JP2003518944A - 新規fgf相同体zfgf12 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、FGFファミリーの新規メンバーzFGF12についてのポリヌクレオチド及びポリペプチド分子に関する。本発明はまた、zFGF12ポリペプチドに対する抗体、及びポリヌクレオチド及びポリペプチドを用いる方法も包含する。
Description
【0001】
発明の背景:
線維芽細胞成長因子(FGF)ファミリーは、広範囲の細胞型のためのミトゲン
として一般的に作用する少なくとも18種の異なったメンバーから成る(Basilico
など., Adv. Cancer Res. 59: 115-165, 1992及びFernigなど., Pro. Growth Fa
ctor Res. 5(4)353-377, 1994)。例えば、塩基性FGF(また、FGF−2としても
知られている)は、内皮細胞、血管平滑筋細胞、線維芽細胞及び、一般的に心臓
及び骨格筋細胞を包含する、中胚葉又は神経外胚葉起原の細胞に対してインビト
ロでミトゲン性である(Gospodarowiczなど., J. Cell. Biol. 70: 395-405, 19
76; Gospodarowiczなど., J. Cell. Biol. 89: 568-578, 1981, 及びKardami, J
. mol. Cell. Biochem. 92: 124-134, 1990)。
として一般的に作用する少なくとも18種の異なったメンバーから成る(Basilico
など., Adv. Cancer Res. 59: 115-165, 1992及びFernigなど., Pro. Growth Fa
ctor Res. 5(4)353-377, 1994)。例えば、塩基性FGF(また、FGF−2としても
知られている)は、内皮細胞、血管平滑筋細胞、線維芽細胞及び、一般的に心臓
及び骨格筋細胞を包含する、中胚葉又は神経外胚葉起原の細胞に対してインビト
ロでミトゲン性である(Gospodarowiczなど., J. Cell. Biol. 70: 395-405, 19
76; Gospodarowiczなど., J. Cell. Biol. 89: 568-578, 1981, 及びKardami, J
. mol. Cell. Biochem. 92: 124-134, 1990)。
【0002】
インビボで、bFGFは、鳥類の心臓成長において役割を演じ(Sugiなど., Dev.
Biol. 168: 567-574, 1995及びMimaなど., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 467-47
1, 1995)、そしてイヌにおける冠状側副成長を誘発する(Lazarousなど., Circ
ulation 94: 1074-1082, 1996)ことが示されている。さらに、非ミトゲン活性
が、FGFファミリーの種々のメンバーに関して示されている。酸性及び/又は塩基
性FGFに関連する非増殖活性は、組織プラスミノーゲン活性化因子の高められた
内皮放出、細胞外マトリックス合成の刺激、内皮細胞の走化性、心筋細胞におけ
る胎性収縮遺伝子の誘発された発現(Parkerなど., J. Clin. Invest. 85: 507-
514, 1990)、及び増強された下垂体ホルモン応答性(Bairdなど., J. Cellular
Physiol. 5: 101-106, 1987)を包含する。
Biol. 168: 567-574, 1995及びMimaなど., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 467-47
1, 1995)、そしてイヌにおける冠状側副成長を誘発する(Lazarousなど., Circ
ulation 94: 1074-1082, 1996)ことが示されている。さらに、非ミトゲン活性
が、FGFファミリーの種々のメンバーに関して示されている。酸性及び/又は塩基
性FGFに関連する非増殖活性は、組織プラスミノーゲン活性化因子の高められた
内皮放出、細胞外マトリックス合成の刺激、内皮細胞の走化性、心筋細胞におけ
る胎性収縮遺伝子の誘発された発現(Parkerなど., J. Clin. Invest. 85: 507-
514, 1990)、及び増強された下垂体ホルモン応答性(Bairdなど., J. Cellular
Physiol. 5: 101-106, 1987)を包含する。
【0003】
FGFファミリーのいくつかのメンバーは、シグナル配列を有さず(aFGF, bFGF
及びたぶんFGF-9)、そして従って、従来の態様で分泌されることが予測されな
い。さらに、いくつかのFGFファミリーメンバーは、細胞核に移動する能力を有
する(Frieselなど., FASEB 9: 919-925, 1995)。FGFファミリーのすべてのメ
ンバーは、構造類似性に基づいてヘパリンを結合する。構造相同性は種を交差し
、このことは、それらの構造/機能関係の保存性を示唆する(Ornitzなど., J. B
iol. Chem. 271 (25): 15292-15297, 1996)。
及びたぶんFGF-9)、そして従って、従来の態様で分泌されることが予測されな
い。さらに、いくつかのFGFファミリーメンバーは、細胞核に移動する能力を有
する(Frieselなど., FASEB 9: 919-925, 1995)。FGFファミリーのすべてのメ
ンバーは、構造類似性に基づいてヘパリンを結合する。構造相同性は種を交差し
、このことは、それらの構造/機能関係の保存性を示唆する(Ornitzなど., J. B
iol. Chem. 271 (25): 15292-15297, 1996)。
【0004】
4種の既知の細胞外FGF受容体(FGFR)が存在し、そしてそれらはすべてチロ
シンキナーゼである。一般的に、FGFファミリーメンバーは、既知のFGFRのすべ
てに結合するが、しかしながら、特定のFGFは高い程度の親和性で特定の受容体
に結合する。FGFファミリー内の特異性についてのもう1つの手段は、胚形成の
間、リガンド及びそれらの受容体の空間的及び一時的発現である。
シンキナーゼである。一般的に、FGFファミリーメンバーは、既知のFGFRのすべ
てに結合するが、しかしながら、特定のFGFは高い程度の親和性で特定の受容体
に結合する。FGFファミリー内の特異性についてのもう1つの手段は、胚形成の
間、リガンド及びそれらの受容体の空間的及び一時的発現である。
【0005】
その証拠は、FGFが、放出の部位からのそれらの拡散を制限するそれらのヘパ
リン結合親和性のために、オークライン及び/又はパラクリン態様においてのみ
作用することを示唆する(Flaumenhaftなど., J. Cell. Biol. 111 (4): 1651-1
659, 1990)。塩基性FGFは、シグナル配列を欠いており、そして従って、作用の
パラクリン又はオートクライン態様に制限される。塩基性FGFは、細胞内貯蔵さ
れ、そして組織損傷に基づいて放出される。塩基性FGFは、ヘパリン結合部位と
は異なった2種の受容体結合領域を有することが示されている(Abrahamなど.,
EMBO J. 5(10): 2523-2528, 1986)。
リン結合親和性のために、オークライン及び/又はパラクリン態様においてのみ
作用することを示唆する(Flaumenhaftなど., J. Cell. Biol. 111 (4): 1651-1
659, 1990)。塩基性FGFは、シグナル配列を欠いており、そして従って、作用の
パラクリン又はオートクライン態様に制限される。塩基性FGFは、細胞内貯蔵さ
れ、そして組織損傷に基づいて放出される。塩基性FGFは、ヘパリン結合部位と
は異なった2種の受容体結合領域を有することが示されている(Abrahamなど.,
EMBO J. 5(10): 2523-2528, 1986)。
【0006】
FGFファミリーのメンバーは、成長的に及び成人組織において重要な役割を演
じることが示されている。それらのファミリーメンバーの活性は、いくつかの組
織において不規則であり、そして他の場合、組織特異性を有さないように思える
。本発明は、FGFファミリーの新規メンバーを提供し、そしてそれらのポリヌク
レオチド及びポリペプチドについての使用は、当業者に明らかである。
じることが示されている。それらのファミリーメンバーの活性は、いくつかの組
織において不規則であり、そして他の場合、組織特異性を有さないように思える
。本発明は、FGFファミリーの新規メンバーを提供し、そしてそれらのポリヌク
レオチド及びポリペプチドについての使用は、当業者に明らかである。
【0007】
発明の特定の記載:
本発明を詳細に記載する前、次の用語を定義することで本発明の理解を助ける
ことができる: “親和性標識”とは、第2ポリペプチドの精製又は検出を提供し、又は基質へ
の第2ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第2ポリペプチドに
結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される
。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタン
パク質が親和性標識として使用され得る。
ことができる: “親和性標識”とは、第2ポリペプチドの精製又は検出を提供し、又は基質へ
の第2ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第2ポリペプチドに
結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される
。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタン
パク質が親和性標識として使用され得る。
【0008】
親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインA (Nilsson など.,
EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など., Methods Enzymol. 198: 3, 1991)
, グルタチオンS トランスフェラーゼ(Smits and Johnson, Gene 67; 31, 19
88), Glu-Glu親和性標識 (Grussenmeyerなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82: 7952-4, 1985), 物質P、すなわちFlagTM ペプチド(Hoppなど., Biotec
hnology 6: 1204-1210, 1988)、ストレプタビジン結合ペプチド、又は他の抗原
性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ford など., Protein E
xpression and Purification 2:95-107, 1991を参照のこと。親和性標識をコ
ードするDNAは、商品供給者(例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ; East
man Kodak, New Heven, CT; New England Biolabs, Beverly, MA)から入手でき
る。
, グルタチオンS トランスフェラーゼ(Smits and Johnson, Gene 67; 31, 19
88), Glu-Glu親和性標識 (Grussenmeyerなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82: 7952-4, 1985), 物質P、すなわちFlagTM ペプチド(Hoppなど., Biotec
hnology 6: 1204-1210, 1988)、ストレプタビジン結合ペプチド、又は他の抗原
性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ford など., Protein E
xpression and Purification 2:95-107, 1991を参照のこと。親和性標識をコ
ードするDNAは、商品供給者(例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ; East
man Kodak, New Heven, CT; New England Biolabs, Beverly, MA)から入手でき
る。
【0009】
用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の
遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対
立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現
象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり(コードされ
たポリペプチドにおいて変化がない)、又は変更されたアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子
の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書におい
て使用される。
遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対
立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現
象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり(コードされ
たポリペプチドにおいて変化がない)、又は変更されたアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子
の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書におい
て使用される。
【0010】
用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位
置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それ
らの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は
一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末
端側に位置する一定の配列は、その対象配列のカルボキシル末端に隣接して位置
するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではな
い。
置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それ
らの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は
一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末
端側に位置する一定の配列は、その対象配列のカルボキシル末端に隣接して位置
するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではな
い。
【0011】
用語“相補体/抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有的に会合される
安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン(又
はストレプタビジン)は、相補体/抗−相補体対の基本型メンバーである。他の
典型的な相補体/抗−相補体対は、受容体/リガンド対、抗体/抗原(又はハプ
テン又はエピトープ)対、センス/アンチセンス ポリヌクレオチド対、及び同
様のものを包含する。相補体/抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その
相補体/抗−相補体対は好ましくは、<109M−1の結合親和性を有する。
安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン(又
はストレプタビジン)は、相補体/抗−相補体対の基本型メンバーである。他の
典型的な相補体/抗−相補体対は、受容体/リガンド対、抗体/抗原(又はハプ
テン又はエピトープ)対、センス/アンチセンス ポリヌクレオチド対、及び同
様のものを包含する。相補体/抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その
相補体/抗−相補体対は好ましくは、<109M−1の結合親和性を有する。
【0012】
用語“ポリヌクレオチド分子の補体”とは、相補的塩基配列、及び対照配列に
比較して逆の配向を有するポリペプチド分子である。例えば、配列5’ ATGCACGG
G 3’ は、5’ CCCGTGCAT 3’に対して相補的である。 用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、1又は複数の縮重コドンを含むヌクレオ
チドの配列(ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して)を示
す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じ
アミノ酸残基をコードする(すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれAsp
をコードする)。
比較して逆の配向を有するポリペプチド分子である。例えば、配列5’ ATGCACGG
G 3’ は、5’ CCCGTGCAT 3’に対して相補的である。 用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、1又は複数の縮重コドンを含むヌクレオ
チドの配列(ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して)を示
す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じ
アミノ酸残基をコードする(すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれAsp
をコードする)。
【0013】
用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能
に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又
は環状DNA分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロ
モーター及びターミネーター配列及び複製の1又は複数の起点、1又は複数の選
択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを包含す
る。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスDNAから誘導され、又は
両者の要素を含むことができる。
に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又
は環状DNA分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロ
モーター及びターミネーター配列及び複製の1又は複数の起点、1又は複数の選
択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを包含す
る。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスDNAから誘導され、又は
両者の要素を含むことができる。
【0014】
用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオ
チドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は所
望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成シス
テム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された
分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてcDNA及びゲノム クローンを
含む分子である。本発明の単離されたDNA分子は、通常関係しない他の遺伝子を
含まないが、しかし天然において存在する5’及び3’ 未翻訳領域、例えばプロ
モーター及びターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は、当業
者に明らかであろう(例えば、Dynan and Tijan, Nature 316: 774―78, 1985を
参照のこと)。
チドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は所
望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成シス
テム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された
分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてcDNA及びゲノム クローンを
含む分子である。本発明の単離されたDNA分子は、通常関係しない他の遺伝子を
含まないが、しかし天然において存在する5’及び3’ 未翻訳領域、例えばプロ
モーター及びターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は、当業
者に明らかであろう(例えば、Dynan and Tijan, Nature 316: 774―78, 1985を
参照のこと)。
【0015】
“単離された”ポリペプチド又はタンパク質は、その生来の環境以外の条件、
例えば血液及び動物組織とは別の条件下で見出されるポリペプチド又はタンパク
質である。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチ
ド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。高く精製された形、
すなわち95%以上の純度、より好ましくは99%以上の純度でポリペプチドを
供給することが好ましい。この情況下で使用される場合、用語“単離された”と
は、他の物理的形、例えばダイマー形又は他のグリコシル化された又は誘導体化
された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
例えば血液及び動物組織とは別の条件下で見出されるポリペプチド又はタンパク
質である。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチ
ド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。高く精製された形、
すなわち95%以上の純度、より好ましくは99%以上の純度でポリペプチドを
供給することが好ましい。この情況下で使用される場合、用語“単離された”と
は、他の物理的形、例えばダイマー形又は他のグリコシル化された又は誘導体化
された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【0016】
“作用可能に連結された”とは、DNAセグメントに適用される場合、前記セグ
メントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、例えば転写がプロ
モーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進
行するよう配列されることを示す。 用語“オルト体(orthology)”とは、異なった種からのポリペプチド又はタ
ンパク質の機能的相対物である、1つの種から得られるポリペプチド又はタンパ
ク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。
メントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、例えば転写がプロ
モーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進
行するよう配列されることを示す。 用語“オルト体(orthology)”とは、異なった種からのポリペプチド又はタ
ンパク質の機能的相対物である、1つの種から得られるポリペプチド又はタンパ
ク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。
【0017】
“ポリヌクレオチド”は、5’末端から3’末端に読み取られるデオキシリボヌ
クレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリ
ヌクレオチドは、RNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロ
で合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレ
オチドのサイズは、塩基対(略語“bp”)、ヌクレオチド(“nt”)、又はキロ塩
基(“kb”)として表される。ここで、後者の2つの用語は、一本鎖又は二本鎖
であるポリヌクレオチドを記載する。
クレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリ
ヌクレオチドは、RNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロ
で合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレ
オチドのサイズは、塩基対(略語“bp”)、ヌクレオチド(“nt”)、又はキロ塩
基(“kb”)として表される。ここで、後者の2つの用語は、一本鎖又は二本鎖
であるポリヌクレオチドを記載する。
【0018】
この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すために使用
され、そして用語、“塩基対”に等しいことが理解されるであろう。二本鎖ポリ
ヌクレオチドの二本の鎖は長さにおいてわずかに異なり、そしてその末端が酵素
分解の結果として異なることは、当業者により理解されており;従って、二本鎖
ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは一対に成り得ない。そのよう
な不対の末端は、一般的に、20ntを越えないであろう。
され、そして用語、“塩基対”に等しいことが理解されるであろう。二本鎖ポリ
ヌクレオチドの二本の鎖は長さにおいてわずかに異なり、そしてその末端が酵素
分解の結果として異なることは、当業者により理解されており;従って、二本鎖
ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは一対に成り得ない。そのよう
な不対の末端は、一般的に、20ntを越えないであろう。
【0019】
“ポリペプチド”は、天然において生成されても又は合成的に生成されてもい
ずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約 10個以下のアミノ酸残基のポリペプチドが、通常“ポリペプチド”として言及
される。 用語“プロモーター”とは、RNA ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供す
るDNA配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロ
モーター配列は通常、遺伝子の5’ 非コード領域に見出されるが、しかし必ずし
もそうではない。
ずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約 10個以下のアミノ酸残基のポリペプチドが、通常“ポリペプチド”として言及
される。 用語“プロモーター”とは、RNA ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供す
るDNA配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロ
モーター配列は通常、遺伝子の5’ 非コード領域に見出されるが、しかし必ずし
もそうではない。
【0020】
用語“タンパク質”は、1又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子であ
る。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる
。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付
加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ
酸主鎖により本明細書において定義され;置換基、例えば炭水化物基は一般的に
、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
る。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる
。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付
加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ
酸主鎖により本明細書において定義され;置換基、例えば炭水化物基は一般的に
、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
【0021】
用語“受容体”は、生物活性分子(すなわち“リガンド”)に結合し、そして細
胞上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質を示す。膜結合受容体は、
細胞外リガンド結合ドメイン、及び典型的には、シグナルトランスダクションに
関与する細胞内エフェクタードメインを含んで成る多ペプチド構造により特徴づ
けられる。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと
他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体におけるコンホメーション変化を
もたらす。
胞上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質を示す。膜結合受容体は、
細胞外リガンド結合ドメイン、及び典型的には、シグナルトランスダクションに
関与する細胞内エフェクタードメインを含んで成る多ペプチド構造により特徴づ
けられる。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと
他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体におけるコンホメーション変化を
もたらす。
【0022】
この相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導する。受容体−リガンド相互作用に
連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、AMP生成の上昇、
細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分
解、及びリン脂質の加水分解を包含する。一般的に、受容体は、膜結合され、シ
トソール性又は核性であり;モノマー(例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、β−
アドレナリン性受容体)、又はマルチマー(例えばPDGF受容体、成長ホルモン受容
体、IL−3受容体、GM―CSF受容体、G−CSF受容体、エリトロポイエチン受容体
及びIL―6受容体)であり得る。
連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、AMP生成の上昇、
細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分
解、及びリン脂質の加水分解を包含する。一般的に、受容体は、膜結合され、シ
トソール性又は核性であり;モノマー(例えば甲状腺刺激ホルモン受容体、β−
アドレナリン性受容体)、又はマルチマー(例えばPDGF受容体、成長ホルモン受容
体、IL−3受容体、GM―CSF受容体、G−CSF受容体、エリトロポイエチン受容体
及びIL―6受容体)であり得る。
【0023】
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより
大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向ずけるポリペ
プチド(“分泌ペプチド”)をコードするDNA配列を示す。前記のより大きなポ
リペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常
分解される。
大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向ずけるポリペ
プチド(“分泌ペプチド”)をコードするDNA配列を示す。前記のより大きなポ
リペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常
分解される。
【0024】
用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるRNAの二者択一の形を
示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたRNA
分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたRNA分子間の二者択一のスプライ
シング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写される
いくつかのmRNAをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異
体はまた、遺伝子から転写されるmRNAのスプライス変異体によりコードされるタ
ンパク質を示すために本明細書において使用される。
示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたRNA
分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたRNA分子間の二者択一のスプライ
シング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写される
いくつかのmRNAをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異
体はまた、遺伝子から転写されるmRNAのスプライス変異体によりコードされるタ
ンパク質を示すために本明細書において使用される。
【0025】
不正確な分析方法(例えば、ゲル電気泳動)により決定されるポリマーの分子
量及び長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値が
“約”X又は“おおよそ”Xとして表される場合、その言及されたXの値は、正確
には±10%であることが理解されるであろう。 本明細書に引用されるすべての文献はそれらのすべてを引用により組み込まれ
る。 本発明は、FGF−19(Nishimuraなど., Biochem. Byophy. Acta. 1444: 148-15
1, 1999)に対して約31%の相同性を有する線維芽細胞成長因子(FGF)相同体ポ
リペプチドをコードする新規DNA配列の発見に一部、基づかれる。前記FGF相同ポ
リペプチドは、zFGF12と命名されている。
量及び長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値が
“約”X又は“おおよそ”Xとして表される場合、その言及されたXの値は、正確
には±10%であることが理解されるであろう。 本明細書に引用されるすべての文献はそれらのすべてを引用により組み込まれ
る。 本発明は、FGF−19(Nishimuraなど., Biochem. Byophy. Acta. 1444: 148-15
1, 1999)に対して約31%の相同性を有する線維芽細胞成長因子(FGF)相同体ポ
リペプチドをコードする新規DNA配列の発見に一部、基づかれる。前記FGF相同ポ
リペプチドは、zFGF12と命名されている。
【0026】
本発明の新規zFGF12ポリペプチドは、FGFファミリーのすべての既知メンバー
において存在することが知られているモチーフを含み、そしてそれらのタンパク
質に対してユニークである。DNAによりコードされるzFGF12相同体ポリペプチド
は、前記モチーフの式:CXFXE(ここで、Xはいずれかのアミノ酸であり、そして
X{}は1つよりも多くのアミノ酸の数である)の変系を含む。このモチーフは
、FGFファミリーのすべてのメンバーにおいて高く保存されるが、しかしながら
、zFGF12は、保存されたGluが酸性残基により塩基性残基を置換するHis(残基11
7)であることにおいてユニークであると思われる。
において存在することが知られているモチーフを含み、そしてそれらのタンパク
質に対してユニークである。DNAによりコードされるzFGF12相同体ポリペプチド
は、前記モチーフの式:CXFXE(ここで、Xはいずれかのアミノ酸であり、そして
X{}は1つよりも多くのアミノ酸の数である)の変系を含む。このモチーフは
、FGFファミリーのすべてのメンバーにおいて高く保存されるが、しかしながら
、zFGF12は、保存されたGluが酸性残基により塩基性残基を置換するHis(残基11
7)であることにおいてユニークであると思われる。
【0027】
ドメインの一致したアミノ酸配列は、例えばヒト筋細胞−活性化因子(FGF−1
0;HSU76381, GENBANK識別体、NCBI)、ヒト線維芽細胞成長因子相同因子4(FH
F−4;Smallwoodなど., 1996, 前記)、ヒト線維芽細胞成長因子相同因子3(F
HF−3;Smallwoodなど., 1996, 前記)、ヒトFGF−4(Basilicoなど., Adv. C
ancer. Res. 59: 115-165, 1992)、ヒトFGF−6(Basilicoなど., 1992, 前記
)、ヒトFGF−2(塩基性;Basilicoなど., 1992, 前記)、ヒトFGF−1(酸性
;Basilicoなど., 1992, 前記)、ヒトケラチノサイト成長因子前駆体(FGF−7
;Basilicoなど., 1992, 前記)、ヒトFGF−5(Basilicoなど., 1992, 前記)
、ヒトFGF−9(Miyamotoなど., Mol. Cell. Biol. 13: 4251-4259, 1993)、ヒ
トFGF−3(Basilicoなど., 1992, 前記)、ヒトFGF−16(Miyakeなど., Bioche
m. Biophys. Res. Commun. 243(1): 148-152, 1998)及びヒトFGF−12(Kokなど
., Biochem. Biophys. Res. Commun. 255(3): 717-721, 1999)を包含する。
0;HSU76381, GENBANK識別体、NCBI)、ヒト線維芽細胞成長因子相同因子4(FH
F−4;Smallwoodなど., 1996, 前記)、ヒト線維芽細胞成長因子相同因子3(F
HF−3;Smallwoodなど., 1996, 前記)、ヒトFGF−4(Basilicoなど., Adv. C
ancer. Res. 59: 115-165, 1992)、ヒトFGF−6(Basilicoなど., 1992, 前記
)、ヒトFGF−2(塩基性;Basilicoなど., 1992, 前記)、ヒトFGF−1(酸性
;Basilicoなど., 1992, 前記)、ヒトケラチノサイト成長因子前駆体(FGF−7
;Basilicoなど., 1992, 前記)、ヒトFGF−5(Basilicoなど., 1992, 前記)
、ヒトFGF−9(Miyamotoなど., Mol. Cell. Biol. 13: 4251-4259, 1993)、ヒ
トFGF−3(Basilicoなど., 1992, 前記)、ヒトFGF−16(Miyakeなど., Bioche
m. Biophys. Res. Commun. 243(1): 148-152, 1998)及びヒトFGF−12(Kokなど
., Biochem. Biophys. Res. Commun. 255(3): 717-721, 1999)を包含する。
【0028】
配列番号1に示されるようなDNA配列は、2つのイントロンにより分離される
3個のエキソンを含んで成る、FGFファミリーの多くのメンバーに共通するゲノ
ム配列を有する。配列番号2で示される、推定されるアミノ酸配列は、24個のア
ミノ酸(配列番号2の残基1〜24)の分泌シグナル配列と共に、227個のアミノ
酸(配列番号2の残基25〜251)の成熟ポリペプチドを含んで成る251個のアミノ
酸(配列番号2)をコードする読み取り枠を形成する。他の既知のFGFとのzFGF1
2との複数の一列整列は、配列番号2のアミノ酸残基82〜131に対応する高い%同
一性のブロックを示した。配列番号5で示されるようなFGFファミリーモチーフ
は、配列番号2のアミノ酸残基113(Cys)〜117(His)に対応する。FGFファミ
リーのいくつかのメンバーは、シグナル配列を有さない。
3個のエキソンを含んで成る、FGFファミリーの多くのメンバーに共通するゲノ
ム配列を有する。配列番号2で示される、推定されるアミノ酸配列は、24個のア
ミノ酸(配列番号2の残基1〜24)の分泌シグナル配列と共に、227個のアミノ
酸(配列番号2の残基25〜251)の成熟ポリペプチドを含んで成る251個のアミノ
酸(配列番号2)をコードする読み取り枠を形成する。他の既知のFGFとのzFGF1
2との複数の一列整列は、配列番号2のアミノ酸残基82〜131に対応する高い%同
一性のブロックを示した。配列番号5で示されるようなFGFファミリーモチーフ
は、配列番号2のアミノ酸残基113(Cys)〜117(His)に対応する。FGFファミ
リーのいくつかのメンバーは、シグナル配列を有さない。
【0029】
FGF−1及びFGF−2結晶構造による相同性の一列整列に基づけば(Erikssonな
ど., Prot. Sci. 2: 1274, 1993)、zFGF12のβ鎖構造についての二次構造予測
は、次のアミノ酸残基の領域を包含する:配列番号2に示されるような、鎖2−
51(Tyr)−56(Lys);鎖3−59(Gly)−64(Ala);鎖4−71(Ser)−77(S
er);鎖5−81(Gly)−88(Val);鎖6−92(Arg)−98(Phe);鎖7−99(
Arg)−105(Ser);鎖5−81(Gly)−88(Val);鎖6−92(Arg)−98(Phe
);鎖7−99(Arg)−105(Ser);鎖8−113(Cys)−120(Leu);鎖9−123
(Gly)−130(Phe);鎖10−134(Phe)−140(Arg);及び鎖11−143(Arg)
−147(Pro)。
ど., Prot. Sci. 2: 1274, 1993)、zFGF12のβ鎖構造についての二次構造予測
は、次のアミノ酸残基の領域を包含する:配列番号2に示されるような、鎖2−
51(Tyr)−56(Lys);鎖3−59(Gly)−64(Ala);鎖4−71(Ser)−77(S
er);鎖5−81(Gly)−88(Val);鎖6−92(Arg)−98(Phe);鎖7−99(
Arg)−105(Ser);鎖5−81(Gly)−88(Val);鎖6−92(Arg)−98(Phe
);鎖7−99(Arg)−105(Ser);鎖8−113(Cys)−120(Leu);鎖9−123
(Gly)−130(Phe);鎖10−134(Phe)−140(Arg);及び鎖11−143(Arg)
−147(Pro)。
【0030】
受容体に結合するzFGF12についての決定的なアミノ酸は、完全なzFGFポリペプ
チドの特定の部位の突然変異誘発により同定され得る。より特定には、それらは
、それらのそれぞれの受容体に結合するために決定的であるものとして同定され
た、酸性FGF(FGF1)及び塩基性FGF(FGF2)におけるアミノ酸残基に対応する、
zFGF12ポリペプチドにおけるアミノ酸の特定部位の突然変異誘発を用いて同定さ
れ得る(Blaberなど., Biochem. 35: 2086-2094, 1996)。zFGF12においては、
タンパク質のコアー内に隠れる疎水性残基、特に極性又は荷電された残基は、置
換に対して比較的、耐えられないであろう。
チドの特定の部位の突然変異誘発により同定され得る。より特定には、それらは
、それらのそれぞれの受容体に結合するために決定的であるものとして同定され
た、酸性FGF(FGF1)及び塩基性FGF(FGF2)におけるアミノ酸残基に対応する、
zFGF12ポリペプチドにおけるアミノ酸の特定部位の突然変異誘発を用いて同定さ
れ得る(Blaberなど., Biochem. 35: 2086-2094, 1996)。zFGF12においては、
タンパク質のコアー内に隠れる疎水性残基、特に極性又は荷電された残基は、置
換に対して比較的、耐えられないであろう。
【0031】
zFGF12のβ−三葉形折りたたみに対して決定的な残基は、残基53(Leu), 61(Va
l), 73(Leu), 75(Ile), 83(Val), 85(Ile), 94(Val), 102(Leu), 115(Phe), 127
(Tyr)及び136(Val)を包含する。当業者は、FGFファミリーの他のメンバーは、
完全に又は部分的に、zFGF12に対する構造的又は生化学的類似性を有することを
認識するであろう。従って、もう1つのFGFファミリーメンバーからのアミノ酸
残基は、zFGF12における対応する位置での置換のために使用され得る。当業者は
、推定されるドメイン境界がいくぶん不明確であり、そして±3個までのアミノ
酸残基により変化することができることを認識するであろう。
l), 73(Leu), 75(Ile), 83(Val), 85(Ile), 94(Val), 102(Leu), 115(Phe), 127
(Tyr)及び136(Val)を包含する。当業者は、FGFファミリーの他のメンバーは、
完全に又は部分的に、zFGF12に対する構造的又は生化学的類似性を有することを
認識するであろう。従って、もう1つのFGFファミリーメンバーからのアミノ酸
残基は、zFGF12における対応する位置での置換のために使用され得る。当業者は
、推定されるドメイン境界がいくぶん不明確であり、そして±3個までのアミノ
酸残基により変化することができることを認識するであろう。
【0032】
本発明のポリペプチドは、配列番号2の少なくとも6、少なくとも9又は少な
くとも15個の連続したアミノ酸残基を含んで成る。本発明の一定の態様において
は、ポリペプチドは、配列番号2の20, 30, 40, 50, 100又はそれ以上の連続し
た残基〜完全な推定される成熟ポリペプチド(配列番号2の残基25〜251)、又
は一次翻訳生成物(配列番号2の残基1〜251)を含んで成る。下記により詳細
に開示されるように、それらのポリペプチドは、追加の非−zFGF12ポリペプチド
配列をさらに含んで成ることができる。
くとも15個の連続したアミノ酸残基を含んで成る。本発明の一定の態様において
は、ポリペプチドは、配列番号2の20, 30, 40, 50, 100又はそれ以上の連続し
た残基〜完全な推定される成熟ポリペプチド(配列番号2の残基25〜251)、又
は一次翻訳生成物(配列番号2の残基1〜251)を含んで成る。下記により詳細
に開示されるように、それらのポリペプチドは、追加の非−zFGF12ポリペプチド
配列をさらに含んで成ることができる。
【0033】
本発明はポリペプチドは、配列番号2に示されるようなタンパク質のエピトー
プ担持の部分を含んで成るポリペプチドである。“エピトープ”は、抗体が結合
できるタンパク質の領域である。例えば、Geysenなど., Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 81: 3998-4002, 1984を参照のこと。エピトープは線状でも又は配座的で
もあり得、ここで後者は、タンパク質の折りたたみに基づいてエピトープを形成
する、タンパク質の断続的領域から構成される。線状エピトープは一般的に、少
なくとも6個の長さのアミノ酸残基である。
プ担持の部分を含んで成るポリペプチドである。“エピトープ”は、抗体が結合
できるタンパク質の領域である。例えば、Geysenなど., Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 81: 3998-4002, 1984を参照のこと。エピトープは線状でも又は配座的で
もあり得、ここで後者は、タンパク質の折りたたみに基づいてエピトープを形成
する、タンパク質の断続的領域から構成される。線状エピトープは一般的に、少
なくとも6個の長さのアミノ酸残基である。
【0034】
タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドは通常、その部分的
に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を誘発することができる。Sutcliffe
など., Science 219: 660-666, 1983を参照のこと。短い線状エピトープを認識
する抗体は、変性されたタンパク質を用いる分析及び診断用途、例えばウェスタ
ーンブロット(Tobin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4356, 1979)、
又は固定された細胞又は組織サンプルの分析において特に有用である。線状エピ
トープに対する抗体はまた、zFGF12のフラグメント、例えば体液又は細胞培養培
地において存在するフラグメントの検出のためにも有用である。
に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を誘発することができる。Sutcliffe
など., Science 219: 660-666, 1983を参照のこと。短い線状エピトープを認識
する抗体は、変性されたタンパク質を用いる分析及び診断用途、例えばウェスタ
ーンブロット(Tobin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4356, 1979)、
又は固定された細胞又は組織サンプルの分析において特に有用である。線状エピ
トープに対する抗体はまた、zFGF12のフラグメント、例えば体液又は細胞培養培
地において存在するフラグメントの検出のためにも有用である。
【0035】
本発明の抗原性エピトープ担持のポリペプチドは、zFGFにタンパク質に対して
特異的に結合する抗体、例えばモノクローナル抗体の生成のために有用である。
抗原性エピトープ担持のポリペプチドは、zFGF12タンパク質(例えば、配列番号
2)の少なくとも6、好ましくは少なくとも9、より好ましくは15〜約30個の連
続したアミノ酸残基の配列を含む。ZFGF12タンパク質の大きな部分、すなわち30
〜50個の残基から完全な配列までを含んで成るポリペプチドが包含される。好ま
しくは、エピトープ担持のポリペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒において実
質的な溶解性を提供するために選択され、すなわちその配列は比較的親水性の残
基を含み、そして疎水性残基は実質的に回避される。これに関しての特に有用な
ポリペプチドは、配列番号2の残基182−187、179−184、175−180、174−179及
び76−81を含んで成るそれらのポリペプチドを包含する。
特異的に結合する抗体、例えばモノクローナル抗体の生成のために有用である。
抗原性エピトープ担持のポリペプチドは、zFGF12タンパク質(例えば、配列番号
2)の少なくとも6、好ましくは少なくとも9、より好ましくは15〜約30個の連
続したアミノ酸残基の配列を含む。ZFGF12タンパク質の大きな部分、すなわち30
〜50個の残基から完全な配列までを含んで成るポリペプチドが包含される。好ま
しくは、エピトープ担持のポリペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒において実
質的な溶解性を提供するために選択され、すなわちその配列は比較的親水性の残
基を含み、そして疎水性残基は実質的に回避される。これに関しての特に有用な
ポリペプチドは、配列番号2の残基182−187、179−184、175−180、174−179及
び76−81を含んで成るそれらのポリペプチドを包含する。
【0036】
本発明のポリペプチドは、配列番号2に比較して、1又は複数のアミノ酸置換
、欠失又は付加により調製され得る。それらの変化は好ましくは、保存性アミノ
酸置換であるマイナーな性質のもの、及び本明細書に記載されるようなタンパク
質又はポリペプチドの折りたたみ又は活性に有意に影響を及ぼさない他の変化の
ものである。それらの変化は、アミノ又はカルボキシル末端延長、例えばアミノ
末端メチオニン残基、マレイミド−活性化されたカサガイヘモシアニンへの続く
結合を促進するためのアミノ又はカルボキシル末端システイン残基、約20〜25個
までの残基の小さなリンカ−ペプチド、又は上記に開示されるような精製を促進
する延長部分(親和性標識)を包含する。複数の親和性標識が組合して使用され
得る。親和性標識を含んで成るポリペプチドはさらに、zFGF12ポリペプチドと親
和性標識との間にポリペプチドリンカ−及び/又はタンパク質分解切断部位を含
むことができる。好ましい切断部位は、トロビン切断部位及び第Xa因子切断部位
を包含する。
、欠失又は付加により調製され得る。それらの変化は好ましくは、保存性アミノ
酸置換であるマイナーな性質のもの、及び本明細書に記載されるようなタンパク
質又はポリペプチドの折りたたみ又は活性に有意に影響を及ぼさない他の変化の
ものである。それらの変化は、アミノ又はカルボキシル末端延長、例えばアミノ
末端メチオニン残基、マレイミド−活性化されたカサガイヘモシアニンへの続く
結合を促進するためのアミノ又はカルボキシル末端システイン残基、約20〜25個
までの残基の小さなリンカ−ペプチド、又は上記に開示されるような精製を促進
する延長部分(親和性標識)を包含する。複数の親和性標識が組合して使用され
得る。親和性標識を含んで成るポリペプチドはさらに、zFGF12ポリペプチドと親
和性標識との間にポリペプチドリンカ−及び/又はタンパク質分解切断部位を含
むことができる。好ましい切断部位は、トロビン切断部位及び第Xa因子切断部位
を包含する。
【0037】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド融合体を提供する。例えば、zFGF12
ポリペプチドは、アメリカ特許第5,155,027号及び第5,567,584号に開示されるよ
うに、ニ量体化タンパク質への融合体として調製され得る。これに関して、好ま
しいニ量体化タンパク質は、免疫グロブリン不変領域ドメインを包含する。免疫
グロブリン−zFGF12ポリペプチド融合体は、種々のマルチマーzFGF類似体を生成
するために、遺伝子的に構築された細胞において発言され得る。さらに、zFGF12
ポリペプチドは、多機能分子を提供するために、もう1つの生活性分子、例えば
サイトカインに連結され得る。ZFGF12ポリペプチドの1又は複数のヘリックスが
、その生物学的性質を増強し、又は他方では、修飾するために、もう1つのサイ
トカインに連結され得る。
ポリペプチドは、アメリカ特許第5,155,027号及び第5,567,584号に開示されるよ
うに、ニ量体化タンパク質への融合体として調製され得る。これに関して、好ま
しいニ量体化タンパク質は、免疫グロブリン不変領域ドメインを包含する。免疫
グロブリン−zFGF12ポリペプチド融合体は、種々のマルチマーzFGF類似体を生成
するために、遺伝子的に構築された細胞において発言され得る。さらに、zFGF12
ポリペプチドは、多機能分子を提供するために、もう1つの生活性分子、例えば
サイトカインに連結され得る。ZFGF12ポリペプチドの1又は複数のヘリックスが
、その生物学的性質を増強し、又は他方では、修飾するために、もう1つのサイ
トカインに連結され得る。
【0038】
補助ドメインは、zFGF12ポリペプチドを特定の細胞、組織又は高分子(例えば
、コラーゲン)に標的化するために、zFGF12ポリペプチドに融合され得る。例え
ば、zFGF12ポリペプチド又はタンパク質は、標的細胞の表面上の受容体に特異的
に結合するリガンドにzFGF12ポリペプチドを融合することによって、予定された
細胞型に標的化され得る。この場合、ポリペプチド及びタンパク質は、治療又は
診断目的のために標的化され得る。zFGF12ポリペプチドは、複数の成分、例えば
精製のための親和性標識及び標的化ドメインに融合され得る。ポリペプチド融合
体はまた、特にドメイン間に1又は複数の切断部位を含むことができる。Tuanな
ど., Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996を参照のこと。
、コラーゲン)に標的化するために、zFGF12ポリペプチドに融合され得る。例え
ば、zFGF12ポリペプチド又はタンパク質は、標的細胞の表面上の受容体に特異的
に結合するリガンドにzFGF12ポリペプチドを融合することによって、予定された
細胞型に標的化され得る。この場合、ポリペプチド及びタンパク質は、治療又は
診断目的のために標的化され得る。zFGF12ポリペプチドは、複数の成分、例えば
精製のための親和性標識及び標的化ドメインに融合され得る。ポリペプチド融合
体はまた、特にドメイン間に1又は複数の切断部位を含むことができる。Tuanな
ど., Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996を参照のこと。
【0039】
本発明のポリペプチド融合体は一般的に、約1,500以下のアミノ酸残基、好ま
しくは約1,200以下の残基、より好ましくは約1,000以下の残基を含み、そして多
くの場合、相当に小さいであろう。例えば、227個の残基(配列番号2の残基25
−251)のzFGF12ポリペプチドは、E. コリβ−ガラクトシダーゼ(1,021個の残
基;Casadabanなど., J. Bacteriol. 143: 971-980, 1980を参照のこと)、10−
残基のスペーサー、及び4−残基の第Xa因子切断部位に融合され、1262個の残基
のポリペプチドが生成され得る。第2の例においては、配列番号2の残基25−25
1が、マルトース結合タンパク質(約370個の残基)、4−残基切断部位及び6−
残基ポリヒスチジン標識に融合され得る。
しくは約1,200以下の残基、より好ましくは約1,000以下の残基を含み、そして多
くの場合、相当に小さいであろう。例えば、227個の残基(配列番号2の残基25
−251)のzFGF12ポリペプチドは、E. コリβ−ガラクトシダーゼ(1,021個の残
基;Casadabanなど., J. Bacteriol. 143: 971-980, 1980を参照のこと)、10−
残基のスペーサー、及び4−残基の第Xa因子切断部位に融合され、1262個の残基
のポリペプチドが生成され得る。第2の例においては、配列番号2の残基25−25
1が、マルトース結合タンパク質(約370個の残基)、4−残基切断部位及び6−
残基ポリヒスチジン標識に融合され得る。
【0040】
上記に開示されるように、本発明のポリペプチドは、配列番号2の少なくとも
6個の連続した残基を含んで成る。それらのポリペプチドはさらに、配列番号2
に示されるような追加の残基、配列番号2の変異体、又は本明細書に開示される
ようなもう1つのタンパク質を含んで成る。配列番号2の変異体が使用される場
合、その得られるポリペプチドは、配列番号2のその対応する領域に対して、少
なくとも80%〜90%、又は他の態様においては、少なくとも95%、96%、97%、
98%又は99%同一であろう。
6個の連続した残基を含んで成る。それらのポリペプチドはさらに、配列番号2
に示されるような追加の残基、配列番号2の変異体、又は本明細書に開示される
ようなもう1つのタンパク質を含んで成る。配列番号2の変異体が使用される場
合、その得られるポリペプチドは、配列番号2のその対応する領域に対して、少
なくとも80%〜90%、又は他の態様においては、少なくとも95%、96%、97%、
98%又は99%同一であろう。
【0041】
%配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Altschulなど., Bul
l. Math. Bio. 48 : 603−616, 1986及びhenikoff and Henikoff, Pruc.Natl. A
cad. Sci. USA 89 :10915−10919, 1992を参照のこと。手短に言及するば、2種
のアミノ酸配列が、10のギャップ開始ペナルティー、1のギャップ延長ペナルテ
ィー、及び第1表(アミノ酸は標準の1文字コードにより示される)に示される
ようなHenikoff and Henikoff (前記)の“blosum 62”評点マトリックスを用
いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、%同一性が次のよう
にして計算される:
l. Math. Bio. 48 : 603−616, 1986及びhenikoff and Henikoff, Pruc.Natl. A
cad. Sci. USA 89 :10915−10919, 1992を参照のこと。手短に言及するば、2種
のアミノ酸配列が、10のギャップ開始ペナルティー、1のギャップ延長ペナルテ
ィー、及び第1表(アミノ酸は標準の1文字コードにより示される)に示される
ようなHenikoff and Henikoff (前記)の“blosum 62”評点マトリックスを用
いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、%同一性が次のよう
にして計算される:
【0042】
【数1】
【0043】
【表1】
【0044】
アミノ酸配列間の同一性のレベルは、Pearson and Lipman, Proc. Nat’l Aca
d. Sci. USA 85: 2444 (1988), 及びPearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990)
により記載される“FASTA”類似性調査アルゴリズムを用いて決定され得る。手
短には、FASTAがまず、問題の配列(例えば、配列番号3)及び保存性アミノ酸
置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性(ktup変数が1である場
合)又は対の同一性(ktup=2である場合)のいずれかを有する試験配列により
共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。
d. Sci. USA 85: 2444 (1988), 及びPearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990)
により記載される“FASTA”類似性調査アルゴリズムを用いて決定され得る。手
短には、FASTAがまず、問題の配列(例えば、配列番号3)及び保存性アミノ酸
置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性(ktup変数が1である場
合)又は対の同一性(ktup=2である場合)のいずれかを有する試験配列により
共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。
【0045】
次に、最高密度の同一性を有する10の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用
いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され
、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう
“整えられる”。“カットオフ”値(配列の長さ及びktup値に基づいて予定され
た式により計算される)よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合
、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形
成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。
いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され
、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう
“整えられる”。“カットオフ”値(配列の長さ及びktup値に基づいて予定され
た式により計算される)よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合
、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形
成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。
【0046】
最終的に、2種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可
能にする、Needleman-Wunsch アルゴリズム(Needleman and winsch, J. Mol. B
iol. 48: 444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787, 1974)の変法を
用いて整列される。FASTA 分析のための例示的なパラメーターは次のものである
:ktup=1、ギャップ開始ペナルティー=10、ギャップ拡張ペナルティー=1及
び置換マトリックス=BLOSUM62。それらのパラメーターは、Appendix 2 of Pear
son, 1990 (前記)に説明されるように、評点マトリックスを調節することによっ
てFASTAプログラム中に導入され得る。
能にする、Needleman-Wunsch アルゴリズム(Needleman and winsch, J. Mol. B
iol. 48: 444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787, 1974)の変法を
用いて整列される。FASTA 分析のための例示的なパラメーターは次のものである
:ktup=1、ギャップ開始ペナルティー=10、ギャップ拡張ペナルティー=1及
び置換マトリックス=BLOSUM62。それらのパラメーターは、Appendix 2 of Pear
son, 1990 (前記)に説明されるように、評点マトリックスを調節することによっ
てFASTAプログラム中に導入され得る。
【0047】
FASTAはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性
を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ktup値は
、誤りとして設定される他のパラメーターを伴って、1〜6、好ましくは3〜6
、最も好ましくは3であり得る。
を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ktup値は
、誤りとして設定される他のパラメーターを伴って、1〜6、好ましくは3〜6
、最も好ましくは3であり得る。
【0048】
本発明は、配列番号2のアミノ酸配列に比較して、1又は複数の保存性アミノ
酸変更を有するポリペプチドを包含する。BLOSUMO62マトリックス(表1)は、
関連するタンパク質の500以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパ
ク質配列セグメントの約2,000の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリ
ックスである[Henikoff and Henikoff, 前記 ]。従って、BLOSUM62置換頻度は
、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存性アミノ酸置換を定義するために
使用され得る。本明細書において使用される場合、用語“保存性アミノ酸置換”
とは、−1よりも大きなBLOSUM62値により表される置換を言及する。例えば、ア
ミノ酸置換は、その置換が0,1,2又は3のBLOSUM62値により特徴づけられる
場合、保存性である。好ましい保存性アミノ酸置換は、少なくとも1(例えば、
1,2又は3)のBLOSUM62値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存
性置換は、少なくとも2(例えば、2又は3)のBLOSUM62値により特徴づけられ
る。
酸変更を有するポリペプチドを包含する。BLOSUMO62マトリックス(表1)は、
関連するタンパク質の500以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパ
ク質配列セグメントの約2,000の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリ
ックスである[Henikoff and Henikoff, 前記 ]。従って、BLOSUM62置換頻度は
、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存性アミノ酸置換を定義するために
使用され得る。本明細書において使用される場合、用語“保存性アミノ酸置換”
とは、−1よりも大きなBLOSUM62値により表される置換を言及する。例えば、ア
ミノ酸置換は、その置換が0,1,2又は3のBLOSUM62値により特徴づけられる
場合、保存性である。好ましい保存性アミノ酸置換は、少なくとも1(例えば、
1,2又は3)のBLOSUM62値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存
性置換は、少なくとも2(例えば、2又は3)のBLOSUM62値により特徴づけられ
る。
【0049】
本発明のタンパク質はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含んで成る。天
然に存在しないアミノ酸は、トランス−3−メチルプロリン、2,4−メタプロ
リン、シス−4−ヒドロキシプロリン、トランス−4−ヒドロキシプロリン、N
−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシ
ステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミ
ン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3−及び4−
メチルプロリン、3,3−ジメチルプロリン、tert−ロイシン、ノルバリン、2
−アザフェニルアラニン、3−アザフェニルアラニン、4−アザフェニルアラニ
ン、及び4−フルオロフェニルアラニンを包含する。
然に存在しないアミノ酸は、トランス−3−メチルプロリン、2,4−メタプロ
リン、シス−4−ヒドロキシプロリン、トランス−4−ヒドロキシプロリン、N
−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシ
ステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミ
ン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3−及び4−
メチルプロリン、3,3−ジメチルプロリン、tert−ロイシン、ノルバリン、2
−アザフェニルアラニン、3−アザフェニルアラニン、4−アザフェニルアラニ
ン、及び4−フルオロフェニルアラニンを包含する。
【0050】
天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方
法が当業界において知られている。例えばナンセンス突然変異が化学的にアミノ
アシル化されたサプレッサーtRNAを用いて抑制されるインビトロシステムが使用
され得る。アミノ酸を合成し、そしてtRNAをアミノアシル化するための方法は
、当業者において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及
び翻訳は、E.コリS30抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る細胞フリ
ーシステムにおいて実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製
される。例えば、Rovertsonなど., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman
など., Meth. Enzymol. 202: 301,1991; Chung など., Science 259: 806−09,
1993; 及びChungなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145−49, 1993を
参照のこと。
法が当業界において知られている。例えばナンセンス突然変異が化学的にアミノ
アシル化されたサプレッサーtRNAを用いて抑制されるインビトロシステムが使用
され得る。アミノ酸を合成し、そしてtRNAをアミノアシル化するための方法は
、当業者において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及
び翻訳は、E.コリS30抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る細胞フリ
ーシステムにおいて実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製
される。例えば、Rovertsonなど., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman
など., Meth. Enzymol. 202: 301,1991; Chung など., Science 259: 806−09,
1993; 及びChungなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145−49, 1993を
参照のこと。
【0051】
第2の方法においては、翻訳は、突然変異誘発されたmRNA及び化学的にアミノ
アミル化されたサプレッサ−tRNAのマイクロインジェクションによりアフリカ
ツメガエル卵母細胞において行われる( Turcatti など., J. Biol. Chem. 271:
1991−98, 1996 )。 第3の方法においては、E.コリ細胞が、置換される予定で
ある天然のアミノ酸(例えば、フェニルアラニン)の不在下で及び所望する天然
に存在しないアミノ酸(例えば、2−アザフェニルアラニン、3−アザフェニル
アラニン、4−アザフェニルアラニン又は4−フルオロフェニルアラニン)の存
在下で培養される。
アミル化されたサプレッサ−tRNAのマイクロインジェクションによりアフリカ
ツメガエル卵母細胞において行われる( Turcatti など., J. Biol. Chem. 271:
1991−98, 1996 )。 第3の方法においては、E.コリ細胞が、置換される予定で
ある天然のアミノ酸(例えば、フェニルアラニン)の不在下で及び所望する天然
に存在しないアミノ酸(例えば、2−アザフェニルアラニン、3−アザフェニル
アラニン、4−アザフェニルアラニン又は4−フルオロフェニルアラニン)の存
在下で培養される。
【0052】
天然に存在しないアミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導
入される。Koide など., Biochem. 33: 7470−46, 1994を参照のこと。天然に存
在するアミノ酸残基は、インビトロ化学的に修飾により天然に存在しない種に転
換され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然
変異誘発と組み合わされ得る(Wynn and Richards,Protein Sci. 2: 395−403,
1993)。
入される。Koide など., Biochem. 33: 7470−46, 1994を参照のこと。天然に存
在するアミノ酸残基は、インビトロ化学的に修飾により天然に存在しない種に転
換され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然
変異誘発と組み合わされ得る(Wynn and Richards,Protein Sci. 2: 395−403,
1993)。
【0053】
アミノ酸配列の変更が、前記のように生物学的活性に対して必須である高次構
造体の破壊を最少にするためにzFGF12ポリペプチドにおいて行われる。構造統合
性の維持に対して決定的である領域又はドメインを含んで成るアミノ酸残基の決
定が行われ得る。それらの領域内で、多かれ少なかれ、変化に耐性であり、そし
て分子の全体的な三次構造を維持するであろう特定の残基を決定することができ
る。配列構造を分析するための方法は、高いアミノ酸又はヌクレオチド同一性を
有する複数配列の一列整列、二次構造性質、二元パターン、相補的パッケージン
グ及び埋もれた極性相互作用を包含するが、但しそれらだけには限定されない(
Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5:372-376, 1995及びCordesなど., Curr
ent Opin. Struct. Biol. 6: 3-10, 1996)。
造体の破壊を最少にするためにzFGF12ポリペプチドにおいて行われる。構造統合
性の維持に対して決定的である領域又はドメインを含んで成るアミノ酸残基の決
定が行われ得る。それらの領域内で、多かれ少なかれ、変化に耐性であり、そし
て分子の全体的な三次構造を維持するであろう特定の残基を決定することができ
る。配列構造を分析するための方法は、高いアミノ酸又はヌクレオチド同一性を
有する複数配列の一列整列、二次構造性質、二元パターン、相補的パッケージン
グ及び埋もれた極性相互作用を包含するが、但しそれらだけには限定されない(
Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5:372-376, 1995及びCordesなど., Curr
ent Opin. Struct. Biol. 6: 3-10, 1996)。
【0054】
一般的に、構造の決定は、修飾された分子の活性を評価することによって付随
されるであろう。例えば、アミノ酸残基の変更は、タンパク質ファミリーのβ−
三葉型折りたたみ構造を破壊しないよう行われるであろう。アミノ酸配列の変更
の効果は、例えば入手できるソフトウエアーを用いてのコンピューターモデル(
例えば、The Insight II(商標)viewer and homology modeling tools; MSI, S
an Diego, CA)により予測され得、又は結晶構造の分析により決定され得る(例
えば、Lapthornなど., Nat. Struct. Biol. 2: 266-268, 1995)。タンパク質の
折りたたみは、円ニ色性(CD)により測定され得る。当業界において良く知られ
ている他の技法は、標準の分子(例えば、生来のタンパク質)と変異体タンパク
質の折りたたみを比較する。例えば、変異体及び標準の分子におけるシステイン
パターンの比較が行われ得る。
されるであろう。例えば、アミノ酸残基の変更は、タンパク質ファミリーのβ−
三葉型折りたたみ構造を破壊しないよう行われるであろう。アミノ酸配列の変更
の効果は、例えば入手できるソフトウエアーを用いてのコンピューターモデル(
例えば、The Insight II(商標)viewer and homology modeling tools; MSI, S
an Diego, CA)により予測され得、又は結晶構造の分析により決定され得る(例
えば、Lapthornなど., Nat. Struct. Biol. 2: 266-268, 1995)。タンパク質の
折りたたみは、円ニ色性(CD)により測定され得る。当業界において良く知られ
ている他の技法は、標準の分子(例えば、生来のタンパク質)と変異体タンパク
質の折りたたみを比較する。例えば、変異体及び標準の分子におけるシステイン
パターンの比較が行われ得る。
【0055】
質量分光及び還元及びアルキル化を用いての化学的修飾は、ジスルフィド結合
に関連するか又はそのような関連を有さないシステイン残基を決定するための方
法を提供する(Beanなど., Anal. Biochem. 201: 216-226, 1992; Gray, Protei
n Sci. 2: 1732-1748, 1993: 及びPattersonなど., Anal. Chem. 66: 3727-3732
, 1994)。一般的に、修飾された分子が標準の分子と同じシステインパターンを
有さない場合、折りたたみが影響を及ぼされると思われる。折りたたみを測定す
るためのもう1つの良く知られており、且つ許容できる方法は、円ニ色性(CD)
である。修飾された分子及び標準の分子により生成されるCDスペクトルの測定及
び比較は、通常のことである(Johnson, Protein 7:205-214, 1990)。
に関連するか又はそのような関連を有さないシステイン残基を決定するための方
法を提供する(Beanなど., Anal. Biochem. 201: 216-226, 1992; Gray, Protei
n Sci. 2: 1732-1748, 1993: 及びPattersonなど., Anal. Chem. 66: 3727-3732
, 1994)。一般的に、修飾された分子が標準の分子と同じシステインパターンを
有さない場合、折りたたみが影響を及ぼされると思われる。折りたたみを測定す
るためのもう1つの良く知られており、且つ許容できる方法は、円ニ色性(CD)
である。修飾された分子及び標準の分子により生成されるCDスペクトルの測定及
び比較は、通常のことである(Johnson, Protein 7:205-214, 1990)。
【0056】
結晶学は、折りたたみ及び構造を分析するためのもう1つの良く知られた方法
である。核磁気共鳴(NMR)、消化ペプチドマッピング及びエピトープマッピン
グはまた、タンパク質とポリペプチドとの間の折りたたみ及び構造的類似性を分
析するための既知方法でもある(Schaananなど., Science 257: 961-964, 1992
)。質量分光法及び還元及びアルキル化を用いての化学的修飾が、ジスルフィド
結合により結合されるか、又はそのような結合を有さないシステイン残基を同定
するために使用され得る(Beanなど., Anal. Biochem. 201: 216-226, 1992; Gr
ay, Protein Sci. 2: 1732-1748, 1993; 及びPattersonなど., Anal. Chem. 66:
3727-3732, 1994)。
である。核磁気共鳴(NMR)、消化ペプチドマッピング及びエピトープマッピン
グはまた、タンパク質とポリペプチドとの間の折りたたみ及び構造的類似性を分
析するための既知方法でもある(Schaananなど., Science 257: 961-964, 1992
)。質量分光法及び還元及びアルキル化を用いての化学的修飾が、ジスルフィド
結合により結合されるか、又はそのような結合を有さないシステイン残基を同定
するために使用され得る(Beanなど., Anal. Biochem. 201: 216-226, 1992; Gr
ay, Protein Sci. 2: 1732-1748, 1993; 及びPattersonなど., Anal. Chem. 66:
3727-3732, 1994)。
【0057】
ジスルフィド結合の変更は、タンパク質折りたたみに影響を及ぼすことが予測
されるであろう。それらの技法は、そのような修飾が有意であるかどうかを決定
するために、変異体タンパク質又はポリペプチドの折りたたみに影響を及ぼす構
造特徴を分析し、そして標準の分子に比較するために、個々に又は組合して使用
され得る。
されるであろう。それらの技法は、そのような修飾が有意であるかどうかを決定
するために、変異体タンパク質又はポリペプチドの折りたたみに影響を及ぼす構
造特徴を分析し、そして標準の分子に比較するために、個々に又は組合して使用
され得る。
【0058】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている
方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同
定され得る(Cunningham and Wells, Science 244: 1081−1085, 1989; Bassな
ど., Proc. Natl. Scad. Sci. USA 88: 4498−502, 1991)。後者の技法におい
ては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得ら
れる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定す
るために、下記に開示されるようして、生物学的活性について試験される。
方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同
定され得る(Cunningham and Wells, Science 244: 1081−1085, 1989; Bassな
ど., Proc. Natl. Scad. Sci. USA 88: 4498−502, 1991)。後者の技法におい
ては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得ら
れる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定す
るために、下記に開示されるようして、生物学的活性について試験される。
【0059】
複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばRe
idhaar−Olson and Sauer (science 241: 53−57, 1988)又はBowie and Sauer
( Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2152−2156,1989 )により開示される方法を
用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペ
プチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリー
ンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異
誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。
idhaar−Olson and Sauer (science 241: 53−57, 1988)又はBowie and Sauer
( Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2152−2156,1989 )により開示される方法を
用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペ
プチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリー
ンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異
誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。
【0060】
使用され得る他の方法は、ファージ表示(例えば、Lowman など., Biochem. 3
0 : 10832−10837,1991; Ladner など., アメリカ特許第5,223,409号; Huse, WI
PO公開WO 92/06204号)、及び領域−指図された突然変異誘発(Derbyshire な
ど., Gene 46 : 145, 1986; Ner など., DNA 7 : 127, 1988 )を包含する。
0 : 10832−10837,1991; Ladner など., アメリカ特許第5,223,409号; Huse, WI
PO公開WO 92/06204号)、及び領域−指図された突然変異誘発(Derbyshire な
ど., Gene 46 : 145, 1986; Ner など., DNA 7 : 127, 1988 )を包含する。
【0061】
開示されるzFGF12 DNA及びポリペプチド配列の変異体は、Stemmer, Nature 3
70 : 389−91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747−51, 1
994及びWIPO公開WI97/20078により開示されるように、DNA シャフリングを通
して生成され得る。手短に言及すれば、変異体遺伝子が、ランダムに導入された
点突然変異をもたらす、親遺伝子のランダム断片化、続く、PCRを用いてのアセ
ンブリーによるインビトロ相同組換えにより生成される。この技法は、前記工程
中に追加の変動性を導入するために、親遺伝子のファミリー、例えば異なった種
からの対立遺伝子変異体又は遺伝子を用いて改良され得る。所望する活性の選択
又はスクリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有
害な変化に対して同時に選択しながら、所望する突然変異について選択すること
によって、配列の急速な“進化”を提供する。
70 : 389−91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747−51, 1
994及びWIPO公開WI97/20078により開示されるように、DNA シャフリングを通
して生成され得る。手短に言及すれば、変異体遺伝子が、ランダムに導入された
点突然変異をもたらす、親遺伝子のランダム断片化、続く、PCRを用いてのアセ
ンブリーによるインビトロ相同組換えにより生成される。この技法は、前記工程
中に追加の変動性を導入するために、親遺伝子のファミリー、例えば異なった種
からの対立遺伝子変異体又は遺伝子を用いて改良され得る。所望する活性の選択
又はスクリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有
害な変化に対して同時に選択しながら、所望する突然変異について選択すること
によって、配列の急速な“進化”を提供する。
【0062】
多くの場合、最後ポリペプチド生成物の構造は、宿主細胞による発生期ポリペ
プチド鎖のプロセッシングに起因し、従って、宿主細胞により生成されるzFGF12
ポリペプチドの最終配列は、発現されたポリヌクレオチドによりコードされる完
全な配列に必ずしも対応するとは限らないであろう。例えば、培養された哺乳類
細胞における完全なzFGF12配列の発現は、少なくとも分泌ペプチドの除去をもた
らすことが予測され、同時に、原核細胞において生成される同じポリペプチドは
切断されることが予測されない。個々の鎖の示差プロセッシングは、発現された
ポリペプチドの異種性をもたらすことができる。
プチド鎖のプロセッシングに起因し、従って、宿主細胞により生成されるzFGF12
ポリペプチドの最終配列は、発現されたポリヌクレオチドによりコードされる完
全な配列に必ずしも対応するとは限らないであろう。例えば、培養された哺乳類
細胞における完全なzFGF12配列の発現は、少なくとも分泌ペプチドの除去をもた
らすことが予測され、同時に、原核細胞において生成される同じポリペプチドは
切断されることが予測されない。個々の鎖の示差プロセッシングは、発現された
ポリペプチドの異種性をもたらすことができる。
【0063】
配列番号3は、配列番号2のzFGF12ポリペプチド(アミノ酸1又は25〜251)
をコードするすべてのポリヌクレオチドを包含する変性ポリヌクレオチド配列で
ある。従って、配列番号3のヌクレオチド1又は72〜753の範囲のzFGF12ポリペ
プチドコードのポリヌクレオチドが、本発明により企画される。配列番号3の類
似する領域から形成される、配列番号1に関しての上記のようなフラグメント及
び融合体がまた、本発明により企画され、ここで配列番号3のヌクレオチド1又
は72〜753は、成熟zFGF12分子のコードに関して、配列番号1のヌクレオチド115
又は187〜870に対応する。
をコードするすべてのポリヌクレオチドを包含する変性ポリヌクレオチド配列で
ある。従って、配列番号3のヌクレオチド1又は72〜753の範囲のzFGF12ポリペ
プチドコードのポリヌクレオチドが、本発明により企画される。配列番号3の類
似する領域から形成される、配列番号1に関しての上記のようなフラグメント及
び融合体がまた、本発明により企画され、ここで配列番号3のヌクレオチド1又
は72〜753は、成熟zFGF12分子のコードに関して、配列番号1のヌクレオチド115
又は187〜870に対応する。
【0064】
配列番号3における記号が、下記第2表に要約される。
【表2】
【0065】
所定のアミノ酸についてのすべての可能なコドンを包含する、配列番号3に使
用される縮重コドンが第3表に示される。
用される縮重コドンが第3表に示される。
【表3】
【0066】
当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可
能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するで
あろう。例えば、セリン(WSN)のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギ
ニン(AGR)をコードすることができ、そしてアルギニン(MGN)のための縮重コ
ドンは、ある環境下で、セリン(AGY)をコードすることができる。類似する関
係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って
、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配
列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号2のアミノ酸配列へ
の参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列
は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。
能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するで
あろう。例えば、セリン(WSN)のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギ
ニン(AGR)をコードすることができ、そしてアルギニン(MGN)のための縮重コ
ドンは、ある環境下で、セリン(AGY)をコードすることができる。類似する関
係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って
、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配
列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号2のアミノ酸配列へ
の参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列
は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。
【0067】
当業者はまた、異なった種が“選択的コドン使用法”を示すことも理解するで
あろう。一般的には、Grantham,など., Nuc. Acids Res. 8: 1893−912, 1980;
Haas, など., Curr. Biol. 6: 315−24, 1996; Wain−Hobson、など.,Gene 1
3:355−64,1981;Grosjean and Fiera,Gene 18:199−209、1982;Holm,N
uc.Acids Res.14:3075−87、1986;Ikemura,J.Mol.Biol.158:573−97
,1982を参照のこと。本明細書において使用される場合、用語、“選択的コドン
使用法”又は“選択的コドン”とは、一定の種の細胞に最も頻繁に使用され、従
って個々のアミノ酸をコードする可能なコドンの1又は少数の代表を好むタンパ
ク質翻訳コドンを言及する技術的用語である(第3表を参照のこと)。
あろう。一般的には、Grantham,など., Nuc. Acids Res. 8: 1893−912, 1980;
Haas, など., Curr. Biol. 6: 315−24, 1996; Wain−Hobson、など.,Gene 1
3:355−64,1981;Grosjean and Fiera,Gene 18:199−209、1982;Holm,N
uc.Acids Res.14:3075−87、1986;Ikemura,J.Mol.Biol.158:573−97
,1982を参照のこと。本明細書において使用される場合、用語、“選択的コドン
使用法”又は“選択的コドン”とは、一定の種の細胞に最も頻繁に使用され、従
って個々のアミノ酸をコードする可能なコドンの1又は少数の代表を好むタンパ
ク質翻訳コドンを言及する技術的用語である(第3表を参照のこと)。
【0068】
例えば、アミノ酸トレオニン(Thr)は、ACA、ACC、ACG、又はACTによりコー
ドされるが、しかし哺乳類細胞においては、ACCが最も通常に使用されるコドン
であり;他の種においては、例えば昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌において
は、異なったThrコドンが好ましい。特定の種のための選択的コドンは、当業界
において知られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入さ
れ得る。
ドされるが、しかし哺乳類細胞においては、ACCが最も通常に使用されるコドン
であり;他の種においては、例えば昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌において
は、異なったThrコドンが好ましい。特定の種のための選択的コドンは、当業界
において知られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入さ
れ得る。
【0069】
例えば、組換えDNA中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は種内
でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を
増強する。従って、配列番号4に開示される縮重コドン配列は、当業界において
通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種において
ポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを含む
配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される
官能性について試験され得る。
でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を
増強する。従って、配列番号4に開示される縮重コドン配列は、当業界において
通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種において
ポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを含む
配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される
官能性について試験され得る。
【0070】
zFGF12における高く保存されたアミノ酸は、新規ファミリーメンバーを同定す
るための手段として使用され得る。ESTデータベースにおける新規ファミリーメ
ンバーを同定するためには、保存されたCXFXEモチーフ(配列番号5)が使用さ
れ得る。ポリヌクレオチドプローブ及びハイブリダイゼーション方法を用いるも
う1つの方法においては、種々の組織源から得られたRNAが、cDNAライブラリーを
生成し、そして新規ファミリーメンバーのためのそれらのライブラリーをプロー
ブするために使用され得る。特に、逆転写−ポリメラーゼ鎖反応(RT−PCR)は
、配列番号2のアミノ酸残基113(Cys)〜アミノ酸残基117(His)に対応する配
列から企画された高い変性のDNAプライマーをコードする配列を増幅するために
使用され得る。
るための手段として使用され得る。ESTデータベースにおける新規ファミリーメ
ンバーを同定するためには、保存されたCXFXEモチーフ(配列番号5)が使用さ
れ得る。ポリヌクレオチドプローブ及びハイブリダイゼーション方法を用いるも
う1つの方法においては、種々の組織源から得られたRNAが、cDNAライブラリーを
生成し、そして新規ファミリーメンバーのためのそれらのライブラリーをプロー
ブするために使用され得る。特に、逆転写−ポリメラーゼ鎖反応(RT−PCR)は
、配列番号2のアミノ酸残基113(Cys)〜アミノ酸残基117(His)に対応する配
列から企画された高い変性のDNAプライマーをコードする配列を増幅するために
使用され得る。
【0071】
zFGF12遺伝子は、染色体12に由来し、そして12p.1.3に位置している(Genome C
atalog, Oakridge National Laboratory, Oakridge, TN)。従って、本発明は、z
FGF12タンパク質の異常発現に関連する染色体障害を同定するために、zFGF12ポ
リヌクレオチド及びポリペプチドを用いる方法を提供する。zFGF12遺伝子座での
検出できる染色体突然変異は、異数性、遺伝子コピー数変化、トランスロケーシ
ョン、挿入、欠失、制限部位変更及び転位を包含するが、但しそれらだけには限
定されない。
atalog, Oakridge National Laboratory, Oakridge, TN)。従って、本発明は、z
FGF12タンパク質の異常発現に関連する染色体障害を同定するために、zFGF12ポ
リヌクレオチド及びポリペプチドを用いる方法を提供する。zFGF12遺伝子座での
検出できる染色体突然変異は、異数性、遺伝子コピー数変化、トランスロケーシ
ョン、挿入、欠失、制限部位変更及び転位を包含するが、但しそれらだけには限
定されない。
【0072】
そのような異常性は、分子遺伝学的技法、例えば制限フラグメント長さ多型現
象(RELP)分析、PCR技法を用いる短いタンデム反復体(STR)分析、及び当業界
において知られている他の遺伝子連鎖分析技法を用いることによって、本発明の
ポリヌクレオチドを用いて検出され得る(Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, 2nd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cols Spring Harbor, NY,
1989, 及びAusubelなど., eds., Current Protocols in Molecular Biology, J
ohn Wiley and Sons, Inc. NY, 1987; A.J. Marian, Chest 108: 255-65, 1995
)。
象(RELP)分析、PCR技法を用いる短いタンデム反復体(STR)分析、及び当業界
において知られている他の遺伝子連鎖分析技法を用いることによって、本発明の
ポリヌクレオチドを用いて検出され得る(Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, 2nd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cols Spring Harbor, NY,
1989, 及びAusubelなど., eds., Current Protocols in Molecular Biology, J
ohn Wiley and Sons, Inc. NY, 1987; A.J. Marian, Chest 108: 255-65, 1995
)。
【0073】
DNAサンプルの分析は、正常なzFGF12 DNA標準にサンプルDNAを比較することに
よって、増幅されたDNA生成物におけるサイズの変化により欠失及び挿入を検出
することができる。二本鎖DNAにおけるミスマッチは、溶解温度におけるRNアー
ゼ消化又は差異により検出され得る。配列における差異を検出するための他の方
法は、電気泳動移動度の変化、サザン分析、及び直接的なDNA配列決定を包含す
る。最近、高密度アレイによる遺伝子情報にアクセスするための技法が利用され
ており(Cheeなど., Science 274: 610-614, 1996)、そして高い識別でゲノムD
NAの大きなフラグメントを分析することができる。
よって、増幅されたDNA生成物におけるサイズの変化により欠失及び挿入を検出
することができる。二本鎖DNAにおけるミスマッチは、溶解温度におけるRNアー
ゼ消化又は差異により検出され得る。配列における差異を検出するための他の方
法は、電気泳動移動度の変化、サザン分析、及び直接的なDNA配列決定を包含す
る。最近、高密度アレイによる遺伝子情報にアクセスするための技法が利用され
ており(Cheeなど., Science 274: 610-614, 1996)、そして高い識別でゲノムD
NAの大きなフラグメントを分析することができる。
【0074】
zFGF12ポリヌクレオチド配列を用いての染色体DNAの分析は、zFGF12遺伝子が
存在する染色体に位置する突然変異と疾病とを関連づけるために有用である。zF
GF12遺伝子の配列における突然変異(そのような突然変異は正常な個人には存在
しない)と関連する疾病を示す個人のDNA配列、cDNA及び/又はゲノムDNAの研究
は、疾病の原因要因として突然変異についての強い証拠を提供することができる
。1つの態様においては、本発明の方法は、個人からのサンプルにおけるzFGF12
染色体異常性を検出するための方法を提供し、ここで前記方法は、(a)サンプ
ルからzFGF12 RNAを獲得し;(b)ポリメラーゼ鎖反応によりzFGF12 cDNAを生
成し;そして(c)配列番号1に示されるような核酸配列に、前記zFGF12 cDNA
の核酸配列を比較することを含んで成る。
存在する染色体に位置する突然変異と疾病とを関連づけるために有用である。zF
GF12遺伝子の配列における突然変異(そのような突然変異は正常な個人には存在
しない)と関連する疾病を示す個人のDNA配列、cDNA及び/又はゲノムDNAの研究
は、疾病の原因要因として突然変異についての強い証拠を提供することができる
。1つの態様においては、本発明の方法は、個人からのサンプルにおけるzFGF12
染色体異常性を検出するための方法を提供し、ここで前記方法は、(a)サンプ
ルからzFGF12 RNAを獲得し;(b)ポリメラーゼ鎖反応によりzFGF12 cDNAを生
成し;そして(c)配列番号1に示されるような核酸配列に、前記zFGF12 cDNA
の核酸配列を比較することを含んで成る。
【0075】
さらなる態様においては、サンプルにおけるzFGF12 cDNA又はzFGF12遺伝子の
配列と配列番号1で示されるようなzFGF12配列との間の差異が、zFGF12染色体突
然変異の表示である。他の態様においては、イントロン、スプライス受容体又は
スプライスドナー異常性が、標準のゲノム配列に患者からのゲノム配列を比較す
ることにより検出され得る。
配列と配列番号1で示されるようなzFGF12配列との間の差異が、zFGF12染色体突
然変異の表示である。他の態様においては、イントロン、スプライス受容体又は
スプライスドナー異常性が、標準のゲノム配列に患者からのゲノム配列を比較す
ることにより検出され得る。
【0076】
本発明はまた、ZFGF12に遺伝子発現についての診断アッセイを行うための、又
は対象のZFGF12遺伝子座を分析するためのキットを企画する。そのようなキット
は、核酸プローブ、例えば配列番号1のヌクレオチド配列又はそのフラグメント
を含んで成る二本鎖核酸分子、及び配列番号1のヌクレオチド配列の補体又はそ
のフラグメントを有する一本鎖核酸分子を含んで成る。プローブ分子は、DNA, R
NA, オリゴヌクレオチド及び同様のものであり得る。キットは、PCRを行うため
の核酸プライマーを含んで成る。
は対象のZFGF12遺伝子座を分析するためのキットを企画する。そのようなキット
は、核酸プローブ、例えば配列番号1のヌクレオチド配列又はそのフラグメント
を含んで成る二本鎖核酸分子、及び配列番号1のヌクレオチド配列の補体又はそ
のフラグメントを有する一本鎖核酸分子を含んで成る。プローブ分子は、DNA, R
NA, オリゴヌクレオチド及び同様のものであり得る。キットは、PCRを行うため
の核酸プライマーを含んで成る。
【0077】
そのようなキットは、上記核酸診断アッセイを行うためのすべての必要な要素
を含むことができる。キットは、ZFGF12プローブ又はプライマーを含んで成る少
なくとも1つの容器を含んで成る。前記キットはまた、ZFGF12配列の存在を示す
ことができる1又は複数の試薬を含んで成る第2容器も含んで成る。そのような
インジケーター試薬の例は、検出できるラベル、例えば放射性ラベル、蛍光色素
、化学発光剤及び同様のものを包含する。
を含むことができる。キットは、ZFGF12プローブ又はプライマーを含んで成る少
なくとも1つの容器を含んで成る。前記キットはまた、ZFGF12配列の存在を示す
ことができる1又は複数の試薬を含んで成る第2容器も含んで成る。そのような
インジケーター試薬の例は、検出できるラベル、例えば放射性ラベル、蛍光色素
、化学発光剤及び同様のものを包含する。
【0078】
キットはまた、ZFGF12プローブ及びプライマーがZFGF12遺伝子発現を検出する
ために使用される、使用者に運ぶための手段も包含する。例えば、説明書は、封
入される核酸分子が、ZFGF12をコードする核酸分子、又はZFGF12コードのヌクレ
オチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸分子を検出する
ために、又はZFGF12遺伝子座に関連する染色体配列を分析するために使用され得
る。その説明書の材料は、容器に直接的に適用され得、又はその材料は、パッケ
ージング挿入体の形で供給され得る。
ために使用される、使用者に運ぶための手段も包含する。例えば、説明書は、封
入される核酸分子が、ZFGF12をコードする核酸分子、又はZFGF12コードのヌクレ
オチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸分子を検出する
ために、又はZFGF12遺伝子座に関連する染色体配列を分析するために使用され得
る。その説明書の材料は、容器に直接的に適用され得、又はその材料は、パッケ
ージング挿入体の形で供給され得る。
【0079】
本発明の好ましい態様においては、単離された核酸分子は、緊縮条件下で、配
列番号1又は3のヌクレオチド配列の少なくとも一部を有する核酸分子、又はそ
れらの配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイ
ズすることができる。1対の核酸分子、例えばDNA-DNA, RNA-RNA及びDNA-RNAは
、ヌクレオチド配列がいくらかの程度の相補性を有する場合、ハイブリダイズす
ることができる。ハイブリッド二重ヘリックスにおけるミスマッチ塩基対を許容
できるが、しかしハイブリッドの安定性はミスマッチの程度により影響される。
ミスマッチハイブリッドのTmは、1〜1.5%の塩基対ミスマッチごとに1℃低下
する。ハイブリダイゼーション条件の緊縮性の変更は、ハイブリッドに存在する
であろうミスマッチの程度に対する制御を可能にする。
列番号1又は3のヌクレオチド配列の少なくとも一部を有する核酸分子、又はそ
れらの配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイ
ズすることができる。1対の核酸分子、例えばDNA-DNA, RNA-RNA及びDNA-RNAは
、ヌクレオチド配列がいくらかの程度の相補性を有する場合、ハイブリダイズす
ることができる。ハイブリッド二重ヘリックスにおけるミスマッチ塩基対を許容
できるが、しかしハイブリッドの安定性はミスマッチの程度により影響される。
ミスマッチハイブリッドのTmは、1〜1.5%の塩基対ミスマッチごとに1℃低下
する。ハイブリダイゼーション条件の緊縮性の変更は、ハイブリッドに存在する
であろうミスマッチの程度に対する制御を可能にする。
【0080】
緊縮性の程度は、ハイブリダイゼーション温度が上昇し、そしてハイブリダイ
ゼーション緩衝液のイオン強度が低下するにつれて、上昇する。緊縮ハイブリダ
イゼーション条件は、ハイブリッドの熱溶融点(Tm)よりも約5〜25℃低い温度
、及び1MまでのNa+を有するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。より
低い温度でのより高い温度の緊縮性は、緩衝溶液における個々の1%ホルムアミ
ドについて約1℃、ハイブリッドのTmを低めるホルムアミドの添加により達成さ
れ得る。一般的に、そのような緊縮条件は、20〜70℃の温度、及び6×SSC及び
0〜50%のホルムアミドを含むハイブリッド緩衝液を包含する。
ゼーション緩衝液のイオン強度が低下するにつれて、上昇する。緊縮ハイブリダ
イゼーション条件は、ハイブリッドの熱溶融点(Tm)よりも約5〜25℃低い温度
、及び1MまでのNa+を有するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。より
低い温度でのより高い温度の緊縮性は、緩衝溶液における個々の1%ホルムアミ
ドについて約1℃、ハイブリッドのTmを低めるホルムアミドの添加により達成さ
れ得る。一般的に、そのような緊縮条件は、20〜70℃の温度、及び6×SSC及び
0〜50%のホルムアミドを含むハイブリッド緩衝液を包含する。
【0081】
高い程度の緊縮性は、40〜70℃の温度で及び4×SSC及び0〜50%のホルムア
ミドを有するハイブリダイゼーション緩衝液により達成され得る。高い緊縮条件
は典型的には、42〜70℃の温度、及び1×SSC及び0〜50%のホルムアミドを有
するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。異なった程度の緊縮液が、標的
配列への最大の特異的結合を達成するために、ハイブリダイゼーション、及び洗
浄の間、使用され得る。典型的には、ハイブリダイゼーションに続く洗浄は、ハ
イブリダイズされた複合体からハイブリダイズされていないポリヌクレオチドプ
ローブを除去するために、上昇する程度の緊縮性で行われる。
ミドを有するハイブリダイゼーション緩衝液により達成され得る。高い緊縮条件
は典型的には、42〜70℃の温度、及び1×SSC及び0〜50%のホルムアミドを有
するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。異なった程度の緊縮液が、標的
配列への最大の特異的結合を達成するために、ハイブリダイゼーション、及び洗
浄の間、使用され得る。典型的には、ハイブリダイゼーションに続く洗浄は、ハ
イブリダイズされた複合体からハイブリダイズされていないポリヌクレオチドプ
ローブを除去するために、上昇する程度の緊縮性で行われる。
【0082】
上記条件は、ガイドとして作用することを意味し、そしてそれは特定のポリペ
プチドハイブリッドとの使用のためのそれらの条件を適合するために、十分に当
業者の能力の範囲内である。特定の標的配列についてのTmは、標的配列の50%が
完全に適合されたプローブ配列にハイブリダイズするであろう温度(定義された
条件下での)である。Tmに影響を及ぼすそれらの条件は、ポリヌクレオチドプロ
ーブのサイズ及び塩基対含有率、ハイブリダイゼーション溶液のイオン温度、及
びハイブリダイゼーション溶液における不安定化剤の存在を包含する。
プチドハイブリッドとの使用のためのそれらの条件を適合するために、十分に当
業者の能力の範囲内である。特定の標的配列についてのTmは、標的配列の50%が
完全に適合されたプローブ配列にハイブリダイズするであろう温度(定義された
条件下での)である。Tmに影響を及ぼすそれらの条件は、ポリヌクレオチドプロ
ーブのサイズ及び塩基対含有率、ハイブリダイゼーション溶液のイオン温度、及
びハイブリダイゼーション溶液における不安定化剤の存在を包含する。
【0083】
Tmを計算するための多くの等式は当業界において知られており、そして種々の
長さのDNA、RNA及びDNA−RNAハイブリッド及びポリヌクレオチドプローブ配列に
対して特異的である(例えば、Sambrook など., Molecular Cloning: A Laborat
ory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1988); Ausubel な
ど., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons
, Inc. 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techn
iques, (Academic Press, Inc. 1987); 及びWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)を参照のこと)。
長さのDNA、RNA及びDNA−RNAハイブリッド及びポリヌクレオチドプローブ配列に
対して特異的である(例えば、Sambrook など., Molecular Cloning: A Laborat
ory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1988); Ausubel な
ど., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons
, Inc. 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techn
iques, (Academic Press, Inc. 1987); 及びWetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)を参照のこと)。
【0084】
配列分析ソフトウェア、例えばOLIGO6.0(LSR; Long Lake, MN)及びPrimer P
remier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA), 並びにインタ
ーネット上のサイトが所定の配列を分析し、そして使用者の定義された基準に基
づいてTmを計算するための手段を入手できる。そのようなプログラムはまた、定
義された条件下で所定の配置を分析し、そして適切なプローブ配列を同定するこ
とができる。典型的には、50以上の塩基対の長いポリヌクレオチド配列のハイブ
リダイゼーションは、計算されたTmよりも約20〜25℃低い温度で行われる。50以
下の塩基対の小さなプローブに関しては、ハイブリダイゼーションは典型的には
、Tm又はそれよりも5〜10℃以下で行われる。これは、DNA−DNA及びDNA−RNAハ
イブリッドに関して、最大速度のハイブリダイゼーションを可能にする。
remier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA), 並びにインタ
ーネット上のサイトが所定の配列を分析し、そして使用者の定義された基準に基
づいてTmを計算するための手段を入手できる。そのようなプログラムはまた、定
義された条件下で所定の配置を分析し、そして適切なプローブ配列を同定するこ
とができる。典型的には、50以上の塩基対の長いポリヌクレオチド配列のハイブ
リダイゼーションは、計算されたTmよりも約20〜25℃低い温度で行われる。50以
下の塩基対の小さなプローブに関しては、ハイブリダイゼーションは典型的には
、Tm又はそれよりも5〜10℃以下で行われる。これは、DNA−DNA及びDNA−RNAハ
イブリッドに関して、最大速度のハイブリダイゼーションを可能にする。
【0085】
ヌクレオチド配列の長さは、ハイブリッド形成の速度及び安定性に影響を及ぼ
す。小さなプローブ配列、すなわち50個以下の塩基対は、相補的配列との平衡化
にすばやく達するが、しかし安定したハイブリッドは形成されない。インキュベ
ーション時間(およそ分〜時)が、ハイブリッド形成を達成するために使用され
得る。より長いプローブ配列はよりゆっくりと平衡化するが、しかし低い温度で
さえ、より安定した複合体を形成する。インキュベーションは、一晩又はそれ以
上の間、進行せしめられる。一般的に、インキュベーションは、計算されたコッ
ト時間の3倍に等しい期間、行われ得る。コット時間、すなわちポリヌクレオチ
ド配列が再会合するのにかかる時間は、当業界において知られている方法により
、特定の配列について計算され得る。
す。小さなプローブ配列、すなわち50個以下の塩基対は、相補的配列との平衡化
にすばやく達するが、しかし安定したハイブリッドは形成されない。インキュベ
ーション時間(およそ分〜時)が、ハイブリッド形成を達成するために使用され
得る。より長いプローブ配列はよりゆっくりと平衡化するが、しかし低い温度で
さえ、より安定した複合体を形成する。インキュベーションは、一晩又はそれ以
上の間、進行せしめられる。一般的に、インキュベーションは、計算されたコッ
ト時間の3倍に等しい期間、行われ得る。コット時間、すなわちポリヌクレオチ
ド配列が再会合するのにかかる時間は、当業界において知られている方法により
、特定の配列について計算され得る。
【0086】
ポリヌクレオチド配列の塩基対組成が、ハイブリッド複合体の熱安定性をもた
らし、それにより、ハイブリダイゼーション温度の選択及びハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液のイオン強度に影響を及ぼす。A−T対は、塩化ナトリウムを含む水溶
液においてG−C対よりも低い安定性である。従って、G−C含有率が高いほど、ハ
イブリッドはより安定する。配列内のG及びC残基の平等な分布がまた、ハイブリ
ッド安定性に正に寄与する。さらに、塩基対組成は、所定の配列のTmを変えるた
めに操作され得る。例えば5−メチルデオキシシヂンは、デオキシシスチジンよ
り置換され得、そして5−ブロモデオキシウリジンは、デオキシシチジンにより
置換され得、そして5−ブロモデオキシウリジンはTmを高めるためにチミジンに
より置換され、そして7−デアズ−2’−デオキシグアノシンは、Tmに対する依
存性を低めるためにグアノシンにより置換され得る。
らし、それにより、ハイブリダイゼーション温度の選択及びハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液のイオン強度に影響を及ぼす。A−T対は、塩化ナトリウムを含む水溶
液においてG−C対よりも低い安定性である。従って、G−C含有率が高いほど、ハ
イブリッドはより安定する。配列内のG及びC残基の平等な分布がまた、ハイブリ
ッド安定性に正に寄与する。さらに、塩基対組成は、所定の配列のTmを変えるた
めに操作され得る。例えば5−メチルデオキシシヂンは、デオキシシスチジンよ
り置換され得、そして5−ブロモデオキシウリジンは、デオキシシチジンにより
置換され得、そして5−ブロモデオキシウリジンはTmを高めるためにチミジンに
より置換され、そして7−デアズ−2’−デオキシグアノシンは、Tmに対する依
存性を低めるためにグアノシンにより置換され得る。
【0087】
ハイブリダイゼーション緩衝液のイオン濃度はまた、ハイブリッドの安定性に
影響を及ぼす。ハイブリダイゼーション緩衝液は一般的にブロッキング剤、例え
ばDenhardt溶液(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)、変性されたサケ精子
DNA、粉乳(BLOTTO)、ヘパリン又はSDS、及びNa+源、例えばSSC(1×SSC:0.
15:NのNaCl、15mMのクエン酸ナトリウム)又はSSPE(1×SSPE:1.8MのNaCl、1
0mMのNaH2PO4、1mMのEDTA、pH7.7)を含む。緩衝液のイオン濃度を低めることに
よって、ハイブリッドの安定性が高められる。
影響を及ぼす。ハイブリダイゼーション緩衝液は一般的にブロッキング剤、例え
ばDenhardt溶液(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)、変性されたサケ精子
DNA、粉乳(BLOTTO)、ヘパリン又はSDS、及びNa+源、例えばSSC(1×SSC:0.
15:NのNaCl、15mMのクエン酸ナトリウム)又はSSPE(1×SSPE:1.8MのNaCl、1
0mMのNaH2PO4、1mMのEDTA、pH7.7)を含む。緩衝液のイオン濃度を低めることに
よって、ハイブリッドの安定性が高められる。
【0088】
典型的には、ハイブリダイゼーション緩衝液は、10mM〜1MのNa+を含む。不
安定剤又は変性剤、例えば、ホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム塩、グ
アニジウムカチオン又はチオシアネートカチオンのハイブリダイゼーション溶液
への添加が、ハイブリッドのTmを変更するであろう。典型的には、ホルムアミド
が、より便利で且つ低い温度でのインキュベーションの実施を可能にするために
、50%までの濃度で使用される。ホルムアミドはまた、RNAプローブを用いる場
合、非特異的バッググラウンドを低めるためにも作用する。
安定剤又は変性剤、例えば、ホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム塩、グ
アニジウムカチオン又はチオシアネートカチオンのハイブリダイゼーション溶液
への添加が、ハイブリッドのTmを変更するであろう。典型的には、ホルムアミド
が、より便利で且つ低い温度でのインキュベーションの実施を可能にするために
、50%までの濃度で使用される。ホルムアミドはまた、RNAプローブを用いる場
合、非特異的バッググラウンドを低めるためにも作用する。
【0089】
これまでに示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、DNA及
びRNAを包含する。DNA及びRNAを調製するための方法は、当業界において良く知
られている。一般的には、RNAは、多量のzFGF12を生成する組織又は細胞から単
離される。そのような組織及び細胞は、ノザンブロット(Thomas, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77: 5201, 1980)により同定され、そして膵臓及び前立腺を包
含する。
びRNAを包含する。DNA及びRNAを調製するための方法は、当業界において良く知
られている。一般的には、RNAは、多量のzFGF12を生成する組織又は細胞から単
離される。そのような組織及び細胞は、ノザンブロット(Thomas, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77: 5201, 1980)により同定され、そして膵臓及び前立腺を包
含する。
【0090】
全RNAは、グアニジウム イソチオシアネート抽出、続くCsClグラジエントに
おける遠心分離による単離により調製され得る(Chirgwinなど.,Biochemistry 1
8:52−94, 1979)。ポリ(A)+ RNAは、Aviv and Leder (Proc.Natl. Acad. Sc
i.USA 69: 1408−1412, 1972 )の方法を用いて全RNAから調製される。相補的DNA
(cDNA)は、既知の方法を用いて、ポリ(A)+ RNAから調製される。次に、zFG
F12ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、例えばハイブリダイゼーシ
ョン又はポリメラーゼ鎖反応により同定され、そして単離される。
おける遠心分離による単離により調製され得る(Chirgwinなど.,Biochemistry 1
8:52−94, 1979)。ポリ(A)+ RNAは、Aviv and Leder (Proc.Natl. Acad. Sc
i.USA 69: 1408−1412, 1972 )の方法を用いて全RNAから調製される。相補的DNA
(cDNA)は、既知の方法を用いて、ポリ(A)+ RNAから調製される。次に、zFG
F12ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、例えばハイブリダイゼーシ
ョン又はポリメラーゼ鎖反応により同定され、そして単離される。
【0091】
zFGF12ポリペプチドをコードする十分な長さのクローンは、従来のクローニン
グ方法により得られる。相補的DNA(cDNA)クローンが好ましいが、但し、いく
つかの用途(例えば、トランスジェニック動物における発現)に関しては、ゲノ
ムクローンを使用し、又は少なくとも1つのゲノムイントロンを含むようcDNAク
ローンを修飾することが好ましい。cDNA及びゲノムクローンを調製するための方
法は、よく知られており、そして当業者のレベルの範囲内であり、そしてライブ
ラリーをプローブし又は感作するために、本明細書に開示される配列又はその一
部の使用を包含する。発現ライブラリーは、zFGF12に対する抗体、受容体フラグ
メント、又は他の特定の結合パートナーによりプローブされ得る。
グ方法により得られる。相補的DNA(cDNA)クローンが好ましいが、但し、いく
つかの用途(例えば、トランスジェニック動物における発現)に関しては、ゲノ
ムクローンを使用し、又は少なくとも1つのゲノムイントロンを含むようcDNAク
ローンを修飾することが好ましい。cDNA及びゲノムクローンを調製するための方
法は、よく知られており、そして当業者のレベルの範囲内であり、そしてライブ
ラリーをプローブし又は感作するために、本明細書に開示される配列又はその一
部の使用を包含する。発現ライブラリーは、zFGF12に対する抗体、受容体フラグ
メント、又は他の特定の結合パートナーによりプローブされ得る。
【0092】
本発明はさらに、他の種(オルト体)からの相対物リガンド及びポリヌクレオ
チドを供給する。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ラット、
ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類リガンドからのzFGF12ポリペプチ
ドである。
チドを供給する。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ラット、
ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類リガンドからのzFGF12ポリペプチ
ドである。
【0093】
ヒトタンパク質のオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明に
より供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、cDNAは
、タンパク質を発現する組織又は細胞型から得られるmRNAを用いてクローン化
され得る。mRNAの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプロー
ブによりノザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次に、ライ
ブラリーが陽性の組織又は細胞系のmRNAから調製される。
より供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、cDNAは
、タンパク質を発現する組織又は細胞型から得られるmRNAを用いてクローン化
され得る。mRNAの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプロー
ブによりノザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次に、ライ
ブラリーが陽性の組織又は細胞系のmRNAから調製される。
【0094】
次に、zFGF12コードのcDNAが種々の方法、例えば完全な又は部分的なヒトcD
NAにより、又は前記開示される配列に基づく1又は複数の変性プローブにより、
プローブすることによって単離され得る。cDNAはまた、本明細書に開示される
代表的なヒトznssp2ポリヌクレオチド配列から企画されたプライマーを用いて、
ポリメラーゼ鎖反応(PCR)(Mullis, アメリカ特許第4,683,202号)を用いても
クローン化され得る。さらなる方法においては、cDNAライブラリーが宿主細胞
を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるcDN
Aの発現がzFGF12に対する抗体により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノ
ム クローンの単離に適用され得る。
NAにより、又は前記開示される配列に基づく1又は複数の変性プローブにより、
プローブすることによって単離され得る。cDNAはまた、本明細書に開示される
代表的なヒトznssp2ポリヌクレオチド配列から企画されたプライマーを用いて、
ポリメラーゼ鎖反応(PCR)(Mullis, アメリカ特許第4,683,202号)を用いても
クローン化され得る。さらなる方法においては、cDNAライブラリーが宿主細胞
を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるcDN
Aの発現がzFGF12に対する抗体により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノ
ム クローンの単離に適用され得る。
【0095】
当業者は、配列番号1及び2に開示される配列がヒトzFGF12遺伝子及びポリペ
プチドの単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシ
ングが生じることが予測されることを認識するであろう。この配列の対立遺伝子
変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのcDNA又はゲノムライブラリ
ーをプローブすることによってクローン化され得る。配列番号1に示されるDNA
配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び
突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、配列番号2の対立遺
伝子変異体であるタンパク質と同じように、本発明の範囲内である。
プチドの単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシ
ングが生じることが予測されることを認識するであろう。この配列の対立遺伝子
変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのcDNA又はゲノムライブラリ
ーをプローブすることによってクローン化され得る。配列番号1に示されるDNA
配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び
突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、配列番号2の対立遺
伝子変異体であるタンパク質と同じように、本発明の範囲内である。
【0096】
本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン
化された突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自
動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。活性ポリペプチド(例えば
、細胞増殖)をコードする突然変異誘発されたDNA分子が、宿主細胞から回収さ
れ、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あ
るポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、
そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
化された突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自
動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。活性ポリペプチド(例えば
、細胞増殖)をコードする突然変異誘発されたDNA分子が、宿主細胞から回収さ
れ、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あ
るポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、
そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【0097】
本明細書において論じられた方法を用いて、当業者は、配列番号2の残基25(
Tyr)〜251(Ile)又は残基1(Met)〜251(Ile)に対して実質的に相同である種
々のポリペプチド、その対立遺伝子変異体、又はその生物学的活性のフラグメン
トを同定し、そして/又は調製することができ、そして野生型タンパク質の増殖
性質を保持することができる。そのようなポリペプチドは、一般的に上記に開示
されるような追加のポリペプチのセグメントを包含する。
Tyr)〜251(Ile)又は残基1(Met)〜251(Ile)に対して実質的に相同である種
々のポリペプチド、その対立遺伝子変異体、又はその生物学的活性のフラグメン
トを同定し、そして/又は調製することができ、そして野生型タンパク質の増殖
性質を保持することができる。そのようなポリペプチドは、一般的に上記に開示
されるような追加のポリペプチのセグメントを包含する。
【0098】
本発明のポリペプチド、例えば十分な長さのタンパク質、そのフラグメント及
び融合タンパク質は、従来の技法に従って、遺伝的に構築された宿主細胞におい
て生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性DNAにより形質転換又はトランスフ
ェクトされ得、そして培養において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして
細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含する。真核細胞、特に多細
胞生物の培養された細胞が好ましい。クローン化されたDNA分子を操作し、そし
て種々の宿主細胞中に外因性DNAを導入するための技法は次の文献に開示される
:Sambrool など., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, 及びAusub
el など., eds., Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley and So
ns, Ins., NY, 1987。
び融合タンパク質は、従来の技法に従って、遺伝的に構築された宿主細胞におい
て生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性DNAにより形質転換又はトランスフ
ェクトされ得、そして培養において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして
細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含する。真核細胞、特に多細
胞生物の培養された細胞が好ましい。クローン化されたDNA分子を操作し、そし
て種々の宿主細胞中に外因性DNAを導入するための技法は次の文献に開示される
:Sambrool など., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, 及びAusub
el など., eds., Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley and So
ns, Ins., NY, 1987。
【0099】
一般的に、本発明のzFGF12ポリペプチドをコードするDNA配列は、その発現の
ために必要とされる他の遺伝子的要素、例えば一般的に、発現ベクター内の転写
プロモーター及びターミネーターに操作可能的に連結される。ベクターはまた、
通常、1又は複数の選択マーカー及び1又は複数の複製の起点を含むであろうが
、しかし当業者は、一定のシステム内で、選択マーカーが別のベクター上に供給
され得、そして外因性DNAの複製が宿主細胞ゲノム中への組み込みにより供給さ
れ得ることを認識するであろう。
ために必要とされる他の遺伝子的要素、例えば一般的に、発現ベクター内の転写
プロモーター及びターミネーターに操作可能的に連結される。ベクターはまた、
通常、1又は複数の選択マーカー及び1又は複数の複製の起点を含むであろうが
、しかし当業者は、一定のシステム内で、選択マーカーが別のベクター上に供給
され得、そして外因性DNAの複製が宿主細胞ゲノム中への組み込みにより供給さ
れ得ることを認識するであろう。
【0100】
プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び要素の選択は、
当業者のレベルの範囲内の通常のことである。多くのそのような要素は文献に記
載されており、そして商業的供給者を通して入手できる。変更された表現型を導
入する他のマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、又は細胞表面タンパク質、例
えばCD4、CD8、クラスI MHC、胎盤アルカリホスファターゼが、FACS分類又は磁
気ビーズ分離技法のような手段により、トランスフェクトされていない細胞から
トランスフェクトされた細胞を分類するために使用される。
当業者のレベルの範囲内の通常のことである。多くのそのような要素は文献に記
載されており、そして商業的供給者を通して入手できる。変更された表現型を導
入する他のマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、又は細胞表面タンパク質、例
えばCD4、CD8、クラスI MHC、胎盤アルカリホスファターゼが、FACS分類又は磁
気ビーズ分離技法のような手段により、トランスフェクトされていない細胞から
トランスフェクトされた細胞を分類するために使用される。
【0101】
zFGF12ポリペプチドを、宿主細胞の分泌路中に方向づけるためには、分泌シグ
ナル配列(又は、シグナル配列、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列とし
ても知られている)が、発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列は、生来
の配列であり得、又はもう1つの分泌されたタンパク質(例えばt−PA及びα−
プレ−プロ分泌リーダー )に由来し、又は新たに合成され得る。分泌シグナル
配列は、zFGF12 DNA配列に正しく読み取り枠を整合して連結される。分泌シグ
ナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列の5’ 側に位置す
るが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるDNA配列の他の場所に位置する
こともできる(例えば、Welchなど.,アメリカ特許第5,037,743号;Hollandなど.
, アメリカ特許第5,143,830号を参照のこと)。
ナル配列(又は、シグナル配列、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列とし
ても知られている)が、発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列は、生来
の配列であり得、又はもう1つの分泌されたタンパク質(例えばt−PA及びα−
プレ−プロ分泌リーダー )に由来し、又は新たに合成され得る。分泌シグナル
配列は、zFGF12 DNA配列に正しく読み取り枠を整合して連結される。分泌シグ
ナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列の5’ 側に位置す
るが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるDNA配列の他の場所に位置する
こともできる(例えば、Welchなど.,アメリカ特許第5,037,743号;Hollandなど.
, アメリカ特許第5,143,830号を参照のこと)。
【0102】
他方では、本発明のポリペプチドに含まれる分泌シグナル配列は、分泌路中に
他のポリペプチドを方向づけるために使用される。本発明はそのような融合ポリ
ペプチドを提供する。シグナル融合ポリペプチドが製造され得、ここで配列番号
2のアミノ酸残基1−24に由来する分泌シグナル配列が当業界において知られて
いる方法及び本明細書に開示される方法を用いて、もう1つのポリペプチドに操
作可能的に連結されている。本発明の融合ポリペプチドに含まれる分泌シグナル
配列は好ましくは、分泌路中い追加のペプチドを方向づけるためにその追加のペ
プチドにアミノ末端的に融合される。そのような構造体は、当業界において知ら
れている多くの用途を有する。
他のポリペプチドを方向づけるために使用される。本発明はそのような融合ポリ
ペプチドを提供する。シグナル融合ポリペプチドが製造され得、ここで配列番号
2のアミノ酸残基1−24に由来する分泌シグナル配列が当業界において知られて
いる方法及び本明細書に開示される方法を用いて、もう1つのポリペプチドに操
作可能的に連結されている。本発明の融合ポリペプチドに含まれる分泌シグナル
配列は好ましくは、分泌路中い追加のペプチドを方向づけるためにその追加のペ
プチドにアミノ末端的に融合される。そのような構造体は、当業界において知ら
れている多くの用途を有する。
【0103】
例えば、それらの新規の分泌シグナル配列融合構造体は通常分泌されないタン
パク質の活性成分の分泌を方向づけることができる。そのような融合は、分泌路
を通してペプチドを方向づけるためにインビボ又はインビトロで使用され得る。
昆虫細胞は、オートグラファ・カリホルニカ( Autographa californica )核多
角体病ウィルス(AcNPV)に通常由来する組換えバキュロウィルスにより感染さ
れ得る。King, L. A. and Possee, R.D., The Baculovirus Exprossion System:
A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O’Reilly, D. R. ., Baculov
irus Expression Vector: A Laboratory Manual, New York, Oxford University
Press., 1994; 及びRichardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protoc
ols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995を参照
のこと。
パク質の活性成分の分泌を方向づけることができる。そのような融合は、分泌路
を通してペプチドを方向づけるためにインビボ又はインビトロで使用され得る。
昆虫細胞は、オートグラファ・カリホルニカ( Autographa californica )核多
角体病ウィルス(AcNPV)に通常由来する組換えバキュロウィルスにより感染さ
れ得る。King, L. A. and Possee, R.D., The Baculovirus Exprossion System:
A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O’Reilly, D. R. ., Baculov
irus Expression Vector: A Laboratory Manual, New York, Oxford University
Press., 1994; 及びRichardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protoc
ols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995を参照
のこと。
【0104】
組換えzFGF12バキュロウィルスを製造するための第2の方法は、Luckow ( Luc
kow, VA, など., J. Virol 67: 4566−79, 1993 ) により記載されるトランスポ
ゾンに基づくシステムを利用する。トランスファーベクターを利用するこのシス
テムは、Bac−to−BacTMキット(Life Technologies, Rockville, MD)として
市販されている。このシステムは、“bacmid” と呼ばれる大きなプラスミドと
して、E.コリに維持されるバキュロウィルスゲノム中に、zFGF12ポリペプチドを
コードするDNAを移動せしめるために、Tn7トランスポゾンを含むトランスファー
ベクター、pFastBacI TM (Life Technologies )を利用する。Hill−Perkins, M.
S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971−6, 1990; Bonning, B.C. など
., J. Gen. Virol. 75: 1551−6, 1994; 及びChazenbalk, G. D., and Rapopor
t, B., J. Biol Chem. 270: 1543−9,1995 を参照のこと。
kow, VA, など., J. Virol 67: 4566−79, 1993 ) により記載されるトランスポ
ゾンに基づくシステムを利用する。トランスファーベクターを利用するこのシス
テムは、Bac−to−BacTMキット(Life Technologies, Rockville, MD)として
市販されている。このシステムは、“bacmid” と呼ばれる大きなプラスミドと
して、E.コリに維持されるバキュロウィルスゲノム中に、zFGF12ポリペプチドを
コードするDNAを移動せしめるために、Tn7トランスポゾンを含むトランスファー
ベクター、pFastBacI TM (Life Technologies )を利用する。Hill−Perkins, M.
S. and Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71: 971−6, 1990; Bonning, B.C. など
., J. Gen. Virol. 75: 1551−6, 1994; 及びChazenbalk, G. D., and Rapopor
t, B., J. Biol Chem. 270: 1543−9,1995 を参照のこと。
【0105】
さらに、昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列により天然のzFGF12分泌
シグナル配列を置換しているトランスファーベクターが構成さえ得る。例えば、
エクジステロイド・グルコシルトランスフェラーゼ(EGT)、ミツバチMelittin
(Invitrogen, Carlsbad, CA) 又はバキュロウィルスgp67(PharMingem, San Die
go, CA)は、生来の分泌シグナル配列を置換するために、構造体に使用され得る
。さらに、トランスファーベクターは発現されたzFGF12ポリペプチドのC−又はN
−末端でエピトープ標識、例えばGlu−Glu エピトープ標識をコードするDNAと
のイン−フレーム融合体を含むことができる(Grussenmeyer, T. など., Peoc.
Natl. Acad. Sci. 82: 7952−6, 1985)。
シグナル配列を置換しているトランスファーベクターが構成さえ得る。例えば、
エクジステロイド・グルコシルトランスフェラーゼ(EGT)、ミツバチMelittin
(Invitrogen, Carlsbad, CA) 又はバキュロウィルスgp67(PharMingem, San Die
go, CA)は、生来の分泌シグナル配列を置換するために、構造体に使用され得る
。さらに、トランスファーベクターは発現されたzFGF12ポリペプチドのC−又はN
−末端でエピトープ標識、例えばGlu−Glu エピトープ標識をコードするDNAと
のイン−フレーム融合体を含むことができる(Grussenmeyer, T. など., Peoc.
Natl. Acad. Sci. 82: 7952−6, 1985)。
【0106】
当業界において知られている技法を用いて、zFGF12を含むトランスファーベク
ターにより、E.コリが形質転換され、そして組換えバキュロウィルスの表示であ
る断続的lacZ遺伝子を含むbacmida についてスクリーンされる。組換えバキュロ
ウィルスゲノムを含むbacmid DNA が、通常の技法を用いて単離され、そしてス
ポドプテラ・フルギペルダ( Spodoptera frugiperda )細胞、例えばSf9 細胞
をトランスフェクトするために使用される。zFGF12を発現する組換えウィルスが
結果的に生成される。組換えウィルス ストックは、当業者において通常使用さ
れる方法により製造される。
ターにより、E.コリが形質転換され、そして組換えバキュロウィルスの表示であ
る断続的lacZ遺伝子を含むbacmida についてスクリーンされる。組換えバキュロ
ウィルスゲノムを含むbacmid DNA が、通常の技法を用いて単離され、そしてス
ポドプテラ・フルギペルダ( Spodoptera frugiperda )細胞、例えばSf9 細胞
をトランスフェクトするために使用される。zFGF12を発現する組換えウィルスが
結果的に生成される。組換えウィルス ストックは、当業者において通常使用さ
れる方法により製造される。
【0107】
組換えウィルスは、宿主細胞、典型的には、アワヨトウの幼虫、スポドプテラ
・フルギペルダに由来する細胞系を感染せしめるために使用される。一般的には
、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applicati
on of Recombinant DNA, ASM Prss, Washington, D.C., 1994を参照のこと。も
う1つの適切な細胞系は、トリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)に由来するH
igh FiveOTM細胞系(Invitrogen)である(アメリカ特許第5,300,435号)。市販の
血清フリー培地が、細胞を増殖し、そして維持するために使用される。適切な培
地は、Sf9細胞のためには、SF900IITM (Life Technologies),又はEST 921TM(Ex
pression Systems); 及びT. ni 細胞のためには、Ex−CellO405TM(JRH Biosci
ences, Lenza, KS)又はExpress FiveOTM(Life Technologies )である。
・フルギペルダに由来する細胞系を感染せしめるために使用される。一般的には
、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applicati
on of Recombinant DNA, ASM Prss, Washington, D.C., 1994を参照のこと。も
う1つの適切な細胞系は、トリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)に由来するH
igh FiveOTM細胞系(Invitrogen)である(アメリカ特許第5,300,435号)。市販の
血清フリー培地が、細胞を増殖し、そして維持するために使用される。適切な培
地は、Sf9細胞のためには、SF900IITM (Life Technologies),又はEST 921TM(Ex
pression Systems); 及びT. ni 細胞のためには、Ex−CellO405TM(JRH Biosci
ences, Lenza, KS)又はExpress FiveOTM(Life Technologies )である。
【0108】
細胞は、約2〜5×105個の細胞〜1〜2×106個の細胞の接種密度から
増殖され、この時点で、組換えウィルスストックが、0.1〜10,より典型的にはほ
ぼ3の感染の多重度(MCI)で添加される。使用される方法は一般的に、入手で
きる実験用マニュアルに記載されている(King, L. A. and Possee, R. D., 前
記; O’Reilly, D. R. など., 前記;Richardson, C. D., 前記)。上清液から
のzFGF12ポリペプチドの続く精製は、本明細書に記載される方法を用いて達成さ
れ得る。
増殖され、この時点で、組換えウィルスストックが、0.1〜10,より典型的にはほ
ぼ3の感染の多重度(MCI)で添加される。使用される方法は一般的に、入手で
きる実験用マニュアルに記載されている(King, L. A. and Possee, R. D., 前
記; O’Reilly, D. R. など., 前記;Richardson, C. D., 前記)。上清液から
のzFGF12ポリペプチドの続く精製は、本明細書に記載される方法を用いて達成さ
れ得る。
【0109】
菌類細胞、例えば酵母細胞はまた、本発明内で使用され得る。これに関して、
特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevi
siae), ピチア・パストリス(Pichia pastoris)及びピチア・メタノリカ(pich
ia methanolica) を包含する。外因性DNAによりS. セレビシアエ細胞を形質転
換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばKawa
saki, アメリカ特許第4,599,311号;Kawasaki など., アメリカ特許第4,931,373
号;Brake, アメリカ特許第4,870,008号;Welchなど., アメリカ特許第5,037,74
3号;及びMurray など., アメリカ特許第4,845,075号により開示される。
特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevi
siae), ピチア・パストリス(Pichia pastoris)及びピチア・メタノリカ(pich
ia methanolica) を包含する。外因性DNAによりS. セレビシアエ細胞を形質転
換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばKawa
saki, アメリカ特許第4,599,311号;Kawasaki など., アメリカ特許第4,931,373
号;Brake, アメリカ特許第4,870,008号;Welchなど., アメリカ特許第5,037,74
3号;及びMurray など., アメリカ特許第4,845,075号により開示される。
【0110】
形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物
(例えばロイシン)の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択
される。サッカロミセス・セレビシアエへの使用のための好ましいベクターシス
テムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可
能にする、Kawasaki など. (アメリカ特許第4,931,373号)により開示されるPOT
1ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びター
ミネーターは、解糖酵素からのそれらを包含する(Cregg, アメリカ特許第4,882
,279 号)。
(例えばロイシン)の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択
される。サッカロミセス・セレビシアエへの使用のための好ましいベクターシス
テムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可
能にする、Kawasaki など. (アメリカ特許第4,931,373号)により開示されるPOT
1ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びター
ミネーターは、解糖酵素からのそれらを包含する(Cregg, アメリカ特許第4,882
,279 号)。
【0111】
アスペルギラス細胞は、Mcknight など.,アメリカ特許第4,935,349号の方法に
従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム(Acremonium chrysogenum
)を形質転換するための方法は、Sumino ., アメリカ特許第5,162,228号により
開示される。ニューロスポラ(Neurospora)を形質転換するための方法は、Lamb
owitz, アメリカ特許第4,486,533号により開示される。
従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム(Acremonium chrysogenum
)を形質転換するための方法は、Sumino ., アメリカ特許第5,162,228号により
開示される。ニューロスポラ(Neurospora)を形質転換するための方法は、Lamb
owitz, アメリカ特許第4,486,533号により開示される。
【0112】
組換えタンパク質の生成のための宿主としてのピチア・メタノリカの使用は、
WIPO公開WO97/17450, WO97/17451、WO98/02536及びWO98/02565に開示される
。P.メタノリカの形質転換に使用するためのDNA分子は通常、形質転換の前、好
ましくは線状化される、二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろう。P.
メタノリカにおけるポリペプチド生成のためには、プラスミドにおけるプロモー
ター及びターミネーターは、P.メタノリカ遺伝子、例えばP.メタノリカ アルコ
ール利用遺伝子(AUG1又はAUG2)のものであることが好ましい。他の有用なプ
ロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ(DHAS)、ギ酸デヒドロゲナー
ゼ(FMD)、及びカタラーゼ(CAT)遺伝子のものを包含する。
WIPO公開WO97/17450, WO97/17451、WO98/02536及びWO98/02565に開示される
。P.メタノリカの形質転換に使用するためのDNA分子は通常、形質転換の前、好
ましくは線状化される、二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろう。P.
メタノリカにおけるポリペプチド生成のためには、プラスミドにおけるプロモー
ター及びターミネーターは、P.メタノリカ遺伝子、例えばP.メタノリカ アルコ
ール利用遺伝子(AUG1又はAUG2)のものであることが好ましい。他の有用なプ
ロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ(DHAS)、ギ酸デヒドロゲナー
ゼ(FMD)、及びカタラーゼ(CAT)遺伝子のものを包含する。
【0113】
宿主染色体中へのDNAの組み込みを促進するためには、宿主DNA配列を両端に有
するプラスミドの完全な発現セグメントを有することが好ましい。ピチア メタ
ノリカへの使用のための好ましい選択マーカーは、アデニンの不在下でade2宿主
細胞の増殖を可能にする、ホスホリボシル−5−アミノイミダゾールカルボキシ
ラーゼ(AIRC; EC. 4.1.1.21)をコードするP.メタノリカADE2遺伝子である。メ
タノールの使用を最少にすることが所望される大規模産業方法のためには、両メ
タノール利用遺伝子(AUG1及びAUG2)が欠失されている宿主細胞を使用するこ
とが好ましい。
するプラスミドの完全な発現セグメントを有することが好ましい。ピチア メタ
ノリカへの使用のための好ましい選択マーカーは、アデニンの不在下でade2宿主
細胞の増殖を可能にする、ホスホリボシル−5−アミノイミダゾールカルボキシ
ラーゼ(AIRC; EC. 4.1.1.21)をコードするP.メタノリカADE2遺伝子である。メ
タノールの使用を最少にすることが所望される大規模産業方法のためには、両メ
タノール利用遺伝子(AUG1及びAUG2)が欠失されている宿主細胞を使用するこ
とが好ましい。
【0114】
分泌されたタンパク質の生成のためには、液胞プロテアーゼ遺伝子(PEP4及
びPRB1)を欠いている宿主細胞が好ましい。エレクトロポレーションが、P.メ
タノリカ細胞中への、興味あるポリペプチドをコードするDNAを含むプラスミド
の導入を促進するために使用される。2.5〜4.5kV/cm,好ましくは約3.75kV/cmの
電場の強さ、及び1〜40m秒、最も好ましくは約20m秒の時定数(t)を有する、指
数的に減衰する、パルスされた電場を用いて、エレクトロポレーションによりP.
メタノリカ細胞を形質転換することが好ましい。
びPRB1)を欠いている宿主細胞が好ましい。エレクトロポレーションが、P.メ
タノリカ細胞中への、興味あるポリペプチドをコードするDNAを含むプラスミド
の導入を促進するために使用される。2.5〜4.5kV/cm,好ましくは約3.75kV/cmの
電場の強さ、及び1〜40m秒、最も好ましくは約20m秒の時定数(t)を有する、指
数的に減衰する、パルスされた電場を用いて、エレクトロポレーションによりP.
メタノリカ細胞を形質転換することが好ましい。
【0115】
培養された哺乳類細胞または、本発明内の適切な宿主である。外因性DNAを 、
哺乳類宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシュウム−仲介トランス
フェクション(Wiglerなど., Cell 14 : 725, 1978; Corsaro and Pearson, Som
atic Cell Genetics 7 :603, 1981; Graham など., Virology 52; 456, 1973),
エレクトロポレーション( Neumann など., EMBO J. 1: 841−845, 1982 ); DEAE
−デキストラン仲介トランスフェクション(Ausubel など., 前記)、及びリポ
ソーム−仲介トランスフェクション(Hawley −Nelson など., Focus 15: 73, 1
993; Ciccarone など.,Focus 15: 80, 1993 )を包含する。
哺乳類宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシュウム−仲介トランス
フェクション(Wiglerなど., Cell 14 : 725, 1978; Corsaro and Pearson, Som
atic Cell Genetics 7 :603, 1981; Graham など., Virology 52; 456, 1973),
エレクトロポレーション( Neumann など., EMBO J. 1: 841−845, 1982 ); DEAE
−デキストラン仲介トランスフェクション(Ausubel など., 前記)、及びリポ
ソーム−仲介トランスフェクション(Hawley −Nelson など., Focus 15: 73, 1
993; Ciccarone など.,Focus 15: 80, 1993 )を包含する。
【0116】
培養された哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、例えばlevinson
など., アメリカ特許第4,713,339 号; Hagen など., アメリカ特許第4,784,950
号; Palmiter など., アメリカ特許第 4,579,821 号; 及びRingold, アメリカ
特許第 4,656,134 号により開示される。培養された適切な哺乳類細胞は、COS−
1(ATCC No. CRL 165)、COS−7(ATCC No. CRL 1651)、BHK(ATCC No. CRL 16
32)、BHK 570 (ATCC No. CRL 10314 )、293(ATCC No. CRL 1573 ; Graham
など., J. Gen. Viro. 36: 59−72, 1977 )、及びチャイニーズ ハムスター卵
巣(例えば CHO−K1; ATCC No. CCL61 )細胞系を包含する。
など., アメリカ特許第4,713,339 号; Hagen など., アメリカ特許第4,784,950
号; Palmiter など., アメリカ特許第 4,579,821 号; 及びRingold, アメリカ
特許第 4,656,134 号により開示される。培養された適切な哺乳類細胞は、COS−
1(ATCC No. CRL 165)、COS−7(ATCC No. CRL 1651)、BHK(ATCC No. CRL 16
32)、BHK 570 (ATCC No. CRL 10314 )、293(ATCC No. CRL 1573 ; Graham
など., J. Gen. Viro. 36: 59−72, 1977 )、及びチャイニーズ ハムスター卵
巣(例えば CHO−K1; ATCC No. CCL61 )細胞系を包含する。
【0117】
追加の適切な細胞系は当業界において知られており、そして公的な寄託所、例
えば American Type Culture Collection,Manassas,VAから入手できる。一般的
に、強い転写プロモーター、例えばSV−40 又はサイトメガロウィルスからのプ
ロモーターが好ましい。例えば、アメリカ特許第4,956,288 号を参照のこと。他
の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター(アメリ
カ特許 4,579,821 号及び第 4,601,978 号)、アデノウィルス主要後期プロモー
ターを包含する。
えば American Type Culture Collection,Manassas,VAから入手できる。一般的
に、強い転写プロモーター、例えばSV−40 又はサイトメガロウィルスからのプ
ロモーターが好ましい。例えば、アメリカ特許第4,956,288 号を参照のこと。他
の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター(アメリ
カ特許 4,579,821 号及び第 4,601,978 号)、アデノウィルス主要後期プロモー
ターを包含する。
【0118】
薬物選択は一般的に、外来性DNAが挿入されている、培養された哺乳類細胞を
選択するために使用される。そのような細胞は通常、“トランスフェクタント”
として言及される。選択剤の存在下で培養され、そしてそれらの子孫に興味ある
遺伝子を伝達することができる細胞は、“適切なトランスフェクタント”として
言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコ
ードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬物、例えばG−418又は同様の
もの存在下で実施される。
選択するために使用される。そのような細胞は通常、“トランスフェクタント”
として言及される。選択剤の存在下で培養され、そしてそれらの子孫に興味ある
遺伝子を伝達することができる細胞は、“適切なトランスフェクタント”として
言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコ
ードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬物、例えばG−418又は同様の
もの存在下で実施される。
【0119】
“増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現
レベルを高めるためにも使用される。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトラ
ンスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベル
で生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。
好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジ
ヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子(例えば、ヒグロマイシン
耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシン アセチルトランスフェラーゼ)もまた
、使用され得る。
レベルを高めるためにも使用される。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトラ
ンスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベル
で生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。
好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジ
ヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子(例えば、ヒグロマイシン
耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシン アセチルトランスフェラーゼ)もまた
、使用され得る。
【0120】
他の高等真核細胞、例えば植物細胞、昆虫細胞、及び鳥類細胞もまた、宿主と
して使用され得る。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしての
アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes )の使用は、Sin
karなど.、J. Biosci. ( Bangalore ) 11: 47−58, 1987 により再考されている
。昆虫細胞の形質転換、及びそこにおける外来性ポリペプチドの生成は、Guarin
o など.,アメリカ特許第5,162,222号;及びWIPOにより開示される。
して使用され得る。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしての
アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes )の使用は、Sin
karなど.、J. Biosci. ( Bangalore ) 11: 47−58, 1987 により再考されている
。昆虫細胞の形質転換、及びそこにおける外来性ポリペプチドの生成は、Guarin
o など.,アメリカ特許第5,162,222号;及びWIPOにより開示される。
【0121】
形質転換され又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の
増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来の
方法に従って培養される。種々の適切な培地、例えば定義された培地及び複合培
地は、当業界において知られており、そして一般的には、炭素源、窒素源、必須
アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要とされる場合、成長因子
又は血清のような成分も含むことができる。増殖培地は一般的に、外因的に付加
されたDNAを含む細胞を、例えば発現ベクター上に担持される選択マーカーによ
り補足され、又は宿主細胞中に同時トランスフェクトされる必須栄養物における
薬物選択又は栄養欠乏により選択するであろう。
増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来の
方法に従って培養される。種々の適切な培地、例えば定義された培地及び複合培
地は、当業界において知られており、そして一般的には、炭素源、窒素源、必須
アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要とされる場合、成長因子
又は血清のような成分も含むことができる。増殖培地は一般的に、外因的に付加
されたDNAを含む細胞を、例えば発現ベクター上に担持される選択マーカーによ
り補足され、又は宿主細胞中に同時トランスフェクトされる必須栄養物における
薬物選択又は栄養欠乏により選択するであろう。
【0122】
P.メタノリカ細胞は適切な炭素源、窒素源及び微量栄養物を含んでなる培地に
おいて、約25℃〜35℃の温度で培養される。液体培養物は、従来の手段、例
えば小さなフラスコの振盪又は発酵器のスパージングにより十分なエアレーショ
ンを提供される。P.メタノリカのための好ましい培養培地は、YEPD(2%D−グ
ルコース、2%のBactoTMペプトン(Difco Laboratories, Detroit, MI), 1%の
BactoTM 酵母抽出物(Difco Laboratories), 0.004%のアデニン及び0.006%の
L−ロイシン)である。
おいて、約25℃〜35℃の温度で培養される。液体培養物は、従来の手段、例
えば小さなフラスコの振盪又は発酵器のスパージングにより十分なエアレーショ
ンを提供される。P.メタノリカのための好ましい培養培地は、YEPD(2%D−グ
ルコース、2%のBactoTMペプトン(Difco Laboratories, Detroit, MI), 1%の
BactoTM 酵母抽出物(Difco Laboratories), 0.004%のアデニン及び0.006%の
L−ロイシン)である。
【0123】
本発明のポリペプチドを80%以上の純度、より好ましくは90%以上の純度、さ
らに好ましくは95%以上の純度に精製することが好ましく、そして汚染性高分子
、特に他のタンパク質及び核酸に対して、99.9%以上の純度であり、そして感染
性及び発熱性剤を有さない医薬的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、精
製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチド
を実質的に有さない。
らに好ましくは95%以上の純度に精製することが好ましく、そして汚染性高分子
、特に他のタンパク質及び核酸に対して、99.9%以上の純度であり、そして感染
性及び発熱性剤を有さない医薬的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、精
製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチド
を実質的に有さない。
【0124】
発現された組換え体zFGF12ポリペプチド(又はキメラzFGF12ポリペプチド)は
、分別及び/又は従来の精製方法及び媒体を用いて精製され得る。硫酸アンモニ
ウム沈殿及び酸又はカオトロピック剤抽出は、サンプルの分別のために使用され
る。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC及び逆相高
性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なクロマトグラフィー用媒体は、
誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、
特別なシリカ及び同様のものを包含する。PEI、DEAE、QAE及びQ誘導体が好まし
く、そしてDEAE Fast-Flow Sepharose(Pharmacia, Piscataway, NJ)が特に好ま
しい。
、分別及び/又は従来の精製方法及び媒体を用いて精製され得る。硫酸アンモニ
ウム沈殿及び酸又はカオトロピック剤抽出は、サンプルの分別のために使用され
る。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC及び逆相高
性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なクロマトグラフィー用媒体は、
誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、
特別なシリカ及び同様のものを包含する。PEI、DEAE、QAE及びQ誘導体が好まし
く、そしてDEAE Fast-Flow Sepharose(Pharmacia, Piscataway, NJ)が特に好ま
しい。
【0125】
典型的なクロマトグラフィー用媒体は、フェニル、ブチル又はオクチル基によ
り誘導体化されたもの、例えばフェニル−Sepharose FF(pharmacia),Toyopearl
ブチル650(Toso Haas, Montgomeryville, PA)、オクチル−Sepharrose (Pharm
acia)及び同様のもの;又はポリアクリル樹脂、例えばAmberchrom CG71 (Toso H
aas)及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基
材の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、
ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使用され
る条件下で不溶性である同様のものを包含する。それらの支持体は、アミノ基、
カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び/又は炭水化物成分に
よるタンパク質の結合を可能にする反応性基より変性され得る。
り誘導体化されたもの、例えばフェニル−Sepharose FF(pharmacia),Toyopearl
ブチル650(Toso Haas, Montgomeryville, PA)、オクチル−Sepharrose (Pharm
acia)及び同様のもの;又はポリアクリル樹脂、例えばAmberchrom CG71 (Toso H
aas)及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基
材の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、
ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使用され
る条件下で不溶性である同様のものを包含する。それらの支持体は、アミノ基、
カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び/又は炭水化物成分に
よるタンパク質の結合を可能にする反応性基より変性され得る。
【0126】
カップリング化学物質の例は、臭化シアン活性化、N−ヒドロキシスクシンイ
ミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化及び
カルボジイミド カップリング化学物質のためのカルボキシル及びアミノ誘導体
を包含する。それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知られており、そ
して広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。支持媒体に受容
体ポリペプチドを結合するための方法は当業界において良く知られている。特定
方法の選択は、通常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部決
定される。例えば、Affinity Chromatograpy: Principles & Methods, Pharmaci
a LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988を参照のこと。
ミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化及び
カルボジイミド カップリング化学物質のためのカルボキシル及びアミノ誘導体
を包含する。それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知られており、そ
して広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。支持媒体に受容
体ポリペプチドを結合するための方法は当業界において良く知られている。特定
方法の選択は、通常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部決
定される。例えば、Affinity Chromatograpy: Principles & Methods, Pharmaci
a LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988を参照のこと。
【0127】
本発明のポリペプチドはまた、それらのヘパリン結合性質の活用により単離さ
れ得る。再考のためには、Burgessなど., Ann. Rev. of Biochem. 58: 575-606,
1989を参照のこと。FGFファミリーのメンバーは、ヘパリン−セファロース親和
性クロマトグラフィーにより明白な均質性に精製され得(Gospodarowiczなど.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6963-6967, 1984)、そしてNaClの直線段階グラジ
エントを用いて溶出され得る(Ronなど., J. Biol. Chem. 268(4): 2984-2988,
1993: Chromatography. Principles & Methods, pp. 77-80, Pharmacia LKB Bio
technology. Uppsala, Sweden, 1993; in “Immobilized Affinity Ligand Tech
niques”, Hermanson など., eds., pp. 165-167, Academic Press, San Diego,
1992; Kjellen など., Ann. Rev. Biochem, Ann. Rev. Biochem. 60: 443-474.
1991; 及びKeなど., Protein Expr. Purif. 3(6); 497-507, 1992)。
れ得る。再考のためには、Burgessなど., Ann. Rev. of Biochem. 58: 575-606,
1989を参照のこと。FGFファミリーのメンバーは、ヘパリン−セファロース親和
性クロマトグラフィーにより明白な均質性に精製され得(Gospodarowiczなど.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6963-6967, 1984)、そしてNaClの直線段階グラジ
エントを用いて溶出され得る(Ronなど., J. Biol. Chem. 268(4): 2984-2988,
1993: Chromatography. Principles & Methods, pp. 77-80, Pharmacia LKB Bio
technology. Uppsala, Sweden, 1993; in “Immobilized Affinity Ligand Tech
niques”, Hermanson など., eds., pp. 165-167, Academic Press, San Diego,
1992; Kjellen など., Ann. Rev. Biochem, Ann. Rev. Biochem. 60: 443-474.
1991; 及びKeなど., Protein Expr. Purif. 3(6); 497-507, 1992)。
【0128】
他の精製方法は、ヒスチジンに富んでいるタンパク質を精製するために、固定
された金属イオン吸着(IMAC)クロマトグラフィーの使用を包含する。手短に言
及すれば、ゲルがまず、二価金属イオンにより荷電され、キレートが形成される
( Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1−7, 1985)。ヒスチジンに富んでいるタ
ンパク質が、使用される金属イオンに依存して、異なった親和性を有するこのマ
トリックスに吸着され、そして競争溶出、pHの低下、又は強いキレート化剤の
使用により溶出されるであろう。
された金属イオン吸着(IMAC)クロマトグラフィーの使用を包含する。手短に言
及すれば、ゲルがまず、二価金属イオンにより荷電され、キレートが形成される
( Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1−7, 1985)。ヒスチジンに富んでいるタ
ンパク質が、使用される金属イオンに依存して、異なった親和性を有するこのマ
トリックスに吸着され、そして競争溶出、pHの低下、又は強いキレート化剤の
使用により溶出されるであろう。
【0129】
他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマト
グラフィーによるグリコシル化されたタンパク質の精製を包含する(Methods in
Enzymol., Vol. 182, “Guide to Protein Purification”, M. Deutscher, (
ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529−39)。他方では、興味あるポ
リペプチド、及び親和性標識(例えばマルトース−結合タンパク質、FLAG標識、
Glu-Gku標識、免疫グロブリンドメイン)の融合体が、精製を促進するために構
成され得る。
グラフィーによるグリコシル化されたタンパク質の精製を包含する(Methods in
Enzymol., Vol. 182, “Guide to Protein Purification”, M. Deutscher, (
ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529−39)。他方では、興味あるポ
リペプチド、及び親和性標識(例えばマルトース−結合タンパク質、FLAG標識、
Glu-Gku標識、免疫グロブリンドメイン)の融合体が、精製を促進するために構
成され得る。
【0130】
タンパク質再生(及び任意には、再酸化)方法が好都合には、使用され得る。
タンパク質を80%以上の純度、より好ましくは90%以上の純度、さらに好ましく
は95%以上の純度に精製することが好ましく、そして汚染性高分子、特に他のタ
ンパク質及び核酸に対して、99.9%以上の純度であり、そして感染性及び発熱性
剤を有さない医薬的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、精製されたタン
パク質は、他のタンパク質、特に動物起源の他のタンパク質を実質的に有さない
。
タンパク質を80%以上の純度、より好ましくは90%以上の純度、さらに好ましく
は95%以上の純度に精製することが好ましく、そして汚染性高分子、特に他のタ
ンパク質及び核酸に対して、99.9%以上の純度であり、そして感染性及び発熱性
剤を有さない医薬的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、精製されたタン
パク質は、他のタンパク質、特に動物起源の他のタンパク質を実質的に有さない
。
【0131】
ZFGF12ポリペプチド又はそのフラグメントはまた、化学合成を通して調製され
得る。ZFGF12ポリペプチドは、モノマー又はマルチマーであり得;グリコシル化
されても、又はグリコシル化されなくても良く;PEG化されても、又はPEG化され
なくても良く;そして初期メチオニンアミノ酸残基を含むことができるか、又は
含まなくても良い。
得る。ZFGF12ポリペプチドは、モノマー又はマルチマーであり得;グリコシル化
されても、又はグリコシル化されなくても良く;PEG化されても、又はPEG化され
なくても良く;そして初期メチオニンアミノ酸残基を含むことができるか、又は
含まなくても良い。
【0132】
本発明のタンパク質をアッセイするためのインビボアプローチは、ウィルス供
給システムを包含する。この目的のための典型的なウィルスは、アデノウィルス
、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノ関連ウィルス(AAV)を包
含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖DNAウィルスは現在、異種拡散の供給
のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである(T. C. Beck
er など., Meth. Cell Bio. 43: 161−89, 1994; 及びJ. T. Douglas and D.T.
Curiel, Science & Medicine 4: 44−53, 1997 を参照のこと)。
給システムを包含する。この目的のための典型的なウィルスは、アデノウィルス
、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノ関連ウィルス(AAV)を包
含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖DNAウィルスは現在、異種拡散の供給
のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである(T. C. Beck
er など., Meth. Cell Bio. 43: 161−89, 1994; 及びJ. T. Douglas and D.T.
Curiel, Science & Medicine 4: 44−53, 1997 を参照のこと)。
【0133】
アデノウィルスシステムは次のいくつかの利点を付与する:( i )アデノウ
ィルスは比較的大きなDNA挿入体を適応せしめることができ;( ii )高い力価
に増殖され得;( iii )広範囲の哺乳類細胞型を感染せしめ;そして( iv )
異なったプロモーターを含む、多数の入手できるプロモーターと共に使用され得
る。また、アデノウィルスは血流において安定しているので、それらは静脈内注
射により投与され得る。
ィルスは比較的大きなDNA挿入体を適応せしめることができ;( ii )高い力価
に増殖され得;( iii )広範囲の哺乳類細胞型を感染せしめ;そして( iv )
異なったプロモーターを含む、多数の入手できるプロモーターと共に使用され得
る。また、アデノウィルスは血流において安定しているので、それらは静脈内注
射により投与され得る。
【0134】
アデノウィルスゲノムの一部を欠失することによって、異種DNAの大きな挿入
体(7kbまでの)が収容され得る。それらの挿入体は、直接的な連結により、又
は同時トランスフェクトされたプラスミドによる相同組換えによりウィルスDNA
中に組み込まれ得る。そしてウィルスは、E1遺伝子が宿主細胞(ヒト293細胞系
が典型である)により供給されなければ、複製しないであろう。損なわれていな
い動物に静脈内投与される場合、アデノウィルスは主に、肝臓を標的化する。ア
デノウィルス供給システムがE1遺伝子欠失を有する場合、ウィルスは宿主細胞
において複製することができない。
体(7kbまでの)が収容され得る。それらの挿入体は、直接的な連結により、又
は同時トランスフェクトされたプラスミドによる相同組換えによりウィルスDNA
中に組み込まれ得る。そしてウィルスは、E1遺伝子が宿主細胞(ヒト293細胞系
が典型である)により供給されなければ、複製しないであろう。損なわれていな
い動物に静脈内投与される場合、アデノウィルスは主に、肝臓を標的化する。ア
デノウィルス供給システムがE1遺伝子欠失を有する場合、ウィルスは宿主細胞
において複製することができない。
【0135】
しかしながら、宿主の組織(例えば、肝臓)は、異種タンパク質を発現し、そ
してプロセッシングするのであろう(そして、分泌シグナル配列が存在する場合
、分泌する)。分泌されたタンパク質は高く血管化された肝臓において循環に入
り、そして感染された動物に対する効果が決定され得る。
してプロセッシングするのであろう(そして、分泌シグナル配列が存在する場合
、分泌する)。分泌されたタンパク質は高く血管化された肝臓において循環に入
り、そして感染された動物に対する効果が決定され得る。
【0136】
アデノウィルスシステムはまた、インビトロでのタンパク質生成のためにも使
用され得る。アデノウィルス感染された非−293細胞を、その細胞が急速に分裂
しないような条件下で培養することによって、前記細胞は長時間、タンパク質を
生成することができる。例えば、BHK細胞は、細胞工場において集密性まで増殖
され、次に興味ある分泌されたタンパク質をコードするアデノウィルスベクター
に暴露される。次に、細胞が、有意な細胞分裂を伴わないで、感染された細胞の
数週間の生存を可能にする血清フリー条件下で増殖せしめられる。
用され得る。アデノウィルス感染された非−293細胞を、その細胞が急速に分裂
しないような条件下で培養することによって、前記細胞は長時間、タンパク質を
生成することができる。例えば、BHK細胞は、細胞工場において集密性まで増殖
され、次に興味ある分泌されたタンパク質をコードするアデノウィルスベクター
に暴露される。次に、細胞が、有意な細胞分裂を伴わないで、感染された細胞の
数週間の生存を可能にする血清フリー条件下で増殖せしめられる。
【0137】
他方では、アデノウィルスベクター感染された293S細胞が、有意な量のタンパ
ク質を生成するために、比較的高い細胞密度で、付着細胞として、又は懸濁培養
において増殖せしめられ得る( Garnier など., Cytotechnol. 15: 145−55, 19
94 を参照のこと)。いずれかのプロトコールにより、発現され、分泌された異
種タンパク質が、細胞培養物上清液から反復して単離され得る。感染された293S
細胞生成プロトコールにおいては、分泌されていないタンパク質が効果的に得
られる。
ク質を生成するために、比較的高い細胞密度で、付着細胞として、又は懸濁培養
において増殖せしめられ得る( Garnier など., Cytotechnol. 15: 145−55, 19
94 を参照のこと)。いずれかのプロトコールにより、発現され、分泌された異
種タンパク質が、細胞培養物上清液から反復して単離され得る。感染された293S
細胞生成プロトコールにおいては、分泌されていないタンパク質が効果的に得
られる。
【0138】
本発明の分子の活性は、例えば、組織特異性に基づいて、神経、前立腺、腎、
膵臓細胞の新生又は過形成(すなわち、増殖)を測定する種々のアッセイを用い
て測定され得る。さらに、組織分析は、zFGF12が、造血細胞の増殖を支持する造
血細胞又は間質細胞の増殖及び/又は分化を促進することを支持する。本発明の
ポリペプチドにたぶん関連する追加の活性は、他の成長因子;内皮細胞、繊維芽
細胞及び/又は食細胞のための走化性因子としての作用;骨形成因子;及び間葉
幹細胞及び前駆体集団を拡張するための因子を通しての、直接的に又は間接的な
、内皮細胞、線維芽細胞、心及び骨格筋細胞、上皮細胞及びケラチノサイトの増
殖を包含する。
膵臓細胞の新生又は過形成(すなわち、増殖)を測定する種々のアッセイを用い
て測定され得る。さらに、組織分析は、zFGF12が、造血細胞の増殖を支持する造
血細胞又は間質細胞の増殖及び/又は分化を促進することを支持する。本発明の
ポリペプチドにたぶん関連する追加の活性は、他の成長因子;内皮細胞、繊維芽
細胞及び/又は食細胞のための走化性因子としての作用;骨形成因子;及び間葉
幹細胞及び前駆体集団を拡張するための因子を通しての、直接的に又は間接的な
、内皮細胞、線維芽細胞、心及び骨格筋細胞、上皮細胞及びケラチノサイトの増
殖を包含する。
【0139】
増殖は、培養された心臓細胞を用いて、又は適切な動物モデルに本発明の分子
を投与することによってインビボで測定され得る。一般的に、増殖効果は、細胞
数の上昇として見出され、そして従って、アポプトシス及び有糸分裂誘発の阻害
を包含する。培養される細胞は、一次培養物からの線維芽細胞、骨格筋細胞、ヒ
ト臍静脈内皮細胞を包含する。確立された細胞系は次のものを包含する:NIH3T3
線維芽細胞(ATCC No. CRL-1658)、CHH−1サケ心臓細胞(ATCC No. CRL-1680
)、H9cZラット心臓筋芽細胞(ATCC No. CRL-1446)、Shionogi乳癌細胞(Tanak
aなど., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 8928-8932, 1992)及びLNCap. FGC腺癌細
胞(ATCC No. CRL-1740)。
を投与することによってインビボで測定され得る。一般的に、増殖効果は、細胞
数の上昇として見出され、そして従って、アポプトシス及び有糸分裂誘発の阻害
を包含する。培養される細胞は、一次培養物からの線維芽細胞、骨格筋細胞、ヒ
ト臍静脈内皮細胞を包含する。確立された細胞系は次のものを包含する:NIH3T3
線維芽細胞(ATCC No. CRL-1658)、CHH−1サケ心臓細胞(ATCC No. CRL-1680
)、H9cZラット心臓筋芽細胞(ATCC No. CRL-1446)、Shionogi乳癌細胞(Tanak
aなど., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 8928-8932, 1992)及びLNCap. FGC腺癌細
胞(ATCC No. CRL-1740)。
【0140】
細胞増殖を測定するアッセイは、当業界において良く知られている。例えば、
増殖を測定するアッセイは、中性の色素に対する化学感受性(Cavanaugh など.,
Investigational New Drugs 8: 347-354, 1990)、放射性ラベルされたヌクレ
オチドの組み込み(Cookなど., Analytical Biochem. 179: 1-7, 1989)、増殖
細胞のDNAへの5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(Brdu)の組み込み(Porst
mannなど., J. Immunol. Methods 82: 169-179, 1985)、及びテトラゾリウム塩
の使用(Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983; Alleyなど., Cancer
Res. 48: 589-601, 1988; Marshall など., Growht Reg. 5: 69-84, 1995; 及
びScudieroなど., Cancer Res. 48: 4827-4833, 1988)としてそのようなアッセ
イを包含する。
増殖を測定するアッセイは、中性の色素に対する化学感受性(Cavanaugh など.,
Investigational New Drugs 8: 347-354, 1990)、放射性ラベルされたヌクレ
オチドの組み込み(Cookなど., Analytical Biochem. 179: 1-7, 1989)、増殖
細胞のDNAへの5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(Brdu)の組み込み(Porst
mannなど., J. Immunol. Methods 82: 169-179, 1985)、及びテトラゾリウム塩
の使用(Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983; Alleyなど., Cancer
Res. 48: 589-601, 1988; Marshall など., Growht Reg. 5: 69-84, 1995; 及
びScudieroなど., Cancer Res. 48: 4827-4833, 1988)としてそのようなアッセ
イを包含する。
【0141】
分化は進行性で且つ動的な工程であり、多能性幹細胞で始まり、そして最終的
に分化された細胞で終結する。拘束なしに系統に再生することができる多能生幹
細胞は、細胞系統への拘束が行われる場合、失われる一組の分化マーカーを発現
する。前駆体細胞は、細胞が成熟に向かって細胞系統路を進行する場合に、発現
され続けることができても又はできなくても良い一組の分化マーカーを発現する
。成熟細胞により独占的に発現される分化マーカーは通常、機能的性質のもの、
例えば細胞生成物、細胞生成物を生成するための酵素、及び受容体及び受容体−
様相補的分子である。
に分化された細胞で終結する。拘束なしに系統に再生することができる多能生幹
細胞は、細胞系統への拘束が行われる場合、失われる一組の分化マーカーを発現
する。前駆体細胞は、細胞が成熟に向かって細胞系統路を進行する場合に、発現
され続けることができても又はできなくても良い一組の分化マーカーを発現する
。成熟細胞により独占的に発現される分化マーカーは通常、機能的性質のもの、
例えば細胞生成物、細胞生成物を生成するための酵素、及び受容体及び受容体−
様相補的分子である。
【0142】
細胞集団の分化の段階は、細胞集団に存在するマーカーの固定によりモニター
される。筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、腺維芽細胞及び網様細胞は、通常の間葉
幹細胞に起因すると思われる(Owenなど., Ciba Fdn. Symp. 136: 42-46, 1988
)。間葉幹細胞のためのマーカーは間だ十分には同定されておらず(Owenなど.,
J. of Cell Sci. 87: 731-738, 1987)、その結果、同定は、前駆体及び成熟細
胞段階で行われる。本発明の新規ポリペプチドは、間葉幹細胞及び筋細胞前駆体
細胞を、インビボ及びエクスビボの両者で単離するための研究のために有用であ
る。
される。筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、腺維芽細胞及び網様細胞は、通常の間葉
幹細胞に起因すると思われる(Owenなど., Ciba Fdn. Symp. 136: 42-46, 1988
)。間葉幹細胞のためのマーカーは間だ十分には同定されておらず(Owenなど.,
J. of Cell Sci. 87: 731-738, 1987)、その結果、同定は、前駆体及び成熟細
胞段階で行われる。本発明の新規ポリペプチドは、間葉幹細胞及び筋細胞前駆体
細胞を、インビボ及びエクスビボの両者で単離するための研究のために有用であ
る。
【0143】
最終分化又は脱分化の方の経路に特定細胞型を刺激する因子が、通常の前駆体
又は幹細胞に起因する全細胞集団に影響を及ぼすことを示唆する証拠が存在する
。従って、本発明は、筋細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、神
経管由来の幹細胞、神経堤幹細胞、及びニューロン前駆体、膵臓細胞、前立腺由
来の細胞及び内皮細胞の刺激、阻害又は増殖を包含する。本発明の分子は、心筋
細胞の増殖又は分化を刺激すると共に、通常の前駆体/幹細胞に対する効果によ
り、脂肪細胞の増殖又は分化を阻害することができる。従って、本発明の分子は
、軟骨肉腫、アテローム硬化症、再狭窄及び肥満の阻害に使用される。
又は幹細胞に起因する全細胞集団に影響を及ぼすことを示唆する証拠が存在する
。従って、本発明は、筋細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、神
経管由来の幹細胞、神経堤幹細胞、及びニューロン前駆体、膵臓細胞、前立腺由
来の細胞及び内皮細胞の刺激、阻害又は増殖を包含する。本発明の分子は、心筋
細胞の増殖又は分化を刺激すると共に、通常の前駆体/幹細胞に対する効果によ
り、脂肪細胞の増殖又は分化を阻害することができる。従って、本発明の分子は
、軟骨肉腫、アテローム硬化症、再狭窄及び肥満の阻害に使用される。
【0144】
分化を測定するアッセイは例えば、組織、酵素活性、機能的活性又は形態学的
変化の段階−特異的発現に関連する細胞−表面マーカーを測定することに包含す
る(Watt, FASEB, 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1
994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989;
すべては引用により本明細書に組み込まれる)。
変化の段階−特異的発現に関連する細胞−表面マーカーを測定することに包含す
る(Watt, FASEB, 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1
994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989;
すべては引用により本明細書に組み込まれる)。
【0145】
新生又は過形成を評価するためのインビボアッセイは、細胞増殖アッセイ(St
ernなど., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6808-6812, 1990; Lokなど,. Nature 3
69: 565-568, 1994)、隔壁及び線条から単離されたニューロン、及びグリア前
駆体の増殖の刺激(Palmerなど., Mol. Cell. Neurosci. 6:474-486, 1995)、
及び神経堤前駆体からのニューロンの分化の刺激(Vaismanなど., Development
115: 1059-1069, 1992)を包含する。
ernなど., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6808-6812, 1990; Lokなど,. Nature 3
69: 565-568, 1994)、隔壁及び線条から単離されたニューロン、及びグリア前
駆体の増殖の刺激(Palmerなど., Mol. Cell. Neurosci. 6:474-486, 1995)、
及び神経堤前駆体からのニューロンの分化の刺激(Vaismanなど., Development
115: 1059-1069, 1992)を包含する。
【0146】
骨形成速度の変化を測定するためのインビボアッセイは、骨組織学(Recker.
R. eds. Bone Histomorphometry: Technioues and Interpretation. Boca Ratou
: CRC Press, Inc., 1983)及び定量的に計算される断層撮影法(QCT; Ferretti
, J. Bone 17: 353S-364S, 1995; Orphanoludakisなど., Investig. Radiol. 14
: 122-130, 1979及びDurandなど., Medical Physics 19: 569-573, 1992)の実
施を包含する。例えば、骨形成の変化を測定するためのエクスビボアッセイは、
頭蓋冠アッセイ(Gowenなど., J. Immunol. 136: 2478-2482, 1986)である。
R. eds. Bone Histomorphometry: Technioues and Interpretation. Boca Ratou
: CRC Press, Inc., 1983)及び定量的に計算される断層撮影法(QCT; Ferretti
, J. Bone 17: 353S-364S, 1995; Orphanoludakisなど., Investig. Radiol. 14
: 122-130, 1979及びDurandなど., Medical Physics 19: 569-573, 1992)の実
施を包含する。例えば、骨形成の変化を測定するためのエクスビボアッセイは、
頭蓋冠アッセイ(Gowenなど., J. Immunol. 136: 2478-2482, 1986)である。
【0147】
エネルギーバランスの調節に関しては、特に、それが脂肪細胞代謝、増殖及び
分化に関連する場合、zFGF12ポリペプチドは、代謝反応に対する効果を調節する
ことができる。そのような代謝反応は、脂肪細胞形成、糖新生、脂質形成、グリ
コース摂取、タンパク質合成、熱発生、酸素利用及び同様のものを包含する。当
業界において知られているか又は本明細書に記載される他の方法の中で、哺乳類
エネルギーバランスは、前記代謝機能の1又は複数の機能をモニターすることに
よって評価され得る。それらの代謝機能は、下記により十分に示されるように、
当業者に知られている技法(アッセイ又は動物モデル)によりモニターされる。
例えばインスリンの糖調節効果は、肝臓、骨格筋及び脂肪組織において優先的に
発揮される。骨格筋及び脂肪組織においては、インスリンは、グリコースの摂取
、貯蔵及び使用を刺激するよう作用する。
分化に関連する場合、zFGF12ポリペプチドは、代謝反応に対する効果を調節する
ことができる。そのような代謝反応は、脂肪細胞形成、糖新生、脂質形成、グリ
コース摂取、タンパク質合成、熱発生、酸素利用及び同様のものを包含する。当
業界において知られているか又は本明細書に記載される他の方法の中で、哺乳類
エネルギーバランスは、前記代謝機能の1又は複数の機能をモニターすることに
よって評価され得る。それらの代謝機能は、下記により十分に示されるように、
当業者に知られている技法(アッセイ又は動物モデル)によりモニターされる。
例えばインスリンの糖調節効果は、肝臓、骨格筋及び脂肪組織において優先的に
発揮される。骨格筋及び脂肪組織においては、インスリンは、グリコースの摂取
、貯蔵及び使用を刺激するよう作用する。
【0148】
技術的に認識されている方法は、上記に引用される代謝機能のすべてをモニタ
ーするために存在する。従って、当業者は、代謝調節機能のためのzFGF12ポリペ
プチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、アゴニスト及びアンタゴニスト
を評価することができる。典型的な調節技法は、下記に示される。 インスリン−刺激された脂質生成は、トリグリセリド(Mackallなど., J. Bio
l. Chem. 251: 6462-6464, 1976)又はトリグリセリド蓄積(Kletzienなど,. Mo
l. Pharmacol. 41: 393-398, 1992)中への14C−アセテートの組み込みを測定す
ることによってモニターされ得る。
ーするために存在する。従って、当業者は、代謝調節機能のためのzFGF12ポリペ
プチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、アゴニスト及びアンタゴニスト
を評価することができる。典型的な調節技法は、下記に示される。 インスリン−刺激された脂質生成は、トリグリセリド(Mackallなど., J. Bio
l. Chem. 251: 6462-6464, 1976)又はトリグリセリド蓄積(Kletzienなど,. Mo
l. Pharmacol. 41: 393-398, 1992)中への14C−アセテートの組み込みを測定す
ることによってモニターされ得る。
【0149】
zFGF12−刺激された摂取は、例えば、インスリン−刺激されたグルコース輸送
についてのアッセイにより評価され得る。一次脂肪細胞又はNIH 3T3 L1細胞(AT
CC No. CCL-91.1)が、1g/lのグルコース、0.5又は1.0%のBSA、20mMのHepes及
び2mMのグルタミンを含むDMEMを置かれる。2〜5時間の培養の後、培地は、0.5
又は1.0%のBSA、20mMのHepes、1mMのピルベート及び2mMのグルタミンを含む新
しい、グルコースを有さないDMEMにより置換される。適切な濃度のzFGF12、イン
スリン又はIGF−1、又は試験物質の一連の希釈溶液が添加され、そして細胞が2
0〜30分間、インキュベートされる。
についてのアッセイにより評価され得る。一次脂肪細胞又はNIH 3T3 L1細胞(AT
CC No. CCL-91.1)が、1g/lのグルコース、0.5又は1.0%のBSA、20mMのHepes及
び2mMのグルタミンを含むDMEMを置かれる。2〜5時間の培養の後、培地は、0.5
又は1.0%のBSA、20mMのHepes、1mMのピルベート及び2mMのグルタミンを含む新
しい、グルコースを有さないDMEMにより置換される。適切な濃度のzFGF12、イン
スリン又はIGF−1、又は試験物質の一連の希釈溶液が添加され、そして細胞が2
0〜30分間、インキュベートされる。
【0150】
3H又は14C−ラベルされたデオキシグルコースが添加され、約50μMの最終濃度
にされ、そして細胞が約10〜30分間、インキュベートされる。次に、細胞が冷緩
衝液(例えば、PBS)によりすばやく、すずがれ、次に適切な溶解剤(例えば、
1%のSDS又は1NのNaOH)により溶解される。次に、細胞溶解物が、シンチレー
ションカウンターにより評価される。細胞−関連放射能が、サイトカラシンb,
すなわちグルコース輸送のインヒビターの存在下で細胞をインキュベートするこ
とによって決定されるように、非特異的結合を控除した後、グルコース輸送の測
定として取られる。他の方法は、例えば、Manchesterなど., Am. J. Physiol. 2
66 (Endocrinol. Metab. 29): E326-E333, 1994 (インスリン刺激されたグルコ
ース輸送)により記載されるそれらのものを包含する。
にされ、そして細胞が約10〜30分間、インキュベートされる。次に、細胞が冷緩
衝液(例えば、PBS)によりすばやく、すずがれ、次に適切な溶解剤(例えば、
1%のSDS又は1NのNaOH)により溶解される。次に、細胞溶解物が、シンチレー
ションカウンターにより評価される。細胞−関連放射能が、サイトカラシンb,
すなわちグルコース輸送のインヒビターの存在下で細胞をインキュベートするこ
とによって決定されるように、非特異的結合を控除した後、グルコース輸送の測
定として取られる。他の方法は、例えば、Manchesterなど., Am. J. Physiol. 2
66 (Endocrinol. Metab. 29): E326-E333, 1994 (インスリン刺激されたグルコ
ース輸送)により記載されるそれらのものを包含する。
【0151】
タンパク質合成は、例えば35S−メチオニン、及び35S−メチオニン及びタンパ
ク質合成の推定上のモジュレーターと共に試験細胞をインキュベートした後、35 S−メチオニン−ラベルされたタンパク質の沈殿を比較することによって評価さ
れ得る。
ク質合成の推定上のモジュレーターと共に試験細胞をインキュベートした後、35 S−メチオニン−ラベルされたタンパク質の沈殿を比較することによって評価さ
れ得る。
【0152】
熱発生は、B. Stanley in The Biology of Neuropeptide Y and Related Pept
ides, W. Colmers and C. Wahlestedt (eds.), Humana Press, Ottawa, 1993, p
p. 457-509; C. Billington など., Am. J. Physiol. 260: R321, 1991; N. Zar
jevskiなど., Endocrinology 133: 1753, 1993; C. Billington など., Am. J.
Physiol. 266: R1765, 1994; Hellerなど., Am. J. Phvsiol. 252 (4Pt2): R661
-7, 1987;及びHellerなど., Am. J. Physiol. 245 (3): R321-8, 1983により記
載のようにして評価され得る。また、種々の技法により測定され得る代謝速度は
、熱発生の間接的な測定である。
ides, W. Colmers and C. Wahlestedt (eds.), Humana Press, Ottawa, 1993, p
p. 457-509; C. Billington など., Am. J. Physiol. 260: R321, 1991; N. Zar
jevskiなど., Endocrinology 133: 1753, 1993; C. Billington など., Am. J.
Physiol. 266: R1765, 1994; Hellerなど., Am. J. Phvsiol. 252 (4Pt2): R661
-7, 1987;及びHellerなど., Am. J. Physiol. 245 (3): R321-8, 1983により記
載のようにして評価され得る。また、種々の技法により測定され得る代謝速度は
、熱発生の間接的な測定である。
【0153】
酸素利用は、Hellerなど., Pflugers Arch. 369 (1): 55-9, 1977により記載
のようにして評価され得る。この方法はまた、視床下部温度及び代謝熱生成の分
析を包含する。酸素利用及び熱調節はまた、Haskellなど., J. Appl. Physiol.
51(4): 948-54, 1981により記載のようにして、ヒトにおいて評価されて来た。
のようにして評価され得る。この方法はまた、視床下部温度及び代謝熱生成の分
析を包含する。酸素利用及び熱調節はまた、Haskellなど., J. Appl. Physiol.
51(4): 948-54, 1981により記載のようにして、ヒトにおいて評価されて来た。
【0154】
zFGF12ポリペプチドはまた、zFGF12エピトープ、ペプチド又はポリペプチドに
対して特異的に結合する抗体を調製するためにも使用され得る。ポリクローナル
及びモノクローナル抗体を調製するための方法は、当業界において良く知られて
いる。例えば、Current Protocols in Immunology, Cooligan, など., (eds.),
National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook
など., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spr
ing Harbor, NY, 1989; 及びHurrell, J.G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Ant
ibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1
982 を参照のこと。当業者に明らかなように、ポリクローナル抗体は、種々の温
血動物、例えば馬、ウシ、ヤギ、羊、犬、鶏、ウサギ、マウス、及びラットを、
zFGF12ポリペプチド又はそのフラグメントにより接種することにより生成され得
る。
対して特異的に結合する抗体を調製するためにも使用され得る。ポリクローナル
及びモノクローナル抗体を調製するための方法は、当業界において良く知られて
いる。例えば、Current Protocols in Immunology, Cooligan, など., (eds.),
National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook
など., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spr
ing Harbor, NY, 1989; 及びHurrell, J.G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Ant
ibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1
982 を参照のこと。当業者に明らかなように、ポリクローナル抗体は、種々の温
血動物、例えば馬、ウシ、ヤギ、羊、犬、鶏、ウサギ、マウス、及びラットを、
zFGF12ポリペプチド又はそのフラグメントにより接種することにより生成され得
る。
【0155】
zFGF12ポリペプチドの免疫性は、アジュバント、例えばミヨウバン(水酸化ア
ルミニュウム)又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用により高めら
れ得る。免疫化のために有用なポリペプチドはまた、免疫グロブリン ポリペプ
チド又はマルトース結合タンパク質との融合体ポリペプチド、例えばzFGF12又は
その一部の融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はそ
の一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのよう
な部分は、免疫化のために、高分子キャリヤー(例えば、カサガイヘモシアニン
(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)又は破傷風トキソイド)に都合良く連結又
は結合され得る。
ルミニュウム)又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用により高めら
れ得る。免疫化のために有用なポリペプチドはまた、免疫グロブリン ポリペプ
チド又はマルトース結合タンパク質との融合体ポリペプチド、例えばzFGF12又は
その一部の融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はそ
の一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのよう
な部分は、免疫化のために、高分子キャリヤー(例えば、カサガイヘモシアニン
(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)又は破傷風トキソイド)に都合良く連結又
は結合され得る。
【0156】
本明細書で使用される場合、用語“抗体”とは、ポリクローナル抗体、親和性
精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗原結合フラグメント
、例えばF(ab’)2及びFabタンパク質分解性フラグメントを包含する。遺伝子的
に構築された損なわれていない抗体又はフラグメント、例えばキメラ抗体、Fvフ
ラグメント、一本鎖抗体及び同様のもの、並びに合成抗原結合ペプチド及びポリ
ペプチドもまた包含される。非ヒト抗体は、ヒト骨格及び不変領域上に非ヒトCD
Rのみを移植することによって、又は完全な非ヒト可変ドメインを組み込むこと
によって(任意には、暴露された残基の置換によってヒト−様表面によりそれら
のドメインを“おおう(cloaking)”ことによって;ここで結果物は“張り合わ
された”抗体である)、ヒト適合され得る。
精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗原結合フラグメント
、例えばF(ab’)2及びFabタンパク質分解性フラグメントを包含する。遺伝子的
に構築された損なわれていない抗体又はフラグメント、例えばキメラ抗体、Fvフ
ラグメント、一本鎖抗体及び同様のもの、並びに合成抗原結合ペプチド及びポリ
ペプチドもまた包含される。非ヒト抗体は、ヒト骨格及び不変領域上に非ヒトCD
Rのみを移植することによって、又は完全な非ヒト可変ドメインを組み込むこと
によって(任意には、暴露された残基の置換によってヒト−様表面によりそれら
のドメインを“おおう(cloaking)”ことによって;ここで結果物は“張り合わ
された”抗体である)、ヒト適合され得る。
【0157】
多くの場合、ヒト適合された抗体は、正しい結合特性を増強するために、ヒト
可変領域骨格ドメイン内に非ヒト残基を保持することができる。ヒト適合化抗体
を通して、生物学的半減期が高められ、そしてヒトへの投与に基づく有害な免疫
反応の可能性が低められる。本明細書において有用な抗体を生成し又は選択する
ための他の技法は、zFGF12タンパク質又はペプチドへのリンパ球インビトロ暴露
、及びファージ又は類似するベクターにおける抗原表示ライブラリーの選択(例
えば、固定された又はラベルされたzFGF12タンパク質又はペプチドの作用を通し
て)を包含する。
可変領域骨格ドメイン内に非ヒト残基を保持することができる。ヒト適合化抗体
を通して、生物学的半減期が高められ、そしてヒトへの投与に基づく有害な免疫
反応の可能性が低められる。本明細書において有用な抗体を生成し又は選択する
ための他の技法は、zFGF12タンパク質又はペプチドへのリンパ球インビトロ暴露
、及びファージ又は類似するベクターにおける抗原表示ライブラリーの選択(例
えば、固定された又はラベルされたzFGF12タンパク質又はペプチドの作用を通し
て)を包含する。
【0158】
抗体は、それらが106M-1又はそれ以上、好ましくは107M-1又はそれ以上、より
好ましくは108M-1又はそれ以上、及び最も好ましくは109M-1又はそれ以上の結合
親和性(Ka)を有するzFGF12ポリペプチドに結合する場合、特異的に結合するも
のとして定義される。抗体の結合親和性は、当業者によって容易に決定され得る
(例えばScatchard 分析による)。
好ましくは108M-1又はそれ以上、及び最も好ましくは109M-1又はそれ以上の結合
親和性(Ka)を有するzFGF12ポリペプチドに結合する場合、特異的に結合するも
のとして定義される。抗体の結合親和性は、当業者によって容易に決定され得る
(例えばScatchard 分析による)。
【0159】
当業者に知られている種々のアッセイが、zFGF12タンパク質又はペプチドに特
異的に結合する抗体を検出するために使用され得る。典型的なアッセイは、Anti
bodies: A Laboratory Manual, Harlow and lane (Eds.), Cold Speing Harbor
Laboratory Press, 1988 に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代表
的な例は次のものを包含する:同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジ
オイムノ沈殿、酵素結合の免疫吸着アッセイ(ELISA)、ドットブロット又はウ
ェスターンブロットアッセイ、阻害又は競争アッセイ。及びサンドイッチアッセ
イ。さらに、野生型対変異体のzFGF12タンパク質又はペプチドに結合する抗体が
スクリーンされ得る。
異的に結合する抗体を検出するために使用され得る。典型的なアッセイは、Anti
bodies: A Laboratory Manual, Harlow and lane (Eds.), Cold Speing Harbor
Laboratory Press, 1988 に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代表
的な例は次のものを包含する:同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジ
オイムノ沈殿、酵素結合の免疫吸着アッセイ(ELISA)、ドットブロット又はウ
ェスターンブロットアッセイ、阻害又は競争アッセイ。及びサンドイッチアッセ
イ。さらに、野生型対変異体のzFGF12タンパク質又はペプチドに結合する抗体が
スクリーンされ得る。
【0160】
zFGF12に対する抗体は、心臓組織にもう1つのタンパク質、小分子又は化学物
質を標的化するために;zFGF12を発現する細胞を標識するために;アフィニティ
ー精製によりzFGF12を単離するために;zFGF12ポリペプチドの循環レベルを決定
するための診断アッセイのために;根本的な病理学のマーカーとして可溶性zFGF
12を検出し又は定量化するために;FACS を使用する分析方法において、発現ラ
イブラリーをスクリーニングするために;抗-インディオタイプ抗体を生成する
ために;及びインビトロでzFGF12活性を阻止するための中和抗体又はアンタゴニ
スとして使用され得る。
質を標的化するために;zFGF12を発現する細胞を標識するために;アフィニティ
ー精製によりzFGF12を単離するために;zFGF12ポリペプチドの循環レベルを決定
するための診断アッセイのために;根本的な病理学のマーカーとして可溶性zFGF
12を検出し又は定量化するために;FACS を使用する分析方法において、発現ラ
イブラリーをスクリーニングするために;抗-インディオタイプ抗体を生成する
ために;及びインビトロでzFGF12活性を阻止するための中和抗体又はアンタゴニ
スとして使用され得る。
【0161】
適切な直接的標識又はラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビ
ター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子及び同様のものを包含し;間
接的な標識又はラベルは、中間体としてのビオチン−アビジン又は他の補体/抗
−補体対の使用を特徴とする。本発明書における抗体及び結合タンパク質はまた
、薬物、トキシン、放射性核種、及び同様のものに直接的に又は間接的に接合さ
れ得、そしてそれらの接合体はインビボ診断又は治療用途のために使用され得る
。
ター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子及び同様のものを包含し;間
接的な標識又はラベルは、中間体としてのビオチン−アビジン又は他の補体/抗
−補体対の使用を特徴とする。本発明書における抗体及び結合タンパク質はまた
、薬物、トキシン、放射性核種、及び同様のものに直接的に又は間接的に接合さ
れ得、そしてそれらの接合体はインビボ診断又は治療用途のために使用され得る
。
【0162】
本発明の分子は、ニューロン又は膵臓細胞増殖に関連する受容体を同定し、そ
して単離するために使用される。例えば、本発明のタンパク質及びペプチドは、
カラム及びカラム上で作動する膜調製物上に固定され得る(Immobilized Affini
ty Ligand Techniques, hermansonなど., eds., Academic Press, San Diego, C
A, 1992, pp. 195-202)。タンパク質及びペプチドはまた、放射成ラベルされ(
Methods in Enzymol., Vol. 182, “Guide to Protein Purification”, M. Deu
tscher, ed., Acad. Press, San Diego, 1990, 721-737)、又は光親和性ラベル
され得(Brunnerなど., Ann. Rev. Biochem. 62: 483-514, 1993及びFedanなど.
, Biochem. Pharmacol. 33: 1167-1180, 1984)、そして特異的細胞−表面タン
パク質が同定され得る。
して単離するために使用される。例えば、本発明のタンパク質及びペプチドは、
カラム及びカラム上で作動する膜調製物上に固定され得る(Immobilized Affini
ty Ligand Techniques, hermansonなど., eds., Academic Press, San Diego, C
A, 1992, pp. 195-202)。タンパク質及びペプチドはまた、放射成ラベルされ(
Methods in Enzymol., Vol. 182, “Guide to Protein Purification”, M. Deu
tscher, ed., Acad. Press, San Diego, 1990, 721-737)、又は光親和性ラベル
され得(Brunnerなど., Ann. Rev. Biochem. 62: 483-514, 1993及びFedanなど.
, Biochem. Pharmacol. 33: 1167-1180, 1984)、そして特異的細胞−表面タン
パク質が同定され得る。
【0163】
アンタゴニストは、細胞型、例えばニューロン、膵臓、上皮細胞、ケラチノサ
イト、及び前立腺細胞、例えば線維芽細胞及び内皮細胞におけるzFGF12分子の増
殖活性を阻害するために有用である。例えば、zFGF12に対するアンタゴニストは
、腎臓上皮に関連する障害、例えば糸球体腎炎の阻害のために有用であろう。ケ
ラチノサイトに関連する障害、例えば乾癬は、zFGF12アンタゴニストにより阻害
され得る。zFGF12ポリペプチド結合ドメインをコードする遺伝子は、ファージ(
ファージ表示)又は細菌、例えばE.コリ上に表示されるランダムペプチドライ
ブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
イト、及び前立腺細胞、例えば線維芽細胞及び内皮細胞におけるzFGF12分子の増
殖活性を阻害するために有用である。例えば、zFGF12に対するアンタゴニストは
、腎臓上皮に関連する障害、例えば糸球体腎炎の阻害のために有用であろう。ケ
ラチノサイトに関連する障害、例えば乾癬は、zFGF12アンタゴニストにより阻害
され得る。zFGF12ポリペプチド結合ドメインをコードする遺伝子は、ファージ(
ファージ表示)又は細菌、例えばE.コリ上に表示されるランダムペプチドライ
ブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
【0164】
前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの手段、例えばラン
ダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる。それら
のランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチドであり得
る既知の標的物、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子、又は有
機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために使用され
得る。
ダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる。それら
のランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチドであり得
る既知の標的物、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子、又は有
機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために使用され
得る。
【0165】
そのようなランダムペプチド表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーニン
グするための技法は、当業界において知られており(Ladner など., アメリカ特
許第5,223,409 号; Ladner など., アメリカ特許第4,946,778 号; Ladner など
., アメリカ特許第5,403,484 号及びLadner など., アメリカ特許第5,571,698
号、及びKayなど., Phage Display of Peputides and Proteins (Academic Pres
s, Inc. 1996))、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなラ
イブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばClontech (Palo Alto,
CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverl
y, MA) 及びPharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piccataway, MJ) から市販さ
れている。
グするための技法は、当業界において知られており(Ladner など., アメリカ特
許第5,223,409 号; Ladner など., アメリカ特許第4,946,778 号; Ladner など
., アメリカ特許第5,403,484 号及びLadner など., アメリカ特許第5,571,698
号、及びKayなど., Phage Display of Peputides and Proteins (Academic Pres
s, Inc. 1996))、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなラ
イブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばClontech (Palo Alto,
CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverl
y, MA) 及びPharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piccataway, MJ) から市販さ
れている。
【0166】
ランダムペプチド表示ライブラリーは、zFGF12に結合するタンパク質を同定す
るために、本明細書に開示されるzFGF12配列を用いてスクリーンされ得る。zFGF
12ポリペプチドと相互作用するそれらの“結合タンパク質”は、細胞を標識する
ために;親和性精製により相同体ポリペプチドを単離するために使用され得る;
それらは薬物、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的にまたは間接的に
接合され得る。それらの結合タンパク質はまた、分析方法に、例えば発現ライブ
ラリーをスクリーニングし、そして活性を中和するためにも使用され得る。結合
タンパク質はまた、ポリペプチドの循環レベルを決定するために;病理学又は疾
病のマーカーとして可溶性ポリペプチドを検出し又は定量化するために、診断ア
ッセイにも使用され得る。
るために、本明細書に開示されるzFGF12配列を用いてスクリーンされ得る。zFGF
12ポリペプチドと相互作用するそれらの“結合タンパク質”は、細胞を標識する
ために;親和性精製により相同体ポリペプチドを単離するために使用され得る;
それらは薬物、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的にまたは間接的に
接合され得る。それらの結合タンパク質はまた、分析方法に、例えば発現ライブ
ラリーをスクリーニングし、そして活性を中和するためにも使用され得る。結合
タンパク質はまた、ポリペプチドの循環レベルを決定するために;病理学又は疾
病のマーカーとして可溶性ポリペプチドを検出し又は定量化するために、診断ア
ッセイにも使用され得る。
【0167】
それらの結合タンパク質はまた、zFGF12結合及びシグナル トランスダクショ
ンをインビトロ及びインビボで阻止するために、zFGF12 “アンタゴニス”とし
て使用することができる。それらの抗−zFGF12結合タンパク質は、増幅又は分化
をもたらす遺伝子の発現を阻害するために有用である。それらの抗−zFGF12結合
タンパク質は、増殖又は分化をもたらす遺伝子の発現を阻害するために有用であ
る。そのような抗−zFGF12結合タンパク質は、例えば神経芽腫、グリア芽腫、前
立腺肥大、前立腺癌、膵癌及び脊髄損傷において、単独で又は他の治療剤と組合
しての処理のために使用され得る。
ンをインビトロ及びインビボで阻止するために、zFGF12 “アンタゴニス”とし
て使用することができる。それらの抗−zFGF12結合タンパク質は、増幅又は分化
をもたらす遺伝子の発現を阻害するために有用である。それらの抗−zFGF12結合
タンパク質は、増殖又は分化をもたらす遺伝子の発現を阻害するために有用であ
る。そのような抗−zFGF12結合タンパク質は、例えば神経芽腫、グリア芽腫、前
立腺肥大、前立腺癌、膵癌及び脊髄損傷において、単独で又は他の治療剤と組合
しての処理のために使用され得る。
【0168】
本発明の分子は、ニューロン、前立腺及び膵臓組織細胞、例えばランゲルハン
ス島、膵臓線房細胞、神経外胚葉、中枢神経系のニューロン及び交感神経ニュー
ロンの増殖のためにインビトロで有用であろう。本発明の分子は、直接的に、又
は造血細胞増殖及び分化を支持する間質細胞の刺激により、造血細胞の増殖及び
分化のために有用であろう。例えば、本発明の分子は、定義された細胞培養培地
の成分として有用であり、そして単独で、又は細胞培養に通常使用される血清を
置換する他のサイトカイン及びホルモンと組合して使用され得る。
ス島、膵臓線房細胞、神経外胚葉、中枢神経系のニューロン及び交感神経ニュー
ロンの増殖のためにインビトロで有用であろう。本発明の分子は、直接的に、又
は造血細胞増殖及び分化を支持する間質細胞の刺激により、造血細胞の増殖及び
分化のために有用であろう。例えば、本発明の分子は、定義された細胞培養培地
の成分として有用であり、そして単独で、又は細胞培養に通常使用される血清を
置換する他のサイトカイン及びホルモンと組合して使用され得る。
【0169】
本発明の分子は、ランゲルハンス島、前立腺細胞(例えば、PZ−HPV−7ヒト
前立腺上皮細胞、ATCC No. CRL-2221及びラットYPEN−1正常前立腺細胞、ATCC
No. CRL-2222);神経細胞(例えばマウスCATH, 脳ニューロン細胞、ATCC No. C
RL-11179, ヒトHCN−1Aニューロン細胞、ATCC No. CRL-10442)の培養における
増殖及び/又は進化を特に促進することにおいて特に有用であり、そしてまた、
過形成及び再生の研究において有用であることが分かっている。zFGF12分子が細
胞培養物を確立し、そして維持するために有用である1つの型の細胞は、上皮細
胞及びケラチノサイトを包含する。上皮細胞は、例えば前立腺、角膜、肺、乳房
又は腎臓組織から単離され得る。
前立腺上皮細胞、ATCC No. CRL-2221及びラットYPEN−1正常前立腺細胞、ATCC
No. CRL-2222);神経細胞(例えばマウスCATH, 脳ニューロン細胞、ATCC No. C
RL-11179, ヒトHCN−1Aニューロン細胞、ATCC No. CRL-10442)の培養における
増殖及び/又は進化を特に促進することにおいて特に有用であり、そしてまた、
過形成及び再生の研究において有用であることが分かっている。zFGF12分子が細
胞培養物を確立し、そして維持するために有用である1つの型の細胞は、上皮細
胞及びケラチノサイトを包含する。上皮細胞は、例えば前立腺、角膜、肺、乳房
又は腎臓組織から単離され得る。
【0170】
本発明のポリペプチド、核酸及び/又は抗体は、真性糖尿病に関連する障害、
神経細胞成長又は退化、筋萎縮側索硬化症、脳血管性発作、ニューロン分化の維
持の欠失に関連する神経障害、及び神経系の先天性障害又はニューロン成長の欠
乏の処理において使用され得る。本発明の分子は、脈管形成及び創傷治療の促進
のために、眼における再血管のために、良好でない循環に関連する合併症、例え
ば糖尿病性の足の潰瘍のために、発作のために、薬理学的方法を用いての冠状再
灌流に続いて、及び脈管形成が有益である他の症状、例えば末端の血管疾病のた
めに有用である。本発明の分子は、心筋細胞新生及び過形成を誘発することによ
って、冠状側副形成を誘発することによって、又は壊死性心筋領域の再造形を誘
発することによって、心臓機能を改良するために有用であり得る。
神経細胞成長又は退化、筋萎縮側索硬化症、脳血管性発作、ニューロン分化の維
持の欠失に関連する神経障害、及び神経系の先天性障害又はニューロン成長の欠
乏の処理において使用され得る。本発明の分子は、脈管形成及び創傷治療の促進
のために、眼における再血管のために、良好でない循環に関連する合併症、例え
ば糖尿病性の足の潰瘍のために、発作のために、薬理学的方法を用いての冠状再
灌流に続いて、及び脈管形成が有益である他の症状、例えば末端の血管疾病のた
めに有用である。本発明の分子は、心筋細胞新生及び過形成を誘発することによ
って、冠状側副形成を誘発することによって、又は壊死性心筋領域の再造形を誘
発することによって、心臓機能を改良するために有用であり得る。
【0171】
zFGF12は、表皮の創傷治療を促進するために有用であろ。本発明の分子は、化
学療法及び/又は放射線による処理の後、胃腸管、小腸及び経口粘膜における上
皮細胞の保護及びその回復の促進のために使用され得る。空気の空間を被膜する
肺上皮細胞の刺激は、新生児早産に関連する肺損傷及び合併症の回復を促進する
ことができる。zFGF12はまた、肺上皮における表面活性の生成を調節することが
できる。他の上皮細胞は、前立腺、角膜、乳房及び腎組織に見出され、そしてそ
れらの細胞の増殖及び特殊化された細胞機能が、zFGF12により調節され得る。
学療法及び/又は放射線による処理の後、胃腸管、小腸及び経口粘膜における上
皮細胞の保護及びその回復の促進のために使用され得る。空気の空間を被膜する
肺上皮細胞の刺激は、新生児早産に関連する肺損傷及び合併症の回復を促進する
ことができる。zFGF12はまた、肺上皮における表面活性の生成を調節することが
できる。他の上皮細胞は、前立腺、角膜、乳房及び腎組織に見出され、そしてそ
れらの細胞の増殖及び特殊化された細胞機能が、zFGF12により調節され得る。
【0172】
虚血現象は、器官への血流の破壊であり、灌流されなかった領域の壊死又は梗
塞をもたらす。虚血―灌流は、器官、例えば心臓又は脳への血流の中断、及び血
流の続く修復(しばしば、分離)である。血流の修復は機能的組織の保存のため
に必要であるが、灌流自体は有害であることが知られている。実際、虚血領域の
再灌流は、再灌流を伴なわないでは虚血現象においては見出されない、血管痙攣
及び心臓不全冠状血管拡張をもたらす内皮依存性血管弛緩を包含する(Cuevasな
ど., Growth Factors 15: 29-40, 1997)。虚血及び灌流の両者は、組織壊死、
例えば心筋梗塞又は発作に対する重要な誘導体である。本発明の分子は、特に心
臓又は脳において、虚血又は虚血―再灌流現象により引き起こされる組織への損
傷を低めるために治療的価値を有するであろう。
塞をもたらす。虚血―灌流は、器官、例えば心臓又は脳への血流の中断、及び血
流の続く修復(しばしば、分離)である。血流の修復は機能的組織の保存のため
に必要であるが、灌流自体は有害であることが知られている。実際、虚血領域の
再灌流は、再灌流を伴なわないでは虚血現象においては見出されない、血管痙攣
及び心臓不全冠状血管拡張をもたらす内皮依存性血管弛緩を包含する(Cuevasな
ど., Growth Factors 15: 29-40, 1997)。虚血及び灌流の両者は、組織壊死、
例えば心筋梗塞又は発作に対する重要な誘導体である。本発明の分子は、特に心
臓又は脳において、虚血又は虚血―再灌流現象により引き起こされる組織への損
傷を低めるために治療的価値を有するであろう。
【0173】
発明のための他の治療用途は、骨格筋新生及び/又は過形成、腎臓再生の誘発
、及び/又は全身性及び肺高血圧の処理を包含する。 zFGF12により誘発された冠状側副成長が、慢性冠状閉塞のモデルを用いて、ウ
サギ、イヌ又はブタにおいて測定されている(Landanなど., Amer. Heart. J. 2
9: 924-931, 1995; Sellkeなど., Surgery 120 (2): 182-188, 1996及びLazarou
s など., 1996, 前記)。発作を処理するためのzFGF12の有益性が、両側性頸動
脈閉塞を用いて、そして組織学的変化及び迷路性能を測定することにより、ラッ
トにおいてインビボで試験されている(Gageなど., Neurobiol. Aging 9: 645-6
55, 1988)。高血圧におけるzFGF12の効力が、全身性高血圧に関して自発的高血
圧ラット(SHR)を用いて、インビボ試験されている(Marcheなど., Clin. Exp.
Pharmacol. Physiol. Suppl. 1: S114-116, 1995)。
、及び/又は全身性及び肺高血圧の処理を包含する。 zFGF12により誘発された冠状側副成長が、慢性冠状閉塞のモデルを用いて、ウ
サギ、イヌ又はブタにおいて測定されている(Landanなど., Amer. Heart. J. 2
9: 924-931, 1995; Sellkeなど., Surgery 120 (2): 182-188, 1996及びLazarou
s など., 1996, 前記)。発作を処理するためのzFGF12の有益性が、両側性頸動
脈閉塞を用いて、そして組織学的変化及び迷路性能を測定することにより、ラッ
トにおいてインビボで試験されている(Gageなど., Neurobiol. Aging 9: 645-6
55, 1988)。高血圧におけるzFGF12の効力が、全身性高血圧に関して自発的高血
圧ラット(SHR)を用いて、インビボ試験されている(Marcheなど., Clin. Exp.
Pharmacol. Physiol. Suppl. 1: S114-116, 1995)。
【0174】
本発明の分子は、神経外胚葉に由来する細胞及び/又は組織、成長性中枢神経
系、成長性末梢神経系、成長性脊髄、前立腺及び膵臓への剤又は薬剤の供給を標
的化するために使用され得る。例えば、本発明の分子は、zFGF12プロモーターに
より指図される組織特異的発現のために、神経組織への発現の制限いおいて有用
であろう。例えば、神経組織―特異的発現は、zFGF12−アデノウィルス 非シス
トロン性構造体を用いて達成され得る(Rothmannなど., Genne Trerapy 3: 919-
926, 1996)。
系、成長性末梢神経系、成長性脊髄、前立腺及び膵臓への剤又は薬剤の供給を標
的化するために使用され得る。例えば、本発明の分子は、zFGF12プロモーターに
より指図される組織特異的発現のために、神経組織への発現の制限いおいて有用
であろう。例えば、神経組織―特異的発現は、zFGF12−アデノウィルス 非シス
トロン性構造体を用いて達成され得る(Rothmannなど., Genne Trerapy 3: 919-
926, 1996)。
【0175】
さらに、zFGF12ポリペプチドは、キメラを形成するために、第2剤又は薬剤と
共にzfGF12相同ポリペプチドから構成される第1分子を結合することによって、
もう1つのタンパク質にzFGF12ポリペプチドを連結することにより他の剤又は神
経組織に制限するために使用され得る(Franzなど., Circ. Res. 73: 629-638,
1993)。タンパク質、例えば抗体は、本発明のzFGF12分子と共にキメラを形成す
るために使用され得る(Narulaなど., J. Nucl. Cardiol. 2: 26-34, 1995)。
剤又は薬剤の例は、生活性―ポリペプチド、遺伝し、毒素、放射性核種、小分子
医薬及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。連結は、
直接的であっても又は間接的(例えば、リポソーム)であっても良く、そして組
換え手段、化学連鎖、強い非共有相互作用及び同様のものにより行われ得る。
共にzfGF12相同ポリペプチドから構成される第1分子を結合することによって、
もう1つのタンパク質にzFGF12ポリペプチドを連結することにより他の剤又は神
経組織に制限するために使用され得る(Franzなど., Circ. Res. 73: 629-638,
1993)。タンパク質、例えば抗体は、本発明のzFGF12分子と共にキメラを形成す
るために使用され得る(Narulaなど., J. Nucl. Cardiol. 2: 26-34, 1995)。
剤又は薬剤の例は、生活性―ポリペプチド、遺伝し、毒素、放射性核種、小分子
医薬及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。連結は、
直接的であっても又は間接的(例えば、リポソーム)であっても良く、そして組
換え手段、化学連鎖、強い非共有相互作用及び同様のものにより行われ得る。
【0176】
医薬使用のためには、本発明のタンパク質は、従来の方法に従って、非経口、
特に静脈内又は皮下投与のために配合される。静脈内投与は、1〜数時間の典型
的な期間、ボーラス注射又は注入により行われるであろう。一般的に、医薬製剤
は、zFGF12タンパク質を、医薬的に許容できるビークル、例えば塩溶液、緩衝溶
液、水中、5%デキストロース、又は同様のものと共にを含むであろう。製剤は
さらに、1又は複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面上のタン
パク質損失を妨げるためのアルブミン、等を含むことができる。配合方法は、当
業界において良く知られており、そして例えば、Remington: The Science and P
ractice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed., 1995に開示される。
特に静脈内又は皮下投与のために配合される。静脈内投与は、1〜数時間の典型
的な期間、ボーラス注射又は注入により行われるであろう。一般的に、医薬製剤
は、zFGF12タンパク質を、医薬的に許容できるビークル、例えば塩溶液、緩衝溶
液、水中、5%デキストロース、又は同様のものと共にを含むであろう。製剤は
さらに、1又は複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表面上のタン
パク質損失を妨げるためのアルブミン、等を含むことができる。配合方法は、当
業界において良く知られており、そして例えば、Remington: The Science and P
ractice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed., 1995に開示される。
【0177】
治療用量は、一般的に、0.1〜100μg/kg患者の体重/日、好ましくは0.5〜20mg
/kg/日の範囲であり、そして正確な用量は処理される病状の性質及び重症度、患
者の特徴、等を考慮して、許容できる標準に従って、臨床医により決定される。
用量の決定は、当業者のレベル内である。タンパク質は、急性処理のために、1
週間又はそれ以下にわたって、しばしば1〜3日間にわたって投与され得、又は
慢性処理のためには、数ヶ月〜数年にわたって使用され得る。一般的に、zFGF12
の治療的有効量は、増殖における臨床的に有意な変化、又は間葉幹細胞及び前駆
体に関する特異的細胞型の上昇を生成するのに十分な量である。
/kg/日の範囲であり、そして正確な用量は処理される病状の性質及び重症度、患
者の特徴、等を考慮して、許容できる標準に従って、臨床医により決定される。
用量の決定は、当業者のレベル内である。タンパク質は、急性処理のために、1
週間又はそれ以下にわたって、しばしば1〜3日間にわたって投与され得、又は
慢性処理のためには、数ヶ月〜数年にわたって使用され得る。一般的に、zFGF12
の治療的有効量は、増殖における臨床的に有意な変化、又は間葉幹細胞及び前駆
体に関する特異的細胞型の上昇を生成するのに十分な量である。
【0178】
zFGF12ポリペプチドはまた、分析熟練、例えば、特に4−α―ヘリックスの配
座を決定するために質量分計法、円二色法、立体構造を決定するためにX−線結
晶学、溶液においてタンパク質の構造を示すために核磁気共鳴分光法を教授する
ために使用され得る。例えば、zFGF12を含むキットは、分析するために学生に与
えられ得る。アミノ酸配列は、教授により知られているので、タンパク質は、学
生の熟練を決定するか又は開発するための試験として学生に与えられ、次に、教
授は、学生がポリペプチドを正しく分析したか否かを知るであろう。あらゆるポ
リペプチドはユニークであるので、zFGF12の教育的使用はそれ自体ユニークであ
ろう。
座を決定するために質量分計法、円二色法、立体構造を決定するためにX−線結
晶学、溶液においてタンパク質の構造を示すために核磁気共鳴分光法を教授する
ために使用され得る。例えば、zFGF12を含むキットは、分析するために学生に与
えられ得る。アミノ酸配列は、教授により知られているので、タンパク質は、学
生の熟練を決定するか又は開発するための試験として学生に与えられ、次に、教
授は、学生がポリペプチドを正しく分析したか否かを知るであろう。あらゆるポ
リペプチドはユニークであるので、zFGF12の教育的使用はそれ自体ユニークであ
ろう。
【0179】
zFGF12に対して特異的に結合する抗体は、zFGF12を精製するためにいかにして
親和性クロマトグラフィーを調製するか、抗体をコードするポリヌクレオチドを
いかにしてクローニングし、そして配列決定するかを学生に教授するために教授
目的として、及びヒト適合された抗体をいかにして企画するか学生に教授するた
めの実施として使用され得る。次に、zFGF12遺伝子、ポリペプチド、又は抗体が
、試薬会社によりパッケージされ、そして学生が分子生物学の熟練を得るために
、教育機関に市販される。個々の遺伝子及びタンパク質はユニークであるので、
個々の遺伝子及びタンパク質は、学生のためにユニークな挑戦及び学習経験を創
造する。zFGFに遺伝子、ポリペプチド又は抗体を含むそのような教育用キットは
、本発明の範囲内である。本発明はさらに、次の非制限的な例により示される。
親和性クロマトグラフィーを調製するか、抗体をコードするポリヌクレオチドを
いかにしてクローニングし、そして配列決定するかを学生に教授するために教授
目的として、及びヒト適合された抗体をいかにして企画するか学生に教授するた
めの実施として使用され得る。次に、zFGF12遺伝子、ポリペプチド、又は抗体が
、試薬会社によりパッケージされ、そして学生が分子生物学の熟練を得るために
、教育機関に市販される。個々の遺伝子及びタンパク質はユニークであるので、
個々の遺伝子及びタンパク質は、学生のためにユニークな挑戦及び学習経験を創
造する。zFGFに遺伝子、ポリペプチド又は抗体を含むそのような教育用キットは
、本発明の範囲内である。本発明はさらに、次の非制限的な例により示される。
【0180】
要約すると、本発明は、配列番号2の残基25〜残基251に示されるような配列
に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る単離された
ポリペプチドを提供する。さらなる態様においては、本発明のポリペプチドは、
位置113でのシステイン、位置115でのフェニルアラニン及び位置117でのヒスチ
ジンを伴なって、95%同一であろう。
に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る単離された
ポリペプチドを提供する。さらなる態様においては、本発明のポリペプチドは、
位置113でのシステイン、位置115でのフェニルアラニン及び位置117でのヒスチ
ジンを伴なって、95%同一であろう。
【0181】
もう1つの態様においては、ポリペプチドはさらに、配列番号2に示されるよ
うに、位置53, 73及び102でのロイシン;位置61, 83, 94及び136でのバリン;位
置75及び85でのイソロイシン;位置113でのシステイン;位置115でのフェニルア
ラニン;位置127でのチロシンを含んで成る。本発明はまた、アミノ酸残基25〜
アミノ酸残基251に示されるような、及びアミノ酸残基1〜アミノ酸残基251で示
されるような配列番号2の配列を含んで成るポリペプチドを提供する。
うに、位置53, 73及び102でのロイシン;位置61, 83, 94及び136でのバリン;位
置75及び85でのイソロイシン;位置113でのシステイン;位置115でのフェニルア
ラニン;位置127でのチロシンを含んで成る。本発明はまた、アミノ酸残基25〜
アミノ酸残基251に示されるような、及びアミノ酸残基1〜アミノ酸残基251で示
されるような配列番号2の配列を含んで成るポリペプチドを提供する。
【0182】
本発明は、転写ターミネーター、本明細書に記載されるポリペプチドをコード
するDNAセグメント及び転写ターミネーターを含んで成るベクターを提供する。
他の観点においては、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドを発現する
培養された細胞、及びそれらのポリペプチドを製造し、そして回収するための方
法、並びにそれらのポリペプチドを含んで成るタンパク質を提供する。 他の観点においては、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドを特異的
に結合する抗体、及びそれらのポリペプチドを含んで成るタンパク質を提供する
。 本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド、及
びヌクレオチド187〜ヌクレオチド870の配列番号1に示される、及びヌクレオチ
ド72〜ヌクレオチド753の配列番号2に示されるそれらのヌクレオチドを含んで
成るポリヌクレオチドを提供する。
するDNAセグメント及び転写ターミネーターを含んで成るベクターを提供する。
他の観点においては、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドを発現する
培養された細胞、及びそれらのポリペプチドを製造し、そして回収するための方
法、並びにそれらのポリペプチドを含んで成るタンパク質を提供する。 他の観点においては、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドを特異的
に結合する抗体、及びそれらのポリペプチドを含んで成るタンパク質を提供する
。 本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド、及
びヌクレオチド187〜ヌクレオチド870の配列番号1に示される、及びヌクレオチ
ド72〜ヌクレオチド753の配列番号2に示されるそれらのヌクレオチドを含んで
成るポリヌクレオチドを提供する。
【0183】
もう1つの観点においては、本発明は、2種のポリペプチドを含んで成る融合
タンパク質を提供し、ここでそれらの少なくとも1つは配列番号2の残基25〜残
基251に示されるようなアミノ酸残基の配列を含んでなり、又は本明細書に記載
される他のポリペプチドは本発明の分子である。 本発明は、本発明の分子を用いる方法を提供する。例えば、1つの方法は、本
明細書に記載されるzFGF12ポリペプチドの存在下で間葉幹細胞又は前駆体細胞を
、そのzFGF12ポリペプチドの不在下で増殖される細胞に比較して、間葉細胞の数
を増すのに十分な量、増殖することを含んで成る、間葉細胞の増殖及び/又は分
下を刺激するために因子としての使用である。 本発明は、次の非制限的な例によりさらに例示される。
タンパク質を提供し、ここでそれらの少なくとも1つは配列番号2の残基25〜残
基251に示されるようなアミノ酸残基の配列を含んでなり、又は本明細書に記載
される他のポリペプチドは本発明の分子である。 本発明は、本発明の分子を用いる方法を提供する。例えば、1つの方法は、本
明細書に記載されるzFGF12ポリペプチドの存在下で間葉幹細胞又は前駆体細胞を
、そのzFGF12ポリペプチドの不在下で増殖される細胞に比較して、間葉細胞の数
を増すのに十分な量、増殖することを含んで成る、間葉細胞の増殖及び/又は分
下を刺激するために因子としての使用である。 本発明は、次の非制限的な例によりさらに例示される。
【0184】
実施例例1
.
酵母における相同組換えを用いて、哺乳類細胞における発現のためのzFGF12を
コードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを創造する。zFGF12/pCZF199
発現ベクターを構成するために、次のDNAフラグメントを用いて、S.セレビシア
エを形質転換する:受容体ベクターとしてのSnaBI消化されたpCZR199, zFGF12 E
coRI制限フラグメント、及び2つの二本鎖リンカーセグメント。発現ベクターpC
ZR199は、酵母複製要素、(CEN, ARS)、選択マーカーURA3、 E. コリ複製要素
(例えば、AMPR及びori)、ブラント末端化されたクローニング部位、SnaBIを有
し、そしてN−末端又はC−末端Glu−Glu標識(配列番号6)を付加する。
コードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを創造する。zFGF12/pCZF199
発現ベクターを構成するために、次のDNAフラグメントを用いて、S.セレビシア
エを形質転換する:受容体ベクターとしてのSnaBI消化されたpCZR199, zFGF12 E
coRI制限フラグメント、及び2つの二本鎖リンカーセグメント。発現ベクターpC
ZR199は、酵母複製要素、(CEN, ARS)、選択マーカーURA3、 E. コリ複製要素
(例えば、AMPR及びori)、ブラント末端化されたクローニング部位、SnaBIを有
し、そしてN−末端又はC−末端Glu−Glu標識(配列番号6)を付加する。
【0185】
前記ベクターは、標識された、発現されるタンパク質Glu−Gluのいずれかの末
端を有するzFGFにポリペプチドを創造するために使用される。二本鎖リンカーセ
グメントを、PCRを用いて調製する。リンカーは、5’及び3’末端の両端で挿入
体フラグメントにベクターを連結するよう作用する。2組のリンカーを調製する
。1組のリンカーは、リンカーを用いて挿入体配列の5’末端でGlu−Glu標識(
配列番号6)を位置決定するベクターに挿入体を連結する。第2組のリンカーは
、3’Glu−Glu標識(配列番号6)を位置決定するベクター中にzFGF12挿入体を
連結するために使用される。
端を有するzFGFにポリペプチドを創造するために使用される。二本鎖リンカーセ
グメントを、PCRを用いて調製する。リンカーは、5’及び3’末端の両端で挿入
体フラグメントにベクターを連結するよう作用する。2組のリンカーを調製する
。1組のリンカーは、リンカーを用いて挿入体配列の5’末端でGlu−Glu標識(
配列番号6)を位置決定するベクターに挿入体を連結する。第2組のリンカーは
、3’Glu−Glu標識(配列番号6)を位置決定するベクター中にzFGF12挿入体を
連結するために使用される。
【0186】
第3組のリンカーは、標識されていない構造体をもたらす、ベクター中へのzF
GF12挿入体を連結するために使用される。5’リンカーは、C−末端Glu−Glu標識
されたzFGF12のために使用されるリンカーと同じである。3’リンカーは、N−末
端Glu−Glu標識されたzFGF12のために使用されるリンカーと同じである。オリゴ
ヌクレオチドは、標識のPCR反応条件を用いて連結され、そして94℃で1.5分、続
いて94℃で30秒、50℃で1分、及び72℃で1分(10サイクル)、次に72℃で10分
間、加熱される。
GF12挿入体を連結するために使用される。5’リンカーは、C−末端Glu−Glu標識
されたzFGF12のために使用されるリンカーと同じである。3’リンカーは、N−末
端Glu−Glu標識されたzFGF12のために使用されるリンカーと同じである。オリゴ
ヌクレオチドは、標識のPCR反応条件を用いて連結され、そして94℃で1.5分、続
いて94℃で30秒、50℃で1分、及び72℃で1分(10サイクル)、次に72℃で10分
間、加熱される。
【0187】
DNAフラグメントを、100?lのコンピテント酵母(Genetic strain SH 838-9Dα
, Roffmanなど., EMBO J.8: 2057-65, 1989)に付加し、そしてエレクトロポレ
ートする。酵母細胞をすぐに、600?lの1.2Mソルビトールにより希釈し、そしてU
ra Dプレート上にプレートし、そして30℃で48時間インキュベートする。Ura+コ
ロニーを、N−末端標識された及びC−末端標識されたzFGF12タンパク質から選択
し、そして得られる酵母コロニーからのDNAを抽出し、そしてE. コリを形質転換
する。正しい発現構造体を有する個々のクローンを、制限消化により同定する。
DNA配列決定は、所望する配列がお互い連結されていることを確証する。
, Roffmanなど., EMBO J.8: 2057-65, 1989)に付加し、そしてエレクトロポレ
ートする。酵母細胞をすぐに、600?lの1.2Mソルビトールにより希釈し、そしてU
ra Dプレート上にプレートし、そして30℃で48時間インキュベートする。Ura+コ
ロニーを、N−末端標識された及びC−末端標識されたzFGF12タンパク質から選択
し、そして得られる酵母コロニーからのDNAを抽出し、そしてE. コリを形質転換
する。正しい発現構造体を有する個々のクローンを、制限消化により同定する。
DNA配列決定は、所望する配列がお互い連結されていることを確証する。
【0188】
大規模プラスミドDNAを、N−及びC−末端標識されたzFGF12配列からの1又は
複数の正しいクローンから単離し、発現カセットをベクターから生成し、そして
大規模タンパク質生成のために酵母又はE.コリを形質転換する。
複数の正しいクローンから単離し、発現カセットをベクターから生成し、そして
大規模タンパク質生成のために酵母又はE.コリを形質転換する。
【0189】例2
.
下記方法を、E.コリ、ピチア・メタノリカ及びチャイニーズハムスター卵単
細胞(CHO)のならし培地において発現されるタンパク質のために使用する。し
かしながら、E.コリ及びピチアにおいて発現されるzFGF12に関しては、培地は
、AF Heparin 650m親和性カラムへの適用の前、濃縮されない。特にことわらな
いければ、すべての操作は、4℃で行われる。CHO細胞からの合計25Lのならし培
地を、4インチの0.2mMのMillipore(Bedford, MA)OptiCapカプセルフィルター
及び0.2mMのGelman(Ann Arbor. MI)Supercap 50を通して連続的に濾過する。
細胞(CHO)のならし培地において発現されるタンパク質のために使用する。し
かしながら、E.コリ及びピチアにおいて発現されるzFGF12に関しては、培地は
、AF Heparin 650m親和性カラムへの適用の前、濃縮されない。特にことわらな
いければ、すべての操作は、4℃で行われる。CHO細胞からの合計25Lのならし培
地を、4インチの0.2mMのMillipore(Bedford, MA)OptiCapカプセルフィルター
及び0.2mMのGelman(Ann Arbor. MI)Supercap 50を通して連続的に濾過する。
【0190】
次に、その材料を、3000kDaカットオフAmicon(Bedford, MA)S10Y3膜を備え
たMillipore ProFlux A30垂直流動濃縮機を用いて、約1.3Lに濃縮する。濃縮さ
れた材料を再び、上記のようなGelmanフィルターにより減菌濾過する。プロテア
ーゼインヒビターの混合物を、濃縮されたならし培地に添加し、2.5mMのエチレ
ンジアミン四酢酸(EDTA、Sigma Chemical Co. St. Louis, MO)、0.001mMのロ
イペプチン(Boehringer−Mannheim, Indianapolis, IN)、0.001mMのペプチド
スタチン(Boehringer−Mannheim)及び0.4mMのPefabloc(Boehringer−Mannhei
m)の最終濃度にする。
たMillipore ProFlux A30垂直流動濃縮機を用いて、約1.3Lに濃縮する。濃縮さ
れた材料を再び、上記のようなGelmanフィルターにより減菌濾過する。プロテア
ーゼインヒビターの混合物を、濃縮されたならし培地に添加し、2.5mMのエチレ
ンジアミン四酢酸(EDTA、Sigma Chemical Co. St. Louis, MO)、0.001mMのロ
イペプチン(Boehringer−Mannheim, Indianapolis, IN)、0.001mMのペプチド
スタチン(Boehringer−Mannheim)及び0.4mMのPefabloc(Boehringer−Mannhei
m)の最終濃度にする。
【0191】
濃縮されたならし培地を、0.25MのNaCl、50mMの燐酸ナトリウム(pH7.2)によ
り平衡化された5.0×15.0cmのAF Heparin 650m (TosoHaas, Montgomeryville, P
A) カラムに、BioCad Sprint HPLC (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)
を用いて、5ml/分の流速で適用する。2mlの画分を集め、そして280nmでの吸光度
をモニターする。サンプルの適用の後、カラムを、10カラム体積の充填緩衝液に
より洗浄し、そして溶出液の吸光度が0.05以下である場合、カラムを、50mMのリ
ン酸ナトリウム(pH7.2)中、0.25M〜2.0MのNaClからの3カラム体積グラジエン
トにより溶出する。zFGF12を含む画分を、抗−zFGF12抗体を用いて、SDS−PAGE
及びウェスターンブロットにより同定する。
り平衡化された5.0×15.0cmのAF Heparin 650m (TosoHaas, Montgomeryville, P
A) カラムに、BioCad Sprint HPLC (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)
を用いて、5ml/分の流速で適用する。2mlの画分を集め、そして280nmでの吸光度
をモニターする。サンプルの適用の後、カラムを、10カラム体積の充填緩衝液に
より洗浄し、そして溶出液の吸光度が0.05以下である場合、カラムを、50mMのリ
ン酸ナトリウム(pH7.2)中、0.25M〜2.0MのNaClからの3カラム体積グラジエン
トにより溶出する。zFGF12を含む画分を、抗−zFGF12抗体を用いて、SDS−PAGE
及びウェスターンブロットにより同定する。
【0192】
zFGF12を含む画分を一緒にプールし、そして50mMの燐酸ナトリウム(pH7.5)
により10倍に希釈し、そしてその材料を、上記のようにして、BioCad Sprintを
用いて、50mMのリン酸緩衝液(pH7.5)により平衡化された1.5×20.0cmのPoros
HSカチオン交換カラムに適用する。サンプルの適用の後、カラムを、40カラム体
積の充填緩衝液により洗浄し、そして溶出液の吸光度が0.05以下である場合、カ
ラムを、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.2)中、0.25M〜2.0MのNaClからの3カラ
ム体積グラジエントにより溶出する。画分を上記のようにして集め、そしてzFGF
12を含むそれらの画分を、SDS−PAGE及びウェスターンブロットにより同定し、
一緒にプールし、そしてYM−10膜を固定されたAmicon撹拌セルを用いて濃縮する
。
により10倍に希釈し、そしてその材料を、上記のようにして、BioCad Sprintを
用いて、50mMのリン酸緩衝液(pH7.5)により平衡化された1.5×20.0cmのPoros
HSカチオン交換カラムに適用する。サンプルの適用の後、カラムを、40カラム体
積の充填緩衝液により洗浄し、そして溶出液の吸光度が0.05以下である場合、カ
ラムを、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.2)中、0.25M〜2.0MのNaClからの3カラ
ム体積グラジエントにより溶出する。画分を上記のようにして集め、そしてzFGF
12を含むそれらの画分を、SDS−PAGE及びウェスターンブロットにより同定し、
一緒にプールし、そしてYM−10膜を固定されたAmicon撹拌セルを用いて濃縮する
。
【0193】
次に、濃縮された材料を、1.0MのNaCl、0.01MのEDTA及び0.05Mのリン酸ナトリ
ウム(pH7.2)により平衡化された3.5×100cmのSephacryl−S100ゲル濾過カラム
に適用する。画分を、上記のようにして、抗−zFGF12抗体を用いて、SDS−PAGE
及びウェスターンブロットにより分析する。純粋なzFGF12を含む画分を一緒にプ
ールし、そしてサンプルを、アミノ酸分析及びN−末端配列決定のために採取す
る。
ウム(pH7.2)により平衡化された3.5×100cmのSephacryl−S100ゲル濾過カラム
に適用する。画分を、上記のようにして、抗−zFGF12抗体を用いて、SDS−PAGE
及びウェスターンブロットにより分析する。純粋なzFGF12を含む画分を一緒にプ
ールし、そしてサンプルを、アミノ酸分析及びN−末端配列決定のために採取す
る。
【0194】
例3.
E.コリ発酵培地を、マルトース結合タンパク質融合体としてzFGF12を発現す
る株から得る。MBPzFGF12融合体を、20mMのHepes, 0.4MのNaCl, 0.01MのEDTA, 1
0mMのDTTを含む緩衝液(pH7.4)を用いて、音波処理又はFrenchプレス破壊の間
、溶解する。抽出緩衝液はまた、4μg/mlのPepstatin, Leupeptin, Aprotinin,
Bestainを含む。フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)がまた、0.5mM
の最終濃度で含まれる。
る株から得る。MBPzFGF12融合体を、20mMのHepes, 0.4MのNaCl, 0.01MのEDTA, 1
0mMのDTTを含む緩衝液(pH7.4)を用いて、音波処理又はFrenchプレス破壊の間
、溶解する。抽出緩衝液はまた、4μg/mlのPepstatin, Leupeptin, Aprotinin,
Bestainを含む。フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)がまた、0.5mM
の最終濃度で含まれる。
【0195】
抽出物を、4℃で30分間、18,000×gで回転する。得られる上清液を、融合体
のMBPドメインを結合するAmylose樹脂(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscata
way, NJ)上で処理する。カラムの洗浄の後、結合されたMBPzFGF12融合体を、DT
T及びプロテアーゼインヒビターを含まないが、しかし10mMのマルトースを含む
抽出緩衝液と同じ緩衝液により溶出する。
のMBPドメインを結合するAmylose樹脂(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscata
way, NJ)上で処理する。カラムの洗浄の後、結合されたMBPzFGF12融合体を、DT
T及びプロテアーゼインヒビターを含まないが、しかし10mMのマルトースを含む
抽出緩衝液と同じ緩衝液により溶出する。
【0196】
MBPzFGF12の溶出されたプールを、ウシトロンビン:MBPzFGF12融合体の1:10
0(w/w)溶液により処理する。切断反応を、室温で6〜8時間、進行せしめ、そ
の後、反応混合物を、Amylose親和性クロマトグラフィーについて上記と同じ溶
出緩衝液を用いて、トロンビンを除去するために、ベンズアミジンセファロース
(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ)の層上に通す。
0(w/w)溶液により処理する。切断反応を、室温で6〜8時間、進行せしめ、そ
の後、反応混合物を、Amylose親和性クロマトグラフィーについて上記と同じ溶
出緩衝液を用いて、トロンビンを除去するために、ベンズアミジンセファロース
(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ)の層上に通す。
【0197】
切断された生成物zFGF12及び遊離MBPドメインを含む、前記通された画分を、0
.5MのNaCl、20mMのHepes, 0.01MのEDTAの溶液(pH7.4)により平衡化されたToso
Haas Heparin親和性マトリックス(Toso Haas, Montgomeryville, PA)に適用
する。結合されたタンパク質を、カラム緩衝液中、0.5MのNaCl及び2.0MのNaClに
より形成されるグラジエント2〜3カラム体積により溶出する。
.5MのNaCl、20mMのHepes, 0.01MのEDTAの溶液(pH7.4)により平衡化されたToso
Haas Heparin親和性マトリックス(Toso Haas, Montgomeryville, PA)に適用
する。結合されたタンパク質を、カラム緩衝液中、0.5MのNaCl及び2.0MのNaClに
より形成されるグラジエント2〜3カラム体積により溶出する。
【0198】例4
.
アデノウィルスベクターの構成のために、ヒトzFGF12の領域をコードするタン
パク質を、それぞれ、5’及び3’末端でPmeI及びAscI制限部位を付加するプライ
マーを用いて、PCRにより増幅する。増幅は、次のようにして、PCR反応において
、十分な長さのzFGF12 cDNAにより行われる:95℃で5分(1サイクル);続い
て、95℃で1分、61℃で1分及び72℃で1.5分(15サイクル);続いて、72℃で
7分:続いて、4℃でのソーキング。PCR反応生成物を、TAE緩衝液(0.04Mのト
リス−アセテート、0.001MのEDTA)中、1.2%の低溶融温度のアガロースゲル上
に負荷する。
パク質を、それぞれ、5’及び3’末端でPmeI及びAscI制限部位を付加するプライ
マーを用いて、PCRにより増幅する。増幅は、次のようにして、PCR反応において
、十分な長さのzFGF12 cDNAにより行われる:95℃で5分(1サイクル);続い
て、95℃で1分、61℃で1分及び72℃で1.5分(15サイクル);続いて、72℃で
7分:続いて、4℃でのソーキング。PCR反応生成物を、TAE緩衝液(0.04Mのト
リス−アセテート、0.001MのEDTA)中、1.2%の低溶融温度のアガロースゲル上
に負荷する。
【0199】
zFGF12 PCR生成物を、ゲルから切除し、そしてシリカゲル膜回転カラム(QIAq
uick(商標)PCR精製キット及びゲルクリーンアップキット;Qiagen, Inc.)を
含んで成る市販のキットを用いて精製する。次に、PCR生成物を、PmeI及びAscI
により消化し、フェノール/クロロホルム抽出し、EtOH沈殿し、そして20mlのTE
(トリス/EDTA, pH8)により再水和化する。次に、zFGF12フラグメントを、トラ
ンスジェニックベクターpTG12−8のPmeI−AscI部位中に連結し、そしてエレクト
ロポレーションによりE.コリDH10BTM コンピテント細胞を形質転換する。
uick(商標)PCR精製キット及びゲルクリーンアップキット;Qiagen, Inc.)を
含んで成る市販のキットを用いて精製する。次に、PCR生成物を、PmeI及びAscI
により消化し、フェノール/クロロホルム抽出し、EtOH沈殿し、そして20mlのTE
(トリス/EDTA, pH8)により再水和化する。次に、zFGF12フラグメントを、トラ
ンスジェニックベクターpTG12−8のPmeI−AscI部位中に連結し、そしてエレクト
ロポレーションによりE.コリDH10BTM コンピテント細胞を形質転換する。
【0200】
ベクターpTG12−8は、NruI部位中へのラットインスリンIIイントロン(約200b
p)及びポリリンカー(FseI/PmeI/AscI)の挿入により、p2999B4(Palmiterなど
., Mol. Cell Biol. 13: 5266-5275, 1993)から誘導された。前記ベクターは、
マウスメタロチオネイン(MT−1)プロモーター(約750bp)及びヒト成長ホルモ
ン(hGH)末翻訳領域、及び10kbのMT−1 5’フランキング配列及び7kbのMT−1 3
’フランキング配列を端に有するポリアデニル化シグナル(約650bp)を含んで
成る。cDNAを、インスリンIIとhGH配列との間に挿入する。zFGF12を含むクロー
ンを、プラスミドDNA miniprepにより同定し、続いてPmeI及びAseIにより消化す
る。陽性クローンを配列決定し、構造体に欠失又は他の異常性が存在しないこと
を確かめる。
p)及びポリリンカー(FseI/PmeI/AscI)の挿入により、p2999B4(Palmiterなど
., Mol. Cell Biol. 13: 5266-5275, 1993)から誘導された。前記ベクターは、
マウスメタロチオネイン(MT−1)プロモーター(約750bp)及びヒト成長ホルモ
ン(hGH)末翻訳領域、及び10kbのMT−1 5’フランキング配列及び7kbのMT−1 3
’フランキング配列を端に有するポリアデニル化シグナル(約650bp)を含んで
成る。cDNAを、インスリンIIとhGH配列との間に挿入する。zFGF12を含むクロー
ンを、プラスミドDNA miniprepにより同定し、続いてPmeI及びAseIにより消化す
る。陽性クローンを配列決定し、構造体に欠失又は他の異常性が存在しないこと
を確かめる。
【0201】
DNAを市販のキット(Maxiキット:Qiagen, Inc.)を用いて調製し、そしてzFG
F12 cDNAを、PmeI及びAscI酵素を用いて、pTG12-8ベクターから開放する。cDNA
を、1%の低溶融温度アガロースゲル上で単離し、そしてゲルから切除する。ゲ
ルスライスを、70℃で溶融し、そしてDNAを、2体積のトリス−緩衝されたフェ
ノールにより2度、抽出し、エタノールにより沈殿し、そして10μlの水に再懸
濁する。
F12 cDNAを、PmeI及びAscI酵素を用いて、pTG12-8ベクターから開放する。cDNA
を、1%の低溶融温度アガロースゲル上で単離し、そしてゲルから切除する。ゲ
ルスライスを、70℃で溶融し、そしてDNAを、2体積のトリス−緩衝されたフェ
ノールにより2度、抽出し、エタノールにより沈殿し、そして10μlの水に再懸
濁する。
【0202】
zFGF12 cDNAを、修飾されたpAdTrack-CMV (He, T-C. など., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 95: 2509-2514, 1998) のEcoRV−AscI部位中にクローン化する。こ
の構造体は、緑色蛍光タンパク質(GFP)マーカー遺伝子を含む。GFP発現を駆動
するCMVプロモーターを、SV40プロモーターにより置換し、そしてSV40ポリアデ
ニル化シグナルを、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより置換する。
さらに、生来のポリリンカーを、FseI, EcoRV及びAscI部位により置換する。こ
の修飾された形のpAdTrack−CMVを、pZyTrackとして命名する。
d. Sci. USA 95: 2509-2514, 1998) のEcoRV−AscI部位中にクローン化する。こ
の構造体は、緑色蛍光タンパク質(GFP)マーカー遺伝子を含む。GFP発現を駆動
するCMVプロモーターを、SV40プロモーターにより置換し、そしてSV40ポリアデ
ニル化シグナルを、ヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより置換する。
さらに、生来のポリリンカーを、FseI, EcoRV及びAscI部位により置換する。こ
の修飾された形のpAdTrack−CMVを、pZyTrackとして命名する。
【0203】
連結を、市販のDNA連結及びスクリーニングキット(Fast−Link(商標)キッ
ト;Epicentre Technologies, Madison, WI)を用いて行う。zFGF12を含むクロ
ーンを、FseI及びAscIによるミニプレプDNAの消化により同定する。プラスミド
を線状化するために、約5μgのその得られるpZyTrack zFGF12プラスミドを、Pm
eIにより消化する。約1μgの線状化されたプラスミドを、200ngのスーパーコイ
ルpAdEasy (Heなど., 前記)と共に、E.コリB15183細胞(Heなど., 前記)中に同
時形質転換する。
ト;Epicentre Technologies, Madison, WI)を用いて行う。zFGF12を含むクロ
ーンを、FseI及びAscIによるミニプレプDNAの消化により同定する。プラスミド
を線状化するために、約5μgのその得られるpZyTrack zFGF12プラスミドを、Pm
eIにより消化する。約1μgの線状化されたプラスミドを、200ngのスーパーコイ
ルpAdEasy (Heなど., 前記)と共に、E.コリB15183細胞(Heなど., 前記)中に同
時形質転換する。
【0204】
この同時形質転換は、2.5kV, 200ohms及び25μFaで、Bio-Rad Gene Pulserを
用いて行われる。完全な同時形質転換混合物を、25μg/mlのカナマイシンを含む
4LBプレート上にプレートする。最小のコロニーを取り、そしてLB/カナマイシ
ンにおいて拡張し、そして組換えアデノウィルスDNAを、標準のDNAミニプレプ方
法により同定する。組換えアデノウィルスミニプレプDNAを、E.コリDH10BTM コ
ンピテント細胞中に形質転換し、そしてDNAを、キットの説明書に従って、Maxi
キット(Qiagen, Inc.)を用いて調製する。
用いて行われる。完全な同時形質転換混合物を、25μg/mlのカナマイシンを含む
4LBプレート上にプレートする。最小のコロニーを取り、そしてLB/カナマイシ
ンにおいて拡張し、そして組換えアデノウィルスDNAを、標準のDNAミニプレプ方
法により同定する。組換えアデノウィルスミニプレプDNAを、E.コリDH10BTM コ
ンピテント細胞中に形質転換し、そしてDNAを、キットの説明書に従って、Maxi
キット(Qiagen, Inc.)を用いて調製する。
【0205】
約5μgの組換えアデノウィルスDNAを、20〜30UのPacIを含む反応体積100μl
において、37℃で3時間、PacI酵素(New England Biolabs)により消化する。
消化されたDNAを、等体積のフェノール/クロロホルムにより2度抽出し、そして
エタノールにより沈殿する。DNAペレットを、10μlの蒸留水に再懸濁する。時前
に接種され、そして60〜70%の集密性に増殖された。T25フラスコのQBI−293A細
胞(Quantum Biotechnologies, Inc. Montreal, Qc. Canada) を、PacI消化さ
れたDNAによりトランスフェクトする。PscI−消化されたDNAを、HBS(150mMのNa
Cl,20mMのHEPES)により50μlの合計体積まで希釈する。
において、37℃で3時間、PacI酵素(New England Biolabs)により消化する。
消化されたDNAを、等体積のフェノール/クロロホルムにより2度抽出し、そして
エタノールにより沈殿する。DNAペレットを、10μlの蒸留水に再懸濁する。時前
に接種され、そして60〜70%の集密性に増殖された。T25フラスコのQBI−293A細
胞(Quantum Biotechnologies, Inc. Montreal, Qc. Canada) を、PacI消化さ
れたDNAによりトランスフェクトする。PscI−消化されたDNAを、HBS(150mMのNa
Cl,20mMのHEPES)により50μlの合計体積まで希釈する。
【0206】
別々の管において、20μlの1mg/mlのN−[1−(2,5−ジオレオイルオキシ
)プロピル]−N, N, N−トリメチル−アンモニウム塩(DOTAP)(Boehringer Ma
nnheim, Indianapolis, IN)を、HBSにより100μlの合計体積まで希釈する。DNA
を、DOTAPに添加し、ピペットを上下することにより軽く混合し、そして室温15
分間、放置する。培地を、393A細胞から除き、そして1mMのピルビン酸ナトリウ
ム、0.1mMのMEM非必須アミノ酸、及び25mMのHEPES緩衝液を含む、5mlの血清フリ
ーの最少必須培地(MEM)α(Life Technologies, Gaithersburg, MD)により洗
浄する。
)プロピル]−N, N, N−トリメチル−アンモニウム塩(DOTAP)(Boehringer Ma
nnheim, Indianapolis, IN)を、HBSにより100μlの合計体積まで希釈する。DNA
を、DOTAPに添加し、ピペットを上下することにより軽く混合し、そして室温15
分間、放置する。培地を、393A細胞から除き、そして1mMのピルビン酸ナトリウ
ム、0.1mMのMEM非必須アミノ酸、及び25mMのHEPES緩衝液を含む、5mlの血清フリ
ーの最少必須培地(MEM)α(Life Technologies, Gaithersburg, MD)により洗
浄する。
【0207】
5mlの血清フリーのMEMを、293A細胞に添加し、そして37℃で維持する。DNA/脂
質混合物を、293A細胞のT25フラスコに滴下し、軽く混合し、そして37℃で4時
間インキュベートする。4時間後、DNA/脂質混合物を含む培地をアスピレートし
、そして5%ウシ胎児血清を含む完全MEM5mlにより置換する。トランスフェクト
された細胞を、GFP発現及びフォーカス(ウィルスプラークの形成)についてモ
ニターする。
質混合物を、293A細胞のT25フラスコに滴下し、軽く混合し、そして37℃で4時
間インキュベートする。4時間後、DNA/脂質混合物を含む培地をアスピレートし
、そして5%ウシ胎児血清を含む完全MEM5mlにより置換する。トランスフェクト
された細胞を、GFP発現及びフォーカス(ウィルスプラークの形成)についてモ
ニターする。
【0208】
組換えアデノウィルスDNAによる239A細胞のトランスフェクションの7日後、
細胞はGFPタンパク質を発現し、そしてフォーカス(ウィルス“プラーク”)を
形成し始める。粗ウィルス溶解物を、293A細胞のすべてを集めるために、細胞ス
クラッパーを用いて採取する。溶解物を、50mlの円錐形管に移す。細胞からほと
んどのウィルス粒子を開放するために、3回の凍結/融解サイクルを、ドライア
イス/エタノール槽及び37℃での水浴において行う。
細胞はGFPタンパク質を発現し、そしてフォーカス(ウィルス“プラーク”)を
形成し始める。粗ウィルス溶解物を、293A細胞のすべてを集めるために、細胞ス
クラッパーを用いて採取する。溶解物を、50mlの円錐形管に移す。細胞からほと
んどのウィルス粒子を開放するために、3回の凍結/融解サイクルを、ドライア
イス/エタノール槽及び37℃での水浴において行う。
【0209】
粗溶解物を増幅し(一次(1°)増幅)、zFGF12 rAdV溶解物の作業用“原液”
を得る。ほぼ集密性(80〜90%)の293A細胞の10個の10cmプレートを、前もって
20時間前、設定、200mlの粗rAdV溶解物を、個々の10cmプレートに添加し、そし
て細胞を光顕微鏡下でCPE(細胞性効果)、及び蛍光顕微鏡下でGFPの発現につい
て、48〜72時間モニターする。すべての293A細胞がCPEを示す場合、この原液溶
解物を集め、そして凍結/融解サイクルを上記のようにして行う。
を得る。ほぼ集密性(80〜90%)の293A細胞の10個の10cmプレートを、前もって
20時間前、設定、200mlの粗rAdV溶解物を、個々の10cmプレートに添加し、そし
て細胞を光顕微鏡下でCPE(細胞性効果)、及び蛍光顕微鏡下でGFPの発現につい
て、48〜72時間モニターする。すべての293A細胞がCPEを示す場合、この原液溶
解物を集め、そして凍結/融解サイクルを上記のようにして行う。
【0210】
次に、zFGF12 rAdVの二次(2°)増幅を行う。293A細胞の20個の15cm組織培
養物皿を、細胞が80〜90%集密性になるよう調製する。すべてではないが、20ml
の5%MEM培地を除き、そして個々の皿を、300〜500mlの1°増幅されたrAdV溶
解物により接種する。48時間後、293A細胞を、ウィルス生成から溶解し、その溶
解物を250mlのポリプロピレン遠心分離ボトル中に集め、そしてrAdVを精製する
。
養物皿を、細胞が80〜90%集密性になるよう調製する。すべてではないが、20ml
の5%MEM培地を除き、そして個々の皿を、300〜500mlの1°増幅されたrAdV溶
解物により接種する。48時間後、293A細胞を、ウィルス生成から溶解し、その溶
解物を250mlのポリプロピレン遠心分離ボトル中に集め、そしてrAdVを精製する
。
【0211】
NP−40界面活性剤を、すべての細胞を溶解するために、粗溶解物のボトルに添
加し、最終濃度を0.5%にする。ボトルを、そのボトルが落ちないよう、できる
だけ早く、10分間、撹拌するために回転プラットフォーム上に配置する。残骸を
、20,000×Gでの15分間の遠心分離によりペレット化する。上澄液を、250mlのポ
リカーボネート遠心分離ボトルに移し、そして0.5体積の20%PEG800/2.5MのNaCl
溶液を添加する。ボトルを氷上で一晩、振盪する。ボトルを、20,000×Gで15分
間、遠心分離し、そして上清液を漂白溶液中に捨てる。
加し、最終濃度を0.5%にする。ボトルを、そのボトルが落ちないよう、できる
だけ早く、10分間、撹拌するために回転プラットフォーム上に配置する。残骸を
、20,000×Gでの15分間の遠心分離によりペレット化する。上澄液を、250mlのポ
リカーボネート遠心分離ボトルに移し、そして0.5体積の20%PEG800/2.5MのNaCl
溶液を添加する。ボトルを氷上で一晩、振盪する。ボトルを、20,000×Gで15分
間、遠心分離し、そして上清液を漂白溶液中に捨てる。
【0212】
滅菌された細胞スクラッパーを用いて、2つのボトルからのウィルス/PEG沈殿
物を、PBS2.5mlに再懸濁する。その得られるウィルス溶液を、2mlのマイクロ遠
心分離管に入れ、そして14,000×Gで10分間、遠心分離し、さらなる細胞残骸を
除去する。2mlのマイクロ遠心分離管からの上清液を、15mlのポリプロピレン性
スナップキャップ管中に移し、そしてCsClにより1.34g/mlの密度に調節する。そ
の溶液を、3.2mlのポリカーボネート製、厚壁遠心分離管に移し、そして348,000
×Gで3〜4時間、25℃で回転する。ウィルスは白色バンドを形成する。広口ピ
ペット先端を用いて、ウィルスバンドを集める。
物を、PBS2.5mlに再懸濁する。その得られるウィルス溶液を、2mlのマイクロ遠
心分離管に入れ、そして14,000×Gで10分間、遠心分離し、さらなる細胞残骸を
除去する。2mlのマイクロ遠心分離管からの上清液を、15mlのポリプロピレン性
スナップキャップ管中に移し、そしてCsClにより1.34g/mlの密度に調節する。そ
の溶液を、3.2mlのポリカーボネート製、厚壁遠心分離管に移し、そして348,000
×Gで3〜4時間、25℃で回転する。ウィルスは白色バンドを形成する。広口ピ
ペット先端を用いて、ウィルスバンドを集める。
【0213】
市販のイオン交換カラム(例えば、Sephadex(商標)G-25Mにより前もって充
填されたPD−10カラム;Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を用いて、ウィ
ルス調製物を脱塩化する。カラムを、20mlのPBSにより平衡化する。ウィルスを
充填し、そしてカラム中に流す、5mlのPBSをカラムに添加し、そして8〜10滴
の画分を集める。個々の画分の1:50希釈溶液の光学密度を、260nmで分光計によ
り決定する。ピーク画分をプールし、そして1:25希釈溶液の光学密度(OD)を
決定する。ODを、次の式:260nmでのOD)(25)(1.1×1012)=ビリオン/mlを用
いて、ウィルス濃度に転換する。
填されたPD−10カラム;Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を用いて、ウィ
ルス調製物を脱塩化する。カラムを、20mlのPBSにより平衡化する。ウィルスを
充填し、そしてカラム中に流す、5mlのPBSをカラムに添加し、そして8〜10滴
の画分を集める。個々の画分の1:50希釈溶液の光学密度を、260nmで分光計によ
り決定する。ピーク画分をプールし、そして1:25希釈溶液の光学密度(OD)を
決定する。ODを、次の式:260nmでのOD)(25)(1.1×1012)=ビリオン/mlを用
いて、ウィルス濃度に転換する。
【0214】
ウィルスを貯蔵するために、グリセロールを、精製されたウィルスに添加し、
15%の最終濃度にし、軽くではあるが、しかし効果的に混合し、そして−80℃で
アリコートで貯蔵する。 Quantum Biotechnologies, Inc. (Montreal, Canada) により開発されたプロ
トコールに従って、組換えウィルス感染度を測定する。手短には、2個の96−ウ
ェル組織培養プレートを、アッセイされるべき個々の組換えウィルスについて、
2%ウシ胎児血清を含むMEMにおける1×104個の293A細胞により、ウェル当たり
接種する。24時間後、1×10-2〜1×10-4の個々のウィルスの10倍希釈溶液を、
2%ウシ胎児血清を含むMEMにおいて製造する。100μlの個々の希釈溶液を20ウ
ェルの個々に配置する。37℃での5日後、ウェルを、CPEについて、正又は負で
読み取り、そして“プラーク形成単位/ml”(PFU)についての値を計算する。
15%の最終濃度にし、軽くではあるが、しかし効果的に混合し、そして−80℃で
アリコートで貯蔵する。 Quantum Biotechnologies, Inc. (Montreal, Canada) により開発されたプロ
トコールに従って、組換えウィルス感染度を測定する。手短には、2個の96−ウ
ェル組織培養プレートを、アッセイされるべき個々の組換えウィルスについて、
2%ウシ胎児血清を含むMEMにおける1×104個の293A細胞により、ウェル当たり
接種する。24時間後、1×10-2〜1×10-4の個々のウィルスの10倍希釈溶液を、
2%ウシ胎児血清を含むMEMにおいて製造する。100μlの個々の希釈溶液を20ウ
ェルの個々に配置する。37℃での5日後、ウェルを、CPEについて、正又は負で
読み取り、そして“プラーク形成単位/ml”(PFU)についての値を計算する。
【0215】例5
.
ヒト組織からのcDNAのパネルを、PCRを用いて、zFGF12発現についてスクリー
ンする。パネルは1つの集団で製造され、そして種々の正常及び腫瘍性ヒト組織
及び細胞系からの94のマラソンcDNA及びcDNAサンプルを含み、そして下記表5に
示される。cDNAは1つの集団のライブラリーからであり、又はアラソンcDNAは1つ
の集団のRNA調製物、Clontech RNA又はInvitrogen RNAからである。マラソンcDN
Aを、マラソン−ReadyTM キット(Clontech, Palo Alto, CA)を用いて製造し、
そしてQCをクラスリンプライマーにより試験し、そして次に、クラスリンバンド
の強さに基づいて希釈する。
ンする。パネルは1つの集団で製造され、そして種々の正常及び腫瘍性ヒト組織
及び細胞系からの94のマラソンcDNA及びcDNAサンプルを含み、そして下記表5に
示される。cDNAは1つの集団のライブラリーからであり、又はアラソンcDNAは1つ
の集団のRNA調製物、Clontech RNA又はInvitrogen RNAからである。マラソンcDN
Aを、マラソン−ReadyTM キット(Clontech, Palo Alto, CA)を用いて製造し、
そしてQCをクラスリンプライマーにより試験し、そして次に、クラスリンバンド
の強さに基づいて希釈する。
【0216】
パネルサンプルの性質を確かめるために、品質調節(QC)についての次の3種
の試験を行う:(1)ライブラリーについて使用されるRNA品質を確かめるため
に、1つの集団でのcDNAを、個々のcDNAライブラリーのためのベクター配列に対
して特異的であるベクターオリゴによるPCRにより平均挿入体サイズについて試
験し;(2)パネルサンプルにおけるcDNAの濃度の標準化を、5’ベクターオリ
ゴヌクレオチド及び3’αチューブリン特異的オリゴヌクレオチドプライマー又
は3’G3PDH特異的オリゴプライマーを用いて、十分な長さのαチューブリン又は
G3PDH cDNAを増幅するために標準PCRを用いて達成し;(3)サンプルを、可能
性あるリボソーム又はミトコンドリアDNA汚染について調べるために配列を決定
する。
の試験を行う:(1)ライブラリーについて使用されるRNA品質を確かめるため
に、1つの集団でのcDNAを、個々のcDNAライブラリーのためのベクター配列に対
して特異的であるベクターオリゴによるPCRにより平均挿入体サイズについて試
験し;(2)パネルサンプルにおけるcDNAの濃度の標準化を、5’ベクターオリ
ゴヌクレオチド及び3’αチューブリン特異的オリゴヌクレオチドプライマー又
は3’G3PDH特異的オリゴプライマーを用いて、十分な長さのαチューブリン又は
G3PDH cDNAを増幅するために標準PCRを用いて達成し;(3)サンプルを、可能
性あるリボソーム又はミトコンドリアDNA汚染について調べるために配列を決定
する。
【0217】
パネルは、ヒトゲノムDNA(Clontech, Palo Alto, CA)陽性対照サンプルを包
含する96−ウェル形において設定される。個々のウェルは、約0.2〜180pg/μlの
cDNAを含む。PCR反応を、適切なオリゴヌクレオチド、Takara Ex TaqTM (TAKARA
Shuzo Co. LTD, Biomedicals Group, Japan) 及びRediload色素(Research Gen
etics, Inc., Huntswille, AL)を用いて設定する。典型的な増幅は、次の通り
に行われる:94℃で2分(1サイクル)、94℃で30秒、66.3℃で30秒及び72℃で
30秒(35サイクル)、続いて72℃で5分(1サイクル)。約10μlのPCR反応生成
物を、4%アガロースゲルを用いて標準のアガロースゲル電気泳動にゆだねる。
正しい推定されるDNAフラグメントサイズを、(1)胎児脳、胎児心臓、胎児腎
臓、胎児肝臓、胎児肺、K52細胞系、精巣、骨髄及びB−細胞からの正常組織;及
び(2)肺、卵巣、直腸及び子宮からの癌性組織において観察する。
含する96−ウェル形において設定される。個々のウェルは、約0.2〜180pg/μlの
cDNAを含む。PCR反応を、適切なオリゴヌクレオチド、Takara Ex TaqTM (TAKARA
Shuzo Co. LTD, Biomedicals Group, Japan) 及びRediload色素(Research Gen
etics, Inc., Huntswille, AL)を用いて設定する。典型的な増幅は、次の通り
に行われる:94℃で2分(1サイクル)、94℃で30秒、66.3℃で30秒及び72℃で
30秒(35サイクル)、続いて72℃で5分(1サイクル)。約10μlのPCR反応生成
物を、4%アガロースゲルを用いて標準のアガロースゲル電気泳動にゆだねる。
正しい推定されるDNAフラグメントサイズを、(1)胎児脳、胎児心臓、胎児腎
臓、胎児肝臓、胎児肺、K52細胞系、精巣、骨髄及びB−細胞からの正常組織;及
び(2)肺、卵巣、直腸及び子宮からの癌性組織において観察する。
【0218】
【表4】
【0219】
【表5】
【0220】
前述から、本発明の特定の態様が例示目的のために記載されて来たが、種々の
修飾が本発明の範囲内で行われ得ることが理解されるであろう。
修飾が本発明の範囲内で行われ得ることが理解されるであろう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
C12N 1/19 C12N 1/21 4C086
1/21 C12P 21/02 C 4H045
5/10 A61K 31/711
C12P 21/02 39/395 D
// A61K 31/711 N
38/00 48/00
39/395 A61P 3/10
9/00
48/00 9/10
A61P 3/10 9/12
9/00 11/00
9/10 13/08
9/12 13/12
11/00 17/02
13/08 21/00
13/12 25/00
17/02 27/02
21/00 35/00
25/00 C12N 15/00 ZNAA
27/02 5/00 A
35/00 A61K 37/02
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE,TR),OA(BF
,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,
ML,MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,G
M,KE,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ
,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,
MD,RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,
AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,B
Z,CA,CH,CN,CR,CU,CZ,DE,DK
,DM,DZ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,
GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,J
P,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR
,LS,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,
MN,MW,MX,MZ,NO,NZ,PL,PT,R
O,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ
,TM,TR,TT,TZ,UA,UG,UZ,VN,
YU,ZA,ZW
Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 BA21 BA44 CA01
CA04 CA07 CA11 DA01 DA02
DA05 DA11 EA01 EA02 EA03
EA04 FA02 GA01 GA11 HA01
HA03
4B064 AG13 AG27 CA01 CA19 CA20
CC24 DA01
4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y
AB01 AB02 BA01 BA08 CA24
CA25 CA44 CA46
4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13
BA01 BA08 BA22 BA23 CA18
MA55 MA66 NA14 ZA012
ZA022 ZA332 ZA362 ZA422
ZA592 ZA812 ZA892 ZA942
ZB262 ZC352
4C085 AA13 AA14 BB11 BB41 BB43
CC22 CC23 GG02 GG04
4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01
MA04 NA14 ZA01 ZA02 ZA33
ZA36 ZA42 ZA59 ZA81 ZA89
ZA94 ZB26 ZC35
4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10
BA41 CA40 DA01 DA76 EA20
EA50 FA72 FA74
Claims (18)
- 【請求項1】 配列番号2の残基25〜残基251に示されるような配列に対し
て少なくとも95%同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る単離されたポリペ
プチド。 - 【請求項2】 配列番号2の位置113でCys残基、位置115でPhe残基及び位置
117でHis残基を含んで成る請求項1記載の単離されたポリペプチド。 - 【請求項3】 配列番号2の位置53でLeu残基、位置61でVal残基、位置73で
Leu残基、位置75でIle残基、位置83でVal残基、位置85でIle残基、位置94でVal
残基、位置102でLeu残基、位置113でCys残基、位置115でPhe残基、位置127でTyr
残基及び位置136でVal残基を含んで成る請求項1記載の単離されたポリペプチド
。 - 【請求項4】 配列番号2のアミノ酸残基25〜アミノ酸残基251に示される
ようなアミノ酸残基の配列を含んで成る単離されたポリペプチド。 - 【請求項5】 配列番号2の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含んで成
る単離されたポリペプチド。 - 【請求項6】 次の作用可能に連結された要素: (a)転写プロモーター; (b)請求項1記載のタンパク質をコードするDNAセグメント;及び (c)転写ターミネーターを含んで成る発現ベクター。
- 【請求項7】 前記DNAセグメントに作用可能に連結される分泌シグナル配
列をさらに含んで成る請求項6記載の発現ベクター。 - 【請求項8】 前記タンパク質が、配列番号2の位置53でLeu残基、位置61
でVal残基、位置73でLeu残基、位置75でIle残基、位置83でVal残基、位置85でIl
e残基、位置94でVal残基、位置102でLeu残基、位置113でCys残基、位置115でPhe
残基、位置127でTyr残基及び位置136でVal残基を含んで成る請求項6記載の発現
ベクター。 - 【請求項9】 次の作用可能に連結された要素: (a)転写プロモーター; (b)請求項4記載のタンパク質をコードするDNAセグメント;及び (c)転写ターミネーターを含んで成る発現ベクター。
- 【請求項10】 請求項6記載の発現ベクターを含んで成る培養された細胞
。 - 【請求項11】 請求項10記載の細胞を、DNAセグメントが発現される条件
下で培養し;そして 前記DNAセグメントによりコードされるタンパク質を回収することを含んで成
る、タンパク質の製造方法。 - 【請求項12】 請求項1記載のポリペプチド又は請求項1記載のポリペプ
チドを含んで成るタンパク質に対して特異的に結合する抗体。 - 【請求項13】 請求項4記載のポリペプチド又は請求項1記載のポリペプ
チドを含んで成るタンパク質に対して特異的に結合する抗体。 - 【請求項14】 配列番号2の残基25〜残基251に示されるような配列に対
して少なくとも95%同一であるアミノ酸残基の配列をコードするヌクレオチドの
配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子。 - 【請求項15】 配列番号2のアミノ酸残基25〜アミノ酸残基251に示され
るようなアミノ酸残基の配列をコードするヌクレオチドの配列を含んで成る単離
されたポリヌクレオチド分子。 - 【請求項16】 配列番号1のヌクレオチド187〜ヌクレオチド870に示され
るような、又は配列番号3のヌクレオチド72〜ヌクレオチド753に示されるよう
なヌクレオチドの配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子。 - 【請求項17】 そのポリペプチドの少なくとも1つが請求項4記載のzFGF
12ポリペプチドを含んで成る、複数のポリペプチドを含んで成る融合タンパク質
。 - 【請求項18】 配列番号2のアミノ酸残基25〜アミノ酸残基251に示され
るようなアミノ酸残基の配列を含んで成るzFGF12ポリペプチドの存在下で間葉幹
細胞又は前駆体細胞を、そのzFGF12ポリペプチドの不在下で増殖される細胞に比
較して、間葉細胞の数を増すのに十分な量、培養することを含んで成る、間葉細
胞の増殖を刺激するための方法。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US47806200A | 2000-01-05 | 2000-01-05 | |
US09/478,062 | 2000-01-05 | ||
PCT/US2001/000238 WO2001049740A1 (en) | 2000-01-05 | 2001-01-04 | Novel fgf homolog zfgf12 |
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---|---|
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---|---|---|---|
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WO2001066596A2 (en) * | 2000-03-08 | 2001-09-13 | Chiron Corporation | Human fgf-23 gene and gene expression products |
EP2075255A1 (en) * | 2000-03-08 | 2009-07-01 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Human FGF-23 gene and gene expression products |
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EP1466925B1 (en) * | 2001-12-28 | 2009-09-02 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Antibodies against fibroblast growth factor 23 |
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KR20150104579A (ko) | 2012-12-27 | 2015-09-15 | 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. | 담즙산 항상성의 조절 및 담즙산 질환 및 질병의 치료 방법 |
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WO2017019957A2 (en) | 2015-07-29 | 2017-02-02 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Binding proteins and methods of use thereof |
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WO1996039507A1 (en) * | 1995-06-05 | 1996-12-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Fibroblast growth factor 11 |
WO1999027100A1 (en) * | 1997-11-25 | 1999-06-03 | Genentech, Inc. | Fibroblast growth factor-19 |
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2001
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- 2001-01-04 CA CA002396401A patent/CA2396401A1/en not_active Abandoned
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