción de SEQ ID NO: 99 [FGF19], teniendo la región C-terminal una primera posición de aminoácido y una última posición de aminoácido, en donde la región C-terminal comprende restos de aminoácido 16-29 de SEQ ID NO: 99 [FGF19] (WGDPIRLRHLy Ts G; SEQ ID NO: 169), en donde el resto W corresponde a la primera posición de aminoácido de la región C-terminal.

Como se describe en la presente memoria, una secuencia peptídica quimérica incluye o consiste en: a) una región N-terminal que comprende una porción de SEQ ID NO: 100 [FGF21], teniendo la región N-terminal una primera posición de aminoácido y una última posición de aminoácido, en donde la región N-terminal comprende restos de aminoácido GQV, y donde el resto V corresponde a la última posición de aminoácido de la región N-terminal; y b) una región C-terminal que comprende una porción de SEQ ID NO: 99 [FGF19], teniendo la región C-terminal una primera posición de aminoácido y una última posición de aminoácido, en donde la región C-terminal comprende restos de aminoácido 21-29 de SEQ ID NO: 99 [FGF19], RLRHLYTSG (SEQ ID NO: 185), y en donde el resto R corresponde a la primera posición de la región C-terminal.

Una secuencia peptídica quimérica incluye o consiste en cualquiera de: a) una región N-terminal que comprende una porción de SEQ ID NO: 100 [FGF21], teniendo la región N-terminal una primera posición de aminoácido y una última posición de aminoácido, en donde la región N-terminal comprende al menos 5 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 100 [FGF21] que incluyen los restos de aminoácido GQV, y donde el resto V corresponde a la última posición de aminoácido de la región N-terminal; y b) una región C-terminal que comprende una porción de SEQ ID NO: 99 [FGF19], teniendo la región C-terminal una primera posición de aminoácido y una última posición de aminoácido, en donde la región C-terminal comprende restos de aminoácido 21-29 de SEQ ID NO: 99 [FGF19], RLRHLYTSG (SEQ ID NO: 185), y en donde el resto R corresponde a la primera posición de la región C-terminal.

Una secuencia peptídica quimérica incluye o consiste en cualquiera de: a) una variante de secuencia de FGF19 que tiene una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácido en comparación con un FGF19 de referencia o de tipo salvaje; b) una variante de secuencia de FGF21 que tiene una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácido en comparación con un FGF21 de referencia o de tipo salvaje; c) una porción de una secuencia de FGF19 fusionada con una porción de una secuencia de FGF21; o d) una porción de una secuencia de FGF19 fusionada a una porción de una secuencia de FGF21, en donde la porción o porciones de la secuencia de FGF19 y/o FGF21 tienen una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácido en comparación con un FGF19 y/o FGF21 de referencia o de tipo salvaje.

La región N-terminal comprende al menos 6 aminoácidos contiguos (o más, p. ej., 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20-25, 25-30, 30-40, 40-50, 50-75, 75-100 aminoácidos contiguos) de SEQ ID NO: 100 [FGF21] incluyendo los restos de aminoácido GQV.

Una secuencia peptídica quimérica o una secuencia peptídica quimérica incluye o consiste en los aminoácidos aminoterminales 1-16 de SEQ ID NO: 100 [FGF21] fusionados con los aminoácidos carboxi-terminales 21-194 de SEQ ID NO: 99 [FGF19], o la secuencia del péptido tiene los aminoácidos 1-147 del extremo amino del SEQ ID NO: 99 [FGF19] fusionados con los aminoácidos del extremo carboxi 147-181 del SEQ ID NO: 100 [FGF21] (M41), o la secuencia del péptido tiene los aminoácidos amino-terminales 1-20 de SEQ ID NO: 99 [FGF19] fusionados a los aminoácidos carboxi-terminales 17-181 de SEQ ID NO: 100 [FGF21] (M44), o la secuencia peptídica tiene los aminoácidos aminoterminales 1-146 de SEQ ID NO: 100 [FGF21] fusionado a los aminoácidos carboxi-terminales 148-194 de SEQ ID NO: 99 [FGF19] (M45), o la secuencia peptídica tiene los aminoácidos amino-terminales 1-20 de SEQ ID NO: 99 [FGF19] fusionado a los aminoácidos internos 17-146 de SEQ ID NO: 100 [FGF21] o fusionados a los aminoácidos carboxi-terminales 148-194 de SEQ ID NO: 99 [FGF19] (M46).

Una secuencia peptídica quimérica tiene al menos una sustitución de aminoácidos por los restos de aminoácido 125129 de SEQ ID NO: 99 [FGF19], EIRPD; al menos una sustitución de aminoácidos por los restos de aminoácido 126 128 de SEQ ID NO: 99 [FGF19], IRP; o al menos una sustitución de aminoácidos por los restos de aminoácido 127 128 de SEQ ID NO: 99 [FGF19], RP, o al menos una sustitución de aminoácidos por los restos de aminoácido 1-124 de SEQ ID NO: 99 [FGF19] y/o por los restos de aminoácido 130-194 de SEQ ID NO: 99 [FGF19]. Más específicamente, por ejemplo, una secuencia peptídica con una sustitución por uno de los restos de aminoácido 127 128 de SEQ ID No : 99 [FGF19], IRP, en donde al menos una sustitución de aminoácidos es R127L o P128E.

Los métodos y usos se pueden poner en práctica utilizando un péptido o secuencia quimérica, como se establece en la presente memoria. Por ejemplo, una secuencia que incluye o consiste en cualquier secuencia peptídica establecida en la presente memoria como M1 a M98, o M101 a M160, o SEQ ID NO: 1 a 98, 101 a 135, o 138 a 196, una secuencia peptídica que incluye o consiste en cualquier secuencia establecida en las Tablas 1 -9, o una secuencia peptídica que incluye o consiste en cualquier secuencia establecida en la Lista de Secuencias de la presente memoria.

Los métodos y usos de la invención se pueden poner en práctica utilizando un péptido quimérico de la invención de cualquier longitud adecuada. En realizaciones concretas, la región N-terminal o C-terminal del péptido quimérico tiene una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 restos de aminoácido. En otros aspectos concretos, un péptido o secuencia quimérica tienen 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más deleciones de aminoácidos del extremo amino, el extremo carboxi o internamente. En otras realizaciones concretas, el péptido quimérico o secuencia quimérica tiene una región N-terminal, o una región C-terminal que incluye o consiste en una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100 o más aminoácidos. En realizaciones adicionales más concretas, el péptido quimérico o secuencia quimérica tienen una porción de secuencia de FGF19, o una porción de secuencia de FGF21 que incluye o consiste en una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 60, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100 o más aminoácidos de FGF19 o FGF21.

Una secuencia peptídica quimérica o una secuencia peptídica quimérica tiene un motivo de secuencia WGDPI (SEQ ID NO: 170) correspondiente a la secuencia WGDPI de los aminoácidos 16-20 de SEQ ID NO: 99 [FGF19]; tiene un motivo de secuencia WGDPI (SEQ ID NO: 170) sustituido, mutado o ausente correspondiente a la secuencia WGDPI (SEQ ID NO: 170) de FGF19 de los aminoácidos 16-20 de FGF19; tiene una secuencia WGDPI (SEQ ID NO: 170) con uno o más aminoácidos sustituidos, mutados o ausentes. En varios otros aspectos adicionales, la secuencia peptídica es distinta de una secuencia variante de FGF 19 que tiene cualquiera de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO: 171), WGDPV (SEQ ID NO: 172), WGDI (SEQ ID NO: 173) , GDPI (SEQ ID NO: 174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO: 175), WGAPI (SEQ ID NO: 176), AGDPI (SEQ ID NO: 177), WADPI (SEQ ID NO: 178), WGDAI ( SEQ ID NO: 179), WGDPA (SEQ ID NO: 180), WDPI (SEQ ID NO: 181), WGDI (SEQ ID NO: 182), WGDP (SEQ ID NO: 183) o FGDPI (SEQ ID NO: 184) sustituido por la secuencia WGDPI (SEQ ID NO: 170) de FGF19 en los aminoácidos 16-20.

Una secuencia peptídica quimérica o una secuencia peptídica quimérica tiene una región N-terminal que comprende los restos de aminoácido VHYG (SEQ ID NO: 101), en donde la región N-terminal comprende los restos de aminoácido DASPHVHYG (SEQ ID NO: 102), o la región N-terminal comprende los restos de aminoácido DSSPLVHYG (SEQ ID NO: 103). Más concretamente, en un aspecto, G corresponde a la última posición de la región N-terminal.

La región N-terminal comprende los restos de aminoácido DSSPLLQ (SEQ ID NO: 104), donde el resto Q es la última posición de aminoácido de la región N-terminal, o comprende los restos de aminoácido DSSPLLQFGGQV (SEQ ID NO: 105), donde el resto V corresponde a la última posición de la región N-terminal.

Una secuencia peptídica quimérica o una secuencia peptídica quimérica tiene una región N-terminal que incluye o consiste en: RHPIP (SEQ ID NO: 106), donde R es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal; o HPIP (SEQ ID NO: 107) (p. ej., donde HPIP son los primeros 4 restos de aminoácido de la región N-terminal), donde H es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal; o RPLAF (SEQ ID NO: 108), donde R es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal; o PLAF (SEQ ID NO: 109), donde P es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal; o R, donde R es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal.

Como se describe en la presente memoria, un péptido o secuencia quimérica tiene: restos de aminoácido HPIP (SEQ ID NO: 107), que son los primeros 4 restos de aminoácido de la región N-terminal. En otros varios aspectos adicionales, un péptido o secuencia quimérica tiene: un resto R en la primera posición de la región N-terminal, o la primera posición de la región N-terminal es un resto M, o la primera y segunda posiciones de la región N-terminal son una secuencia MR, o la primera y segunda posiciones de la región N-terminal son una secuencia RM, o la primera y segunda posiciones de la región N-terminal son una secuencia RD, o la primera y segunda posiciones de la región N-terminal son una secuencia DS, o la primera y segunda posiciones de la región N-terminal son una secuencia MD, o la primera y segunda posiciones de la región N-terminal son una secuencia MS, o la primera a tercera posiciones de la región N-terminal son una secuencia MDS, o la primera a tercera posiciones de la región N-terminal son una secuencia RDS, o la primera a tercera posiciones de la región N-terminal son una secuencia MSD, o la primera a tercera posiciones de la región N-terminal son una secuencia MSS, o la primera a tercera posiciones de la región N-terminal son una secuencia DSS, o la primera a cuarta posiciones de la región N-terminal son una secuencia RDSS (SEQ ID NO: 115), o la primera a cuarta posiciones de la región N-terminal son una secuencia de MDSS (SEQ ID NO: 116), o la primera a quinta posición de la región N-terminal son una secuencia de MRDSS (SEQ ID NO: 117), o la primera a quinta posiciones de la región N-terminal son una secuencia MSSPL (SEQ ID NO: 113). En algunas realizaciones, la primera a sexta posiciones de la región N-terminal son una secuencia MDSSPL (SEQ ID NO: 110), o la primera a séptima posiciones de la región N-terminal son una secuencia MSDSSPL (SEQ ID NO: 111).

En varios otros aspectos concretos, el péptido quimérico tiene en la posición del primer aminoácido de la región N-terminal un resto "M", un resto "R", un resto "S", un resto "H", un resto "P", un resto "L" o un resto "D". En varios aspectos concretos alternativos, el péptido quimérico no tiene un resto "M" o un resto "R" en la primera posición de aminoácido de la región N-terminal.

En otros aspectos adicionales, el péptido quimérico tiene una región N-terminal con cualquiera de las siguientes secuencias: MDSSPL (SEQ ID NO: 110), MSDSSPL (SEQ ID NO: 111), SDSSPL (SEQ ID NO: 112), MSSPL (SEQ ID NO: 113) o SSPL (SEQ ID NO: 114).

Una secuencia peptídica quimérica o una secuencia peptídica quimérica una adición de restos de aminoácido 30-194 de SEQ ID NO: 99 [FGF19] en el extremo C-terminal, dando como resultado un polipéptido quimérico que tiene en la última posición de la región C-terminal que corresponde a aproximadamente el resto 194 de SEQ ID NO: 99 [FGF19]. En otras realizaciones adicionales, una secuencia peptídica quimérica o secuencia peptídica comprende toda o una porción de una secuencia de FGF19 (p. ej., SEQ ID NO: 99), situada en el extremo C-terminal del péptido, o donde el resto "R" del extremo amino terminal está suprimido del péptido.

Una secuencia peptídica quimérica o una secuencia peptídica incluyen o consisten en cualquiera de las secuencias de péptidos variantes M1-M98, o una subsecuencia o fragmento de cualquiera de las secuencias de péptidos variantes M1-M98. Los métodos y usos descritos en la presente memoria también se pueden poner en práctica utilizando un péptido o secuencia quimérica, como se establece en la presente memoria. Por ejemplo, una secuencia que incluye o consiste en cualquier secuencia peptídica establecida en la presente memoria como M1 a M98, o M101 a M160, o SEQ ID NO: 1 a 98, 101 a 135, o 138 a 196, una secuencia peptídica que incluye o consiste en cualquier secuencia establecida en las Tablas 1-9, o una secuencia peptídica que incluye o consiste en cualquier secuencia establecida en la Lista de Secuencias de la presente memoria.

Los métodos y usos descritos en la presente memoria se pueden poner en práctica utilizando un péptido o secuencia quimérica de cualquier longitud adecuada. La región N-terminal o C-terminal del péptido o secuencia quimérica puede tener una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 restos de aminoácido. Una secuencia peptídica quimérica o una secuencia peptídica puede tener al menos una deleción de aminoácidos. En otros aspectos concretos, un péptido o secuencia quimérica tiene 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más deleciones de aminoácidos del extremo amino, el extremo carboxi o internamente. La sustitución o deleción de aminoácidos se realiza en cualquiera de las posiciones de aminoácidos 8-20 de FGF19 (AGPHVHYGWGDPI) (AGPHVHYGWGDPI) (SEQ ID NO: 187). Un péptido o secuencia quimérica tiene una región N-terminal, o una región C-terminal que incluye o consiste en una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100 o más aminoácidos. Un péptido o secuencia quimérica tiene una porción de secuencia de FGF19, o una porción de secuencia de FGF21 que incluye o consiste en una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 50 a 60, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100 o más aminoácidos de FGF19 o FGF21.

En realizaciones concretas adicionales, el péptido quimérico tiene funciones o actividades concretas como se especificó anteriormente. En un aspecto, el péptido quimérico mantiene o aumenta una actividad mediada por FGFR4. En aspectos adicionales, el péptido quimérico se une a FGFR4 con una afinidad comparable o mayor que la afinidad de unión de FGF19 por FGFR4, o activa FGFR4 en una extensión o cantidad comparable o mayor que FGF19 activa FGFR4. En aspectos adicionales, una secuencia peptídica quimérica o secuencia peptídica tiene una formación de CHC reducida en comparación con FGF19, o una secuencia variante de FGF 19 que tiene cualquiera de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO: 171), WGDPV (SEQ ID NO: 172), WGDI (SEQ ID NO: 173), GDPI (SEQ ID NO: 174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO: 175), WGAPI (SEQ ID NO: 176), AGDPI (SEQ ID NO: 177), WADPI (SEQ ID NO: 178), WGDAI (SEQ ID NO: 179), WGDPA (SEQ ID NO: 180), WDPI (SEQ ID NO: 181), WGDI (SEQ ID NO: 182), WGDP (SEQ ID NO: 183) o FGDPI (SEQ ID NO: 184) sustituido por la secuencia WGDPI (SEQ ID NO: 170) en los aminoácidos 16-20 de FGF19; o tiene una mayor actividad reductora de glucosa en comparación con FGF19, o una secuencia variante de FGF 19 que tiene cualquiera de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO: 171), WGDPV (SEQ ID NO: 172), WGDI (SEQ ID NO: 173), GDPI (SEQ ID NO: 174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO: 175), WGAPI (SEQ ID NO: 176), AGDPI (SEQ ID NO: 177), WADPI (SEQ ID NO: 178), WGDAI (SEQ ID NO: 179), WGDPA (SEQ ID NO: 180), WDPI (SEQ ID NO: 181), WGDI (SEQ ID NO: 182), WGDP (SEQ ID NO: 183) o FGDPI (SEQ ID NO: 184) sustituido por la secuencia WGDPI (SEQ ID NO: 170) en los aminoácidos 16-20 de FGF19; tiene menos actividad de aumento de lípidos en comparación con FGF19, o una secuencia variante de FGF 19 que tiene cualquiera de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO: 171), WGDPV (SEQ ID NO: 172), WGDI (SEQ ID NO: 173), GDPI (SEQ ID NO: 174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO: 175), WGAPI (SEQ ID NO: 176), AGDPI (SEQ ID NO: 177), WADPI (SEQ ID NO: 178), WGDAI (SEQ ID NO: NO: 179), WGDPA (SEQ ID NO: 180), WDPI (SEQ ID NO: 181), WGDI (SEQ ID NO: 182), WGDP (SEQ ID NO: 183) o FGDPI (SEQ ID NO: 184) sustituido por la secuencia WGDPI (SEQ ID NO: 170) en los aminoácidos 16-20 de FGF19; o tiene menos actividad de aumento de triglicéridos, colesterol, no HDL o HDL en comparación con FGF19, o una secuencia variante de FGF 19 que tiene cualquiera de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO: 171), WGDPV (SEQ ID NO: 172), WGDI (SEQ ID NO: 173), GDPI (SEQ ID NO: 174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO: 175), WGAPI (SEQ ID NO: 176), AGDPI (SEQ ID NO: 177), WADPI (SEQ ID NO: NO: 178), WGDAI (SEQ ID NO: 179), WGDPA (SEQ ID NO: 180), WDPI (SEQ ID NO: 181), WGDI (SEQ ID NO: 182), WGDP (SEQ ID NO: 183) o FGDPI (SEQ ID NO: 184) sustituido por la secuencia WGDPI (SEQ ID NO: 170) en los aminoácidos 16-20 de FGF19; o secuencia peptídica tiene menos actividad reductora de masa magra en comparación con FGF21. Tales funciones y actividades se pueden determinar in vitro o in vivo, por ejemplo, en un ratón db/db.

En otras realizaciones adicionales, los péptidos quiméricos se aíslan o purifican y/o los péptidos quiméricos se pueden incluir en las composiciones. En una realización, el péptido quimérico se incluye en una composición farmacéutica. Tales composiciones incluyen combinaciones de ingredientes inactivos u otros activos. En una realización, una composición, tal como una composición farmacéutica, incluye el péptido quimérico y un agente reductor de glucosa.

En otras realizaciones adicionales, se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican el péptido quimérico de la invención. Tales moléculas pueden incluir adicionalmente un elemento de control de la expresión en una conexión operable que confiere la expresión de la molécula de ácido nucleico que codifica el péptido in vitro, en una célula o in vivo, o un vector que comprende la molécula de ácido nucleico (p. ej., un vector viral). También se proporcionan células transformadas y anfitrionas que expresan el péptido quimérico.

También se proporcionan usos de los péptidos quiméricos de la invención para el tratamiento que incluye la administración o suministro del péptido quimérico. En realizaciones concretas, el uso para el tratamiento de un sujeto incluye administrar un péptido quimérico de la invención a un sujeto, tal como un sujeto que tiene, o corre el riesgo de tener, una enfermedad o trastorno tratables mediante una secuencia peptídica de la invención, en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o trastorno. En una realización adicional, el uso incluye administrar un péptido quimérico de la invención a un sujeto, tal como un sujeto que tiene una afección hiperglucémica (p. ej., diabetes, tal como diabetes insulinodependiente (tipo I), diabetes tipo II o diabetes gestacional), resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa o síndrome metabólico, o es obeso o tiene una masa corporal no deseable.

En aspectos concretos de los usos, el péptido quimérico se administra a un sujeto en una cantidad eficaz para mejorar el metabolismo de la glucosa en el sujeto. En aspectos más concretos, un sujeto tiene un nivel de glucosa plasmática en ayunas superior a 100 mg/dl o tiene un nivel de hemoglobina Alc (HbAlc) superior a 6%, antes de la administración.

En realizaciones adicionales, que el uso para el tratamiento de un sujeto está destinado a, o da como resultado, la reducción de los niveles de glucosa, el aumento de la sensibilidad a la insulina, la reducción de la resistencia a la insulina, la reducción del glucagón, la mejora de la tolerancia a la glucosa o el metabolismo u homeostasis de la glucosa, la mejora de la función pancreática o la reducción de los niveles de triglicéridos, colesterol, IDL, LDL o VLDL, o la disminución de la presión arterial, la disminución del engrosamiento de la íntima de los vasos sanguíneos o la disminución de la masa corporal o aumento de peso.

También se describen métodos para analizar y/o identificar una secuencia peptídica quimérica o una secuencia peptídica tales como secuencias de péptidos quiméricos y secuencias de péptidos que tienen actividad reductora de glucosa sin actividad sustancial de CHC. En un ejemplo, un método incluye: a) proporcionar una secuencia peptídica quimérica o una secuencia peptídica candidatas; b) administrar la secuencia peptídica candidata a un animal de prueba (p. ej., un ratón db/db); c) medir los niveles de glucosa del animal después de la administración de la secuencia peptídica candidata, para determinar si la secuencia peptídica candidata reduce los niveles de glucosa. En un ejemplo concreto, la secuencia peptídica quimérica o secuencia peptídica también se analizan para determinar la inducción de CHC en el animal (p. ej., evaluando una muestra de tejido hepático del animal de prueba), o la expresión de un marcador que se correlaciona con la actividad de CHC, en donde un péptido candidato tiene actividad reductora de glucosa y no una actividad sustancial de CHC. Tales métodos identifican que el candidato tiene actividad reductora de glucosa, opcionalmente también sin actividad sustancial de CHC.

Descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra las secuencias de proteínas de FGF19 y FGF21 (SEQ ID NO: 99 y 100, respectivamente) y secuencias variantes representativas, a saber, secuencia peptídica variante M5 (SEQ ID NO: 5), variante M1 (SEQ ID NO: 1), variante M2 (SEQ ID NO: 2), variante M69 (SEQ ID No : 69), variante M3 (SEQ ID NO: 3), variante m 48 (SEQ ID NO: 48), variante M49 (SEQ ID NO: 49), variante M50 (SEQ ID NO: 50), variante M51 (SEQ ID NO: 51), variante M52 (SEQ ID NO: 52), variante M53 (SEQ ID NO: 192) y variante M70 (s Eq ID NO: 70). También se muestran tres formas alélicas (polimórficas) adicionales de FGF21, a saber, M71 (SEQ ID NO: 71), M72 (SEQ ID NO: 72) y M73 (SEQ ID NO: 73).

La FIG. 2 muestra intercambios de dominio representativos entre las secuencias de proteínas de FGF21 (sin sombreado) y FGF19 (sombreado de color gris), y las secuencias de fusión (quiméricas) resultantes. Las regiones de aminoácidos de cada una de FGF21 y FGF19 presentes en la fusión (quimera) se indican mediante números. Se muestran la reducción de glucosa y la elevación de lípidos para cada una de las secuencias quiméricas.

Las FIG. 3A-3I muestran datos de reducción de glucosa y peso corporal. Las secuencias A) variante M5; B) variante M1; C) variante M2 y variante M69; D) variante M3; E) variante M48 y variante M49; F) variante M51 y variante M50; G) péptido variante M52; H) péptido variante M53; e I) péptido variante M70 tienen todas actividad reductora de glucosa (es decir, antidiabética) en ratones db/db. A los ratones se les inyectó el vector AAV que expresaba FGF19, FGF21, las variantes seleccionadas, y la solución salina y GFP son controles negativos.

Las FIG. 4A-4I muestran el perfil de lípidos séricos (triglicéridos, colesterol total, HDL y no HDL) de ratones db/db a los que se había inyectado vector AAV que expresaba FGF19, FGF21 o las secuencias A) variante M5; B) variante M1; C) variante M2 y variante M69; D) variante M3; E) variante M48 y variante M49; F) variante M51 y variante M50; G) péptido variante M52; H) péptido variante M53; e I) péptido variante M70. La secuencia del péptido variante M5 no aumentó ni elevó los lípidos, en contraste con FGF19, M1, M2 y M69 que aumentan y elevan los lípidos. Los niveles séricos de todas las variantes fueron comparables. La solución salina y GFP son controles negativos.

Las FIG.5A-5I muestran datos relacionados con CHC para las secuencias A) variante M5; B) variante M1; C) variante M2 y variante M69; D) variante M3; E) variante M48 y variante M49; F) variante M51 y variante M50; G) variante M52; H) péptido variante M53; e I) péptido variante M70. Ninguna de las variantes aumentó o indujo significativamente la formación de CHC o la tumorigénesis de CHC, en contraste con FGF19. La puntuación de CHC se registra como el número de nódulos de CHC sobre la superficie de todo el hígado de ratones a los que se habían inyectado las variantes dividido por el número de nódulos de CHC de ratones a los que se había inyectado FGF19 de tipo salvaje.

Las FIG. 6A-6I muestran datos de masa magra o masa grasa para las secuencias A) variante M5; B) variante M1; C) variante M2 y variante M69; D) variante M3; E) variante M48 y variante M49; F) variante M51 y variante M50; G) variante M52; H) péptido variante M53; e I) péptido variante M70. A excepción de M2, M5 y M69, las secuencias de péptidos variantes reducen la masa magra o la masa grasa, en contraste con FGF21.

Las FIG.7A-7B muestran datos gráficos que demuestran que inyección de los polipéptidos recombinantes A) variante M5; y B) variante M69 reducen la glucosa en sangre en ratones ob/ob.

La FIG. 8 describe que la expresión del complejo FGFR4/p-klotho en las células L6 potencia la activación de las vías de señalización intracelulares por FGF19, M3 y M70.

Descripción detallada

La invención proporciona un péptido quimérico que puede disminuir o reducir los niveles de glucosa. En una realización, un péptido quimérico incluye o consiste en una región N-terminal que tiene al menos siete restos de aminoácido y la región N-terminal tiene una primera posición de aminoácido y una última posición de aminoácido, donde la región N-terminal tiene una secuencia DAGPH (restos de aminoácido 7 a 11 de SEQ ID NO: 99), DSSPL (SEQ ID NO: 121) o DASPH (SEQ ID NO: 122); y una región C-terminal que tiene una porción de FGF19 y la región C-terminal que tiene una primera posición de aminoácido y una última posición de aminoácido, donde la región C-terminal incluye los restos de aminoácido 16-29 de FGF19 (WGDPIRLRHLYTSG; SEQ ID NO: 169) y el resto W corresponde a la primera posición de aminoácido de la región C-terminal, y SEQ ID NO: 188, en donde la secuencia EIRPD está sustituida por EILPD, EIRED, EILCD o EILED.

Una secuencia peptídica quimérica incluye o consiste en una región N-terminal que tiene una porción de FGF21 y la región N-terminal que tiene una primera posición de aminoácido y una última posición de aminoácido, donde la región N-terminal tiene una secuencia GQV y el resto V corresponde a la última posición de aminoácido de la región N-terminal; y una región C-terminal que tiene una porción de FGF19 y la región C-terminal que tiene una primera posición de aminoácido y una última posición de aminoácido donde la región C-terminal incluye los restos de aminoácido 21 29 de FGF19 (Rl RHLYTSG; SEQ ID NO: 185) y el resto R corresponde a la primera posición de la región C-terminal.

Una secuencia peptídica quimérica incluye o consiste en una variante de secuencia de FGF19 que tiene una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácido en comparación con FGF19 de referencia o de tipo salvaje. Una secuencia peptídica quimérica incluye o consiste en una variante de secuencia de FGF21 que tiene una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácido en comparación con un FGF21 de referencia o de tipo salvaje. Un péptido quimérico incluye o consiste en una porción de una secuencia de FGF19 fusionada a una porción de una secuencia de FGF21. Una secuencia peptídica quimérica incluye o consiste en una porción de una secuencia de FGF19 fusionada a una porción de una secuencia de FGF21, donde la porción o los porciones de la secuencia de FGF19 y/o FGF21 tienen una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácido en comparación con FGF19 y/o FGF21 de referencia o de tipo salvaje.

Los péptidos quiméricos de la invención se pueden utilizar en un método de tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un trastorno metabólico tratable utilizando variantes y fusiones de secuencias de péptidos de FGF19 y/o FGF21. En una realización, un método incluye poner en contacto o administrar a un sujeto una o más variantes o fusiones de péptidos de FGF19 y/o FGF21 de la invención en una cantidad eficaz para tratar el trastorno. En otra realización, un método incluye poner en contacto o administrar a un sujeto una o más moléculas de ácido nucleico que codifican una variante o fusión de los péptidos de FGF19 y/o FGF21 de la invención (por ejemplo, un elemento de control de expresión en conexión operable con el ácido nucleico que codifica el péptido quimérico, que incluye opcionalmente un vector), en una cantidad eficaz para tratar el trastorno.

Aunque no se requiere una comprensión del mecanismo de acción subyacente de los péptidos de la invención para poner en práctica la invención, sin estar ligados a ninguna teoría o hipótesis en particular, se cree que los péptidos de la invención imitan, al menos en parte, el efecto que la cirugía bariátrica tiene, por ejemplo, sobre la homeostasis de la glucosa y la pérdida de peso. Se cree que los cambios en la secreción de hormonas gastrointestinales (p. ej., péptido similar al glucagón 1 (GLP-1)) después de la cirugía bariátrica son responsables de la resolución de, por ejemplo, las afecciones diabéticas. FGF19 se expresa en gran medida en el intestino delgado distal y la expresión en exceso transgénica de FGF19 mejora la homeostasis de la glucosa. Debido a que los niveles de FGF19 en seres humanos también se elevan después de la cirugía de bypass gástrico, el FGF19 elevado podría estar relacionado con la remisión de la diabetes observada después de la cirugía bariátrica.

Una secuencia de FGF19 de referencia o de tipo salvaje representativa se establece como:

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA

VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSL

SSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLE

AVRSPSFEK (SEQ ID NO:99).

Una secuencia de FGF21 de referencia o de tipo salvaje representativa se establece como:

HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPH RDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (SEQ ID NO: 100). Las variantes alélicas de FGF21 se ilustran en la Figura 1 (p. ej., M70, M71 y M72).

Los términos secuencia de "péptido", "proteína" y "polipéptido" se utilizan indistintamente en la presente memoria para referirse a dos o más aminoácidos, o "restos", que incluyen modificaciones químicas y derivados de aminoácidos, conectados covalentemente por un enlace amida o equivalente. Los aminoácidos que forman todo o parte de un péptido pueden seleccionarse entre los 21 aminoácidos naturales conocidos, a los que se hace referencia tanto por su abreviatura de una sola letra como por la abreviatura común de tres letras. En las secuencias de péptidos de la invención, los restos de aminoácido convencionales tienen su significado convencional. Por lo tanto, "Leu" es leucina, "Ile" es isoleucina, "Nle" es norleucina, etc.

En la presente memoria se ilustran las secuencias de péptidos, distintas de los polipéptidos de FGF19 y FGF21 de referencia establecidos en la presente memoria, que reducen o disminuyen la glucosa in vivo (p. ej., Tablas 1 -9, Figura 1 y Lista de Secuencias). Los ejemplos concretos no limitantes son una secuencia peptídica con los aminoácidos amino-terminales 1-16 de FGF21 fusionados con los aminoácidos carboxi-terminales 21 -194 de FGF19; una secuencia peptídica con los aminoácidos amino-terminales 1-147 de FGF19 fusionados con los aminoácidos carboxi-terminales 147-181 de FGF21; una secuencia peptídica con los aminoácidos amino-terminales 1-20 de FGF19 fusionados con los aminoácidos carboxi-terminales 17-181 de FGF21; una secuencia peptídica con los aminoácidos amino-terminales 1-146 de FGF21 fusionados con los aminoácidos carboxi-terminales 148-194 de FGF19; y una secuencia peptídica con los aminoácidos amino-terminales 1-20 de FGF19 fusionados con los aminoácidos internos 17-146 de FGF21 fusionados con los aminoácidos carboxi-terminales 148-194 de FGF19.

Las secuencias de péptidos concretas adicionales tienen un motivo de secuencia WGDPI (SEQ ID NO: 170) correspondiente a la secuencia WGDPI de los aminoácidos 16-20 de FGF19 (SEQ ID NO: 99), carecen de un motivo de secuencia WGDPI (SEQ ID NO: 170) correspondiente a la secuencia WGDPI de los aminoácidos 16-20 de FGF19 (SEQ ID NO: 99), o tienen un motivo de secuencia WGDPI (SEQ ID NO: 170) sustituido (es decir, mutado) correspondiente a la secuencia WGDPI de los aminoácidos 16-20 de FGF19 (SEQ ID NO: 99).

Las secuencias de péptidos concretas de la invención también incluyen secuencias distintas de FGF19 y FGF21 (p. ej., como se establece en la presente memoria), y secuencias variantes de FGF 19 que tienen cualquier GQV, GDI, WGPI (SEC ID NO: 171), WGDPV (SEC ID NO: 172), WGDI (SEC ID NO: 173), GDPI (SEC ID NO: 174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO: 175), WGAPI (SEQ ID NO: 176), AGDPI (SEQ ID NO: 177), WADPI (SEQ ID NO: 178), WGDAI (SEQ ID NO: 179), WGDPA (SEQ ID NO: 180), WDPI (SEQ ID NO: 181), WGDI (SEQ ID NO: 182), WGDP (SEQ ID NO: 183) o FGDPI (SEQ ID NO: 184) sustituido por la secuencia WGDPI (SEQ ID NO: 170) de FGF19 en los aminoácidos 16 20. Por consiguiente, FGF19 y FGF21 de tipo salvaje (p. ej., como se establece en la presente memoria como SEQ ID NO: 99 y 100, respectivamente) pueden ser secuencias excluidas, y FGF19 que tenga cualquiera de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO: 171), WGDPV (SEQ ID NO: 172), WGDI (SEQ ID NO: 173), GDPI (SEQ ID NO: 174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO: 175), WGAPI (SEQ ID NO: 176), AGDPI (SEQ ID NO: 177), WADPI (SEQ ID NO: 178), WGDAI (SEQ ID NO: 179), WGDPA (SEQ ID NO: 180), WDPI (SEQ ID NO: 181), WGDI (SEQ ID NO: 182), WGDP (SEQ ID NO: 183) o FGDPI ( SEQ ID NO: 184) sustituido por la secuencia WGDPI (SEQ ID NO: 170) en los aminoácidos 16-20 de FGF19 también puede excluirse. Esta exclusión, sin embargo, no se aplica cuando una secuencia tiene, por ejemplo, 3 restos de FGF21 fusionados con FGF19 que tienen, por ejemplo, cualquiera de GQV, GQV, GDI o GPI, o 2 restos de FGF21 fusionados con cualquiera de WGPI (SEQ ID NO: 171), WGDI (SEQ ID NO: 173), GDPI (SEQ ID NO: 174), WDPI (SEQ ID NO: 181), WGDI (SEQ ID NO: 182) o WGDP (SEQ ID NO: 183 ).

Los ejemplos no limitantes concretos de secuencias de péptidos descritos en la presente memoria incluyen o consisten en la totalidad o una porción de una variante de secuencia especificada en la presente memoria como M1-M98 (SEQ ID NO: 1-52, 192 y 54-98, respectivamente). Los ejemplos no limitantes más concretos de las secuencias de péptidos quiméricos incluyen o consisten de la totalidad o una parte de una secuencia establecida como: HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQ RQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSP SFEK (M5-R) (SEQ ID NO: 160) (las secuencias FGF21 también pueden incluir un "resto R" en el extremo amino);

DSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAI KGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDC'AFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQ LYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE

K (SEQ ID NO: 138 y 161);

RPLAFSDASPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSL SSAKQRQLYKNRGFLPLSIIFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLE AVRSPSFEK ( MI ) (SEQ ID NO: I o 139);

RPLAFSDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAV ALRTVAIKGVHSVRYL.CMGADGKMQGELQYSEEDCAFEEE1RPDGYNVYRSEKHRI.PVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDl.RGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (M2) (SEQ ID NO:2 O 140);

DSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRTV AIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQR QLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSF EK (SEQ ID NO: 141);

RDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQY SEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPV SLSSAKQ RQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSP SFEK (M69) (SEQ ID NO:69);

RDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAI KGYHSYRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNYYRSEKHRLPYSLSSAKQRQ LYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE

K (M52) (SEQ ID NO:52);

HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQY SEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPV SLSSAKQ RQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSP SFEK (M5-R) (SEQ ID NO: 160);

HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHSLPLHLPGNKSPH RDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGS SDPLSMVGPSQGRSPSYAS (M71)(SEQ

ID NO:71);

HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPH RDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (M72) (SEQ ID NO:72);

HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPH RDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVVQDELQGVGGEGCHMHPE NCKTLLTDIDRTHTEKPVWDGITGE (M73) (SEQ ID NO:73);

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSL SSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLE AVRSPSFEK (M3) (SEQ ID NO:3);

RDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLE1KAVALRTVAI KGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQ LYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE

K (M48) (SEQ ID NO:4H, 6 O 148);

RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVAL RTVAIKGVIISVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEK1IRLPVSLSSA KQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVR SPSFEK (M49) (SEQ ID NO:49, 7 O 149);

RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALR TYAIKGVHSYRYLCMGADGKMQGLLQY SEEDCAFEEEILEDGYNYYRSEKHRLPV SLS SAK QRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRS PSFEK (M50) (SEQ ID NO:50);

RHPIPDSSPLLQFGGNVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALR TVAIKGV1ISVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAK QRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRS PSFEK (M51) (SEQ ID NO:51, 36 o 155);

MDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVA IKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQ LYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE

K (M53) (SEQ ID NO: 192);

MRDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALR TVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAK QRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRS PSFEK (M70) (SEQ ID NO:70);

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKA

VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILPDGYNVYRSEKHRLPVSL

SSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLE

AVRSPSFEK (M139) (SEQ ID NO: 193);

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKA

VALRTVAIKGVHS VRYLCMGADGKMQGLLQY SEEDCAFEEEIREDGYNVYRSEKHRLPV SL

SSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLE

AVRSPSFEK (M I40) (SEQ ID NO: 194);

RPLAFSDAGPHVHYGWGDP1RLRHLYTSGPHGLSSCFLR1RADGVVDCARGQSAHSLLEIKA

VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDC'AFEEEILCDGYNVYRSEKHRLPVSL

SSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLE

AVRSPSFEK (M141) (SEQ ID NO: 195); o

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRQRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA

VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSL

SSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLE

AVRSPSFEK (M I60) (SEQ ID NO: 196);

o una subsecuencia o fragmento de la misma de cualquiera de las secuencias de péptidos anteriores. En determinadas realizaciones de cualquiera de las secuencias de péptidos anteriores, se suprime el resto R terminal.

Otros ejemplos concretos no limitantes de secuencias de péptidos, descritos en la presente memoria que tienen en el extremo N-terminal, una secuencia peptídica que incluye o consiste en todo o parte de cualquiera de:

HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M5-R) (aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 160);

DSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M6) (M6-R) (aminoácidos 2-22 de SEQ ID NO: 6);

RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M7) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 7);

HPIPDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSG (M8-R) (aminoácidos 2-26 de SEQ ID NO: 8);

HPIPDSSPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M9-R) (aminoácidos 2-28 de SEQ ID NO: 9);

HPIPDSSPHVHYGWGDPIRLRHLYTSG (M10-R) (aminoácidos 2-28 de SEQ ID NO: 10);

RPLAFSDAGPLLQWGDPIRLRHLYTSG (M11) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 11);

RPLAFSDAGPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M12) (aminoácidos 1-29 de SEQ ID NO: 12);

RPLAFSDAGPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M13) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 13);

HPIPDSSPHVHYGGQVRLRHLYTSG (M14-R) (aminoácidos 2-26 de SEQ ID NO: 14);

RPLAFSDAGPHVHYGGQVRLRHLYTSG (M15) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 15);

RPLAFSDAGPHVHWGDPIRLRHLYTSG (M16) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 16);

RPLAFSDAGPHVGWGDPIRLRHLYTSG (M17) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 17);

RPLAFSDAGPHYGWGDPIRLRHLYTSG (M18) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 18);

RPLAFSDAGPVYGWGDPIRLRHLYTSG (M19) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 19);

RPLAFSDAGPVHGWGDPIRLRHLYTSG (M20) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 20);

RPLAFSDAGPVHYWGDPIRLRHLYTSG (M21) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 21);

RPLAFSDAGPHVHGWGDPIRLRHLYTSG (M22) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 22);

RPLAFSDAGPHHGWGDPIRLRHLYTSG (M23) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 23);

RPLAFSDAGPHHYWGDPIRLRHLYTSG (M24) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 24);

RPLAFSDAGPHVYWGDPIRLRHLYTSG (M25) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 25);

RPLAFSDSSPLVHWGDPIRLRHLYTSG (M26) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 26);

RPLAFSDSSPHVHWGDPIRLRHLYTSG (M27) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 27);

RPLAFSDAGPHVWGDPIRLRHLYTSG (M28) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 28);

RPLAFSDAGPHVHYWGDPIRLRHLYTSG (M29) (aminoácidos 1-28 de SEQ ID NO: 29);

RPLAFSDAGPHVHYAWGDPIRLRHLYTSG (M30) (aminoácidos 1-29 de SEQ ID NO: 30);

RHPIPDSSPLLQFGAQVRLRHLYTSG (M31) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 31);

RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSG (M32) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 32);

RHPIPDSSPLLQFGPQVRLRHLYTSG (M33) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 33);

RHPIPDSSPLLQFGGAVRLRHLYTSG (M34) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 34);

RHPIPDSSPLLQFGGEVRLRHLYTSG (M35) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 35);

RHPIPDSSPLLQFGGNVRLRHLYTSG (M36) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 36);

RHPIPDSSPLLQFGGQARLRHLYTSG (M37) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 37);

RHPIPDSSPLLQFGGQIRLRHLYTSG (M38) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 38);

RHPIPDSSPLLQFGGQTRLRHLYTSG (M39) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 39);

RHPIPDSSPLLQFGWGQPVRLRHLYTSG (M40) (aminoácidos 1-28 de SEQ ID NO: 40);

DAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSG (M74-R) (aminoácidos 2-24 de SEQ ID NO: 74);

VHYGWGDPIRLRHLYTSG (M75-R) (aminoácidos 2-19 de SEQ ID NO: 75);

RLRHLYTSG (M77-R) (aminoácidos 2-10 de SEQ ID NO: 77);

RHPIPDSSPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M9) (aminoácidos 1-28 de SEQ ID NO: 9);

RHPIPDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSG (M8) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 8);

RPLAFSDAGPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M12) (aminoácidos 1-29 de SEQ ID NO: 12);

RHPIPDSSPHVHYGWGDPIRLRHLYTSG (M10) (aminoácidos 1-28 de SEQ ID NO: 10);

RPLAFSDAGPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M13) (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 13);

RHPIPDSSPHVHYGGQVRLRHLYTSG (M14) (aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 14);

RPLAFSDAGPHVHYGGDIRLRHLYTSG (M43) aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 43); o RDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M6) (aminoácidos 1 -22 de SEQ ID NO: 6); y para cualquiera de las secuencias de péptidos anteriores, se puede suprimir el resto R amino terminal.

Los péptidos quiméricos de la invención incluyen aquellos con inducción o formación reducida o ausente de CHC en comparación con FGF19, o una secuencia variante de FGF 19 que tiene cualquiera de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO: 171), WGDPV (SEQ ID NO: 172), WGDI (SEQ ID NO: 173), GDPI (SEQ ID NO: 174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO: 175), WGAPI (SEQ ID NO: 176), AGDPI (SEQ ID NO: 177), WADPI (SEQ ID NO: 178), WGDAI (SEQ ID NO: 179), WGDPA (SEQ ID NO: 180), WDPI (SEQ ID NO: 181), WGDI (SEQ ID NO: 182), WGDP (SEQ ID NO: 183) o FGDPI (SEQ ID NO: 184) sustituido por la secuencia WGd Pi (SEQ ID NO: 170) en los aminoácidos 16-20 de fGf 19. Los péptidos quiméricos de la invención también incluyen aquellos con mayor actividad reductora de glucosa en comparación con FGF19, o una secuencia variante de FGF 19 que tiene cualquiera de GQV, GDI, WGPI, WGPI (SEQ ID NO: 171), WGDPV (SEQ ID NO: 172), WGDI (SEQ ID NO: 173), GDPI (SEQ ID NO: 174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO: 175), WGAPI (SEQ ID NO: 176), AGDPI (SEQ ID NO: 177), WADPI ( SEQ ID NO: 178), WGDAI (SEQ ID NO: 179), WGDPA (SEQ ID NO: 180), WDPI (SEQ ID NO: 181), WGDI (SEQ ID NO: 182), WGDP (SEQ ID NO: 183 ) o FGDPI (SEQ ID NO: 184) sustituido por la secuencia WGDPl (SEQ ID NO: 170) en los aminoácidos 16-20 de fGf 19. Los péptidos quiméricos de la invención incluyen además aquellos con menor actividad aumentadora de lípidos (p. ej., triglicéridos, colesterol, no HDL o HDL) en comparación con FGF19, o una secuencia variante de FGF 19 que tiene cualquiera de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO: 171), WGDPV (SEQ ID NO: 172), WGDI ( SEQ ID NO: 173), GDPI (SEQ ID NO: 174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO: 175), WGAPI (SEQ ID NO: 176), AGDPI (SEQ ID NO: 177), WADPI (SEQ ID NO: 178), WGDAI (SEQ ID NO: 179), WGDPA (SEQ ID NO: 180), WDPI (SEQ ID NO: 181), WGDI (SEQ ID NO: 182), WGDP (SEQ ID NO: 183) o Fg Dp I (SEQ ID NO: 184) sustituido por la secuencia WGDPI (SEQ ID NO: 170) en los aminoácidos 16-20 de FGF19.

Típicamente, el número de aminoácidos o restos del péptido quimérico de la invención totalizará menos de aproximadamente 250 (p. ej., aminoácidos o miméticos de los mismos). En varias realizaciones concretas, el número de restos de los péptidos quiméricos de la invención comprende hasta aproximadamente 200 restos (p. ej., aminoácidos o miméticos de los mismos). En realizaciones adicionales, el número de restos de los péptidos quiméricos de la invención comprende hasta aproximadamente 195 restos (p. ej., aminoácidos o miméticos de los mismos) de longitud.

Los aminoácidos o restos pueden estar conectados por enlaces químicos amídicos o no amídicos y no naturales que incluyen, por ejemplo, los formados con glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales o N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC). Los enlaces no amídicos incluyen, por ejemplo, cetometileno, aminometileno, olefina, éter, tioéter y similares (véase, p. ej., Spatola en Chemistry and Biochemitry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, págs. 267-357 (1983), "Peptide and Backbbone Modifications", Marcel Decker, NY). Por lo tanto, cuando un péptido quimérico de la invención incluye una porción de una secuencia de FGF19 y una porción de una secuencia de FGF21, no es necesario que las dos porciones estén unidas entre sí por un enlace amida, sino que pueden estar unidas por cualquier otro radical químico o conjugadas entre sí a través de un radical conector.

La invención también incluye subsecuencias, variantes y formas modificadas de las secuencias de péptidos ilustradas (incluidas las variantes y subsecuencias de FGF19 y FGF21 enumeradas en las Tablas 1-9, la Figura 1 y la Lista de Secuencias, y las fusiones y quimeras de FGF19/FGF21 enumeradas en las Tablas 1-9, la Figura 1 y la Lista de Secuencias), siempre que lo anterior conserve al menos una actividad o función detectable o medible. Por ejemplo, ciertos péptidos variantes ilustrados tienen la secuencia C-terminal de FGF19,

PHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGL LQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPE EPEDLRGHLESDMFSSPLETSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID NO: 188) y la porción C-terminal, p. ej., después de los restos aminoácido “TSG” de la variante.

Asimismo, ciertos péptidos quiméricos variantes ilustrados, por ejemplo, los que tienen toda o una porción de la secuencia de FGF21 en el extremo amino, pueden tener un resto "R" situado en el extremo N-terminal, que puede omitirse. De manera similar, ciertos péptidos quiméricos variantes ilustrados incluyen un resto "M" situado en el extremo N-terminal, que se puede añadir o sustituir adicionalmente por un resto omitido, tal como un resto "R". Más concretamente, en diversas realizaciones, las secuencias de péptidos quiméricos en el extremo N-terminal incluyen cualquiera de: RDSS (SEQ ID NO: 115), DSS, MDSS (SEQ ID NO: 116) o MRDSS (SEQ ID NO: 117). Además, en las células cuando un resto "M" está adyacente a un resto "S", el resto "M" se puede escindir de modo que el resto "M" se elimine de la secuencia del péptido, mientras que cuando el resto "M" es adyacente a un resto "D", el resto "M" no se puede escindir. Por tanto, a modo de ejemplo, en diversas realizaciones, las secuencias de péptidos incluyen aquellas con los siguientes restos en el extremo N-terminal: MDSSPL (SEQ iD NO: 119), MSDSSp L (SEQ ID NO: 120) (escindido a SDSSPL (SEQ ID NO: 112)).

En consecuencia, las secuencias de "péptido", "polipéptido" y "proteína" de la invención incluyen subsecuencias, variantes y formas modificadas de las variantes y subsecuencias de FGF19 y FGF21 enumeradas en las Tablas 1-9, la Figura 1 y la Lista de Secuencias, y las fusiones y quimeras de FGF19/FGF21 enumeradas en las Tablas 1-9, la Figura 1 y la Lista de Secuencias, siempre que la subsecuencia, variante o forma modificada (p. ej., fusión o quimera) conserve al menos una actividad o función detectable.

Como se emplea en la presente memoria, el término "modificar" y variaciones gramaticales del mismo, significan que la composición se desvía con respecto a una composición de referencia, tal como una secuencia peptídica. Tales secuencias de péptidos modificados, ácidos nucleicos y otras composiciones pueden tener mayor o menor actividad 0 función, o tener una función o actividad distinta en comparación con una secuencia peptídica, ácido nucleico u otra composición de referencia sin modificar, o pueden tener una propiedad deseable en una proteína, formulada para terapia (p. ej. semivida en suero), para obtener anticuerpos para su uso en un ensayo de detección y/o para la purificación de proteínas. Por ejemplo, un péptido quimérico de la invención se puede modificar para aumentar la semivida en suero, para aumentar la estabilidad de la proteína in vitro y/o in vivo, etc.

Los ejemplos concretos de tales subsecuencias, variantes y formas modificadas de las secuencias de péptidos quiméricos ilustradas en la presente memoria (p. ej., una secuencia peptídica enumerada en las Tablas 1 -9, la Figura 1 y la Lista de Secuencias) incluyen sustituciones, deleciones y/o inserciones/adiciones de uno o más aminoácidos, hacia o desde el extremo amino, el extremo carboxi o internamente. Un ejemplo es la sustitución de un resto de aminoácido por otro resto de aminoácido dentro de la secuencia del péptido quimérico. Otro es una deleción de uno o más restos de aminoácido de la secuencia peptídica quimérica, o una inserción o adición de uno o más restos de aminoácido en la secuencia peptídica.

El número de restos sustituidos, suprimidos o insertados/añadidos son uno o más aminoácidos (p. ej., 1-3, 3-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150 160, 160-170, 170-180, 180-190, 190-200, 200-225, 225-250 o más) de la secuencia peptídica quimérica. Por lo tanto, una secuencia de FGF19 o FGF21 puede tener pocos o muchos aminoácidos sustituidos, suprimidos o insertados/añadidos (p. ej., 1-3, 3-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150-160, 160-170, 170-180, 180-190, 190-200, 200-225, 225-250 o más). Además, una secuencia de aminoácidos de FGF19 puede incluir o consistir en una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 1-3, 3-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60., 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150-160, 160-170, 170-180, 180-190, 190-200, 200-225, 225-250 o más aminoácidos de FGF21; o un aminoácido o secuencia de FGF21 puede incluir o consistir en una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 1-3, 3-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150-160, 160-170, 170-180, 180-190, 190-200, 200-225, 225-250 o más aminoácidos de FGF19.

Los ejemplos específicos de sustituciones incluyen la sustitución de un resto L por un resto D. Por consiguiente, aunque los restos se enumeran en la configuración del isómero L, se incluyen aminoácidos D en cualquier posición concreta o en todas las posiciones de las secuencias de péptidos de la invención, a menos que un isómero D conduzca a una secuencia que no tenga función detectable o medible.

Los ejemplos específicos adicionales son sustituciones conservativas y no conservativas. Una "sustitución conservativa" es el remplazo de un aminoácido por un resto similar biológica, química o estructuralmente. Biológicamente similar significa que la sustitución es compatible con una actividad biológica, p. ej., actividad reductora de glucosa. Estructuralmente similar significa que los aminoácidos tienen cadenas laterales con una longitud similar, tal como alanina, glicina y serina, o que tienen un tamaño similar, o que se mantiene la estructura de una primera, segunda secuencia peptídica, o de una secuencia peptídica adicional. La similitud química significa que los restos tienen la misma carga o son tanto hidrófilos como hidrófobos. Los ejemplos concretos incluyen la sustitución de un resto hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un resto polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico o glutamina por asparragina, serina por treonina, etc. Se pueden utilizar ensayos de rutina para determinar si una subsecuencia, variante o forma modificada tienen actividad, por ejemplo, actividad reductora de glucosa.

Los ejemplos concretos de subsecuencias, variantes y formas modificadas de las secuencias de péptidos ilustradas en la presente memoria (p. ej., una secuencia peptídica enumerada en las Tablas 1-9, la Figura 1 y la Lista de Secuencias) tienen 50%-60%, 60%-70%, 70%-75%, 75%-80%, 80%-85%, 85%-90%, 90%-95% o 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con una secuencia peptídica de referencia (por ejemplo, una secuencia peptídica en cualquiera de la Tabla 1-9 y la Figura 1). Los términos "identidad" y "homología" y las variaciones gramaticales de los mismos significan que dos o más entidades referenciadas son iguales. Por tanto, cuando dos secuencias de aminoácidos son idénticas, tienen la misma secuencia de aminoácidos. "Zonas, regiones o dominios de identidad" significan que una porción de dos o más entidades referenciadas son iguales. Por tanto, cuando dos secuencias de aminoácidos son idénticas u homólogas en una o más regiones de secuencia, comparten identidad en estas regiones.

El grado de identidad entre dos secuencias se puede determinar utilizando un programa informático y un algoritmo matemático conocidos en la técnica. Tales algoritmos que calculan el porcentaje de identidad de secuencia (homología) generalmente tienen en cuenta los huecos de secuencia y los emparejamientos erróneos en la región de comparación. Por ejemplo, un algoritmo de búsqueda BLAST (p. ej., BLAST 2.0) (véase, p. ej., Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990), disponible públicamente a través de NCBI) tiene los siguientes parámetros de búsqueda ilustrativos: Emparejamiento erróneo -2; apertura del hueco 5; extensión del hueco 2. Para las comparaciones de secuencias de péptidos, se utiliza típicamente un algoritmo BLASTP combinado con una matriz de puntuación, como PAM100, PAM 250, b Lo SUM 62 o BLOSUM 50. También se utilizan FASTA (p. ej., FASTA2 y FASTA3) y los programas de comparación de secuencias SSEARCH para cuantificar el grado de identidad (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132:185 (2000); y Smith et al., J. Mol. Biol. 147: 195 (1981)). También se han desarrollado programas para cuantificar la similitud estructural de proteínas utilizando mapeo topológico basado en Delaunay (Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003)).

En las secuencias de péptidos quiméricos, incluidas las subsecuencias, variantes y formas modificadas de las secuencias de péptidos ilustradas en la presente memoria (p. ej., secuencias enumeradas en la Tabla 1-9 y la Figura 1) un "aminoácido" o "resto" incluyen alfa-aminoácidos convencionales así como beta-aminoácidos, aminoácidos alfa,alfa disustituidos y aminoácidos N-sustituidos en donde al menos una cadena lateral es un radical de cadena lateral de aminoácido como se define en la presente memoria. Un "aminoácido" incluye adicionalmente N-alquil alfaaminoácidos, en donde el grupo amino del extremo N terminal tiene un sustituyente alquilo C¹a C⁶lineal o ramificado. Por tanto, el término "aminoácido" incluye estereoisómeros y modificaciones de aminoácidos proteicos de origen natural, aminoácidos no proteicos, aminoácidos modificados postraduccionalmente (p. ej., por glicosilación, fosforilación, escisión de éster o amida, etc.), aminoácidos sintetizados o modificados enzimáticamente, aminoácidos derivatizados, construcciones o estructuras diseñadas para imitar aminoácidos, aminoácidos con un radical de cadena lateral modificado, derivatizado de radicales naturales, o sintéticos, o de origen no natural, etc. Se incluyen aminoácidos modificados e inusuales en las secuencias de péptidos de la invención (véase, por ejemplo, en Synthetic Peptides: a User's Guide; Hruby et al., Biochem. J. 268:249 (1990); y Toniolo C., Int. J. Peptide Protein Res. 35:287 (1990)).

Además, se incluyen grupos protectores y modificadores de aminoácidos. El término "radical de cadena lateral de aminoácido" como se emplea en la presente memoria incluye cualquier cadena lateral de cualquier aminoácido, como se define el término "aminoácido" en la presente memoria. Por tanto, esto incluye el radical de la cadena lateral en los aminoácidos de origen natural. Incluye adicionalmente radicales de cadena lateral en aminoácidos naturales modificados como se establece en la presente memoria y conoce un experto en la técnica, tales como radicales de cadena lateral en estereoisómeros y modificaciones de aminoácidos proteicos de origen natural, aminoácidos no proteicos, aminoácidos modificados post-traduccionalmente, aminoácidos sintetizados o modificados enzimáticamente, aminoácidos derivatizados, construcciones o estructuras diseñadas para imitar aminoácidos, etc. Por ejemplo, el radical de la cadena lateral de cualquier aminoácido descrito en la presente memoria o conocido por un experto en la técnica está incluido dentro de la definición.

Un "derivado de un radical de cadena lateral de aminoácido" se incluye dentro de la definición de un radical de cadena lateral de aminoácido. Los ejemplos no limitantes de radicales de cadena lateral de aminoácidos derivatizados incluyen, por ejemplo: (a) añadir uno o más átomos de carbono saturados o insaturados a una cadena de alquilo, arilo o aralquilo existente; (b) sustituir un carbono en la cadena lateral por otro átomo, preferiblemente oxígeno o nitrógeno; (c) añadir un grupo terminal a un átomo de carbono de la cadena lateral, incluido metilo (-CH³), metoxi (-OCH³), nitro (--NO²), hidroxilo (--OH) o ciano (--C=N); (d) para radicales de cadena lateral que incluyen grupos hidroxi, tiol o amino, añadir un grupo protector de hidroxi, tiol o amino adecuado; o (e) para radicales de cadena lateral que incluyen una estructura anular, añadir uno o más sustituyentes anulares, incluidos grupos hidroxilo, halógeno, alquilo o arilo anclados directamente o a través de un enlace éter. Para los grupos amino, los expertos en la técnica conocen los grupos protectores adecuados. Siempre que dicha derivatización proporcione una actividad deseada en la secuencia peptídica final (p. ej., reducción de glucosa, mejora del metabolismo de glucosa o lípidos, actividad antidiabética, ausencia de formación sustancial de CHC o tumorigénesis, ausencia de modulación sustancial de masa magra o grasa, etc.).

Un "radical de cadena lateral de aminoácido" incluye todas estas derivatizaciones, y los ejemplos concretos no limitantes incluyen: ácido gamma-aminobutírico, ácido 12-aminododecanoico, ácido alfa-aminoisobutírico, ácido 6-aminohexanoico, ácido 4-(aminometil)ciclohexanocarboxílico, ácido 8-aminooctanoico, bifenilalanina, Boc-tbutoxicarbonilo, bencilo, benzoílo, citrulina, ácido diaminobutírico, pirrolisina, ácido diaminopropiónico, 3,3-difenilalanina, ortonina, citrulina, ácido 1,3-dihidro-2H-isoindolcarboxílico, etilo, Fmoc-fluorenilmetoxicarbonilo, heptanoilo (CH³-(CH²)⁵--C(=O)--), hexanoílo (CH³-(CH²)⁴--C(=O)--), homoarginina, homocisteína, homolisina, homofenilalanina, homoserina, metilo, metionina sulfóxido, metionina sulfona, norvalina (NVA), fenilglicina, propilo, isopropilo, sarcosina (SAR), terc-butilalanina y benciloxicarbonilo.

Un solo aminoácido, que incluye estereoisómeros y modificaciones de aminoácidos proteicos naturales, aminoácidos no proteicos, aminoácidos modificados postraduccionalmente, aminoácidos sintetizados enzimáticamente, aminoácidos de origen no natural que incluyen aminoácidos derivatizados, un aminoácido alfa,alfa- disustituido derivado de cualquiera de los anteriores (es decir, un aminoácido alfa,alfa-disustituido, en donde al menos una cadena lateral es la misma que la del resto del que se obtiene), un beta-aminoácido derivado de cualquiera de los anteriores (es decir, un beta-aminoácido que, aparte de la presencia de un carbono beta, es por lo demás el mismo que el resto del que se obtiene), etc., incluyendo todo lo anterior, puede denominarse en la presente memoria "resto". Los sustituyentes adecuados, además del radical de cadena lateral del alfa-aminoácido, incluyen alquilo C1 a C6 lineal o ramificado. Aib es un ejemplo de un aminoácido alfa,alfa-disustituido. Si bien se puede hacer referencia a los aminoácidos alfa,alfa-disustituidos utilizando referencias de isómeros L y D convencionales, debe entenderse que tales referencias son por conveniencia, y que cuando los sustituyentes en la posición alfa son diferentes, tal aminoácido puede ser referido indistintamente como un aminoácido alfa,alfa-disustituido derivado del isómero L o D, según sea apropiado, de un resto con el radical de cadena lateral de aminoácido designado. Por lo tanto, el ácido (S)-2-amino-2-metil-hexanoico puede se referido como un aminoácido alfa,alfa disustituido derivado de L-Nle (norleucina) o como un aminoácido alfa,alfa-disustituido derivado de D-Ala. De forma similar, Aib puede ser referido como un aminoácido alfa,alfa-disustituido derivado de Ala. Siempre que se proporcione un aminoácido alfa,alfa-disustituido, se debe entender que incluye todas las configuraciones (R) y (S) del mismo.

Un "aminoácido N-sustituido" incluye cualquier aminoácido en donde un radical de cadena lateral de aminoácido está unido covalentemente al grupo amino de la cadena principal, opcionalmente cuando no hay sustituyentes distintos de H en la posición del carbono alfa. La sarcosina es un ejemplo de un aminoácido N-sustituido. A modo de ejemplo, se puede hacer referencia a la sarcosina como un derivado de aminoácido N-sustituido de Ala, ya que el radical de la cadena lateral de aminoácidos de sarcosina y Ala es el mismo, es decir, metilo.

Las modificaciones covalentes de las secuencias de péptidos de la invención, incluidas subsecuencias, variantes y formas modificadas de las secuencias de péptidos ilustradas en la presente memoria (p. ej., secuencias enumeradas en la Tabla 1-9 y la Figura 1), se incluyen en la invención. Un tipo de modificación covalente incluye la reacción de restos de aminoácido diana con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los restos N- o C-terminales del péptido. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para entrecruzar el péptido a una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para utilizar en el método para purificar anticuerpos anti-péptido, y viceversa. Los agentes de entrecruzamiento comúnmente utilizados incluyen, p. ej., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Otras modificaciones incluyen la desamidación de los restos glutaminilo y asparraginilo a los correspondientes restos glutamilo y aspartilo, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de restos serilo o treonilo, metilación de los grupos alfa-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, págs. 79-86 (1983)), acetilación de la amina N-terminal, amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal, etc.

Las secuencias de péptidos ilustradas y subsecuencias, variantes y formas modificadas de las secuencias de péptidos ilustradas en la presente memoria (p. ej., secuencias enumeradas en la Tabla 1-9 y la Figura 1), también pueden incluir alteraciones de la cadena principal para la estabilidad, derivados y peptidomiméticos. El término "peptidomimético" incluye una molécula que es un imitador de un resto (denominado "mimético"), que incluye pero no se limita a moléculas centrales de piperazina, moléculas centrales de cetopiperazina y moléculas centrales de diazepina. A menos que se especifique lo contrario, un mimético de aminoácido de un péptido quimérico de la invención incluye tanto un grupo carboxilo como un grupo amino, y un grupo correspondiente a una cadena lateral de aminoácido, o en el caso de un mimético de glicina, ninguna cadena lateral aparte de hidrógeno.

A modo de ejemplo, estos incluirían compuestos que imitan las características estéricas, la distribución de carga superficial, la polaridad, etc. de un aminoácido de origen natural, pero no es necesario que sea un aminoácido, que conferiría estabilidad al sistema biológico. Por ejemplo, la prolina puede estar sustituida por otras lactamas o lactonas de tamaño y sustitución adecuados; la leucina puede estar sustituida por una alquilcetona, amida N-sustituida, así como variaciones en la longitud de la cadena lateral de aminoácidos utilizando alquilo, alquenilo u otros sustituyentes, otros pueden resultar evidentes para el experto en la materia. El elemento esencial para realizar tales sustituciones es proporcionar una molécula de aproximadamente el mismo tamaño, carga y configuración que el resto utilizado para diseñar la molécula. El refinamiento de estas modificaciones se realizará analizando los compuestos en un ensayo funcional (p. ej., reducción de glucosa) u otro ensayo, y comparando la relación estructura-actividad. Tales métodos están dentro del alcance del experto en la técnica que trabaja en química médica y desarrollo de fármacos.

Otro tipo de modificación de las secuencias de péptidos de la invención, que incluyen subsecuencias, variantes de secuencia y formas modificadas de las secuencias de péptidos quiméricos ilustradas (incluidos los péptidos enumerados en la Tabla 1-9 y la Figura 1), es la glicosilación. Como se emplea en la presente memoria, "glicosilación" se refiere en sentido amplio a la presencia, adición o anclaje de uno o más azúcares (p. ej., carbohidratos) a proteínas, lípidos u otras moléculas orgánicas. Se pretende que el uso del término "desglicosilación" en la presente memoria signifique generalmente la eliminación o deleción de uno o más radicales azúcar (p. ej., carbohidrato). Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas que implican un cambio en el tipo y las proporciones (cantidad) de los distintos radicales azúcar (p. ej., carbohidrato) presentes.

La glicosilación se puede lograr mediante la modificación de un resto de aminoácido o añadiendo uno o más sitios de glicosilación que pueden estar presentes o no en la secuencia nativa. Por ejemplo, un resto típicamente no glicosilado se puede sustituir por un resto que puede estar glicosilado. La adición de sitios de glicosilación se puede lograr alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración de la secuencia del péptido quimérico se puede realizar, por ejemplo, mediante la adición o sustitución de uno o más restos de serina o treonina (para sitios de glicosilación unidos a O) o restos de asparragina (para sitios de glicosilación unidos a N). Las estructuras de los oligosacáridos unidos a N y unidos a O y los restos de azúcar que se encuentran en cada tipo pueden ser diferentes. Un tipo de azúcar que se encuentra comúnmente en ambos es el ácido N-acetilneuramínico (en lo sucesivo, referido como ácido siálico). El ácido siálico es habitualmente el resto terminal de los oligosacáridos tanto unidos a N como unidos a O y, en virtud de su carga negativa, puede conferir propiedades ácidas a la glicoproteína.

Las secuencias de péptidos quiméricos de la invención se pueden alterar opcionalmente mediante cambios en el nivel de nucleótidos (p. ej., ADN), particularmente mediante la mutación del ADN que codifica el péptido en bases preseleccionadas de modo que se generen codones que se traducirán a los aminoácidos deseados. Otro medio para aumentar el número de radicales carbohidrato en el péptido quimérico es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido (véase, por ejemplo, en el documento WO 87/05330). La desglicosilación se puede lograr eliminando el sitio de glicosilación subyacente, eliminando la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos, o mediante la sustitución de codones que codifican restos de aminoácido que están glicosilados. Se conocen técnicas de desglicosilación química, y la escisión enzimática de radicales carbohidrato en polipéptidos se puede lograr mediante el uso de una variedad de endo- y exoglicosidasas.

Se pueden utilizar varias líneas celulares para producir proteínas que están glicosiladas. Un ejemplo no limitante son las células de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR), que son una célula anfitriona comúnmente utilizada para la producción de glicoproteínas recombinantes. Estas células no expresan la enzima beta-galactósido alfa-2,6-sialiltransferasa y, por lo tanto, no añaden ácido siálico en la conexión alfa-2,6 a los oligosacáridos unidos a N de glicoproteínas producidas en estas células.

Otro tipo de modificación consiste en conjugar (p. ej., conectar) uno o más componentes o moléculas adicionales en el extremo N- y/o C-terminal de una secuencia peptídica quimérica de la invención, tal como otra proteína (p. ej., una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos heteróloga a la proteína en cuestión), o una molécula portadora. Por tanto, una secuencia peptídica ilustrativa puede ser un producto conjugado con otro componente o molécula.

En determinadas realizaciones, el extremo amino o carboxi del péptido quimérico de la invención se pueden fusionar con una región Fc de inmunoglobulina (p. ej., Fc humana) para formar un producto conjugado de fusión (o molécula de fusión). Los productos conjugados de fusión con Fc pueden aumentar la semivida sistémica de los biofármacos y, por tanto, el producto biofarmacéutico puede tener una actividad prolongada o requerir una administración menos frecuente. Fc se une al receptor de Fc neonatal (FcRn) en las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos y, al unirse, la molécula de fusión de Fc se protege de la degradación y se vuelve a liberar a la circulación, lo que mantiene la molécula en circulación por más tiempo. Se cree que esta unión de Fc es el mecanismo por el cual la IgG endógena conserva su semivida plasmática prolongada. Los fármacos de fusión de Fc bien conocidos y validados consisten en dos copias de un biofármaco ligado a la región Fc de un anticuerpo para mejorar la farmacocinética, la solubilidad y la eficiencia de producción. La tecnología de fusión de Fc más reciente une una copia única de un biofármaco a la región Fc de un anticuerpo para optimizar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas del biofármaco en comparación con los productos conjugados de fusión de Fc tradicionales.

Se puede utilizar una modificación del producto conjugado para producir una secuencia peptídica que conserve actividad con una función o actividad adicional o complementaria de la segunda molécula. Por ejemplo, una secuencia peptídica se puede conjugar con una molécula, p. ej., para facilitar la solubilidad, el almacenamiento, la semivida o estabilidad in vivo o durante el período de conservación, reducción de la inmunogenicidad, liberación retardada o controlada in vivo, etc. Otras funciones o actividades incluyen un producto conjugado que reduce la toxicidad con respecto a una secuencia peptídica no conjugada, un producto conjugado que se dirige a un tipo de célula u órgano de manera más eficaz que una secuencia peptídica no conjugada, o un fármaco para contrarrestar adicionalmente las causas o efectos asociados con un trastorno o enfermedad como se establece en la presente memoria (p. ej., diabetes).

La eficacia clínica de las terapias proteicas puede verse limitada por la semivida plasmática corta y la susceptibilidad a la degradación. Los estudios de varias proteínas terapéuticas han demostrado que diversas modificaciones, incluida la conjugación o la unión de la secuencia peptídica a cualquiera de una variedad de polímeros no proteicos, p. ej., polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos (véase, por ejemplo, típicamente a través de un radical de conexión unido covalentemente tanto a la proteína como al polímero no proteico (p. ej., un PEG) puede prolongar la semivida. Se ha demostrado que tales biomoléculas conjugadas con PEG poseen propiedades clínicamente útiles, incluida una mejor estabilidad física y térmica, protección contra la susceptibilidad a la degradación enzimática, mayor solubilidad, mayor semivida circulante in vivo y menor aclaramiento, menores inmunogenicidad y antigenicidad y menor toxicidad.

Los PEG adecuados para la conjugación con los péptidos quiméricos de la invención son generalmente solubles en agua a temperatura ambiente y tienen la fórmula general R(O-CH2-CH2)nO-R, donde R es hidrógeno o un grupo protector tal como un grupo alquilo o alcanol, y donde n es un número entero de 1 a 1000. Cuando R es un grupo protector, generalmente tiene de 1 a 8 carbonos. El PEG conjugado con la secuencia del péptido puede ser lineal o ramificado. Los derivados de PEG ramificados, los "PEG en estrella" y los PEG de brazos múltiples se incluyen en la invención. El peso molecular del PEG utilizado en la invención no está restringido a ningún intervalo concreto, pero ciertos ejemplos tienen un peso molecular entre 500 y 20.000 mientras que otras realizaciones tienen un peso molecular entre 4.000 y 10.000.

La invención incluye composiciones de productos conjugados en donde los PEG tienen diferentes valores de "n" y, por tanto, los diversos PEG diferentes están presentes en proporciones específicas. Por ejemplo, algunas composiciones comprenden una mezcla de productos conjugados donde n = 1, 2, 3 y 4. En algunas composiciones, el porcentaje de productos conjugados donde n = 1 es 18-25%, el porcentaje de productos conjugados donde n = 2 es 50-66%, el porcentaje de productos conjugados donde n = 3 es 12-16% y el porcentaje de productos conjugados donde n = 4 es hasta 5%. Tales composiciones se pueden producir mediante condiciones de reacción y métodos de purificación conocidos en la técnica.

El PEG se puede unir, directa o indirectamente (p. ej., a través de un intermedio) a las secuencias de péptidos de la invención. Por ejemplo, en una realización, el PEG se une a través de un grupo reactivo terminal (un "espaciador"). El espaciador es, por ejemplo, un grupo reactivo terminal que media un enlace entre los grupos amino o carboxilo libres de una o más de las secuencias de péptidos y polietilenglicol. El PEG que tiene el espaciador que puede unirse al grupo amino libre incluye N-hidroxisuccinilimida polietilenglicol que se puede preparar activando el éster de ácido succínico de polietilenglicol con N-hidroxisuccinilimida. Otro polietilenglicol activado que se puede unir al grupo amino libre es 2,4-bis(O-metoxipolietilenglicol)-6-cloro-s-triazina, que se puede preparar haciendo reaccionar monometiléter de polietilenglicol con cloruro cianúrico. El polietilenglicol activado que está unido al grupo carboxilo libre incluye polioxietilendiamina.

La conjugación de uno o más de los péptidos quiméricos de la invención con PEG que tiene un espaciador se puede llevar a cabo mediante varios métodos convencionales. Por ejemplo, la reacción de conjugación se puede llevar a cabo en solución a un pH de 5 a 10, a una temperatura de 4°C a temperatura ambiente, durante 30 minutos a 20 horas, utilizando una razón molar de reactivo respecto a proteína de 4:1 a 30:1. Las condiciones de reacción se pueden seleccionar para dirigir la reacción hacia la producción predominante de un grado de sustitución deseado. En general, una baja temperatura, un bajo pH (p. ej., pH = 5), y un tiempo de reacción corto tienden a disminuir el número de PEG anclados, mientras que una temperatura alta, un pH neutro elevado (p. ej., pH > 7), y un tiempo de reacción más prolongado tienden a aumentar el número de PEG anclados. Se pueden utilizar varios métodos conocidos en la técnica para terminar la reacción. La reacción se puede terminar acidulando la mezcla de reacción y congelando a, por ejemplo, -20°C.

En la presente memoria se describen subsecuencias, variantes de secuencia y formas modificadas de las secuencias de péptidos ilustradas (incluidos los péptidos enumerados en la Tabla 1-9 y la Figura 1). Los péptidos quiméricos de la invención incluyen adicionalmente la conjugación con macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tales como proteínas; polisacáridos, tales como sefarosa, agarosa, celulosa, cuentas de celulosa; aminoácidos poliméricos tales como ácido poliglutámico, polilisina; copolímeros de aminoácidos; partículas de virus inactivadas; toxinas bacterianas inactivadas tales como toxoide de difteria, tétanos, cólera, moléculas de leucotoxina; bacterias inactivadas; y células dendríticas. Tales formas conjugadas, si se desea, se pueden utilizar para producir anticuerpos contra secuencias peptídicas de la invención.

Los componentes y moléculas adecuados adicionales para la conjugación incluyen, por ejemplo, tiroglobulina; albúminas tales como albúmina de suero humano (HSA); toxoide tetánico; toxoide diftérico; poliaminoácidos tales como poli(D-lisina:ácido D-glutámico); polipéptidos VP6 de rotavirus; hemaglutinina del virus de la influenza, nucleoproteína del virus de la influenza; Hemocianina de Lapa de Ojo de Cerradura (KLH); y proteína núcleo y antígeno de superficie del virus de la hepatitis B; o cualquier combinación de los anteriores.

La fusión de albúmina con los péptidos quiméricos de la invención se puede lograr, por ejemplo, mediante manipulación genética, de modo que el ADN que codifica HSA (albúmina de suero humano), o un fragmento de la misma, se une al ADN que codifica una secuencia peptídica. Después de eso, un anfitrión adecuado se puede transformar o transfectar con la secuencia de nucleótidos fusionada en forma de, por ejemplo, un plásmido adecuado, para expresar un polipéptido de fusión. La expresión se puede efectuar in vitro a partir de, por ejemplo, células procarióticas o eucarióticas, o in vivo a partir de, por ejemplo, un organismo transgénico. En algunas realizaciones de la invención, la expresión de la proteína de fusión se realiza en líneas celulares de mamíferos, por ejemplo, líneas celulares CHO.

Otros medios para fusionar genéticamente proteínas o péptidos diana con albúmina incluyen una tecnología conocida como Albufuse® (Novozymes Biopharma A/S; Dinamarca), y las secuencias de péptidos terapéuticos conjugados con frecuencia se vuelven mucho más eficaces con una mejor absorción en el organismo. La tecnología se ha utilizado comercialmente para producir Albuferon® (Human Genome Sciences), una combinación de albúmina e interferón a-2B que se utiliza para tratar la infección por hepatitis C.

Otro ejemplo implica el uso de uno o más anticuerpos de dominio humano (dAb). Los dAb son las unidades de unión funcionales más pequeñas de los anticuerpos humanos (IgG) y tienen características favorables de estabilidad y solubilidad. La tecnología implica uno o varios dAb conjugados con HSA (formando así un ''AlbudAb''; véanse, p. ej., los documentos EP1517921B, WO2005/118642 y WO2006/051288) y una molécula de interés (p. ej., una secuencia peptídica de la invención). Los AlbudAb son a menudo más pequeños y más fáciles de fabricar en sistemas de expresión microbiana, tales como bacterias o levaduras, que las tecnologías actuales utilizadas para prolongar la semivida sérica de los péptidos. Puesto que la HSA tiene una semivida de aproximadamente tres semanas, la molécula conjugada resultante mejora la semivida. El uso de la tecnología dAb también puede mejorar la eficacia de la molécula de interés.

Los componentes y moléculas adecuados adicionales para la conjugación incluyen aquellos adecuados para el aislamiento o la purificación. Los ejemplos concretos no limitantes incluyen moléculas de unión, tales como biotina (par de unión específico de biotina-avidina), un anticuerpo, un receptor, un ligando, una lectina o moléculas que comprenden un soporte sólido, incluidas, por ejemplo, cuentas de plástico o poliestireno, placas o cuentas, cuentas magnéticas, tiras reactivas y membranas.

Se pueden utilizar métodos de purificación tales como la cromatografía de intercambio catiónico para separar productos conjugados por diferencia de carga, lo que separa eficazmente los productos conjugados en sus diversos pesos moleculares. Por ejemplo, la columna de intercambio catiónico se puede cargar y a continuación lavar con acetato de sodio ~20 mM, pH ~4, y a continuación eluir con un gradiente de NaCl lineal (0 M a 0,5 M) tamponado a un pH de 3 a 5,5, preferiblemente a pH ~ 4,5. El contenido de las fracciones obtenidas por cromatografía de intercambio catiónico se puede identificar por peso molecular utilizando métodos convencionales, por ejemplo, espectroscopia de masas, SDS-PAGE u otros métodos conocidos para separar entidades moleculares por peso molecular. En consecuencia, se identifica a continuación una fracción que contiene el producto conjugado que tiene el número deseado de PEG anclados, purificado libre de secuencias de proteínas no modificadas y de productos conjugados que tienen otro número de PEG anclados.

Los péptidos quiméricos de la invención se pueden conectar a un agente químico (p. ej., una inmunotoxina o agente quimioterapéutico), que incluye, pero no se limita a, un agente citotóxico, que incluye taxol, citocalasina B, gramicidina D, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina y análogos u homólogos de los mismos. Otros agentes químicos incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil descarbazina); agentes alquilantes (p. ej., mecloretamina, carmustina y lomustina, ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisplatino); antibióticos p. ej., bleomicina); y agentes antimitóticos (p. ej., vincristina y vinblastina). Las citotoxinas se pueden conjugar con un péptido quimérico de la invención utilizando tecnología de conectores conocida en la técnica y descrita en la presente memoria.

Otros componentes y moléculas adecuados para la conjugación incluyen aquellos adecuados para la detección en un ensayo. Los ejemplos concretos no limitantes incluyen marcadores detectables, tales como un radioisótopo (p. ej., 125I; 35S, 32P; 33P), una enzima que genera un producto detectable (p. ej., luciferasa, p-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina), una proteína fluorescente, una proteína cromogénica, colorante (p. ej., isotiocianato de fluoresceína); metales que emiten fluorescencia p. ej., 152Eu); compuestos quimioluminiscentes (p. ej., sales de luminol y acridinio); compuestos bioluminiscentes (p. ej., luciferina); y proteínas fluorescentes. Las marcas indirectas incluyen anticuerpos marcados o detectables que se unen a una secuencia peptídica, donde se puede detectar el anticuerpo.

Los péptidos quiméricos de la invención se pueden conjugar con un isótopo radiactivo para generar un radiofármaco citotóxico (productos radioinmunoconjugados) útil como agente de diagnóstico o terapéutico. Los ejemplos de tales isótopos radiactivos incluyen, pero no se limitan a, yodo131, indio111, itrio90 y lutecio177. Los expertos en la técnica conocen métodos para preparar productos radioinmunoconjugados. Los ejemplos de productos radioinmunoconjugados que están disponibles comercialmente incluyen ibritumomab, tiuxetan y tositumomab.

Otros medios y métodos incluidos en la invención para prolongar la semivida en la circulación, aumentar la estabilidad, reducir el aclaramiento o alterar la inmunogenicidad o alergenicidad de una secuencia peptídica quimérica de la invención implican la modificación de secuencia peptídica por hesilación, que utiliza derivados de hidroxietil almidón conectados a otras moléculas para modificar las características de la molécula. Varios aspectos de la hesilación se describen, por ejemplo, en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos Núm. 2007/0134197 y 2006/0258607.

Cualquiera de los componentes y moléculas anteriores utilizados para modificar las secuencias de péptidos de la invención se puede conjugar opcionalmente mediante un conector. Los conectores adecuados incluyen "conectores flexibles" que generalmente tienen una longitud suficiente para permitir algún movimiento entre las secuencias de péptidos modificados y los componentes y moléculas conectados. Las moléculas conectoras tienen generalmente una longitud aproximada de 6 a 50 átomos. Las moléculas conectoras también pueden ser, por ejemplo, aril acetileno, oligómeros de etilenglicol que contienen 2-10 unidades monoméricas, diaminas, diácidos, aminoácidos o combinaciones de los mismos. Los conectores adecuados se pueden seleccionar fácilmente y pueden tener cualquier longitud adecuada, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30-50 aminoácidos (p. ej., Gly).

Los conectores flexibles ilustrativos incluyen polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (por ejemplo, (GS)ⁿ, GSGGSⁿ(SEQ ID NO: 129) y GGGSⁿ(SEQ ID NO: 130), donde n es un número entero de al menos uno), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros conectores flexibles. Los polímeros de glicina y glicina-serina están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como una unión neutra entre los componentes. Los conectores flexibles ilustrativos incluyen, pero no se limitan a GGSG (SEQ ID NO: 131), GGSGG (SEQ ID NO: 132), GSGSG (SEQ ID NO: 133), GSGGG (SEQ ID NO: 134), GGGSG (SEQ ID NO: NO: 189) y GSSSG (SEQ ID NO: 135).

Los péptidos quiméricos de la invención, incluidas las variantes y subsecuencias de FGF19 y FGF21 y las fusiones y quimeras de FGF19/FGF21 enumeradas, tienen una o más actividades como se expone en la presente memoria. Un ejemplo de actividad es la actividad reductora de glucosa. Otro ejemplo de una actividad es la reducción de la estimulación o formación de CHC, por ejemplo, en comparación con FGF19. Un ejemplo adicional de una actividad es la disminución o reducción de lípidos (p. ej., triglicéridos, colesterol, no HDL) o actividad de aumento de HDL, por ejemplo, en comparación con FGF21. Un ejemplo adicional de una actividad es una actividad reductora de masa muscular magra más baja o reducida, por ejemplo, en comparación con FGF21. Otro ejemplo más de una actividad es la unión a FGFR4, o la activación de FGFR4, por ejemplo, secuencias de péptidos que se unen a FGFR4 con una afinidad comparable o mayor que la afinidad de unión de FGF19 por FGFR4; y las secuencias de péptidos que activan FGFR4 en un grado o una cantidad comparable o mayor que FGF19 activa FGFR4. Otros ejemplos más de actividades incluyen la regulación por disminución o la reducción de la expresión del gen de la aldoceto reductasa, por ejemplo, en comparación con FGF19; regulación por incremento o aumento de la expresión del gen Slcla2 en comparación con FGF21.

Más concretamente, los péptidos quiméricos de la invención, que incluyen las variantes y subsecuencias de FGF19 y FGF21 y las fusiones y quimeras de FGF19/FGF21 incluyen aquellos con las siguientes actividades: secuencias de péptidos que tienen una menor formación de CHC en comparación con FGF19, o una secuencia variante de FGF19 que tiene cualquiera de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO: 171), WGDPV (SEQ ID NO: 172), WGDI (SEQ ID NO: 173), GDPI (SEQ ID NO: 174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO: 175), WGAPI (SEQ ID NO: 176), AGDPI (SEQ ID NO: 177), WADPI (SEQ ID NO: 178), WGDAI (SEQ ID NO: 179), WGDPA (SEQ ID NO: 180), WDPI ( SEQ ID NO: 181), WGDI (SEQ ID NO: 182), WGDP (SEQ ID NO: 183) o FGDPI (SEQ ID NO: 184) sustituido por la secuencia WGDPI (SEQ ID NO: 170) en los aminoácidos 16-20 de FGF19; secuencias de péptidos que tienen una mayor actividad reductora de glucosa en comparación con FGF19, o secuencia variante de FGF 19 que tiene cualquiera de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO: 171), WGDPV (SEQ ID NO: 172), WGDI (SEQ ID NO: 173), GDPI (SEQ ID NO: 174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO: 175), WGAPI (SEQ ID NO: 176), AGDPI (SEQ ID NO: 177), WADPI (SEQ ID NO: 178), WGDAI (SEQ ID NO: 179), WGDPA (SEQ ID NO: 180), WDPI (SEQ ID NO: 181), WGDI (SEQ ID NO: 182), WGDP (SEQ ID NO: 183) o FGDPI (SEQ ID NO: 184) sustituido por la secuencia WGDPI (SEQ iD NO: 170) en los aminoácidos 16-20 de FGF19; secuencias de péptidos que tienen menor actividad de aumento de lípidos (p. ej., menos triglicéridos, colesterol, no HDL) o mayor actividad de aumento de HDL en comparación con FGF19, o una secuencia variante de FGF 19 que tiene cualquiera de GQV, GDI, WGPI (SEQ ID NO: 171), WGDPV (SEQ ID NO: 172), WGDI (SEQ ID NO: 173), GDPI (SEQ ID NO: 174), GPI, WGQPI (SEQ ID NO: 175), WGAPI (SEQ ID NO: 176), AGDPI (SEQ ID NO: 177), WADPI (SEQ ID NO: 178), WGDAI (SEQ ID NO: 179), WGDPA (SEQ ID NO: 180), WDPI (SEQ ID NO: 181), WGDI (SEQ ID NO: 182), WGDP (SEQ ID NO: 183) o FGDPI (SEQ ID NO: 184) sustituido por la secuencia WGDPI (SEQ ID NO: 170) en los aminoácidos 16-20 de FGF19; y secuencias de péptidos que tienen menor actividad reductora de masa magra en comparación con FGF21.

Más concretamente, los péptidos quiméricos de la invención, incluidas las variantes y subsecuencias de FGF19 y FGF21 y las fusiones y quimeras de FGF19/FGF21 incluyen aquellos con las siguientes actividades: secuencias de péptidos que se unen a FGFR4, o activan FGFR4, tales como secuencias de péptidos que se unen a FGFR4 con una afinidad comparable o mayor que la afinidad de unión de FGF19 por FGFR4; secuencias de péptidos que activan FGFR4 en un grado o una cantidad comparable o mayor que FGF19 activa FGFR4; secuencias de péptidos que regulan por disminución o reducen la expresión del gen de la aldoceto reductasa, por ejemplo, en comparación con FGF19; y secuencias de péptidos que regulan por incremento o aumentan la expresión génica del miembro 2 de la familia portadora de solutos 1 (Slc la2) en comparación con FGF21.

Como se describe en la presente memoria, las variantes incluyen varias modificaciones N-terminales y/o truncamientos de FGF19, incluidas variantes en las que ha habido una sustitución de uno o varios aminoácidos N-terminales de FGF19 por aminoácidos de FGF21. Tales variantes incluyen variantes que tienen actividad reductora de glucosa, así como un perfil lipídico favorable y no son tumorigénicas de manera medible o detectable.

En varios aspectos concretos, se describen en la presente memoria modificaciones a la región Bucle-8 de FGF19 (los restos 127-129 se definen como constituyentes de la región Bucle-8) que tienen actividad reductora de glucosa y también poseen parámetros metabólicos favorables sin exhibir una tumorigenicidad sustancial. En la presente memoria, los restos 127-129 de FGF19 se definen como constituyentes de la región Bucle-8, aunque en la bibliografía se define a veces que la región Bucle-8 incluye o consiste en otros restos (p. ej., restos 125-129). Como se expone en el Ejemplo 9 y la Tabla 8, ciertas combinaciones de las sustituciones R127L y P128E en el armazón de FGF19 tuvieron un efecto inesperadamente positivo sobre la formación de CHC. Aún más sorprendente, una combinación de las sustituciones R127L y P128E y una sustitución de Gln (Q) por Leu (L) en la región núcleo de FGF19 (véase, p. ej., la secuencia de la región núcleo indicada en las Tablas 1-4, 8 y 9) tuvo un efecto aún más significativo en la prevención de la formación de CHC. Por consiguiente, se incluyen variantes de la región Bucle-8 de FGF19 ya que pueden reducir o eliminar la formación de CHC de manera sustancial, medible o detectable. Además, el efecto de reducción de la formación de CHC se puede mejorar mediante modificaciones en los restos de aminoácido fuera de la región Bucle 8 (p. ej., sustituciones de restos de aminoácido en la región núcleo).

Las actividades tales como, por ejemplo, formación de CHC o tumorigénesis, actividad reductora de glucosa, actividad incrementadora de lípidos o actividad reductora de masa magra se pueden determinar en un animal, tal como un ratón db/db . La medición de la unión a FGFR4 o la activación de FGFR4 se puede determinar mediante ensayos descritos en la presente memoria (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1) o conocidos por el experto en la técnica.

El término "unión" o "que se une", cuando se utiliza en referencia a una secuencia peptídica, significa que la secuencia peptídica interactúa a nivel molecular. Por tanto, una secuencia peptídica que se une a FGFR4 se une a toda o parte de la secuencia de FGFR4. La unión específica y selectiva se puede distinguir de la unión no específica utilizando ensayos conocidos en la técnica (p. ej., unión por competición, inmunoprecipitación, ELISA, citometría de flujo, transferencia Western).

Se pueden producir y aislar péptidos y peptidomiméticos utilizando métodos conocidos en la técnica. Los péptidos se pueden sintetizar, en su totalidad o en parte, utilizando métodos químicos (véase, p. ej., Caruthers (1980). Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215; Horn (1980); y Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA). La síntesis de péptidos se puede realizar utilizando varias técnicas en fase sólida (véase, p. ej., Roberge Science 269:202 (1995); Merrifield, Methods Enzymol.

289:3 (1997)) y se puede lograr una síntesis automatizada, p. ej., utilizando el sintetizador de péptidos ABI 431A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los péptidos y peptidomiméticos también se pueden sintetizar utilizando metodologías combinatorias. Los restos sintéticos y polipéptidos que incorporan miméticos se pueden sintetizar utilizando una variedad de procedimientos y metodologías conocidos en la técnica (véase, p. ej., Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman, et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., Nueva York). Los péptidos modificados se pueden producir mediante métodos de modificación química (véase, por ejemplo, Belousov, Nucleic Acids Res. 25:3440 (1997); Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19:373 (1995); y Blommers, Biochemistry 33:7886 (1994).)). También se pueden realizar variaciones, derivados, sustituciones y modificaciones de secuencia peptídica utilizando métodos tales como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida al sitio), barrido de alanina y mutagénesis basada en PCR. La mutagénesis dirigida al sitio (Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucí. Acids Res. 10:6487 (1987)), mutagénesis en casete (Wells et al., Gene 34:315 (1985)), mutagénesis por selección de restricción (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317:415 (1986)) y se pueden realizar otras técnicas sobre ADN clonado para producir péptidos quiméricos de la invención, variantes, fusiones y quimeras, y variaciones, derivados, sustituciones y modificaciones de los mismos.

Una secuencia peptídica "sintetizada" o "fabricada" es un péptido elaborado mediante cualquier método que implique manipulación por parte del hombre. Tales métodos incluyen pero no se limitan a los mencionados anteriormente, tales como síntesis química, tecnología de ADN recombinante, fragmentación bioquímica o enzimática de moléculas más grandes y combinaciones de los anteriores.

Las secuencias de péptidos descritas en la presente memoria incluyen subsecuencias, variantes de secuencia y formas modificadas de las secuencias de péptidos ilustradas (p. ej., secuencias enumeradas en la Tabla 1-9 y la Figura 1), también se pueden modificar para formar una molécula quimérica. De acuerdo con la invención, se proporcionan secuencias de péptidos quiméricos que incluyen un dominio heterólogo. Tales dominios se pueden añadir al extremo amino o al extremo carboxilo de la secuencia peptídica. Los dominios heterólogos también se pueden colocar dentro de la secuencia peptídica y/o alternativamente flanquear por secuencias de aminoácidos derivadas de FGF19 y/o FGF21.

El término "péptido" también incluye dímeros o multímeros (oligómeros) de péptidos. De acuerdo con la invención, también se proporcionan dímeros o multímeros (oligómeros) de las secuencias de péptidos ilustradas, así como subsecuencias, variantes y formas modificadas de las secuencias de péptidos ilustradas (p. ej., secuencias enumeradas en la Tabla 1-9 y la Figura 1).

La invención proporciona adicionalmente moléculas de ácido nucleico que codifican secuencias de péptidos quiméricos de la invención y vectores que incluyen ácido nucleico que codifica la secuencia peptídica quimérica. En consecuencia, los "ácidos nucleicos" incluyen aquellos que codifican las secuencias de péptidos ilustradas descritas en la presente memoria, así como los que codifican subsecuencias funcionales, variantes de secuencia y formas modificadas de las secuencias de péptidos ilustradas, siempre que los anteriores conserven al menos una actividad o función detectable o medible. Por ejemplo, una subsecuencia, una variante o forma modificada de una secuencia peptídica ilustrada descrita en la presente memoria (p. ej., una secuencia enumerada en la Tabla 1-9 y la Figura 1) que conserva cierta capacidad para disminuir o reducir la glucosa, proporcionar una homeostasis normal de la glucosa o reducir las afecciones histopatológicas asociadas con la hiperglucemia crónica o aguda in vivo, etc.

El ácido nucleico, que también se puede denominar en la presente memoria gen, polinucleótido, secuencia de nucleótidos, cebador, oligonucleótido o sonda, se refiere a polímeros que contienen purina y pirimidina, naturales o modificados, de cualquier longitud, ya sean polirribonucleótidos o polidesoxirribonucleótidos o polirribopolidesoxirribonucleótidos mixtos, y formas a-anoméricas de los mismos. Los dos o más polímeros que contienen purina y pirimidina están típicamente conectados por un enlace fosfoéster o análogo del mismo. Los términos pueden utilizarse indistintamente para referirse a todas las formas de ácido nucleico, incluido el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN). Los ácidos nucleicos pueden ser de hebra sencilla, doble o triple, lineales o circulares. Los ácidos nucleicos incluyen ADN genómico y ADNc. El ácido nucleico de ARN puede ser ARNm, ARNr, ARNt o antisentido sometidos a corte y empalme o no sometidos a corte y empalme. Los ácidos nucleicos incluyen análogos y derivados de nucleótidos, sintéticos y de origen natural.

Como resultado de la degeneración del código genético, las moléculas de ácido nucleico incluyen secuencias degeneradas con respecto a las moléculas de ácido nucleico que codifican las secuencias de péptidos quiméricos de la invención. Por tanto, se proporcionan secuencias de ácido nucleico degeneradas que codifican secuencias de péptidos, incluidas subsecuencias, variantes y formas modificadas de las secuencias de péptidos ilustradas en la presente memoria (p. ej., las secuencias enumeradas en la Tabla 1-9 y la Figura 1). El término "complementario", cuando se utiliza en referencia a una secuencia de ácido nucleico, significa que las regiones referenciadas son 100% complementarias, es decir, exhiben un emparejamiento de bases de 100% sin emparejamientos erróneos.

El ácido nucleico se puede producir utilizando cualquiera de una variedad de métodos de síntesis química y clonación convencionales conocidos, y se puede alterar intencionalmente mediante mutagénesis dirigida al sitio u otros mecanismos recombinantes conocidos por un experto en la técnica. La pureza de los polinucleótidos se puede determinar mediante secuenciación, electroforesis en gel, espectrometría UV.

Los ácidos nucleicos se pueden insertar en una construcción de ácidos nucleicos en la que la expresión del ácido nucleico está influenciada o regulada por un "elemento de control de la expresión", denominado en la presente memoria "casete de expresión". El término "elemento de control de la expresión" se refiere a uno o más elementos de secuencia de ácido nucleico que regulan o influyen en la expresión de una secuencia de ácido nucleico a la que está conectado operativamente. Un elemento de control de la expresión puede incluir, según corresponda, promotores, potenciadores, terminadores de la transcripción, silenciadores de genes, un codón de inicio (p. ej., ATG) delante de un gen que codifica una proteína, etc.

Un elemento de control de la expresión conectado operativamente a una secuencia de ácido nucleico controla la transcripción y, según sea apropiado, la traducción de la secuencia de ácido nucleico. El término "conectado operativamente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes referenciados están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Normalmente, los elementos de control de la expresión se yuxtaponen en los extremos 5' o 3' de los genes, pero también pueden ser intrónicos.

Los elementos de control de expresión incluyen elementos que activan la transcripción constitutivamente, que son inducibles (es decir, requieren una señal o estímulos externos para su activación), o desreprimibles (es decir, requieren una señal para desactivar la transcripción; cuando la señal ya no está presente, la transcripción se activa o "desreprime"). También se incluyen en los casetes de expresión de la invención elementos de control suficientes para hacer que la expresión génica sea controlable para tipos de células o tejidos específicos (es decir, elementos de control específicos de tejido). Por lo general, estos elementos se encuentran aguas arriba o aguas abajo (es decir, 5' y 3') de la secuencia codificante. Los promotores generalmente se colocan 5' de la secuencia codificante. Se pueden utilizar promotores, producidos mediante técnicas de ADN recombinante o sintéticas, para proporcionar la transcripción de los polinucleótidos de la invención. Un "promotor" típicamente significa un elemento de secuencia mínimo suficiente para dirigir la transcripción.

Los ácidos nucleicos se pueden insertar en un plásmido para su transformación en una célula anfitriona y para su posterior expresión y/o manipulación genética. Un plásmido es un ácido nucleico que se puede propagar de forma estable en una célula anfitriona; los plásmidos pueden contener opcionalmente elementos de control de la expresión con el fin de impulsar la expresión del ácido nucleico. Para los propósitos de esta invención, un vector es sinónimo de un plásmido. Los plásmidos y vectores contienen generalmente al menos un origen de replicación para la propagación en una célula y un promotor. Los plásmidos y vectores también pueden incluir un elemento de control de expresión para la expresión en una célula anfitriona y, por lo tanto, son útiles para la expresión y/o manipulación genética de ácidos nucleicos que codifican secuencias de péptidos, que expresan secuencias de péptidos en células y organismos anfitriones (p. ej., un sujeto que necesita tratamiento), o producir secuencias de péptidos, por ejemplo.

Como se emplea en la presente memoria, el término "transgén" significa un polinucleótido que se ha introducido en una célula u organismo mediante un artificio. Por ejemplo, en una célula que tiene un transgén, el transgén se ha introducido mediante manipulación genética o "transformación" de la célula. Una célula o progenie de la misma en la que se ha introducido el transgén se denomina "célula transformada" o "transformante". Normalmente, el transgén se incluye en la progenie del transformante o se convierte en parte del organismo que se desarrolla a partir de la célula. Los transgenes se pueden insertar en el ADN cromosómico o mantener como un plásmido autorreplicante, YAC, minicromosoma o similares.

Los promotores del sistema bacteriano incluyen promotores de T7 y inducibles tales como pL del bacteriófago A., Plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) y promotores sensibles a tetraciclina. Los promotores del sistema de células de insectos incluyen promotores constitutivos o inducibles (p. ej., ecdisona). Los promotores constitutivos de células de mamífero incluyen promotores de SV40, RSV, virus del papiloma bovino (BPV) y otros virus, o promotores inducibles derivados del genoma de células de mamífero (p. ej., promotor de metalotioneína IIA; promotor de choque térmico) o de virus de mamíferos (p. ej., el promotor tardío de adenovirus; repetición terminal larga del virus del tumor mamario de ratón inducible). Alternativamente, un genoma retroviral se puede modificar genéticamente para introducir y dirigir la expresión de una secuencia peptídica en células anfitrionas apropiadas.

En cuanto a los métodos y usos descritos en la presente memoria se incluyen sistemas de expresión de suministro in vivo, que incluyen adicionalmente vectores diseñados para su uso in vivo. Los ejemplos concretos no limitantes incluyen vectores adenovirales (Patentes de Estados Unidos Núm. 5.700.470 y 5.731.172), vectores adenoasociados (Patente de Estados Unidos Núm. 5.604.090), vectores del virus del herpes simple (Patente de Estados Unidos Núm.

5.501.979), vectores retrovirales (Patentes de Estados Unidos Núm. 5.624.820, 5.693.508 y 5.674.703), vectores de BPV (Patente de Estados Unidos Núm. 5.719.054), vectores CMV (Patente de Estados Unidos Núm. 5.561.063) y vectores de parvovirus, rotavirus, virus de Norwalk y lentivirales (véase, p. ej., Patente de Estados Unidos Núm.

6.013.516). Los vectores incluyen aquellos que transportan genes a las células del tracto intestinal, incluidas las células madre (Croyle et al., Gene Ther. 5:645 (1998); S. J. Henning, Adv. Drug Deliv. Rev. 17: 341 (1997), Patentes de Estados Unidos Núm. 5.821.235 y 6.110.456). Muchos de estos vectores han sido aprobados para estudios en seres humanos.

Los vectores de levadura incluyen promotores constitutivos e inducibles (véanse, p. ej., Ausubel et al., En: Current Protocols in Molecular Biology. vol. 2, cap. 13, ed., Greene Publish. Assoc. y Wiley Interscience, 1988; Grant et al. Methods in Enzymology, 153:516 (1987), eds. Wu y Grossman; Bitter Methods in Enzymology, 152:673 (1987), eds. Berger y Kimmel, Acad. Press, N.Y.; y, Strathern et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (1982) eds. Cold Spring Harbor Press, Vol. I y II). Se puede utilizar un promotor de levadura constitutivo tal como ADH o LEU2 o un promotor inducible tal como GAL (R. Rothstein en: DNA Cloning, A Practical Approach, vol. 11, cap. 3, ed. D.M. Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986). Los vectores que facilitan la integración de secuencias de ácidos nucleicos foráneos en un cromosoma de levadura, mediante recombinación homóloga, por ejemplo, son conocidos en la técnica. Los cromosomas artificiales de levadura (YAC) se utilizan normalmente cuando los polinucleótidos insertados son demasiado grandes para los vectores más convencionales (p. ej., mayor de aproximadamente 12 Kb).

Los vectores de expresión también pueden contener un marcador seleccionable que confiere resistencia a una presión selectiva o un marcador identificable (p. ej., beta-galactosidasa), permitiendo así que las células que tienen el vector sean seleccionadas, cultivadas y expandidas. Alternativamente, un marcador seleccionable puede estar en un segundo vector que se cotransfecta a una célula anfitriona con un primer vector que contiene un ácido nucleico que codifica una secuencia peptídica. Los sistemas de selección incluyen, entre otros, el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), el gen de la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)) y los genes de adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) que se pueden emplear en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Adicionalmente, la resistencia a los antimetabolitos se puede utilizar como base de selección para dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); el gen gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); gen de neomicina, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)); puromicina; y el gen de higromicina, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Los genes seleccionables adicionales incluyen trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); y ODC (ornitina descarboxilasa), que confiere resistencia al inhibidor de ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue (1987) En: Current Communications in Molecular Biology. Cold Spring Harbor Laboratory).

De acuerdo con la invención, se proporcionan células transformadas (in vitro, ex vivo e in vivo) y células anfitrionas que producen una variante o fusión de FGF19 y/o FGF21 como se establece en la presente memoria, donde la expresión de la variante o fusión de FGF19 y/o FGF21 es conferida por un ácido nucleico que codifica la variante o fusión de FGF19 y/o FGF21. Las células transformadas y anfitrionas que expresan secuencias de péptidos quiméricos de la invención incluyen típicamente un ácido nucleico que codifica la secuencia peptídica quimérica de la invención. En una realización, una célula transformada o anfitriona es una célula procariótica. En otra realización, una célula transformada o anfitriona es una célula eucariótica. En varios aspectos, la célula eucariótica es una célula de levadura o mamífero (p. ej., humana, primate, etc.).

Como se emplea en la presente memoria, una célula "transformada" o "anfitriona" es una célula en la que se introduce un ácido nucleico que se puede propagar y/o transcribir para la expresión de una secuencia peptídica codificada. El término también incluye cualquier progenie o subclones de la célula anfitriona.

Las células transformadas y anfitrionas incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias y levaduras; y células vegetales, de insecto y de mamífero. Por ejemplo, las bacterias transformadas con vectores de expresión de ácido nucleico de bacteriófago recombinante, ácido nucleico plasmídico o ácido nucleico cosmídico; levadura transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (p. ej., plásmido Ti); sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., baculovirus); y sistemas de células animales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., retrovirus, adenovirus, virus vaccinia) o sistemas de células animales transformadas diseñados para una propagación o expresión transitoria o estable.

Para usos en terapia génica, una célula transformada puede estar en un sujeto. Una célula en un sujeto se puede transformar con un ácido nucleico que codifica una secuencia peptídica quimérica de la invención como se establece en la presente memoria in vivo. Alternativamente, una célula se puede transformar in vitro con un transgén o polinucleótido, y a continuación trasplantadar a un tejido de sujeto para efectuar el tratamiento. Alternativamente, un producto aislado celular primario o una línea celular establecida se pueden transformar con un transgén o polinucleótido que codifican una variante de FGF19 y/o FGF21 o una secuencia de fusión/quimérica (o variante) de la misma, tal como una secuencia peptídica quimérica que incluye todo o una porción de FGF19, o que incluye todo o una porción de FGF21, y a continuación, opcionalmente, trasplantar a un tejido de un sujeto.

Las células diana no limitantes para la expresión de los péptidos quiméricos, particularmente para la expresión in vivo, incluyen células del páncreas (células de los islotes), células musculares, células de la mucosa y células endocrinas. Tales células endocrinas pueden proporcionar producción (secreción) inducible de una variante de FGF19 y/o FGF21, o una secuencia de fusión/quimérica (o variante) de la misma, tal como una secuencia peptídica quimérica que incluye todo o una porción de FGF19, o que incluye todo o una porción de FGF21. Las células adicionales para su transformación incluyen células madre u otras células multipotentes o pluripotentes, por ejemplo, células progenitoras que se diferencian para proporcionar las diversas células del páncreas (células de los islotes), células musculares, células mucosas y células endocrinas. La selección de células madre proporciona una expresión a más largo plazo de los péptidos quiméricos de la invención.

Como se emplea en la presente memoria, el término "cultivado", cuando se utiliza en referencia a una célula, significa que la célula se hace crecer in vitro. Un ejemplo concreto de tal célula es una célula aislada de un sujeto y cultivada o adaptada para el crecimiento en cultivo de tejidos. Otro ejemplo es una célula manipulada genéticamente in vitro, y trasplantada de nuevo al mismo sujeto o a otro diferente.

El término "aislado", cuando se utiliza en referencia a una célula, significa una célula que está separada de su entorno natural in vivo. Las células "cultivadas" y "aisladas" pueden ser manipuladas por la mano del hombre, por ejemplo, transformadas genéticamente. Estos términos incluyen cualquier progenie de las células, incluidas las células progenitoras que pueden no ser idénticas a la célula parental debido a mutaciones que ocurren durante la división celular. Los términos no incluyen un ser humano completo.

Los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de péptidos quiméricos se pueden introducir para una expresión estable en células de un organismo completo. Tales organismos, incluidos animales transgénicos no humanos, son útiles para estudiar el efecto de la expresión de péptidos en un animal completo y el beneficio terapéutico. Por ejemplo, como se describe en la presente memoria, la producción de una variante de FGF19 y/o FGF21 o una secuencia de fusión/quimérica (o variante) de la misma, tal como una secuencia peptídica quimérica que incluye todo o una porción de FGF19, o que incluye todo o una porción de FGF21, como se expone en la presente memoria, en ratones redujo la glucosa y es antidiabética.

Las cepas de ratones que desarrollan o son susceptibles de desarrollar una enfermedad concreta (p. ej., diabetes, trastornos degenerativos, cáncer, etc.) también son útiles para introducir proteínas terapéuticas como se describe en la presente memoria para estudiar el efecto de la expresión de proteínas terapéuticas en el ratón susceptible a la enfermedad. Los modelos animales transgénicos y genéticos que son susceptibles a enfermedades o condiciones fisiológicas concretas, tales como ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ) (STZ), son dianas apropiadas para expresar variantes de FGF19 y/o FGF21, secuencias de fusión/quiméricas (o variantes) de la misma, tal como una secuencia peptídica quimérica que incluye todo o una porción de FGF19, o que incluye todo o una porción de FGF21, como se expone en la presente memoria. Por lo tanto, de acuerdo con la invención, se proporcionan animales transgénicos no humanos que producen los péptidos quiméricos de la invención cuya producción no ocurre naturalmente en el animal sino que es conferida por un transgén presente en las células somáticas o germinales del animal.

El término "animal transgénico" se refiere a un animal cuyas células somáticas o de la línea germinal portan información genética recibida, directa o indirectamente, mediante manipulación genética deliberada a nivel subcelular, tal como mediante microinyección o infección con virus recombinante. El término "transgénico" incluye adicionalmente células o tejidos (es decir, "célula transgénica", "tejido transgénico") obtenidos de un animal transgénico manipulado genéticamente como se describe en la presente memoria. En el presente contexto, un "animal transgénico" no incluye animales producidos por cruzamiento clásico o fertilización in vitro, sino que más bien denota animales en los que una o más células reciben una molécula de ácido nucleico. Los animales transgénicos de la invención pueden ser heterocigotos u homocigotos con respecto al transgén. Los métodos para producir animales transgénicos, incluidos ratones, ovejas, cerdos y ranas, son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Patentes de Estados Unidos Núm.

5.721.367, 5.695.977, 5.650.298 y 5.614.396) y, como tales, se incluyen adicionalmente.

Las secuencias de péptidos, ácidos nucleicos que codifican secuencias de péptidos, vectores y células anfitrionas transformadas que expresan secuencias de péptidos incluyen formas aisladas y purificadas. El término "aislada", cuando se utiliza como modificador de una composición de la invención, significa que la composición está separada, sustancialmente completamente o al menos en parte, de uno o más componentes en un entorno. Generalmente, las composiciones que existen en la naturaleza, cuando se aíslan, están sustancialmente libres de uno o más materiales con los que normalmente se asocian en la naturaleza, por ejemplo, una o más proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos o membranas celulares. El término "aislado" no excluye formas físicas alternativas de la composición, tales como variantes, modificaciones o formas derivatizadas, fusiones y quimeras, multímeros/oligómeros, etc., o formas expresadas en células anfitrionas. El término "aislado" tampoco excluye formas (p. ej., composiciones farmacéuticas, composiciones combinadas, etc.) en las que hay combinaciones, cualquiera de las cuales es producida por la mano del hombre.

Una composición "aislada" también se puede "purificar" cuando está libre de algunos, un número sustancial o la mayoría o todos de uno o más materiales, tales como un contaminante o una sustancia o material no deseado. Los péptidos quiméricos de la invención generalmente no se conocen ni se cree que existan en la naturaleza. Sin embargo, para una composición que existe en la naturaleza, una composición aislada generalmente estará libre de algunos, un número sustancial de, o la mayoría o todos los demás materiales con los que se asocia típicamente en la naturaleza. Por tanto, una secuencia peptídica aislada que también se encuentra en la naturaleza no incluye polipéptidos o polinucleótidos presentes entre millones de otras secuencias, tales como proteínas de una biblioteca de proteínas o ácidos nucleicos en una biblioteca genómica o de ADNc, por ejemplo. Una composición "purificada" incluye combinaciones con una o más de otras moléculas inactivas o activas. Por ejemplo, un péptido quimérico de la invención se puede combinar con otro fármaco o agente, tal como un fármaco reductor de glucosa o un agente terapéutico, por ejemplo.

Como se emplea en la presente memoria, el término "recombinante", cuando se utiliza como un modificador de secuencias de péptidos, ácidos nucleicos que codifican secuencias de péptidos, etc., significa que las composiciones han sido manipuladas (es decir, modificadas genéticamente) de una manera que generalmente no ocurre en la naturaleza (p. ej., in vitro). Un ejemplo concreto de un péptido recombinante sería cuando una secuencia peptídica quimérica de la invención es expresada por una célula transfectada con un ácido nucleico que codifica la secuencia peptídica. Un ejemplo concreto de un ácido nucleico recombinante sería cuando un ácido nucleico (p. ej., genómico o ADNc) codifica una secuencia peptídica clonada en un plásmido, con o sin regiones 5', 3' o intrónicas en donde el gen es normalmente contiguo dentro del genoma del organismo. Otro ejemplo de un péptido o ácido nucleico recombinante es una secuencia híbrida o de fusión, tal como una secuencia peptídica quimérica que comprende una porción de FGF19 y una porción de FGF21.

De acuerdo con la invención, se proporcionan composiciones y mezclas de los péptidos quiméricos de la invención. En una realización, una mezcla incluye uno o más péptidos quiméricos y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptables. En otra realización, una mezcla incluye uno o más péptidos quiméricos y un fármaco o agente terapéutico adjunto, tal como un fármaco o agente terapéutico antidiabético o reductor de glucosa. A continuación se exponen ejemplos de fármacos y agentes terapéuticos. También se proporcionan combinaciones, tales como uno o más péptidos quiméricos en un portador o excipiente farmacéuticamente aceptables, con uno o más de un fármaco o agente terapéutico antidiabético o reductor de glucosa. Tales combinaciones de los péptidos quiméricos de la invención con otro fármaco o agente, tal como un fármaco reductor de glucosa o un agente terapéutico, por ejemplo, son útiles de acuerdo con los métodos y usos de la invención, por ejemplo, para su uso en un método de tratamiento de un trastorno en un sujeto que lo necesite.

Las combinaciones también incluyen la incorporación de péptidos quiméricos o ácidos nucleicos de la invención a partículas o sustancias poliméricas, tales como poliésteres, carbohidratos, poliaminoácidos, hidrogel, polivinilpirrolidona, etileno-acetato de vinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, sulfato de protamina o copolímeros de lactida/glicólido, copolímeros de polilactida/glicólido o copolímeros de etilenvinilacetato; atrapamiento en microcápsulas preparadas mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, mediante el uso de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina, o microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente; incorporación en sistemas de suministro y dispersión de fármacos coloidales, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, cuentas y sistemas basados en lípidos (p. ej., grupos N-acilo graso tales como N-lauroilo, N-oleoilo, aminas grasas tales como dodecil amina, oleoilamina, etc., véase la Patente de Estados Unidos Núm. 6.638.513), incluidas las emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas, por ejemplo.

Los péptidos quiméricos de la invención se pueden utilizar para modular el metabolismo de la glucosa y facilitar el transporte de glucosa desde la sangre a órganos metabólicos clave tales como músculo, hígado y grasa. Tales secuencias de péptidos se pueden producir en cantidades suficientes o eficaces para restaurar la tolerancia a la glucosa y/o mejorar o proporcionar la homeostasis normal de la glucosa.

Como se describe en la presente memoria, la administración de diversas variantes de FGF19 y/o FGF21 y secuencias de péptidos de fusión a ratones redujo con éxito los niveles de glucosa. Además, a diferencia de FGF19, ciertas secuencias de péptidos no estimularon ni indujeron la formación de CHC o la tumorigénesis en ratones. Por tanto, la administración de los péptidos quiméricos de la invención a un animal, ya sea mediante métodos in vivo directos o indirectos o ex vivo (p. ej., administrando la variante o el péptido de fusión, un ácido nucleico que codifica la variante o el péptido de fusión, o una célula transformada o un vector de terapia génica que expresa la variante o el péptido de fusión), se puede utilizar para tratar diversos trastornos.

Por consiguiente, la invención incluye usos de los péptidos quiméricos de la invención in vitro, ex vivo e in vivo (p. ej., sobre o en un sujeto). Tales métodos y usos se pueden poner en práctica con cualquiera de las secuencias peptídicas de la invención expuestas en la presente memoria.

De acuerdo con la invención, se proporcionan péptidos quiméricos de la invención para su uso en métodos de tratamiento de un sujeto que tiene, o corre el riesgo de tener, un trastorno. En varias realizaciones, un método incluye administrar el péptido quimérico a un sujeto en una cantidad eficaz para tratar el trastorno.

Los trastornos ilustrativos que se pueden tratar, prevenir y similares con los péptidos quiméricos de la invención incluyen enfermedades y trastornos metabólicos. Los ejemplos no limitantes de enfermedades y trastornos incluyen: 1. Trastornos en la utilización de glucosa y secuelas asociadas con los mismos, incluida diabetes mellitus (Tipo I y Tipo 2), diabetes gestacional, hiperglucemia, resistencia a la insulina, metabolismo anormal de la glucosa, "prediabetes" (Glucosa Alterada en Ayunas (GAA) o Tolerancia Alterada a la Glucosa (TAG)), y otros trastornos fisiológicos asociados con, o que resultan de, la afección hiperglucémica, incluyendo, por ejemplo, cambios histopatológicos tales como destrucción de células p pancreáticas. Para su uso en un método de tratamiento, los péptidos quiméricos se pueden administrar a sujetos que tengan un nivel de glucosa en plasma en ayunas (GPA) superior a aproximadamente 100 mg/dl. Los péptidos quiméricos de la invención también pueden ser útiles en otros trastornos relacionados con la hiperglucemia, incluido el daño renal (p. ej., daño de los túbulos o nefropatía), degeneración hepática, daño ocular (p. ej., retinopatía diabética o cataratas) y trastornos del pie diabético; 2. Dislipidemias y sus secuelas tales como, por ejemplo, aterosclerosis, enfermedad de las arterias coronarias, trastornos cerebrovasculares y similares; 3. Otras afecciones que pueden estar asociadas con el síndrome metabólico, tales como obesidad y masa corporal elevada (incluidas las afecciones co-mórbidas de las mismas, tales como, entre otras, enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), y síndrome de ovario poliquístico (SOPQ)), y también incluyen trombosis, estados hipercoagulables y protrombóticos (arterial y venoso), hipertensión, enfermedad cardiovascular, accidente cerebrovascular e insuficiencia cardíaca; 4. Trastornos o afecciones en donde intervienen reacciones inflamatorias, incluyendo aterosclerosis, enfermedades inflamatorias crónicas del intestino (p. ej., enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), asma, lupus eritematoso, artritis u otros trastornos reumáticos inflamatorios; 5. Trastornos del ciclo celular o procesos de diferenciación celular tales como tumores de células adiposas, carcinomas lipomatosos que incluyen, por ejemplo, liposarcomas, tumores sólidos y neoplasias; 6. Enfermedades neurodegenerativas y/o trastornos desmielinizantes del sistema nervioso central y periférico y/o enfermedades neurológicas que implican procesos neuroinflamatorios y/u otras neuropatías periféricas, incluyendo enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, leucoencefalopatía multifocal progresiva y síndrome de Guillian-Barre; 7. Trastornos de la piel y dermatológicos y/o trastornos de los procesos de cicatrización de heridas, incluidas las dermatosis eritematoescamosas; y 8. Otros trastornos tales como síndrome X, osteoartritis y síndrome de dificultad respiratoria aguda.

Como se emplea en la presente memoria, el término "hiperglucémico" o "hiperglucemia", cuando se utiliza en referencia a una afección de un sujeto, significa un nivel anormalmente alto transitorio o crónico de glucosa presente en la sangre de un sujeto. La afección puede ser causada por un retraso en el metabolismo o la absorción de la glucosa, de manera que el sujeto exhibe intolerancia a la glucosa o un estado de glucosa elevada que no se encuentra típicamente en sujetos normales (p. ej., en sujetos prediabéticos intolerantes a la glucosa con riesgo de desarrollar diabetes, o en sujetos diabéticos). Los niveles de glucosa plasmática en ayunas (GPA) para la normoglucemia son menores de aproximadamente 100 mg/dl, para el metabolismo de la glucosa alterado, entre aproximadamente 100 y 126 mg/dl, y para diabéticos mayores de aproximadamente 126 mg/dl.

Como se describe en la presente memoria, la invención incluye péptidos quiméricos de uso en métodos para prevenir (p. ej., en sujetos predispuestos a tener un trastorno concreto), retrasar, ralentizar o inhibir la progresión, el inicio o el tratamiento de (p. ej., mejorar) la obesidad o una masa corporal no deseable (p. ej., un índice de masa corporal mayor de lo normal, o "IMC" relativo a un sujeto emparejado apropiado de edad, sexo, raza, etc. comparables). Por tanto, en diversas realizaciones, el método para, por ejemplo, tratar la obesidad o una masa corporal no deseable (incluidas las condiciones co-mórbidas de obesidad, p. ej., apnea obstructiva del sueño, artritis, cáncer (p. ej., mama, endometrio y colon), cálculos biliares o hiperglucemia, incluye poner en contacto o administrar el péptido quimérico de la invención como se expone en la presente memoria en una cantidad eficaz para tratar la obesidad o una masa corporal no deseable. En aspectos concretos, un sujeto tiene un índice de masa corporal mayor que 25, por ejemplo, 25-30, 30 35, 35-40 o mayor que 40.

Además, la invención incluye péptidos quiméricos para su uso en métodos de prevención (p. ej., en sujetos predispuestos a tener un trastorno o trastornos concretos), ralentizar o inhibir la progresión de, retrasar el inicio de o tratar niveles no deseables de LDL, VLDL, triglicéridos o colesterol en suero/plasma anormalmente elevados, todos los cuales, solos o combinados, puede conducir a, por ejemplo, la formación de placa, estrechamiento o bloqueo de los vasos sanguíneos y un mayor riesgo de hipertensión, accidente cerebrovascular y enfermedad de las arterias coronarias. Tales trastornos pueden deberse, por ejemplo, a predisposición genética o dieta, por ejemplo.

El término "sujeto" se refiere a un animal. Normalmente, el animal es un mamífero que se beneficiaría del tratamiento con péptidos quiméricos de la invención. Los ejemplos concretos incluyen primates (p. ej., seres humanos), perros, gatos, caballos, vacas, cerdos y ovejas.

Los sujetos incluyen aquellos que tienen un trastorno, p. ej., un trastorno hiperglucémico, tal como diabetes, o sujetos que no tienen un trastorno pero que pueden tener riesgo de desarrollar el trastorno, p. ej., sujetos prediabéticos que tienen niveles de GPA superiores a 100 mg/dl, por ejemplo, entre aproximadamente 100 y 126 mg/dl. Los sujetos en riesgo de desarrollar un trastorno incluyen, por ejemplo, aquellos cuya dieta puede contribuir al desarrollo de hiperglucemia aguda o crónica (p. ej., diabetes), masa corporal no deseable u obesidad, así como aquellos que puedan tener antecedentes familiares o predisposición genética al desarrollo de hiperglucemia aguda o crónica, o masa corporal no deseable u obesidad.

Como se describe en la presente memoria, los métodos de tratamiento incluyen poner en contacto o administrar un péptido quimérico de la invención como se establece en la presente memoria en una cantidad eficaz para lograr un desenlace o resultado deseado en un sujeto. Un tratamiento que da como resultado un desenlace o resultado deseado incluye disminuir, reducir o prevenir la gravedad o frecuencia de uno o más síntomas de la afección en el sujeto, p. ej., una mejora en el estado del sujeto o un "efecto beneficioso" o "efecto terapéutico". Por lo tanto, el tratamiento puede disminuir o reducir o prevenir la gravedad o frecuencia de uno o más síntomas del trastorno, estabilizar o inhibir la progresión o empeoramiento del trastorno y, en algunos casos, revertir el trastorno, de forma transitoria (p. ej., durante 1-6, 6-12 o 12-24 horas), a medio plazo (p. ej., 1-6, 6-12, 12-24 o 24-48 días) o largo plazo (p. ej., durante 1-6, 6-12, 12-24, 24-48 semanas o más de 24-48 semanas). Así, en el caso de un trastorno hiperglucémico, por ejemplo, el tratamiento puede disminuir o reducir la glucosa en sangre, mejorar la tolerancia a la glucosa, mejorar el metabolismo de la glucosa, proporcionar una homeostasis normal de la glucosa, disminuir o reducir la resistencia a la insulina, disminuir o reducir los niveles de insulina, o disminuir, prevenir, mejorar o revertir el síndrome metabólico, o un cambio histopatológico asociado con o que resulte del trastorno hiperglucémico, tal como la diabetes.

Por ejemplo, un método o uso de péptidos quiméricos puede disminuir o reducir la glucosa en uno o más sujetos que tienen niveles de GPA mayores de 100 mg/dl, por ejemplo, entre aproximadamente 100 y 125 mg/dl, o mayores de 125 mg/dl, en 5-10%, 10-20%, 20-30% o 30-50%, o más, o por ejemplo de más de 200 mg/dl a menos de 200 mg/dl, de más 150 mg/dl a menos de 150 mg/dl, de más de 125 mg/dl a menos de 125 mg/dl, etc. Además, una secuencia peptídica, método o uso pueden disminuir o reducir la glucosa, por ejemplo, para sujetos con prediabetes o diabetes (p. ej., Tipo 2) con niveles basales de HbAIc mayores de aproximadamente 5%, 6%, 7 %, 8%, 9% o 10%, en particular 5%, 6% o 7%.

Los ejemplos no limitantes de una mejora de un cambio histopatológico asociado con una afección hiperglucémica incluyen, por ejemplo, disminuir, inhibir, reducir o detener: la destrucción o degeneración de las células del páncreas (p. ej., células p), daño renal tal como calcificación de los túbulos o nefropatía, degeneración del hígado, daño ocular (p. ej., retinopatía diabética, cataratas), pie diabético, ulceraciones en mucosas tal como boca y encías, periodontitis, sangrado excesivo, cicatrización lenta o retardada de lesiones o heridas (p. ej., que conducen a carbúnculos diabéticos), infecciones de la piel y otros trastornos cutáneos, enfermedad cardíaca cardiovascular y coronaria, enfermedad vascular periférica, accidente cerebrovascular, dislipidemia, hipertensión, obesidad o el riesgo de desarrollar cualquiera de los anteriores. La mejora de la masa corporal no deseable o de la obesidad puede incluir, por ejemplo, una reducción de la masa corporal (reflejada por el IMC o similar) o una mejora de un trastorno asociado, tal como una disminución de los niveles de triglicéridos, colesterol, LDL o VLDL, un disminución de la presión arterial, disminución del engrosamiento de la íntima de los vasos sanguíneos, disminución o reducción del riesgo de enfermedad cardiovascular o accidente cerebrovascular, disminución de la frecuencia cardíaca en reposo, etc.

Una "cantidad eficaz" o una "cantidad suficiente" para utilizar y/o para tratar a un sujeto se refiere a una cantidad que proporciona, en dosis únicas o múltiples, sola o combinada con una o más de otras composiciones (agentes terapéuticos tales como un fármaco o tratamiento para la hiperglucemia), tratamientos, protocolos o agentes de regímenes terapéuticos, una respuesta detectable de cualquier duración de tiempo (transitorio, medio o largo plazo), un desenlace deseado o un beneficio objetivo o subjetivo para un sujeto de cualquier grado medible o detectable o durante cualquier período de tiempo (p. ej., horas, días, meses, años o curación). Tales cantidades típicamente son eficaces para mejorar un trastorno, o uno, múltiples o todos los síntomas adversos, consecuencias o complicaciones del trastorno, hasta un grado medible, aunque la reducción o inhibición de una progresión o empeoramiento del trastorno se considera un desenlace satisfactorio.

Como se emplea en la presente memoria, el término "mejorar" significa una mejora en el trastorno del sujeto, una reducción en la gravedad del trastorno o una inhibición de la progresión o empeoramiento del trastorno (p. ej., estabilización del trastorno). En el caso de un trastorno hiperglucémico (p. ej., diabetes, resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa, síndrome metabólico, etc.), por ejemplo, una mejora puede ser un descenso o una reducción de la glucosa en sangre, una reducción de la resistencia a la insulina, una reducción del glucagón, una mejora de la tolerancia a la glucosa o metabolismo u homeostasis de la glucosa. Una mejora en un trastorno hiperglucémico también puede incluir una mejor función pancreática (p. ej., inhibición o prevención de la destrucción de células p/islotes o mejora del número y/o la función de células p), una disminución de una patología asociada con el trastorno o que resulte de él, tal como una mejora en la histopatología de un tejido u órgano afectados, como se establece en la presente memoria. En el caso de una masa corporal no deseable u obesidad, por ejemplo, una mejora puede ser una disminución en el aumento de peso, una reducción de la masa corporal (como se refleja en un IMC reducido, por ejemplo) o una mejora en una afección asociada con la masa corporal no deseable u obesidad, por ejemplo, como se establece en la presente memoria (p. ej., disminución o reducción de los niveles de glucosa, triglicéridos, colesterol, LDL o VLDL en sangre, disminución de la presión arterial, disminución del engrosamiento de la íntima de los vasos sanguíneos, etc.).

Por lo tanto, no es necesario que un beneficio o mejora terapéuticos representen una anulación completa de uno cualquiera, la mayoría o todos los síntomas, complicaciones, consecuencias o causas subyacentes asociados con el trastorno o la enfermedad. Por lo tanto, se logra un criterio de valoración satisfactorio cuando hay una mejora incremental transitoria, a mediano o largo plazo en el estado de un sujeto, o una reducción parcial en la aparición, frecuencia, severidad, progresión o duración, o inhibición o reversión, de uno o más síntomas adversos asociados o complicaciones o consecuencias o causas subyacentes, empeoramiento o progresión (p. ej., estabilización de uno o más síntomas o complicaciones de la afección, trastorno o enfermedad), del trastorno o enfermedad, durante un período de tiempo (horas, días, semanas, meses, etc.).

Por tanto, en el caso de un trastorno tratable con un péptido quimérico de la invención, la cantidad de péptido suficiente para mejorar un trastorno dependerá del tipo, gravedad y extensión o duración del trastorno, el efecto terapéutico o desenlace deseado, y puede ser fácilmente determinado por el experto en la técnica. Las cantidades apropiadas también dependerán del sujeto individual (p. ej., la biodisponibilidad dentro del sujeto, sexo, edad, etc.). Por ejemplo, una restauración transitoria o parcial de la homeostasis normal de la glucosa en un sujeto puede reducir la cantidad de dosificación o la frecuencia de la inyección de insulina, aunque no se haya producido una completa ausencia de insulina.

Se puede determinar una cantidad eficaz, por ejemplo, midiendo uno o más efectos fisiológicos relevantes. En un ejemplo no limitante concreto en el caso de una afección hiperglucémica, se puede utilizar una disminución o reducción de glucosa en sangre o una mejora en la prueba de tolerancia a la glucosa para determinar si la cantidad de péptidos quiméricos de la invención es eficaz para tratar una afección hiperglucémica. En otro ejemplo no limitante concreto, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para reducir o disminuir cualquier nivel (p. ej., un nivel de referencia) de GPA, en donde, por ejemplo, una cantidad suficiente para reducir un nivel de GPA superior a 200 mg/dl a menos de 200 mg/dl, una cantidad suficiente para reducir un nivel de GPA entre 175 mg/dl y 200 mg/dl a menos del nivel previo a la administración, una cantidad suficiente para reducir un nivel de GPA entre 150 mg/dl y 175 mg/dl a menos del nivel previo a la administración, una cantidad suficiente para reducir un nivel de GPA entre 125 mg/dl y 150 mg/dl a menos del nivel previo a la administración, y así sucesivamente (p. ej., reducir los niveles de GPA a menos de 125 mg/dl, a menos de 120 mg/dl, a menos de 115 mg/dl, a menos de 110 mg/dl, etc.). En el caso de los niveles de HbAIc, una cantidad eficaz incluye una cantidad suficiente para reducir o disminuir los niveles en más de aproximadamente 10% a 9%, en más de aproximadamente 9% a 8%, en más de aproximadamente 8% a 7%, en más de aproximadamente 7% a 6%, en más de aproximadamente 6% a 5%, y así sucesivamente. Más concretamente, una reducción o disminución de los niveles de HbAIc en aproximadamente 0,1%, 0,25%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,5%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50% o más es una cantidad eficaz de acuerdo con la invención. En otro ejemplo no limitante concreto, en el caso de masa corporal no deseable u obesidad, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para disminuir o reducir el índice de masa corporal (IMC) de un sujeto, una disminución o reducción de glucosa, una disminución o reducción de los niveles séricos/plasmáticos de triglicéridos, lípidos, colesterol, ácidos grasos, LDL y/o VLDL. En otros ejemplos no limitantes concretos adicionales, una cantidad es una cantidad suficiente para disminuir o reducir cualquiera de los parámetros mencionados anteriormente en, por ejemplo, aproximadamente 0,1%, 0,25%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 1,5%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50% o más.

Los usos de la invención para tratar a un sujeto son aplicables para la profilaxis para prevenir un trastorno en un sujeto, tal como un trastorno hiperglucémico, o el desarrollo de masa corporal no deseable u obesidad. Alternativamente, los métodos y usos se pueden poner en práctica durante o después del tratamiento de un sujeto. Por ejemplo, antes, durante o después del tratamiento de un sujeto para disminuir la glucosa utilizando insulina u otro fármaco o agente terapéutico para disminuir la glucosa, se puede administrar al sujeto un péptido quimérico de la invención. Además, tal secuencia peptídica de la invención se puede combinar con otro fármaco o agente, tal como un fármaco reductor de glucosa o un agente terapéutico, por ejemplo.

En consecuencia, el péptido quimérico de la invención se puede utilizar en un método de tratamiento de un sujeto antes, sustancialmente al mismo tiempo o después de otro tratamiento, y se puede complementarse con otras formas de terapia. Las terapias complementarias incluyen otros tratamientos reductores de glucosa, tales como insulina, un potenciador de la sensibilidad a la insulina y otros tratamientos farmacológicos, un cambio en la dieta (bajo contenido de azúcar, grasas, etc.), cirugía para bajar de peso (reducción del volumen del estómago mediante bypass gástrico, gastrectomía), banda gástrica, balón gástrico, manga gástrica, etc. Por ejemplo, el péptido quimérico de la invención para tratar un trastorno hiperglucémico o de resistencia a la insulina se puede utilizar combinado con fármacos u otras composiciones farmacéuticas que reducen la glucosa o aumentan la sensibilidad a la insulina en un sujeto. Los fármacos para tratar la diabetes incluyen, por ejemplo, biguanidas y sulfonilureas (p. ej., tolbutamida, clorpropamida, acetohexamida, tolazamida, glibenclamida y glipizida), tiazolidinodionas (rosiglitazona, pioglitazona), análogos de GLP-1, inhibidores de dipeptidil peptidasa-4 (DPP-4), formulaciones de bromocriptina, y secuestrantes de ácidos biliares (p. ej., colesevelam) e insulina (bolo y análogos basales), metformina (p. ej., hidrocloruro de metformina) con o sin una tiazolidinodiona (TZD) e inhibidores de SGLT-2. Los fármacos supresores del apetito también son bien conocidos y se pueden utilizare combinados con los métodos de la invención. Se pueden administrar terapias complementarias antes, al mismo tiempo o después de los métodos de la invención y usos de los mismos.

Los péptidos quiméricos de la invención se pueden formular en una dosis unitaria o en una forma de dosificación unitaria. En una realización concreta, el péptido quimérico está en una cantidad eficaz para tratar a un sujeto que necesita tratamiento, p. ej., debido a la hiperglucemia. Las dosis unitarias ilustrativas oscilan entre aproximadamente 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 o 2500-5000, 5000-25,000, 25.000-50.000 ng; de aproximadamente 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 o 2500-5000, 5000-25.000, 25.000-50.000 pg; y de aproximadamente 25-250, 250 500, 500-1000, 1000-2500 o 2500-5000, 5000-25.000, 25.000-50.000 mg.

Los péptidos quiméricos de la invención se pueden administrar para proporcionar el efecto deseado en forma de una dosis única o múltiples dosificaciones, por ejemplo, en una cantidad eficaz o suficiente. Las dosis ilustrativas oscilan entre aproximadamente 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 o 2500-5000, 5000-25.000, 25.000-50.000 pg/kg; de aproximadamente 50-500, 500-5000, 5000-25.000 o 25.000-50.000 ng/kg; y de aproximadamente 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 o 2500-5000, 5000-25.000, 25.000-50.000 pg/kg. Se pueden administrar dosis únicas o múltiples, por ejemplo, varias veces al día, en días consecutivos, días alternos, semanalmente o de forma intermitente (p. ej., dos veces por semana, una vez cada 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas, o una vez cada 2, 3, 4, 5 o 6 meses).

Los péptidos quiméricos de la invención se pueden administrar y los métodos se pueden poner en práctica mediante administración sistémica, regional o local, por cualquier vía. Por ejemplo, una secuencia peptídica se puede administrar por vía parenteral (p. ej., por vía subcutánea, intravenosa, intramuscular o intraperitoneal), por vía oral (p. ej., ingestión, bucal o sublingual), inhalación, intradérmica, intracavitaria, intracraneal, transdérmica (tópica), transmucosa o rectal. Los péptidos quiméricos de la invención y las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante un sistema de suministro (micro)encapsulado o empaquetar en un implante para su administración.

Un ejemplo concreto no limitante de administración parenteral (p. ej., subcutánea) implica el uso del sistema de administración subcutánea de Intarcia (Intarcia Therapeutics, Inc.; Hayward, CA). El sistema comprende una bomba osmótica en miniatura que suministra una cantidad constante de un agente terapéutico durante un período de tiempo deseado. Además de mantener los niveles de fármaco dentro de un intervalo terapéutico apropiado, el sistema se puede utilizar con formulaciones que mantienen la estabilidad de los agentes terapéuticos proteicos a la temperatura del cuerpo humano durante periodos de tiempo prolongados. El sistema subcutáneo está siendo evaluado para el suministro subcutáneo continuo de exenatida (comercializada como Byetta™) en una terapia de GLP-1 sin inyección una vez al año para el tratamiento de la diabetes tipo 2.

La invención proporciona adicionalmente "composiciones farmacéuticas", que incluyen un péptido o péptidos quiméricos de la invención, y uno o más diluyentes, portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables. En realizaciones concretas, los péptidos quiméricos están presentes en una cantidad terapéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas se pueden utilizar de acuerdo con la invención como se expone en la presente memoria. Así, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar ex vivo o in vivo a un sujeto con el fin de poner en práctica métodos de tratamiento y usos de la invención.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular para que sean compatibles con el método o vía de administración pretendidos; en la presente memoria se exponen rutas de administración ilustrativas. Además, las composiciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente otros agentes o compuestos terapéuticamente activos descritos en la presente memoria (p. ej., agentes reductores de glucosa) o conocidos por el experto en la técnica que se pueden utilizar en el tratamiento o prevención de diversas enfermedades y trastornos como se establece en la presente memoria.

Las composiciones farmacéuticas comprenden típicamente una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos uno de los péptidos quiméricos de la invención, incluidas subsecuencias, variantes y formas modificadas de las secuencias de péptidos ilustradas (secuencias enumeradas en la Tabla 1-9 y la Figura 1) y uno o más agentes de formulación farmacéuticamente y fisiológicamente aceptables. Los diluyentes, portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico y bisulfato de sodio), conservantes (p. ej., alcohol bencílico, metilparabenos, p-hidroxibenzoato de etilo o npropilo), agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes dispersantes, disolventes, cargas, agentes voluminizantes, tampones, vehículos, diluyentes y/o coadyuvantes. Por ejemplo, un vehículo adecuado puede ser una solución salina fisiológica o una solución salina tamponada con citrato, posiblemente complementada con otros materiales comunes en las composiciones farmacéuticas para administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina sérica son vehículos ilustrativos adicionales. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente una variedad de tampones que podrían utilizarse en las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación utilizadas en la invención. Los tampones típicos incluyen, pero sin limitación, ácidos débiles, bases débiles o mezclas de los mismos farmacéuticamente aceptables. Los componentes tamponadores también incluyen materiales solubles en agua tales como ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido acético, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido glutámico y sales de los mismos.

Un disolvente primario en un vehículo puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Adicionalmente, el vehículo puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la esterilidad o la estabilidad de la composición farmacéutica. En determinadas realizaciones, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un tampón acuoso. En otras realizaciones, un vehículo comprende, por ejemplo, cloruro de sodio y/o citrato de sodio.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener aún otros agentes de formulación farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener la velocidad de liberación de un péptido quimérico de la invención. Tales agentes de formulación incluyen aquellas sustancias conocidas por los expertos en la preparación de formulaciones de liberación sostenida. Para obtener más referencias relacionadas con los agentes de formulación farmacéutica y fisiológicamente aceptables, véanse, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa 18042) páginas 1435-1712, The Merck Index, 12a ed. (1996, Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ); y Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.). Se conocen en la técnica composiciones farmacéuticas adicionales apropiadas para su administración y son aplicables en los métodos y composiciones de la invención.

Una composición farmacéutica se puede almacenar en un vial estéril en forma de una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o polvo deshidratado o liofilizado. Tales composiciones se pueden almacenar en una forma lista para su uso, una forma liofilizada que requiere reconstitución antes de su uso, una forma líquida que requiere dilución antes de su uso u otra forma aceptable. En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica en un recipiente de un solo uso (p. ej., un vial, ampolla, jeringa o autoinyector de un solo uso (similar a, p. ej., un EpiPen®)), mientras que en otras realizaciones se proporciona un recipiente multiuso (p. ej., un vial de multiuso). Se puede utilizar cualquier aparato de suministro de fármacos para suministrar péptidos quiméricos de la invención, incluidos implantes (p. ej., bombas implantables) y sistemas de catéter, ambos conocidos por el experto en la técnica. Las inyecciones de depósito, que generalmente se administran por vía subcutánea o intramuscular, también se pueden utilizar para liberar péptidos quiméricos de la invención durante un período de tiempo definido. Las inyecciones de depósito suelen estar basadas en aceite o en sólido y generalmente comprenden al menos uno de los componentes de la formulación establecidos en la presente memoria. El experto en la técnica está familiarizado con las posibles formulaciones y usos de las inyecciones de depósito.

Se puede formular una composición farmacéutica para que sea compatible con su vía de administración prevista. Por tanto, las composiciones farmacéuticas incluyen portadores, diluyentes o excipientes adecuados para la administración por vías que incluyen la parenteral (p. ej., subcutánea (s.c.), intravenosa, intramuscular o intraperitoneal), intradérmica, oral (p. ej., ingestión), inhalación, intracavitaria, intracraneal y transdérmica (tópica).

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados descritos en la presente memoria o conocidos por el experto en la técnica. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Los diluyentes, disolventes y medios de dispersión aceptables que se pueden emplear incluyen agua, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS), etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. Además, se emplean convencionalmente aceites fijados estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite fijado suave incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Por otra parte, los ácidos grasos tales como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables. La absorción prolongada de determinadas formulaciones inyectables se puede lograr mediante la inclusión de un agente que retrase la absorción (p. ej., monoestearato de aluminio o gelatina).

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en una forma adecuada para uso oral, por ejemplo, en forma de comprimidos, cápsulas, trociscos, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes, soluciones, microcuentas o elixires. Las composiciones farmacéuticas destinadas a uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas. Tales composiciones pueden contener uno o más agentes tales como agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes para proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y agradables. Los comprimidos que contienen un péptido quimérico de la invención pueden estar mezclados con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes incluyen, por ejemplo, diluyentes, tales como carbonato cálcico, carbonato sódico, lactosa, fosfato cálcico o fosfato sódico; agentes de granulación y disgregación, por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo almidón, gelatina o goma arábiga, y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.

Los comprimidos, cápsulas y similares adecuados para la administración oral pueden no estar recubiertos o pueden recubrirse mediante técnicas conocidas para retrasar la disgregración y absorción en el tracto gastrointestinal y de ese modo proporcionar una acción sostenida durante un período más largo. Por ejemplo, se puede emplear un material de retardo temporal tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. También se pueden recubrir mediante mecanismos conocidos en la técnica para formar comprimidos terapéuticos osmóticos para liberación controlada. Los agentes adicionales incluyen partículas biodegradables o biocompatibles o una sustancia polimérica tal como poliésteres, ácidos poliamínicos, hidrogel, polivinilpirrolidona, polianhídridos, ácido poliglicólico, etilenoacetato de vinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, sulfato de protamina o copolímeros de lactida/glicólido, copolímeros de polilactida/glicólido, o copolímeros de etilenvinilacetato para controlar el suministro de una composición administrada. Por ejemplo, el agente oral se puede atrapar en microcápsulas preparadas mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, mediante el uso de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina o microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, o en un sistema de suministro de fármaco coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, microcuentas y sistemas basados en lípidos, que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Los expertos en la técnica conocen métodos para la preparación de tales formulaciones y están disponibles comercialmente.

Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse en forma de cápsulas de gelatina dura en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio, caolín o celulosa microcristalina, o en forma de cápsulas de gelatina blanda en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.

Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos mezclados con excipientes adecuados para su fabricación. Tales excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga; los agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfátido natural, por ejemplo lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietilensorbitán. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes.

Las suspensiones oleosas se pueden formular suspendiendo el ingrediente activo en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Se pueden añadir agentes edulcorantes tales como los expuestos anteriormente y agentes aromatizantes para proporcionar una preparación oral agradable.

Los polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el ingrediente activo mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes y los agentes de suspensión adecuados se ilustran en la presente memoria.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de oliva o aceite de cacahuete, o un aceite mineral, por ejemplo, parafina líquida, o mezclas de estos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas de origen natural, por ejemplo, goma arábiga o goma de tragacanto; fosfátidos de origen natural, por ejemplo, soja, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos; anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitán; y productos de condensación de ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitán.

Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir portadores para proteger la composición contra la rápida degradación o eliminación del organismo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, liposomas, hidrogeles, profármacos y sistemas de suministro microencapsulados. Por ejemplo, se puede emplear un material de retardo temporal tal como monoestearato de glicerilo o estearato de glicerilo solo o combinado con una cera. La absorción prolongada de composiciones farmacéuticas inyectables se puede lograr incluyendo un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares.

Los péptidos quiméricos de la invención también se pueden administrar en forma de supositorios para administración rectal. Los supositorios se pueden preparar mezclando un péptido quimérico de la invención con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperaturas normales pero líquido a la temperatura rectal y, por lo tanto, se derretirá en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales incluyen, pero no se limitan a, manteca de cacao y polietilenglicoles.

También se describen métodos para identificar un péptido (o una subsecuencia, variante o forma modificada como se expone en la presente memoria) que tiene actividad reductora de glucosa sin actividad sustancial de CHC. El método puede incluir: escrutar (p. ej., someter a ensayo o medir) una secuencia peptídica (o una subsecuencia, variante o forma modificada como se establece en la presente memoria) para determinar la actividad reductora de glucosa; y escrutar (p. ej., someter a ensayo o medir) una secuencia peptídica (o una subsecuencia, variante o forma modificada como se establece en la presente memoria) para determinar la actividad de CHC, o la expresión de un marcador que se correlaciona con la actividad de CHC. Un péptido que tiene actividad reductora de glucosa y actividad de CHC reducida o ausente identifica de ese modo el péptido. En aspectos concretos, el marcador que se correlaciona con la actividad de CHC comprende perfil de lípidos - un péptido que tiene menos actividad de aumento de lípidos en comparación con FGF19 indica que el péptido tiene actividad de CHC reducida o ausente; o el marcador que se correlaciona con la actividad de CHC comprende la expresión del gen de aldo-ceto reductasa - un péptido que regula por disminución o reduce la expresión del gen de aldo-ceto reductasa en comparación con FGF19 indica que el péptido tiene actividad de CHC reducida o ausente; o el marcador indicativo de la actividad de CHC comprende la expresión del gen Slcla2 - un péptido que regula por incremento o aumenta la expresión del gen Slcla2 en comparación con FGF19 indica que el péptido tiene una actividad de CHC reducida o ausente.

Los términos "someter a ensayo" y "medir" y variaciones gramaticales de los mismos se utilizan indistintamente en la presente memoria y se refieren a determinaciones cualitativas o cuantitativas, o determinaciones tanto cualitativas como cuantitativas. Cuando los términos se utilizan en referencia a la detección, se contempla cualquier medio de evaluar la cantidad relativa, incluidos los diversos métodos expuestos en la presente memoria y conocidos en la técnica. Por ejemplo, la expresión génica se puede someter a ensayo o medir mediante una transferencia Northern, una transferencia Western, un ensayo de inmunoprecipitación o midiendo la actividad, función o cantidad de la proteína expresada (p. ej., aldo-ceto reductasa o Slcla2).

Los factores de riesgo del CHC, el tipo más común de cáncer de hígado, incluyen la diabetes tipo 2 (probablemente agravada por la obesidad). El riesgo de CHC en los diabéticos tipo 2 es mayor (de ~2,5 a ~7 veces el riesgo de los no diabéticos) dependiendo de la duración de la diabetes y el protocolo de tratamiento.

Se pueden utilizar diversas metodologías en el escrutinio y diagnóstico de CHC y son bien conocidas por el experto en la técnica. Los indicadores de CHC incluyen la detección de un marcador tumoral, tal como niveles de alfafetoproteína (AFP) o des-gamma carboxiprotrombina (DCP) elevados. También resultan útiles una serie de técnicas de diagnóstico por imágenes y barrido diferentes, que incluyen ultrasonido, tomografías computarizadas y resonancias magnéticas. La evaluación de si un péptido (p. ej., un péptido candidato) muestra evidencia de inducir CHC se puede determinar in vivo por ejemplo, cuantificando la formación de nódulos de CHC en un modelo animal, tal como ratones db/db, a los que se les administró un péptido, en comparación con la formación de nódulos de CHC por FGF19 de tipo salvaje. Macroscópicamente, el cáncer de hígado puede ser nodular, en donde los nódulos tumorales (que son redondos a ovalados, de color gris o verde, bien circunscritos pero no encapsulados) aparecen como una masa grande o como múltiples masas más pequeñas. Alternativamente, el CHC puede presentarse como un tumor infiltrante que es difuso y mal circunscrito y que frecuentemente infiltra las venas porta.

La evaluación patológica de las muestras de tejido hepático se realiza generalmente después de que los resultados de una o más de las técnicas mencionadas anteriormente indiquen la probable presencia de CHC. Por tanto, los métodos de la invención pueden incluir adicionalmente la evaluación de una muestra de tejido hepático de un modelo animal in vivo, p. ej., un ratón db/db) útil en estudios de CHC con el fin de determinar si una secuencia peptídica muestra evidencia de inducir CHC. Mediante evaluación microscópica, un patólogo puede determinar si está presente uno de los cuatro tipos (patrones) arquitectónicos y citológicos generales de CHC (es decir, fibrolamelar, pseudoglandular (adenoide), pleomórfico (células gigantes) y células claras).

También se describen en la presente memoria la generación y el uso de anticuerpos, y fragmentos de los mismos, que se unen a los péptidos quiméricos de la invención, incluidas subsecuencias, variantes de secuencia y formas modificadas de las secuencias de péptidos ilustradas (incluidos los péptidos enumerados en la Tabla 1-9 y la Figura 1).

Como se emplea en la presente memoria, los términos "anticuerpos" (Ab) e "inmunoglobulinas" (Ig) se refieren a glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos exhiben especificidad de unión a un antígeno, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que pueden carecer de especificidad de antígeno.

El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de unión de anticuerpos que incluyen Fab y F(ab)'2, siempre que presenten la actividad biológica deseada. La unidad estructural del anticuerpo básico comprende un tetrámero, y cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. En contraste, la porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda, mientras que las cadenas pesadas humanas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgA e IgE, respectivamente. Los fragmentos de unión se producen mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv y anticuerpos de cadena sencilla.

Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variable y constante están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo la cadena pesada también una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Todas las cadenas de anticuerpos exhiben la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par están alineadas por las regiones marco, lo que permite la unión a un epítopo específico. Desde el N-terminal al C-terminal, tanto las cadenas ligeras como pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.

Un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión y, excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son iguales. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena ligera/pesada diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante una variedad de métodos que incluyen la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab'.

Como se emplea en la presente memoria, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos y se dirigen contra un único sitio antigénico. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante del antígeno.

Un "anticuerpo neutralizante" es una molécula de anticuerpo que puede eliminar o reducir significativamente una función efectora de un antígeno diana al que se une.

Los fragmentos de unión a anticuerpos se pueden producir mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. La digestión de anticuerpos con la enzima papaína da como resultado dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, también conocidos como fragmentos "Fab", y un fragmento "Fc" que no tiene actividad de unión a antígeno. La digestión de anticuerpos con la enzima pepsina produce un fragmento F(ab')2 en el que los dos brazos de la molécula de anticuerpo permanecen unidos y comprenden dos sitios de unión de antígeno. El fragmento F(ab')2 tiene la capacidad de entrecruzarse con el antígeno.

El término "Fab" se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada. El término "Fv", cuando se utiliza en la presente memoria, se refiere al fragmento mínimo de un anticuerpo que conserva tanto los sitios de reconocimiento de antígeno como de unión a antígeno. En una especie Fv de dos cadenas, esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación no covalente. En una especie Fv monocatenaria, un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera se pueden unir covalentemente mediante un conector peptídico flexible de modo que las cadenas ligeras y pesadas puedan asociarse en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno sobre la superficie del dímero VH-VL. Mientras que las seis CDR, colectivamente, confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno.

El término "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR" se refiere a partes de receptores inmunológicos que hacen contacto con un ligando específico y determinan su especificidad. El término "región hipervariable" se refiere a los restos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable generalmente comprende restos de aminoácido de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" y/o esos restos de un "bucle hipervariable".

Como se emplea en la presente memoria, el término "epítopo" se refiere a sitios de unión para anticuerpos en antígenos proteicos. Los determinantes epitópicos normalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, así como características estructurales tridimensionales y de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une a un antígeno cuando la constante de disociación es < 1 pM, preferiblemente < 100 nM y lo más preferiblemente < 10 nM. Una constante de equilibrio aumentada ("K^d") significa que hay menos afinidad entre el epítopo y el anticuerpo, mientras que una constante de equilibrio disminuida significa que hay una mayor afinidad entre el epítopo y el anticuerpo. Un anticuerpo con una K^dde "no más de" una cierta cantidad significa que el anticuerpo se unirá al epítopo con la K^ddada o con más fuerza. Considerando que la K^ddescribe las características de unión de un epítopo y un anticuerpo, "potencia" describe la eficacia del propio anticuerpo para una función del anticuerpo. No existe necesariamente una correlación entre una constante de equilibrio y una potencia; así, por ejemplo, una K^drelativamente baja no significa automáticamente una alta potencia.

El término "se une selectivamente" en referencia a un anticuerpo no significa que el anticuerpo solo se una a una sola sustancia, sino que la K^ddel anticuerpo para una primera sustancia es menor que la K^ddel anticuerpo para una segunda sustancia. Un anticuerpo que se une exclusivamente a un epítopo solo se une a ese único epítopo.

Cuando se administran a seres humanos, los anticuerpos que contienen regiones variables y/o constantes de roedor (murino o rata) a veces se asocian, por ejemplo, con un rápido aclaramiento del organismo o la generación de una respuesta inmunitaria por parte del organismo contra el anticuerpo. Para evitar la utilización de anticuerpos derivados de roedores, se pueden generar anticuerpos completamente humanos mediante la introducción de la función del anticuerpo humano en un roedor, de modo que el roedor produzca anticuerpos completamente humanos. A menos que se identifique específicamente en la presente memoria, los anticuerpos "humanos" y "completamente humanos" se pueden utilizar de manera indistinta en la presente memoria. El término "completamente humano" puede ser útil para distinguir anticuerpos que son solo parcialmente humanos de los que son completa o totalmente humanos. El experto en la técnica conoce varios métodos para generar anticuerpos completamente humanos.

Para abordar posibles respuestas de anti-anticuerpos de ratón humanos, se pueden utilizar anticuerpos quiméricos o humanizados de otro modo. Los anticuerpos quiméricos tienen una región constante humana y una región variable murina y, como tales, pueden observarse respuestas anti-anticuerpos quiméricos humanos en algunos pacientes. Por tanto, resulta ventajoso proporcionar anticuerpos completamente humanos contra enzimas multiméricas para evitar posibles respuestas de anti-anticuerpos de ratón humanos o anti-anticuerpos quiméricos humanos.

Se pueden preparar anticuerpos monoclonales completamente humanos, por ejemplo, mediante la generación de líneas de células de hibridoma mediante mecanismos conocidas por el experto en la técnica. Otros métodos de preparación implican el uso de secuencias que codifican anticuerpos concretos para la transformación de una célula anfitriona de mamífero adecuada, tal como una célula CHO. La transformación se puede realizar mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula anfitriona, incluyendo, por ejemplo, empaquetamiento del polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y transducción de una célula anfitriona con el virus (o vector) o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica. Los métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamíferos son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del polinucleótido o polinucleótidos en liposomas y microinyección directa de los ADN en núcleos. Las líneas de células de mamífero disponibles como anfitriones para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, células CHO, células HeLa y células de carcinoma hepatocelular humano.

Los anticuerpos se pueden utilizar de forma diagnóstica y/o terapéutica. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden utilizar como diagnóstico detectando el nivel de uno o más péptidos quiméricos de la invención en un sujeto, y comparando el nivel detectado con el nivel de control convencional o con un nivel basal en un sujeto determinado previamente (p. ej., antes de cualquier enfermedad). Los anticuerpos se pueden utilizar como un agente terapéutico para modular la actividad de uno o más péptidos quiméricos de la invención, teniendo de ese modo un efecto sobre una afección o trastorno.

También se describen kits que incluyen, pero no se limitan a, péptidos quiméricos de la invención, opcionalmente combinados con uno o más agentes terapéuticos, composiciones y composiciones farmacéuticas de los mismos, empaquetados en un material de empaquetamiento adecuado. Un kit incluye opcionalmente una etiqueta o prospecto que incluye una descripción de los componentes o instrucciones de uso in vitro, in vivo, o ex vivo, de los componentes que contiene. Las instrucciones ilustrativas incluyen instrucciones para reducir o disminuir la glucosa en sangre, el tratamiento de la hiperglucemia, el tratamiento de la diabetes, etc.

Un kit puede contener una colección de tales componentes, p. ej., dos o más secuencias de péptidos solas, o una combinación de una secuencia peptídica con otra composición terapéuticamente útil (p. ej., un fármaco antidiabético, tal como un compuesto de gastrina).

El término "material de empaquetamiento" se refiere a una estructura física que aloja los componentes del kit. El material de empaquetamiento puede mantener los componentes de forma estéril y puede estar preparado a partir de material comúnmente utilizado para tales fines (p. ej., papel, fibra ondulada, vidrio, plástico, láminas, ampollas, viales, tubos, etc.).

Los kits pueden incluir etiquetas o prospectos. Las etiquetas o prospectos incluyen "material impreso", p. ej., papel o cartón, separado o adherido a un componente, un kit o material de embalaje (p. ej., una caja) o fijado, por ejemplo, a una ampolla, tubo o vial que contiene un componente del kit. Las etiquetas o prospectos pueden incluir adicionalmente un medio legible por ordenador, tal como un disco (p. ej., disco duro, tarjeta, disco de memoria), disco óptico tal como CD o DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, cinta magnética o un medio de almacenamiento eléctrico tal como RAM y ROM o híbridos de estos tales como medios de almacenamiento magnético/óptico, medios FLASH o tarjetas de tipo de memoria.

Las etiquetas o prospectos pueden incluir información de identificación de uno o más componentes, cantidades de dosis, farmacología clínica del ingrediente o ingredientes activos, incluido el mecanismo de acción, la farmacocinética y la farmacodinamia. Las etiquetas o prospectos pueden incluir información identificativa con información del fabricante, números de lote, localización del fabricante y fecha.

Las etiquetas o prospectos pueden incluir información sobre una afección, trastorno, enfermedad o síntoma para el que se puede utilizar un componente del kit. Las etiquetas o prospectos pueden incluir instrucciones para el médico o para un sujeto sobre el uso de uno o más de los componentes del kit en un método, protocolo de tratamiento o régimen terapéutico. Las instrucciones pueden incluir cantidades, frecuencia o duración de la dosificación, e instrucciones para practicar cualquiera de los métodos, protocolos de tratamiento o regímenes terapéuticos establecidos en la presente memoria. Las instrucciones ilustrativas incluyen instrucciones para el tratamiento o uso de una secuencia peptídica como se establece en la presente memoria. Por lo tanto, los kits pueden incluir adicionalmente etiquetas o instrucciones para poner en práctica cualquiera de los métodos y usos de la invención descritos en la presente memoria, incluidos los métodos de tratamiento y usos.

Las etiquetas o prospectos pueden incluir información sobre cualquier beneficio que pueda proporcionar un componente, tal como un beneficio profiláctico o terapéutico. Las etiquetas o prospectos pueden incluir información sobre posibles efectos secundarios adversos, tales como advertencias al sujeto o al médico sobre situaciones en donde no sería apropiado utilizar una composición en particular. Los efectos secundarios adversos también se podrían producir cuando el sujeto tiene, estará o está tomando actualmente uno o más medicamentos que pueden ser incompatibles con la composición, o el sujeto tiene, estará o está actualmente en otro protocolo de tratamiento o régimen terapéutico que sería incompatible con la composición y, por tanto, las instrucciones podrían incluir información referente a tales incompatibilidades.

Los kits pueden incluir adicionalmente otros componentes. Cada componente del kit puede incluirse dentro de un recipiente individual y todos los diversos recipientes pueden estar dentro de un solo paquete. Los kits pueden diseñarse para almacenamiento en frío. Los kits pueden diseñarse adicionalmente para contener secuencias de péptidos de la invención, o contener ácidos nucleicos que codifican secuencias de péptidos. Las células del kit se pueden mantener en condiciones de almacenamiento adecuadas hasta que estén listas para su uso.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de la invención, en la presente memoria se describen métodos y materiales adecuados.

En caso de conflicto, prevalecerá la memoria descriptiva, incluidas las definiciones. Como se emplea en la presente memoria, las formas singulares "un", “uno”, “una”, y "el" y "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una secuencia peptídica" o un "tratamiento" incluye una pluralidad de tales secuencias, tratamientos, etc.

Como se emplea en la presente memoria, los valores numéricos a menudo se presentan en un formato de intervalo a lo largo de todo este documento. El uso de un formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad y no se debe interpretar como una limitación inflexible del alcance de la invención a menos que el contexto indique claramente lo contrario. En consecuencia, el uso de un intervalo incluye expresamente todos los subintervalos posibles, todos los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo y todos los valores numéricos o intervalos numéricos, incluidos los números enteros dentro de tales intervalos y fracciones de los valores o los números enteros dentro de los intervalos a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Esta construcción se aplica independientemente de la amplitud del intervalo y en todos los contextos a lo largo de este documento de patente. Así, por ejemplo, la referencia a un intervalo de 90-100% incluye 91 -99%, 92-98%, 93-95%, 91 -98%, 91 -97%, 91 -96%, 91-95%, 91-94%, 91-93% y así sucesivamente. La referencia a un intervalo de 90-100% también incluye 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, etc., así como 91,1%, 91,2%, 91,3%, 91,4%, 91,5%, etc., 92,1%, 92,2%, 92,3%, 92,4%, 92,5%, etc., y así sucesivamente.

Además, la referencia a un intervalo de 1 -3, 3-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150-160, 160-170, 170-180, 180-190, 190-200, 200-225, 225-250 incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc. En un ejemplo adicional, la referencia a un intervalo de 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 o 2500-5000, 5000-25.000, 5000-50.000 incluye cualquier valor numérico o intervalo dentro o que abarque tales valores, p. ej., 25, 26, 27, 28, 29...250, 251, 252, 253, 254.... 500, 501,502, 503, 504..., etc.

Como también se emplea en la presente memoria, se describen una serie de intervalos a lo largo de este documento. El uso de una serie de intervalos incluye combinaciones de los intervalos superior e inferior para proporcionar otro intervalo. Esta construcción se aplica independientemente de la amplitud del intervalo y en todos los contextos a lo largo de este documento de patente. Así, por ejemplo, la referencia a una serie de intervalos tales como 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-75, 75-100, 100-150, incluye intervalos tales como 5 -20, 5-30, 5-40, 5-50, 5-75, 5-100, 5-150 y 10-30, 10-40, 10-50, 10-75, 10-100, 10-150 y 20-40, 20-50, 20-75, 20-100, 20-150, etc.

Por razones de concisión, en la presente memoria se utilizan determinadas abreviaturas. Un ejemplo es la abreviatura de una sola letra para representar restos de aminoácido. Los aminoácidos y sus correspondientes abreviaturas de tres letras y de una sola letra son los siguientes:

alanina Ala (A)

arginina Arg (R)

asparragina Asn (N)

ácido aspártico Asp (D)

cisteína Cys (C)

ácido glutámico Glu (E)

glutamina Gln (Q)

glicina Gly (G)

histidina His (H)

isoleucina Ile (I)

leucina Leu (L)

lisina Lys (K)

metionina Met (M)

fenilalanina Phe (F)

prolina Pro (P)

serina Ser (S)

treonina Thr (T)

triptófano Trp (W)

tirosina Tyr (Y)

valina Val (V)

La invención se describe en general en la presente memoria utilizando un lenguaje afirmativo para describir las numerosas realizaciones. La invención también incluye específicamente realizaciones en las que se excluye un tema concreto, total o parcialmente, tales como sustancias o materiales, etapas y condiciones del método, protocolos, procedimientos, ensayos o análisis. Por tanto, aunque la invención generalmente no se expresa en la presente memoria en términos de lo que la invención no incluye, los aspectos que no están expresamente incluidos en la invención se describen en la presente memoria.

Por consiguiente, se pretende que los siguientes ejemplos ilustren pero no limiten el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1

La siguiente es una descripción de varios métodos y materiales utilizados en los estudios de la presente memoria.

Animales. Se adquirieron ratones db/db en The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), los ratones se mantuvieron de acuerdo con las pautas de bienestar bajo luz controlada (ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, oscuridad de 6:30 pm a 6:30 am), temperatura (22± 4°C) y condiciones de humedad (50% ± 20%). Tenían libre acceso al agua (agua destilada esterilizada en autoclave) y fueron alimentados ad libitum con una dieta comercial (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, Irradiated 2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet) que contenía 17 kcal% de grasa, 23 kcal% de proteína y 60 kcal% de carbohidrato. Para la obesidad inducida por la dieta, los ratones C57BL6/J (Jackson Laboratory) se mantuvieron con una dieta alta en grasas (D12492, Research Diet, New Brunswick, NJ. EE. UU.) Que contenía 60 kcal% de grasa, 20 kcal% de proteína y 20 kcal% de carbohidrato durante 16-20 semanas. Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de NGM.

Secuencias de ADN y aminoácidos. ADNc de ORF que codifica de variantes FGF19 humano (FGF19 de Homo sapiens, Núm. de Acceso GenBank NM_005117.2). Secuencia de proteínas codificada por el ADNc (Núm. de Acceso GenBank NP_005108.1)

PCR. El ORF de FGF19 se amplificó con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando ADN recombinante (ADNc) preparado a partir de tejido del intestino delgado humano. Los kits de reactivos de PCR con ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion se adquirieron en New England BioLabs (F-530L, Ipswich, MA). Se utilizaron los siguientes cebadores: cebador de PCR directo:

5' CCGACTAGTCACCatgcggagcgggtgtgtgg (SEQ ID NO: 136)

y cebador de PCR inverso:

5' ATAAGAATGCGGCCGCTTACTTCTCAAAGCTGGGACTCCTC (SEQ ID NO: 137).

El fragmento de ADN amplificado se digirió con las enzimas de restricción Spe I y Not I (los sitios de restricción se incluyeron en los cebadores de PCR 5' o 3', respectivamente) y a continuación se ligó con vectores transgénicos de AAV que habían sido digeridos con las mismas enzimas de restricción. El vector utilizado para la expresión contenía un marcador seleccionable y un casete de expresión compuesto por un promotor eucariótico fuerte 5' de un sitio para la inserción de la secuencia codificante clonada, seguido de una región no traducida 3' y una cola de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina. La construcción de expresión también está flanqueada por repeticiones terminales internas en los extremos 5' y 3'.

Producción y purificación de AAV. Se cultivaron células AAV293 (obtenidas de Agilent Technologies, Santa Clara, CA) en Modificación de Dulbeco del Medio de Eagle (DMEM, Mediatech, Inc. Manassas, VA) con un suplemento de suero bovino fetal al 10% y 1x solución de antibiótico-antimicótico (Mediatech, Inc. Manassas, VA). Las células se sembraron a una densidad de 50% el día 1 en placas de cultivo celular de 150 mm y se transfectaron el día 2, utilizando el método de precipitación con fosfato cálcico con los siguientes 3 plásmidos (20 gg/placa de cada uno): plásmido transgénico a Av , plásmidos pHelper (Agilent Technologies) y plásmido AAV2/9 (Gao et al., J. Virol. 78:6381 (2004)). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se rasparon de las placas, se sedimentaron mediante centrifugación a 3000xg y se resuspendieron en tampón que contenía Tris 20 mM de pH 8,5, NaCl 100 mM y MgCl21 mM. La suspensión se congeló en un baño de hielo seco con alcohol y a continuación se descongeló en un baño de agua a 37°C. Los ciclos de congelación y descongelación se repitieron tres veces; se añadió Benzonase® (Sigmaaldrich, St. Louis, MO) a 50 unidades/ml; se añadió desoxicolato hasta una concentración final de 0,25%. Después de una incubación a 37°C durante 30 min, los desechos celulares se sedimentaron mediante centrifugación a 5000 x g durante 20 min. Las partículas virales en el sobrenadante se purificaron utilizando un gradiente de yodixanal discontinuado (Sigma-aldrich, St. Louis, MO) como se describió anteriormente (Zolotukhin S. et al. (1999) Gene Ther.

6:973). La reserva viral se concentró utilizando Vivaspin Benzonase® 20 (PM de corte 100.000 Dalton, Sartorius Stedim Biotech, Aubagne, Francia) y se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con glicerol al 10% y se almacenó a -80°C. Para determinar el número de copias del genoma viral, se incubaron 2 gl de reserva viral en 6 gl de solución que contenía 50 unidades/ml de Benzonase®, Tris-HCl 50 mM de pH 7,5, MgCl2 10 mM y CaCl2 10 mM a 37°C durante 30 minutos.

Posteriormente, se añadieron 15 gl de la solución que contenía 2 mg/ml de Proteinasa K, SDS al 0,5% y EDTA 25 mM y la mezcla se incubó durante 20 min más a 55°C para liberar el ADN viral. El ADN viral se limpió con el kit mini DNeasy® (Qiagen, Valencia, CA) y se eluyó con 40 gl de agua. La copia del genoma viral (CG) se determinó mediante PCR cuantitativa.

La reserva viral se diluyó con PBS hasta la CG/ml deseable. Se suministró una solución viral de trabajo (200 gl) a ratones mediante inyección en la vena de la cola.

Ensayo de glucosa en sangre. La glucosa en sangre en el corte de la cola del ratón se midió utilizando tiras reactivas ACCU-CHEK Active leídas por el medidor ACCU-CHEK Active (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ensayo de perfil lipídico. La sangre completa de los cortes de la cola de ratón se recogió en tubos capilares simples (BD Clay Adams SurePrep™, Becton Dickenson y Co. Sparks, MD). El suero y las células sanguíneas se separaron centrifugando los tubos en un Autocrit™ Ultra 3 (Becton Dickinson and Co. Sparks, MD). Las muestras de suero se analizaron para determinar el perfil de lípidos (triglicéridos, colesterol total, HDL y no HDL) utilizando el Analizador Clínico Integra™ 400 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ensayo de nivel de exposición de FGF19/FGF21/variantes en suero. Se recogió sangre completa (aproximadamente 50 gl/ratón) de cortes de cola de ratón en tubos capilares simples (BD Clay Adams SurePrep, Becton Dickenson y Co. Sparks, MD). El suero y las células sanguíneas se separaron centrifugando los tubos en un Autocrit™ Ultra 3 (Becton Dickinson and Co. Sparks, MD). Los niveles de exposición de FGF19, FGF21 y variantes en suero se determinaron utilizando kits de EIA (Biovendor) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ensayo de carcinoma hepatocelular (CHC). Se recogió una muestra de hígado de ratones db/db 6 meses después de la inyección de AAV. La puntuación de CHC se registró como el número de nódulos de CHC en la superficie de todo el hígado de ratones a los que se habían inyectado variantes dividido por el número de nódulos de CHC de los ratones a los que se había inyectado FGF19 de tipo salvaje.

Ensayo de expresión génica hepática. La muestra de hígado se recogió y homogeneizó en reactivo TRIzol® (Invitrogen). El ARN total se extrajo siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN se trató con DNasa (Ambion) seguido de un análisis de RT-PCR cuantitativo utilizando cebadores TaqMan® y reactivos de Applied Biosystems. Se calcularon los niveles relativos de ARNm de aldo-ceto reductasa y slc1a2 en el hígado utilizando el método AACt.

Ensayos de unión y actividad de FGFR4. El ensayo de fosforilación de ERK y ELISA en fase sólida (unión) se puede realizar utilizando proteínas recombinantes purificadas. El ensayo de unión de FGFR se puede realizar utilizando ELISA en fase sólida. En resumen, una placa de 96 pocillos se puede recubrir con 2 pg/ml de anticuerpo anti-hFc y se puede incubar con 1 pg/ml de FGFR1 -hFc o FGFR4-hFc. La unión a variantes de FGF19 en presencia de 1 pg/ml de p-klotho soluble y 20 pg/ml de heparina se puede detectar mediante anticuerpos anti-FGF19 biotinilados (0,2 pg/ml), seguido de incubación con estreptavidina-HRP (100 ng/ml). Para el ensayo de activación de FGFR4, las células Hep3B se pueden estimular con variantes de FGF19 durante 10 minutos a 37°C, a continuación se pueden lisar inmediatamente y analizar la fosforilación de ERK utilizando un kit asequible comercialmente de Cis-Bio.

Ejemplo 2

La siguiente es una descripción de estudios que muestran la actividad reductora de glucosa de diversas variantes de secuencia de FGF19 y FGF21, y construcciones de fusión de FGF19/FGF21.

La Figura 2 ilustra construcciones de fusión de FGF19/FGF21 ilustrativas, y los segmentos de cada uno de FGF19 y FGF21 presentes en los péptidos de fusión. Estos péptidos se analizaron para determinar la actividad reductora de glucosa y la actividad elevadora o creciente de lípidos estadísticamente significativa (Tabla 1-9 y Figura 1).

A ratones (db/db) se les inyectaron el vector viral que expresaba FGF19, FGF21 o variantes, y se analizaron después de la inyección. La actividad reductora de glucosa de cada secuencia está representada por un símbolo "+" (un símbolo "-" significa que no hay actividad reductora de glucosa, un símbolo "+/-" significa que las variantes conservan una actividad reductora de glucosa mínima); la actividad de elevación de lípidos está representada por un símbolo "+" (un símbolo "-" significa que no hay actividad de elevación de lípidos, un símbolo "+/-" significa que las variantes retienen una actividad mínima de elevación de lípidos, Figura 2).

Dos fusiones de FGF21 y FGF19, indicadas como variante M5 y variante 45 (M45), exhibieron actividad reductora de glucosa y una ausencia de actividad elevadora o creciente de lípidos estadísticamente significativa. Las variantes indicadas M1, M2 y M69, respectivamente (Figura 1, también exhibieron actividad reductora de glucosa (Figuras 3B y 3C, Tabla 5). Los datos que comparan la actividad reductora de glucosa M5, M1, M2 y M69 y la actividad elevadora o creciente de lípidos con FGF19 y FGF21 se ilustran en las Figuras 3A-3C y 4A-4C.

Ejemplo 3

La siguiente es una descripción de estudios que muestran que las variantes M5, M1, M2 y M69 no son tumorigénicas, según lo determinado por la formación de CHC, y que las variantes M5, M2 y M69 tampoco reducen la masa muscular magra y la grasa.

A animales (db/db) se les inyectaron vectores AAV que expresaban FGF19, FGF21, M5, M1, M2 o M69, o se les inyectó solución salina, y se analizaron 6 meses después de la inyección. Los datos indican que las variantes M5, M1, M2 y M69 no indujeron la formación de (CHC) de manera significativa (Figuras 5A-5C).

A animales (ratones db/db) también se les inyectó vector viral que expresa FGF19, FGF21, M5, M1, M2 o M69, o se les inyectó solución salina, y se analizaron 6 meses después de la inyección para determinar el efecto sobre la masa magra y la masa grasa. Los datos indican que los péptidos M5, M2 y M69 no causaron una reducción estadísticamente significativa en la masa magra o masa grasa, en contraste con FGF21, y que el péptido M1 reduce la masa magra (Figuras 6A-6C).

Ejemplo 4

El siguiente es un resumen de datos de 25 péptidos variantes adicionales analizados para determinar la actividad de elevación de lípidos y la tumorigénesis. Los datos muestran claramente una correlación positiva entre la elevación de lípidos y la tumorigénesis, según lo determinado por la formación de CHC en ratones db/db.

Las Tablas 1 a 3 resumen los datos de 26 péptidos variantes diferentes. Tales péptidos variantes ilustrados tienen la secuencia C-terminal de FGF19:

PHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGL LQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPE EPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLAVRSPSFEK (SEQ ID NO: 188) en la porción C-terminal, p. ej., después de los restos de aminoácido "TSG". En particular, los péptidos variantes (7 en total, incluido M5) que no causaron una elevación estadísticamente significativa de lípidos no indujeron la formación de CHC. En contraste, todos los péptidos variantes (17 en total) que causaron una elevación estadísticamente significativa de lípidos también causaron la formación de CHC en ratones. Estos datos indican que existe una fuerte correlación positiva entre la actividad de elevación de lípidos y la formación de CHC. Por consiguiente, la actividad de elevación de lípidos se puede utilizar como indicador y/o predictor de la formación de CHC en animales.

Tabla 1: Triglicéridos y Colesterol Elevados en Ratones db/db Parecen Correlacionarse Positivamente con la Formación de CHC (véanse SEQ ID NO: 99, 5 y 74 a 81)

Dominio N-terminal S E Q II) N O. Núcleo S E Q Eleva Forma

ID ción ción

N O . Lipidos CHC

FGF19 R PLA FSD A G PirV H Y C iW G D IM 99 (aa 1-20) RLR11LYTSG 185

Tabla 2: Triglicéridos y Colesterol Elevados en Ratones db/db Parecen Correlacionarse Positivamente con la Formación de CHC (véanse SEQ ID NO: 99, 100 y 82 a 98)

Dominio N-terminal SEQ ID NO. Núcleo SEQ ID Elevación Forma-NO. Lipidos ción , ------------------A ----------------- s CHC FGF19 RPLAFSDAGPHVHYGWGDPI 99 (aa 1-20) RLRIILYTSG 185 FGF21 HPIPDSSPLLQ--FGGQV 100 (aa 1-16) RQRYI.YTDD 186 - -M82 RPLAFSAAGPHVHYGWGDPI 82 (aa 1-20) RLRIILYTSG 185 M83 RPLAFSDAAPHVHYGWGDPI 83 (aa 1-20) RLRIILYTSG 185 /- / M84 R PLAFS DAGAHVH YGWG DPI 84 (aa 1-20) RLRIILYTSG 185 /- / M85 RPLAFSDAGPHVHYGAGDPI 85 (aa 1-20) RLRIILYTSG 185 - -MK6 RPLAFSDAGPHVHYGWGAPI 86 (aa 1-20) RLRIILYTSG 185

M87 RPLAFSDAGPHVHYGWGDAT 87 (aa 1-20) RLRIILYTSG 185 Tabla 3: T rig licé rid o s y C o les te ro l E le vad os en R a to ne s d b /d b P are cen C o rre la c io n a rse P o s itiva m e n te con la F o rm ac ión de C H C (vé a n se S E Q ID NO : 99, 100 y 88 a 98)

M88 (H31A/S141 A):

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPAGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKN RGFLPLAHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID

NO:88)

M89 (H31A/H142A):

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPAGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKN RGFLPLSAFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID

NO:89)

M90 (K127A/R129A):

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAAQAQLYKN RGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID

NO:90)

M91 (K127A/S141 A):

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAAQRQLYKN RGFLPLAHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID

NO:91)

M92 (K127A/H142A):

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAAQRQLYKN RGFLPLSAFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ

ID NO:92)

M93 (R129A/S141 A):

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQAQLYKN RGFLPLAHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID

NO:93)

M94 (S141A/H142A):

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKN RGFLPLAAFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID

NO: 94)

M95 (K127A/H142A):

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAAQRQLYKN RGFLPLSAFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID

NO:95)

M96 (K127A/R129A/S141 A):

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAAQAQLYKN RGFLPLAHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID

NO:96)

M97 (K127A/R129A/H142A):

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAAQAQLYKN RGFLPLSAFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ

ID NO:97)

M98 (K127A/R129A/S141A/H142A):

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAAQAQLYKN RGFLPLAAFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID

NO:98)

Ejemplo 5

El siguiente es un resumen de datos de péptidos variantes de FGF19 adicionales analizados para determinar la actividad reductora de glucosa y la actividad elevadora de lípidos.

La Tabla 4 ilustra las "secuencias núcleo" de péptidos de 35 variantes de FGF19 adicionales, denominadas M5 a M40. Tales péptidos variantes ilustrados tienen la secuencia C-terminal de FGF19, PHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGL LQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPE EPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLAVRSPSFEK (SEQ ID NO: 188) en la porción C-terminal, p. ej., después de los restos de aminoácido "TSG" de la secuencia núcleo. Los datos muestran claramente que las variantes M6, M7, M8, mM38 y M39 tienen las características deseadas de actividad reductora de glucosa y no tienen actividad elevadora de lípidos estadísticamente significativa en ratones db/db.

Tabla 4: V a ria n te s ad ic io n a le s y m ap eo fino de l d o m in io N -te rm ina l (véa nse S E Q ID NO : 99, 100 y 5 a 40) Dominio N-terminal SEQ ID NO del Núcleo SEQ Reducción de Elevación de dominio N- ID NO. Glucosa Lípidos terminal

FGF19 RPLAFSDAGPHVHYGWGDPI 99 (aa 1-20) RLRHLYTSG 185 FGF21 -HPIPDSSPLLQ--FGGQV 100 (aa 1-16) RQRYLYTDD 186 -M5 RHPIPDSSPLLQ--FGGQV 5 (aa 1-17) RLRHLYTSG 185 -M6 R----DSSPLLQ--FGGQV 6 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 -M7 RPLAFSDSSPLLQ--FGGQV 7 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 -M8 R-HPIPDSSPLLQ--WGDPI 8 (aa 1-17) RLRHLYTSG 185 -M9 R-HPIPDSSPLLQFGWGDPI 9 (aa 1-19) RLRHLYTSG 185 M10 R-HPIPDSSPHVHYGWGDPI 10 (aa 1-19) RLRHLYTSG 185 - M11 RPLAFSDAGPLLQ--WGDPI 11 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 N/D N/D M12 RPLAFSDAGPLLQFGWGDPI 12 (aa 1-20) RLRHLYTSG 185 - M13 RPLAFSDAGPLLQ--FGGQV 13 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 - -M14 R-HPIPDSSPHVHYG--GQV 14 (aa 1-17) RLRHLYTSG 185 - -M15 RPLAFSDAGPHVHYG--GQV 15 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 M16 RPLAFSDAGPHVH--WGDPI 16 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 N/D N/D M17 RPLAFSDAGPHV--GWGDPI 17 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 N/D N/D M18 RPLAFSDAGPH--YGWGDPI 18 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 N/D N/D M19 RPLAFSDAGP-V-YGWGDPI 19 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 N/D N/D M20 RPLAFSDAGP-VH-GWGDPI 20 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 N/D N/D M21 RPLAFSDAGP-VHY-WGDPI 21 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 N/D N/D M22 RPLAFSDAGPHVH-GWGDPI 22 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 N/D N/D M23 RPLAFSDAGPH-H-GWGDPI 23 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 N/D N/D M24 RPLAFSDAGPH-HY-WGDPI 24 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 N/D N/D M25 RPLAFSDAGPHV-Y-WGDPI 25 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 N/D N/D M26 RPLAFSDSSPLVH--WGDPI 26 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 N/D N/D M27 RPLAFSDSSPHVH--WGDPI 27 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 N/D N/D M28 RPLAFSDAPHV----WGDPI 28 (aa 1-16) RLRHLYTSG 185 N/D N/D M29 RPLAFSDAGPHVHY-WGDPI 29 (aa 1-19) RLRHLYTSG 185 N/D N/D Dominio N-terminal SEQ ID NO del Núcleo SEQ Reducción de Elevación de dominio N- ID NO. Glucosa Lípidos terminal

M30 RPLAFSDAGPHVHYAWGDPI 30 (aa 1-20) RLRHLYTSG 185 N/D N/D M31 R-HPIPDSSPLLQ--FGAQV 31 (aa 1-17) RLRHLYTSG 185 /- -M32 R-HPIPDSSPLLQ--FGIYQV 32 (aa 1-18) RLRHLYTSG 185 - -M33 R-HPIPDSSPLLQ--FGGQV 33 (aa 1-17) RLRHLYTSG 185 - -M34 R-HPIPDSSPLLQ--FGGAV 34 (aa 1-17) RLRHLYTSG 185 /- -M35 R-HPIPDSSPLLQ--FGGEV 35 (aa 1-17) RLRHLYTSG 185 /- / M36 R-HPIPDSSPLLQ--FGGQV 36 (aa 1-17) RLRHLYTSG 185 /- -M37 R-HPIPDSSPLLQ--FGGUA 37 (aa 1-17) RLRHLYTSG 185 - -M38 R-HPIPDSSPLLQ--FGGQT 38 (aa 1-17) RLRHLYTSG 185 -M39 R-HPIPDSSPLLQ--FGGQT 39 (aa 1-17) RLRHLYTSG 185 -M40 R-HPIPDSSPLLQFGWGQP 40 (aa 1-16) RLRHLYTSG 185 -

Tabla 4a: (véanse SEQ ID NO: 99, 100, 5, 9, 8, 12, 10, 13, 15, 14, 43, 6 y 7)

Tabla 4b: (véa nse S E Q ID NO : 99, 5 y 31 a 40)

Tabla 4c: (véanse SEQ ID NO: 99, 100, 5, 52, 54 a 68, 4, 69, 70 y 53)

La Tabla 5 ilustra las secuencias de péptidos de 3 variantes de FGF19, denominadas M1, M2 y M69. Los datos muestran claramente que estas tres variantes tienen las características deseadas de actividad reductora de glucosa en ratones db/db. Estas tres variantes parecen elevar los lípidos en ratones db/db.

Tabla 5: Variantes adicionales (SEQ ID NO: 1,2 y 69)

MI:

RPLAFSDASPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VAI RTVAIKGVHSVRYECMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSI, SSAKQRQLYKNRGFLPLSFIFLPVILPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLE AVRSPSFEK (SEQ ID NO:1 o 139)

M2:

RPLAFSDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGOSAHSLLEIKAV ALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK (SEQ ID NO:2 o 140)

M 69 :

RDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLE1KAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQ RQEYKNRGFLPESHFI.PMEPMVPEEPEDI.RGFII.ESDMFSSPLETDSMDPFGEVTGEEAVRSP SFEK (SEQ ID NO:69)

Ejemplo 6

El siguiente es un resumen de datos que muestra que FGF19 reduce el peso corporal en ratones con obesidad inducida por la dieta y en ratones ob/ob, y la actividad de formación de tumores hepáticos y el peso corporal en ratones db/db.

A los ratones se les inyectó FGF19 o FGF21 en el vector AAV. El peso corporal se registró 4 semanas después de la inyección.

Tabla 6: FGF19 reduce el peso corporal en ratones con obesidad inducida por dieta y en ratones ob/ob (secuencias correspondientes a aa 1-29 de SEQ ID NO: 99 y aa 1-25 de SEQ ID NO: 100, respectivamente)

Disminución Peso Disminución Peso Dominio N-terminal Corporal en OID Corporal en Ob/ob .................... ,....................... Núcleo

FGF19 RPLAFSDAGPHVHYGWGDPI RLRHLYTSG +

rCFCl HPIPDS3PLLQ— FGGfcV FQRYLYTPD t

Tabla 7: Correlación de peso corporal y formación de tumor hepático de FGF19, FGF21 y variantes seleccionadas en ratones db/db (véanse, p. ej., SEQ ID NO: 99, 100, 5, 6, 32, 52 y 69)

Ejemplo 7

El siguiente es un estudio que muestra que los péptidos variantes M5 y variante M69 reducen la glucosa en sangre. A los ratones (ob/ob) se les inyectó (por vía subcutánea) M5 (0,1 y 1 mg/kg, s.c.) o FGF19 (1 mg/kg, s.c.), o variante M69 (0,1 y 1 mg/kg, s.c.) o FGF19 (1 mg/kg, s.c.). Los niveles de glucosa en plasma se midieron 2, 4, 7 y 24 horas después de la inyección, y los resultados se muestran en la Figura 7. M5 (Figura 7A) y la variante M69 (Figura 7B) mostraron efectos reductores de glucosa similares a los del FGF19 de tipo salvaje.

Ejemplo 8

Este ejemplo expone varios polipéptidos variantes y características concretas de los mismos, incluido el efecto de las variantes sobre la reducción de glucosa, los parámetros del perfil de lípidos y la formación de CHC.

En particular, la Tabla 8 compara los datos generados para las variantes M5 (SEQ ID NO: 5), M6 (SEQ ID NO: 6) y M50 (SEQ ID NO: 50) con los datos generados para los polipéptidos variantes correspondientes (indicados como M144, M145, y M146, respectivamente) que tienen deleciones de Arg (R) N-terminales. Solo se enumeran ciertos dominios de secuencia para cada variante: dominio N-terminal, núcleo y región Lámina-8/Bucle-8/Lámina-9.

Tabla 8

D o m in io N -te rm ina l N ú c leo R e g ió n Lám ina-8 / Disminución Reducción Elevación Elevación Formación B u c le 8 /Lám ina 9 de Glucosa de Peso HDL Trigli de CHC Corporal céridos

F G F I9 R P L A F S D A G P IIV IIY G W G D P I R L R IIL Y T S G //E E IR P D G Y N V Y // - <aa 1-20 deS FQ ID N O :99) (aa 21-29 deSFQ (aa 102 112 deS FQ

ID N O :99) ID N O :99)

IG 1-2I IIP IPD SS I’L L Q -F G G Q V R Q R Y L Y T D D //E L L L E D G Y N V Y // - - -(aa 1-20 de SHQ ID N O : 100) (aa 21-29 deS FQ (aa 97-107 deSFQ

ID N O : 100) ID NO : 100)

M5 R -U P IP D S S P II.Q -F G G Q V R L R IIL Y T S G //E E IR P D G Y N V Y // - - ■ -(aa 1 l7 d e S E Q ID N O :5 ) (aa 18-26 de SFQ (aa 99-109 de SFQ

ID N O :5) ID NO: 5)

M 6 r -------- DSSPI .1 Q -F G G Q V R I-R H LY TS G //E E IR P D G Y N V Y // - - • -(aa 1-14 de SEQ ID N O :6 ) (aa 15-23 de SEQ (aa 95-105de SEQ

ID N O :6) ID NO :6)

M 50 R HPIPDSSPLI.Q - FG D Q V R L R H L Y T S G //'E E IR P D G Y N V Y // - * -(aa 1-17 de SFQ ID N O :50) (aa 18-26 de SFQ (aa 99-109 deSFQ

ID N O :50) ID N O :50)

M I 46 —HPIPDSSPLLQ —F G D Q V RIJ1HLYTSG<a //E E IR P D G Y N V Y // * - * (aa 2-17 deSFQ ID N O :50) a 18-26 de SEQ (aa 99-109 deSFQ

ID N O :50) ID N O :50)

Como indican los datos de la Tabla 8, la deleción de la Arg (R) N-terminal no tuvo un impacto significativo en la reducción de glucosa, la reducción del peso corporal, la elevación de HDL y triglicéridos y la formación de CHC. Ejemplo 9

Este ejemplo expone varios péptidos variantes que tienen sustituciones de aminoácidos en la región bucle 8 de FGF19, junto con el efecto de las variantes sobre el peso corporal, ciertos parámetros metabólicos y la formación de CHC. Los datos de la Tabla 9 están asociados con polipéptidos variantes denominados M3, M139, M140, M141 y M160. La secuencia de aminoácidos para M3 se establece en otra parte de la presente memoria, y las secuencias de aminoácidos para M139, M140, M141 y M160 son las siguientes:

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILPDGYNVYRSEKHRLPVSL SSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLE AVRSPSFEK (M I39) (SEQ ID NO: 193);

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQ Y SEEDCAFEEEIREDGYNVYRSEKHRLPV SL SSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLE AVRSPSFEK (MI40) (SEQ ID NO: 194);

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQ Y SEEDCAFEEEILCDGYNVYRSEKHRLPV SL SSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLE AVRSPSFEK (M141) (SEQ ID NO: 195);

y

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRQRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKA

VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSL

SSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLE

AVRSPSFEK (M I60) (SEQ ID NO: 196).

Solo los siguientes dominios de secuencia para cada una de las variantes antes mencionadas se enumeran en la Tabla 9: dominio N-terminal, núcleo y región Lámina-8/Bucle-8/Lámina-9. Si bien los restos de aminoácido concretos que forman la región Bucle 8 no están universalmente aceptados en la bibliografía, los restos 127-129 de FGF19 se definen en la presente memoria como constituyentes de la región Bucle-8.

Tabla 9

D o m in io N -term ina l N ú c le o Disminución Reducción Elevación Elevación Fomación de Glucosa de Peso de HDL trigli* de CHC Corporal céridos

F G FI9 R r i A F SD A G P H VH YG W G D PI R l.R H I.Y TS G //F.F.IRPDGY'NVY// “

(aa 1-20 d e S E g ID N O :99) (aa 21-29 de (au 102-112 d eS E g

SEQ ID NO:99) ID NO :99)

FGF2I H P IP D S S P LL Q -F G ÍiQ V R Q R Y LY T D D //E L L L E D G Y N V Y //

(aa 120 de SI g i l ) NO: 100) (aa 21-29 de (aa 97-107 de SI g

s i g ID ID N O : 100)

N O : 100)

M 3 R P LAFSDAG PHV HY G W G D P I R I.R H I.YTSG //E E IL K D G Y N V Y //( +/■

(aa 1-20 de SEQ II) \ ( » 1 (aa 21-29 de aa 102-112 de S lig

S F g ID NO :3) ID N O :3)

M U Í R P LAI S D A G P lIV H Y G W G D P I RLRJILYTSG //EE ILPDG YN VYW

^{(aa l-20d e} SF.g ^{ID N O I93 )}(aa 21-29 de (aa 102 112 de S F g

S F g ID ID N O : 193)

NO : 193)

M I4 I RPI A I SDAG PI IV H Y G W G D P I R I-R IIE YES G //E E IL C D G Y N V Y //

(aa 1-20 deSI g i l ) N O :l95 ) (aa 21-29 de (aa 102-112 deS E g

SFQ ID I I) N O : 195)

NO : 195)

M 160 RPLAFSDAGPHV HYGWGDPI RgRH LY TSG //E E II j: iX iY 'N V Y //(

(aa 1-20 deSEg ID N O : 196) (aa 21-29 de aa 102-112 deS E g

S E g iD ID N O : 196)

NO : 196)

Con referencia a la Tabla 9, la sustitución P128E parece necesaria para prevenir significativamente la formación de CHC, pero es insuficiente por sí misma para prevenir la formación de CHC. En particular, se observa una mejora en la prevención de la formación de CHC con la sustitución de P128E en M140. Por el contrario, la sustitución de R127L por sí misma no previene la formación de CHC (véase M139). Como se indica en comparación con M3, una combinación de las sustituciones R127L y P128E disminuye la formación de CHC pero no elimina la formación de CHC. Sin embargo, sorprendentemente, una combinación de las sustituciones R127L y P128E junto con una sustitución de Gln (Q) por Leu (L) en la región núcleo de FGF19 previene significativamente la formación de CHC (véase M160).

Estos datos indican que la región bucle 8 de FGF19 juega un papel en la formación de CHC. Los restos de aminoácido fuera de la región bucle 8 (p. ej., sustituciones en la región núcleo) pueden mejorar la prevención de la formación de CHC.

M1 (SEQ ID NO: 1)

RPLAFSDASPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKA

VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSL

SSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLE

AVRSPSFEK

M2 (SEQ ID NO: 2)

RPLAFSDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAV ALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLS SAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEA VRSPSFEK

M3 (SEQ ID NO: 3)

RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNYYRSEKHRLPVSL SSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLE AVRSPSFEK

M5 (SEQ ID NO: 5)

RHPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALR TVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAK QRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRS PSFEK

M5-R (SEQ ID NO: 160)

HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQY SEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPV SLSSAKQ RQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSP SFEK

M48 (SEQ ID NO: 48)

RDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAI KGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNYYRSEKHRLPVSLSSAKQRQ LYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE K

M49 (SEQ ID NO: 49)

RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVAL RTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQY SEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPV SLSSA KQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVR SPSFEK

M50 (SEQ ID NO: 50)

RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALR TVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQY SEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPV SLS SAK QRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRS PSFEK

M51 (SEQ ID NO: 51)

RHPIPDSSPLLQFGGNVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALR TVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAK QRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRS PSFEK

M52 (SEQ ID NO: 52)

RDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAI KGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQ LYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE K

M53 (SEQ ID NO: 192)

MDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVA IKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQ LYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFE K

M69 (SEQ ID NO: 69)

RDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRT VAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQY SEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPV SLSSAKQ RQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSP SFEK

M70 (SEQ ID NO: 70)

MRDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALR TVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQY SEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPV SLS SAK QRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRS PSFEK

M71 (SEQ ID NO: 71)

HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHSLPLHLPGNKSPH RDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS

M72 (SEQ ID NO: 72)

HPIPDSSPLLQFGGQYRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGY IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPH RDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS

M73 (SEQ ID NO: 73)

HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGV IQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPH RDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDV GS SDPLSMVVQDELQGV GGEGCHMHPE N CKTLLTDIDRTHTEKPV WDGIT GE

M75 (SEQ ID NO: 75)

RVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKG VHS VRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPV SLS S AKQRQLY KNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK

M76 (SEQ ID NO: 76)

RGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVR YLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFL PLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK FGF19 (SEQ ID NO: 99) RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGWDCARGQSAHSLLEIKA VALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNYYRSEKHRLPVSL SSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLE AVRSPSFEK

Ejemplo 10:

Este ejemplo muestra la activación de la señalización de FGFR4-p-klotho de ratón por FGF19, M3 y M70 en una línea celular de mioblastos de rata

Métodos: Se realizó un ensayo de luciferasa ELK en células L6 transfectadas transitoriamente con FGFR4 de ratón, b-klotho y construcciones informadoras que contienen luciferasa 5xUAS y dominio de unión a ADN (DBD) GAL4 fusionado con ELK1. En este sistema, la actividad de la luciferasa está regulada por la quinasa regulada por señal extracelular fosforilada endógena (ERK). Las células se incubaron con ligandos durante 6 horas antes de lisarlas para las mediciones de la actividad luciferasa.

Se utilizó un ensayo de activación del receptor basado en células para evaluar la capacidad del FGFR4 de ratón para mediar la señalización dependiente de ligando en presencia de p-klotho. Con este fin, se transfectó una línea celular de mioblastos L6 de rata, que carecía de expresión endógena de estas proteínas, con ADN que codificaba FGFR4 y p-klotho de ratón, así como plásmidos que contenían un sistema informador basado en el factor de transcripción quimérico dependiente de Elk1.

Después de la transfección, se analizó la respuesta a la concentración de la expresión de luciferasa dependiente de ligando en productos lisados de células completas en presencia de sustrato de luciferina.

Resultados: Se descubrió que la co-expresión de FGFR4 y p-klotho en las células L6 potencia la activación de las vías de señalización intracelular por M3, M70 y FGF19 (CE50 = 20, 38 y 53 pM, respectivamente (véanse la Tabla 10 y la Figura 8).

Tabla 10: La coexpresión del complejo FGFR4/p-klotho de ratón en células L6 potencia la activación de vías de señalización intracelular por FGF19, M3 y M70.

CE50 = concentración eficaz semimáxima; Emax = eficacia máxima. Los datos se expresan como media ± DT Estos datos sugieren que la formación de un complejo ternario entre los correceptores FGFR4-p-klotho y ligandos afines es importante para la activación potente de la señalización intracelular.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un péptido quimérico, que comprende:

(a) una región N-terminal que comprende al menos siete restos de aminoácido, teniendo la región N-terminal una primera posición de aminoácido y una última posición de aminoácido, en donde la región N-terminal comprende DSSPL (SEQ ID NO: 121), DASPH (SEQ ID NO: 122), o DAGPH (restos de aminoácido 7 a 11 de SEQ ID NO: 99 [FGF19]) y

(b) una región C-terminal que comprende una primera posición de aminoácido y una última posición de aminoácido, en donde la región C-terminal comprende

i. una primera secuencia de la región C-terminal que comprende WGDPIRLRHLYTSG (SEQ ID NO: 169), en donde el resto W corresponde a la primera posición de aminoácido de la región C-terminal; y ii. una segunda secuencia de la región C-terminal que comprende

PHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGV

HSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSE

KHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRG

HLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (SEQ ID

NO:188);

en donde el péptido quimérico comprende

la secuencia EILPD, EIRED, EILCD o EILED sustituida por secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188; y en donde el péptido quimérico

(i) se une al receptor 4 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR4) con una afinidad igual o mayor que la afinidad de unión de FGF19 por FGFR4;

(ii) activa FGFR4 en un grado o cantidad igual o mayor que FGF19 activa FGFR4;

(iii) tiene al menos uno de formación reducida de carcinoma hepatocelular (CHC); mayor actividad reductora de glucosa, menor actividad de aumento de lípidos, menor actividad de triglicéridos, menor actividad de colesterol, menor actividad de no HDL o menor actividad de aumento de HDL, en comparación con FGF19, o en comparación con una secuencia variante de FGF19 que tenga cualquiera de GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP o FGDPI sustituido por la secuencia de WGDPI en los aminoácidos 16-20 de FGF19 (SEQ ID NO: 99); y/o

(iv) tiene menos actividad reductora de masa magra en comparación con FGF21.

2. El péptido quimérico de la reivindicación 1, en donde la región N-terminal comprende:

(a) restos de aminoácido (i) VHYG (SEQ ID NO: 101), (ii) DASPHVHYG (SEQ ID NO: 102), o (iii) DSSPLVHYG (SEQ ID NO: 103);

en donde, opcionalmente, G corresponde a la última posición de la región N-terminal;

en donde opcionalmente la región N-terminal comprende adicionalmente:

(i) RHPIP (SEQ ID NO: 106), en donde R es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal;

(ii) HPIP (SEQ ID NO: 107), en donde H es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal; (iii) RPLAF (SEQ ID NO: 108), en donde R es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal;

(iv) PLAF (SEQ ID NO: 109), en donde P es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal;

o

(v) R, en donde R es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal; o

(b) restos de aminoácido DSSPLLQ (SEQ ID NO: 104), y en donde el resto Q es la última posición de aminoácido de la región N-terminal;

en donde opcionalmente la región N-terminal comprende adicionalmente:

(i) RHPIP (SEQ ID NO: 106), en donde R es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal;

(ii) HPIP (SEQ ID NO: 107), en donde H es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal; (iii) RPLAF (SEQ ID NO: 108), en donde R es la primera posición de aminoácido de la región N terminal;

(iv) PLAF (SEQ ID NO: 109), en donde P es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal;

o

(v) R, en donde R es la primera posición de aminoácido de la región N-terminal; o

(c) restos de aminoácido DSSPLLQFGGQV (SEQ ID NO: 105), y en donde el resto V corresponde a la última posición de la región N-terminal.

3. El péptido quimérico de la reivindicación 1, en donde

(a) los restos de aminoácido HPIP (SEQ ID NO: 107) son los primeros 4 restos de aminoácido de la región N-terminal;

(b) la posición del primer aminoácido de la región N-terminal es un resto "M", un resto "R", un resto "S", un resto "H", un resto "P", un resto "L" o un resto "D",

(c) la región N-terminal no tiene un resto "M" o un resto "R" en la primera posición de aminoácido de la región N-terminal;

(d) la región N-terminal comprende una cualquiera de las siguientes secuencias: MDSSPL (SEQ ID NO: 119), MSDSSPL (SEQ ID NO: 120) o SDSSPL (SEQ ID NO: 112); o

(e) (i) la primera posición de la región N-terminal es un resto R o M;

(ii) la primera y segunda posiciones de la región N-terminal son una secuencia MR, RM, RD, DS, MD o MS;

(iii) de la primera a la tercera posiciones de la región N-terminal son una secuencia MDS, RDS, MSD, MSS o DSS;

(iv) de la primera a la cuarta posiciones de la región N-terminal son una secuencia RDSS (SEQ ID NO:

115) o MDSS (SEQ ID NO: 116);

(v) de la primera a la quinta posiciones de la región N-terminal son una secuencia MRDSS (SEQ ID NO: 117);

(vi) de la primera a la sexta posiciones de la región N-terminal son una secuencia MDSSPL (SEQ ID NO: 119); o

(vii) las posiciones primera a séptima de la región N-terminal son una secuencia MSDSSPL (SEQ ID NO: 120).

4. El péptido quimérico de la reivindicación 1, en donde el péptido quimérico comprende una región N-terminal que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en cualquiera de:

RPLAFSDASPHVHYG (M1) (aminoácidos 1-15 de SEQ ID NO: 1);

RPLAFSDSSPLVHYG (M2) (aminoácidos 1-15 de SEQ ID NO: 2);

RPLAFSDAGPHVH (M16) (aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO: 16);

RPLAFSDAGPHVG (M17) (aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO: 17);

RPLAFSDAGPHYG (M18) (aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO: 18);

RPLAFSDAGPHVHG (M22) (aminoácidos 1-14 de SEQ ID NO: 22);

RPLAFSDAGPHHG (M23) (aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO: 23);

RPLAFSDAGPHHY (M24) (aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO: 24);

RPLAFSDAGPHVY (M25) (aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO: 25);

RPLAFSDSSPLVH (M26) (aminoácidos 1-13 de SEQ ID NO: 26);

RPLAFSDAGPHV (M28) (aminoácidos 1-12 de SEQ ID NO: 28);

RPLAFSDAGPHVHY (M29) (aminoácidos 1-14 de SEQ ID NO: 29);

RPLAFSDAGPHVHYA (M30) (aminoácidos 1-15 de SEQ ID NO: 30);

RDSSPLLQ (M52) (aminoácidos 1-8 de SEQ ID NO: 52);

MDSSPLVHYG (M53) (aminoácidos 1-10 de SEQ ID NO: 53);

RDSSPLVHYG (M69) (aminoácidos 1-10 de SEQ ID NO: 69);

MRDSSPLVHYG (M70) (aminoácidos 1-11 de SEQ ID NO: 70);

RPLAFSDAGPHVHYG (M160) (aminoácidos 1-15 de SEQ ID NO: 196); o

cualquiera de las secuencias de péptidos anteriores, en donde se suprime el resto R amino terminal.

5. El péptido quimérico de la reivindicación 1, en donde el péptido quimérico tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en:

(i) SEQ ID NO: 1 (M1) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO:

188;

(ii) SEQ ID NO: 2 (M2) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO:

188;

(iii) SEQ ID NO: 16 (M16) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(iv) SEQ ID NO: 17 (M17) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(v) SEQ ID NO: 18 (M18) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(vi) SEQ ID NO: 22 (M22) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(vii) SEQ ID NO: 23 (M23) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(viii) SEQ ID NO: 24 (M24) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(ix) SEQ ID NO: 25 (M25) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(x) SEQ ID NO: 26 (M26) con al menos una sustitución de aminoácidos en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xi) SEQ ID NO: 28 (M28) con al menos una sustitución de aminoácidos en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xii) SEQ ID NO: 28 (M28) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xiii) SEQ ID NO: 29 (M29) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xiv) SEQ ID NO: 30 (M30) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xv) SEQ ID NO: 52 (M52) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xvi) SEQ ID NO: 53 (M53) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xvii) SEQ ID NO: 68 (M68) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xviii) SEQ ID NO: 69 (M69) con al menos una sustitución de aminoácido en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xix) SEQ ID NO: 70 (M70) con al menos una sustitución de aminoácidos en la secuencia EIRPD de SEQ ID NO: 188;

(xx) SEQ ID NO: 193 (M139);

(xxi) SEQ ID NO: 194 (M140);

(xxii) SEQ ID NO: 195 (M141); o

cualquiera de las secuencias de péptidos anteriores, en donde se suprime el resto R amino terminal.

6. Un péptido quimérico que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en SEQ ID NO: 196.

7. Péptido quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el péptido quimérico está fusionado con una región Fc de inmunoglobulina.

8. Una composición farmacéutica que comprende el péptido quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la composición farmacéutica comprende opcionalmente un agente reductor de glucosa.

9. Una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la molécula de ácido nucleico comprende adicionalmente un elemento de control de la expresión en una conexión operable que confiere la expresión de la molécula de ácido nucleico in vitro, en una célula o in vivo.

10. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 9, en donde el vector comprende opcionalmente un vector viral.

11. Una célula transformada o anfitriona que expresa el péptido quimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

12. Un péptido quimérico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en un método para mejorar el metabolismo de la glucosa en un sujeto que lo necesite.

13. Un péptido quimérico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en un método de tratamiento de un trastorno en un sujeto que lo necesite, en donde el trastorno es una afección hiperglucémica, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, síndrome metabólico, obesidad, masa corporal no deseable, EHGNA o EHNA, en donde opcionalmente la afección hiperglucémica comprende diabetes; en donde opcionalmente la diabetes es diabetes insulinodependiente (tipo I), diabetes tipo II, diabetes gestacional o prediabetes.

14. El péptido quimérico para uso de la reivindicación 12 o 13, en donde el sujeto:

(a) tiene una afección hiperglucémica, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, síndrome metabólico, obesidad, masa corporal no deseable, enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) o esteatohepatitis no alcohólica (EHNA);

en donde opcionalmente la afección hiperglucémica comprende diabetes; en donde opcionalmente la diabetes es diabetes insulinodependiente (tipo I), diabetes tipo II, diabetes gestacional o prediabetes; y/o (b) (i) tiene un nivel de glucosa plasmática en ayunas (GPA) superior a 100 mg/dl; (ii) tiene un nivel de GPA superior a 125 mg/dl; (iii) tiene un nivel de GPA de entre 100 y 125 mg/dl; o (iv) tiene un nivel de hemoglobina A1c (HbA1c) superior al 6%.

15. El péptido quimérico para el uso de la reivindicación 12 o 13, en donde el método da como resultado un aumento de la sensibilidad a la insulina, una reducción de la resistencia a la insulina, una reducción del glucagón, una mejora de la tolerancia a la glucosa, una mejora del metabolismo o la homeostasis de la glucosa, una mejora de la función pancreática, una reducción del nivel de triglicéridos, una reducción del nivel de colesterol, una reducción del nivel de IDL, una reducción del nivel de LDL, una reducción del nivel de VLDL, una reducción de la presión arterial, una reducción del engrosamiento de la íntima de los vasos sanguíneos, una reducción de la masa corporal o aumento de peso, o una reducción de los niveles de glucosa.