JPS62500100A - 酸開裂性化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はアミ７基を有する物質の液体媒質への制御された放出及びかかる放出に おいて用いる化合物に関する。 アミノ含有物質の液体媒質への放出を制御することが望ましい状態が多数有る。 例として、細胞集団或は！ａ胞集団の内の特定部分へのアミ７基含有薬剤又は細 胞毒素の放出を制御するのが望ましいことがあろう。また、例えば、ペプチド或 はタンパク質等の大きなアミノ基含有分子の複合体における空間的関係を分析す る際に、棟々の架橋タンパク質或はペプチドの開裂を制御するのが望ましいこと もあろう。〔「ペプチド」なる用飴は、本出願中、タンパク質を、いかに大きい ものであっても、並びは短い鎖のペプチドを含むのに用いる。〕制御した放出が 望ましい特定の状態の１つは、生物学的に活性な化合物を細胞膜に通して内細胞 構造に送達し、例えば、そこで化合物は細胞膜の外側媒質中に捕えられるならば 低い又は減じた作用を有するが、細胞内で一担放出されれば一層効力が出る。 また、生物学的に活性な化合物を！Ａ種細胞集団中の選択細胞に送達することも 望ましい。例えば、ウィルス感染細胞或は変化した細胞或は悪性細胞等の病気に かがった或は感染した細胞を治療する際に、細胞毒素を病気にかかった細胞或は 悪性の細胞に送達することが望ましく、正常の細胞に送達することは望ましくな い。 悪性細胞を生物学的に活性な化合物の目標にするのに開示される１つのアプロー チは、抗体−毒素配合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　）を用いる。抗体は悪性細胞に 対して特異でありかつ毒素を悪性細胞に送達する。このような系は、有効である ためには、標的細胞への選択性の尚い毒素を、活性物質の効能を不必要に低減さ せないで送達すべきである。これらの問題は、目標が生体内で正常の細胞を害し ないで感染した或は病気にかかった細胞を破壊することである場合に特に重要で ある。 種々の開裂性二官能価の架橋剤が知られている。 ランバー）　（Ｌａｍｂ＠ｒｔ　）等（１９８１年）のＪｏＭｏｌ。 Ｂｉｏｌ、　１４９巻、４５１〜４７６頁及びワンプ（Ｗｔｎｇ　）等（１９７ ４年）のＩｍｒ、　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　１２巻、３７５−３８９頁は、開裂性ジ スルフィド結合を含有する二官能価架橋試薬を開示している。試薬は生化学系の 特性を示すのに用いている０ ルツター（Ｌｕｔｔ＠ｒ　）等（１９７４年）のＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ４８ 巻、２８８−２９２頁は、過ヨウ紫酸塩酸化によって開裂することのできるｖｉ ｅ−グリコール結合を有する二官能価架橋試薬を開示している。 カールソン（ｃｔｒｌａｓｏｎ　）等（１９７８年）のＢｉｏｃｈａｍＪ、１７ ３巻、７２５−７３７頁は、二官能価試薬Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピ リジルジチオ）プロピオネートを用いて２つの異るタンパク質問にジス／Ｉ／フ ィト結合を形成する手順について開示している。 よりｖＰ細には、ある種のモノクローナル抗体、毒素及びそれらの配合物が知ら れている。 ビテツタ（Ｖｌｔｓｔｔａ　）等（１９８３年）、サイエンス、２１９巻、６４ ４−６５０頁及びエドワーズ（Ｅｄｖａｒｄａ　）（１９８３年）、Ｐｈａｒｍ ａｃｏｌ、Ｔｈ＠ｒ、　２３巻、１４７−１７７頁は、細胞−表面構造に特異な 毒素とモノクロナル抗体とのジスルフィド結合した配合物を開示している。これ らの配合物を用いて毒素を抗体が認識する表面構造を有する特異細胞の標的にし ている。 ラマクリシュナン（Ｒａｍａｋｒｉａｈｎａｎ　）等（１９８４年）キャンサー リサーチ、４４巻、１３９Ｂ−１４０４号は、アメリカヤマゴボウ（ｐｏｋｅｖ ｏｏｄ　）抗ウイルス性タンパク質（ＰＡＰ）をモノクローナル抗体である抗チ ミン（Ｔｈｙ）ｔｌに接合させることを開示している。配合物を用いてチミン上 １−陽性標的白血病細胞におけるタンパク質合成を選択的に抑制している。配合 物を形成するのに用いるリンカ−はＮ−スクシンイミジル−ｇ−（２−ピリジル ジチオ）プロピオネートである。ジスルフィド結合を　′開裂すれば、遊隙のＰ ＡＰ毒素を産生ずる。 リンフ（Ｒｌｔｚ　）等（１９８０）、ネーチャー、２８３巻、５８５−５８５ 頁は、通常の急性リンパ芽球白血病抗原に特異なモノクローナル抗体（Ｊ５）を 開示している。 パービエリ（Ｂａｒｂｉ＊ｒｉ　）等（１９８２年）バイオケミ　。 ストリージャーナル、２０３巻、５５−５９頁はアメリカヤマゴざつ抗ウイルス タンパク質−ｓ（［ｐＡｐ−ｓ］）として知られる抗ウイルスタンパク質の精製 及び部分特性表示について開示している。 スターペ（５ｔｉｒｐｅ　）等（１９８０年）、ジャーナルオプパイオｐジ力ル ケミストリー（Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　）はタンパク質毒素であるゲロ ニン（ｇ＠１ｏｎＩｎ　）の製造法について開示している。 ネビル（Ｎ・マｉｌｌ・）等の米国特許４．５５９．４５７号は抗チミンｔ１そ ノクリーナル抗体とりチンとの配合物をリンパ腫に対する腫瘍抑制組成物として 使用することを開示している。使用する結合剤はｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ −ヒドロキシスクシンイミドである。 上記のアプローチは抗体−毒素配合物の毒性に依存するか１或は毒素の放出を標 的細胞に送達する前に一時的に制御し及び空間的に回避するのが難かしくなり得 る現象であるジスルフィド結合開裂に依存する。 カービイ（Ｋｌｒｂｙ　）等（１９７０年）、Ｐｒｏｅ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ＳｏＣ，Ｓｙｍｐ、　５１巻、９９−１０３頁は、マレイン 醸アミドがｐＨ３より低い所で急速に加水分解されかつマレインアミド酸の置換 がその速度を増大させ、ｔ−ブチル置換基が最大の増加を与え、メチル置換基が 最小の増加を与えることを開示している。 ジクソン（Ｄｌｘｏｎ　）等（１９６８年）、Ｂｌｏｃｈｓｍ　Ｊ。 １０９巻、３１２−３１４頁は無水２−メチルマレイン酸（「シトラコン酸」） をブロッキング剤として使用するアミ７基の可逆ブロッキングについて開示して いる。 シトラコニル残基とインシュリンのりジン残基との間のアミド基はｐ　Ｈ６，５ において開裂されなかった。ｐＨを五５に下げ一晩中２０℃においた場合にブロ ッキング基の全放出があり、インシュリンは変わらないままであった。 発明の要約 温和な酸性条件下でアミノ基含有物質の制御された放出を可能にする一群の架橋 剤を見出した。 発明は、−面において、アミノ基含有基含有物質のアミノ窒素と第二化合物のス ルフヒドリル機能との間の酸開裂性結合を形成するのに適した架橋試薬を特徴と する。 架橋試薬は下記の単位： （式中、Ｒ１及びＲ，は独立に、Ｈｓ”Ｂ又はそれ以下のアルキル基から選び、 人は橋（ブリッジ）単位を含む）を含む。 代りに、架橋試薬は下記の単位： （式中、Ｒ２はＨ％　ＣＩ！又はそれ以下のアルキル基から選び、Ａはブリッジ 滋位を含み、８＝２〜５である）を含む。 発明は、第２の而において、アミン基含有化合物をスルフヒドリ／ｌ／基含有化 合物と架橋させて生じる架橋ヘテロダイマー複合体を特徴と丈る。アミ７基含有 化合物は複合体から、アミド結合を加水分解してアミノ基含有化合物を再生する 程（こ媒質のｐＨを丁げることによって放出される。 発明の初めの２つの而の好まｔ７い実ｉ　Ｍ様において、ブリッジは下記の単位 人： （ここで、Ｒ３”’　ＲＱは独立にＩ１１ハロゲン、ｃＩ！又はそれ以下のアル フ午シ及びアノシキル基、第三アミンから選び；Ｂはマレイミド機能へのリンカ −である）を含む。ｎ、ｓ　＋　Ｒ１！及びＢは、単位Ａの環に結合されだイオ ウが対応するチオフェノール化合物において、Ａにおいてスルフィド基を形成す る間にＯＨ−によって引き起こされる競争副反応を回避するような十分に低いｐ Ｋａを有するように選ぶ。例えば、チオフェノールのｐＫａは１α０より低い。 また、好ましい実施態様において、Ａにおける芳香族環のスルフィド機能を（ｃ ｎｚ）ｋ（ｋは１−５である）を含む基によってマレイン酸機能に結合させる。 最も好ましくは、Ｂはアミド機能であってその窒素をＡの芳香族環にスルフィド 機能に対しバラに結合させかつそのカルボニル機能を（ＣＩ（！　）　ｑ　（ｑ 　”　’　−５である）或はアリール基〔最も好ましくは、マレイミド結合がカ ルボニル結合に対しメタ或はバラである未置換アリール基〕によってマレイミド 基の窒素に結合させたものを含む。 °よた、生成した架橋複合体の好ましい実施態様において、了ミノ基含有物質は 選択ａｌｌ飽に送達されるべき生物学的に活性な物質であり、かつスルフヒドリ ル基含有化合物はそれらの細胞について選択性の結合パートナ−を含む。化合物 は、発明の第４の面にＭ連して下記に一層完全に説明する通りの活性物質を選択 細胞に送達スル方法で用いる。 発明は、第３の面において、チオフェノール含有機能を含む化合物に活性化ｗ換 マレイン酸誘導体を結合させる置換反応によって架橋剤を合成する方法を特徴と する。 反応はチオフェノールのスルフヒドリル基をイオン化し、それによって競争Ｓｌ ’ｈ’ｆｉ！換反応を回避する程に尚くかつＯＨ−の競争反応を回避する程に低 いｐｉ（において行う〇次いで、生成した中間体をマレイミド機能に結合させる 。 合成方法の好適な実施態様において、置換反応をｐＨ約９．５〜１ｔ５において 行い、最も好ましくはｐＨは１α５〜１ｔ５、又は約１ｔＯである。また、好適 な実施態様において、チオフェノール含１ｖ機能はアミン窒素を含むアミド結合 によってマレイミド機能に結合させるアミンを含む。 発明は、第４の面において、活性物質を選択細胞の細胞−表面受容体に特異なス ルフヒドリル−機能化細胞−結合パートナ−に架橋させて形成した複合体に細胞 を簀呈させることによって、生物学的に活性なアミン基含有物質を異質細胞集団 の選択部分に送達する方法を特徴とする。化合物は選択的にそれらの細胞に結合 し、かつ活性物質と架橋のマレイン酸機能との間のアミド結合を開裂する程に低 いｐＩ（に暴露されて活性物質を複合体から放出する。 第４の面の好適な実施態様において、生物学的に活性な物質はペプチド又はタン パク質であり、最も好ましくはリポソームを不活性化してタンパク質合成を不活 性化する細胞毒性物質である。細胞結合パートナ−はＪ５抗体或はＴ３、Ｔ４、 Ｔ１１又はＴ１２のＴ細胞表面抗原に対する抗体等の細胞−表面抗原を認識する 抗体、例えばモノクローナル抗体である。 また、好適な送達方法において、抗体は次面抗原を含有する細胞の膜を横断して 輸送されるものであり、そのため架橋複合体が細胞内を移送される。複合体は一 担細胞の中に入れば活性物質、例えばリポソーム不活性化毎素を放出するのに十 分な吊性度を自然に示す特異な細胞画分に暴露され、こうして活性物質を有効か つ選択的に放出する。 発明はアミ７基含有物質か或は液体媒質系の他の成分のどちらかを変質させ得る 酸化又は還元条件又は極端なｐＨ値を必要としない点で温和な注意深く制御する 条件下でアミノ基含有物質を液体媒質に送達することを可能にする。その上、開 裂は生体内系と調和する程に温和であるだけでなく実際天然に起きる細胞内現象 によってもたらされるｐ　Ｔ（において起きる。有利なことに、アミノ含有物質 はそのｐ）ｌにおいて確実に放出されるが、より高いｐＨ値において安定に結合 される。好ましくは、アミノ置換基の放出はＰＨ３，５〜５５において、最も好 ましくはｐ　Ｈ４，０〜５．０、又は約４．５において達成される。 その上、架橋及び放出プロセスは単位をアミノ基含有物質に付加したり、或はア ミ７基含有物質から単位を減じたりしない。 その他の特徴及び利点は下記の好適な実ｆｉ態様の説明及び請求の範囲の記載か ら明らかになるものと思う。 好適な実ＩＭ態様の説明 今、発明の好適な実施態様の説明にとりかかり、初めに図面の簡単な説明する。 第１図は一群の架橋試薬を調製するフローダイヤグラムである。 第２図は第１図において調製した試薬によって架橋した特定の複合体を調製する フローダイヤグラムである。 発明の特に好ましい２つの実施態様がある。１つは上述した通りに生物学的に活 性なタンパク質又はペプチドを細胞に送達する細胞送出（ｃ＠ｌｌ　−ｄｅｌｉ マ・ｒｙ）剤である。 他方はリボソーム複合体又は多ユニツト酵素等の大きなアミ７基含有分子を１個 又はそれ以上含む複合体を評価する道具である。複合体の架橋部材によって、架 橋成分を切り離し、次いで架橋成分を分析するためにそれらの構造を変更しない で架橋成分の結合を断つ（ｄｅｅｏｕｐｌｅ）ことが可能である。複合体の部材 及び架橋物質の出現及び消失を分析することは、生命系の成分を評価し、かつそ れによりこれらの系の治療の効果及びこれらの系における異常を追跡する道具を 提供する。 細胞送出実施態様 細胞に送達されるべき好ましい生物学的に活性な物質はタンパク質又はペプチド 薬剤又は酵素である。特に好適な実施態様において、活性物質は選択細胞に送達 されるべき細胞毒素である。このような毒素は上述しかつアービン（Ｉｒｖｌｍ 　）　（１９７５年）、Ｐｈａｒｍａｅ　、　Ｔｈ＠ｒ、　２１巻、３７１−３ ８７頁におけるアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩ及 びＰＡＰ−８を含む。その他のペプチド細胞毒素はりチンＡＨｉ、アブリンＡ鎖 、モデシン（ｍｏｄ＠ｅｅｌｎ　）Ａ　＠並びにゲロニン及びバービエリ（Ｂａ ｒｂｉ＊ｒｉ　）等（１９８２年）、Ｃａｎｃ＠ｒ　Ｂｕｙ。 １巻、４８９−５２０頁に記載されているようなその他の単一鎖リポソーム不活 性化タンパク質を含む。 ペプチド毒素は試薬に容易に結合されかつ細胞内に極めて微小な量で存在すれば 細胞タンパク質合成を抑制する極めて効力のある毒素であるが故に好ましい。し かしながら、ペプチドでないその他のアミノ基含有細胞毒素もまた発明の範囲内 にある。かかる細胞毒素又は細胞毒性薬剤の例はメルフアラン、プレオマイシン 、アドリアマイシン、ダウノマイシンである。 上述した活性物質は、パートナ−を細胞表面特徴に結合させることによって選択 細胞に送達する。好適な結合パートナ−は細胞表面抗原に対する抗体である。特 に好適なものは、病気にかかった、感染した、変質した或は悪性の細胞に特異で あるが正常の細胞に特異でない細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体である 。特に、シ。 かし排除するものでなく、それらは細胞によって取り上げられる抗体である。細 胞による活性物質のかなりの取り上げを可能にする十分な数の抗原が正常細胞に 存在しないさえすれば、正常な（すなわち、非標的）細胞が特定の抗原を完全に 欠くことは必要でない。 かかる抗体の１つは、ハイアリア７ｐリダ、コウルターイミュノロジー（Ｃｏｕ ｌｔ＊ｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　）から入手し得る上述したＪ５である。その 他の例はイマイ等（１９８３年）、Ｃ畠ｎｅ・ｒＩ順、１５巻、２０６頁以降に 記載されているような色素細胞肺表面抗原に対する抗体である。コウルターイミ ュノロジーから入手し得るその他の適当な抗体はＴ細胞、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ１１、 ＴＩ　２等のＴ細胞リンパ腫に見られる表面抗原に対する抗体を含む。 本実施態様におけるその他の結合パートナ−はトランスフェリン等の非抗体細胞 膜輸送因子及びインシュリン等のタンパク質ホルモンを含む。 生物学系評価 架橋によって評価すべき好適な系はリポソーム、膜等の細胞構造及び複合タンパ ク質を含む。系の１つの成分をスルフヒドリル基で機能化し、かつ上述した架橋 剤を用いてその成分をスルフヒドリル基に隣接したアミ７基含有物質に架橋させ る。例えば、機能化した酵素基質を用いて酵素触媒反応の進行の間に架橋するこ とにより酵素の結合領域を確立することができる。 架橋剤 上に挙げた２つの実施態様の内のいずれかにおいて、アミノ基含有物質とスルフ ヒドリル基とを連結させるリンカ−が極めて重要である。アミノ基含有物質は、 その活性を変えないで、好ましくはその構造を変えないでリンカ−に連結されか つリンカ−から開放されるべきである。 こうして、アミノ結合はタンパク質構造に影響を与えない温和な条件下で形成さ れるべきである。同時に、結合は早過ぎて開裂されず、しかも生物学的系の繊細 な成分に適合し得る温和な条件下で開裂される強いものになるべきである。開裂 部位はアミノ基含有物質のアミノ基とリンカ−との結合位置になるべきであり、 それにより物質は成分を付加せずかつ切断しないでそのまま開放される。 上述したように、アミ７基含有物質の窒素への開裂性アミド結合を形成するのに 無水マレイン酸機能が適当である。また、複合体の第２化合物のスルフヒドリル 機能への安定な結合を形成するのにマレイミド単位が適している。 上記のマレイミド単位と無水マレイン酸との間のブリッジが自然のプロセスによ り（すなわち、生体内系における酵素により）望ましくない時又は場所において 開裂されるならば、結合パートナ−の選択性が失われ、かつ毒素又は潜在的毒性 活性を有する化合物が細胞の外の媒質中に標的細胞を選択する手段を持たないで 存在することになるから、該ブリッジは重要である。ブリッジに関するその他の 制約は複合体の他の成分に関する相容性及び不活性でありかつそれらの成分を害 しない条件下での形成の容易性である。 好適なブリッジについては、上記「発明の要約」において詳細に説明している。 今、例示のために、次式二 〇 を有する下記の好適な架橋試薬の２つの特定の代表例の合成及び使用について説 明１−る。 第１の例においてＷは（ＣＨｚ）ｓであり、第２の例においてＷは 架橋結合の合成 第１例の合成を第１図に示す。かいつまんで言えば、架橋試薬６は下記の主工程 によって合成することができる； ｔ　２−ブロモメチルマレイン酸無水物（化合物２）を加水分解する； λ　生成したマレイン酸誘導体（化合物３）に４−アミノチオフェノールを反応 させて化合物４とする；五　化合物４に６−マレイミトーカプロン酷のアシルク ロリドな反ろさせて二酸を作り、これを脱水させて化合物６を生成する。 無水物（２）を希薄水溶液中で加水分解しかつ完全に加水分解した後すぐに二酸 （３）を中和して２−（ブロモメチル）マレイン酸（５）の対応する７マレ一ト 類似体への異性化を回避する工程を採用する。生成したブロモメチルフマル酸誘 導体はずぺて下記に一層詳細に説明する通りに化合物（４）を精製する際に除く 。 反応混合物のｐＨを、ｐ−アミノチオフェノールを対応するチオフェルレートア ニオンに転化させる程に上げてブロモメチルマレイン酸の（望ましいＳＮ２置換 よりもむしろ）望ましくないＳ　Ｎ　２　’置換反応を抑制する。 上述した合成の特定の詳細は次の通りである。 ローセン（Ｌａｕｒｓ＠ｎ　）等（’　１９７１年）、Ｊ、Ｍａｄ。 Ｃｈ＠ｍ、　１４巻、６１９−６２１頁の方法のグリーンリー（Ｇｒｔｅｎｌｅ ｓ　）及びウッドワード（Ｗｏｏｄｖａｒｄ　）　（１９８０年）、テトラヘド ロン、３６巻、３３６７〜３３７５頁による変法に従って、化合物１から２−（ ブロモメチ１ｖ）−マレイン酸無水物（２）を作る。この物質（２９）を水（２ ｏ＊）中室温において約１時間加水分解して２−（ブロモメチル）−マレイン酸 （５）とし、かつ溶液を１ＮＮａＯＨ（２ｔ　２　ｍＬ）で中和し、ガス抜きし 、Ｎｚ下に保ツ。溶液を、脱気したＩＮ　ｌＮａ０Ｈ（１ｔ　６　ｍＬ　）中に Ｎ。 下相やかに加熱しながら溶解しかつろ過して不溶性二量体を除いておいたあらか じめ調製しておいた４−アミノチオフェノール（ｔ５１９）の溶液に加える。ろ 液ヲ脱気水（１２ｍＬ）で希釈した後に上記化合物５の溶液に加える。最終反応 溶液をＩＮ　ＮｍＯＨで約ｐＨ１ｔＯにもたらしかつＮ２下室温において一晩中 攪拌する。次いで、溶液をろ過して少量のビス−（４−アミノフェニル）−ジス ルフィドを除き、氷冷し、ＩＮ　ＨＣＩで酸性にして黄色沈殿を与える。ｎ−ブ タノールを加え（ａｏｍＬ）かつ混合物を氷上５分間激しく攪拌する。これは化 合物４のフマル酸類似体を除く。次いで、固体をろ過によって集め、αｌＮＨＣ ｌ及び水で続けて洗浄し、最後に真空デシケータ−中Ｐ、　ｏｓで乾燥して中和 化合物４を生じる。 ２、　マレイミドー二酸＆ ケラ−（Ｋｅｌｌｅｒ　）及びルデインガ−（Ｒｕｄｉｎｇｅｔ）（１９７４年 ）ＳＨｅｌｖ、　Ｃｈｅｗ、　Ａｅｔａ　、　５８巻、５３１〜５４１頁の方法 に従って６−マレイミトーカプロン酸を作り、かつ塩化チオニルでその酸塩化物 に変える。６−マレイミトーカプロン酸（ｔｏ６９）を乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ） 中に溶解し、５ＯＣ１ｚ　（α５１　ｍＬ　）で処理し、溶液を水分を除外して １５時間還流する。溶液を真空で蒸発させて乾燥状態にし、かつ残留油を乾燥Ｔ ＨＦ　（ｓ＊）中に溶解する。この溶液を乾燥ＴＨＦ　（１５ｍｊ）及びＮ−エ チルモルホリン（２，１６ｍＬ）中化合物４（ｔ１＋ｓｇ）の溶液に１０分かけ て滴下する。２時間後、溶液を減圧下で蒸発させて乾燥状態にする。残留前を取 り上げて酢酸エチルに入れかつ溶液を冷αｌＮＨＣｌで、次いで水で洗浄する。 酢酸エチル溶液を乾燥させかつ溶媒を蒸発によって除く。 次いで、溶離液として酢酸２％を含有するＣＨＣＩｓ−ＭｅＯＨ（９５：　５、 ｖ／ｖ）を有するシリカゲルの７ラツシユクロマトグツフイーによって粗生成物 を精製する。 最後に純生成物をＭａＯＨ−ＨｚＯ（１：　２、ｖ／ｖ　）中Ｄｏｗｅｘ　５０ 　（Ｈ＋形）のカラムの中に通す。溶媒を蒸発しかつ油状残留物を高真空下で乾 燥して脆性固形７オームを収率５５％（９７６岬）で与える。 五　架橋用試薬＆ 乾燥ＴＨＦ（３ｍｊ）中の化合物５（２００η）を乾燥ＴＨＦ（２ｍＬ）中ジシ クロヘキシルカルボジイミド（１１０η）の溶液で０℃において処理する。反応 混合物を室温において４５分間攪拌し、次いでろ過して沈降ジシクロヘキシル尿 素をなくす。ろ液を真空で濃縮して乾燥状態にし、生成した油を乾燥ジオキサン （２ｍＬ）中に溶解しかつ再度ろ過する。最後に、ジオキサンを凍結乾燥して除 き、茶色がかった固体が残る。 架橋用試薬の第２例は、上記工程２の６−マレイミドカプロン醐クロリドの代り にｐ−マレイミドベンゾイルクロリドを用い上述した化合物６と同じ方法で作る 。 上述した２つの架橋剤を用いて下記に説明する通りにペプチド薬剤又は毒素を細 胞−特異抗体に架橋させることができる。説明する特定例は上述した毒素ゲロニ ン及びモノクローナル抗体Ｊ５を利用する。第２図はこれらの工程を図解する。 ゲロニンは、上に挙げたスターぺ等（１９８０年）が記載する通りにゲロニウム ムルチ７０ラム（Ｇ＊１ｏｎｉｕｍｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ　）　（）ウダイグ サ科＜　Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｅ＠ａｅ　）からの種子から得られる。種子はイン ド、カルカッター１、クライブロウ１（１，ユナイテイツドケミカルアンドアラ イドプロダクツからニューシャーシー、ノースパーゲン、ミ７　（Ｍｅｅｒ　） コーポレーションから入手し得る。ｐＨ１２のリン酸ナトリウム緩衝液１００ｍ Ｍ中のゲロニン（ｔ４７　ｑ／ｍＬ　）の試料を、ＤＭＳＯ中の１２倍過剰量の 化合物６で２０℃において３０分間処理する。次いで、ＫＤＴＡ（１ｍＭ）を含 有するｐ　Ｈ７，０のリン酸ナトリウム緩衝液１００ｍＭで平衡にさせた４℃の セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｚ　）Ｇ　−２５（超微細（５ｕｐｅｒｆＩｎ ｅ　）　）のカラムに試料をかけて新しく生成された化合物７から過剰の化合物 ６を除く。 次いで、化合物７を用いて、抗体１モル当′す２．０モルのスルフヒドリル基を 導入するために下記に説明する通りに２−イミノチオランで改質しておいたモノ クローナル抗体Ｊ５への架橋結合を形成する。 リン酸カリウム（７ｍ　Ｍ　）と、ＮａＣ１（１００ｍＭ　）と、ＥＤＴＡ（１ ｍＭ）とを含有するｐ　Ｈ８，０のトリエタノールアミン−ＭＣＩ緩衝液６０ｍ Ｍ中の５５抗体（２町／コ）をガス抜きし、次いで２−イミノチオラン（１ｍＭ ）で窒素下０℃において９０分間処理する。２−イミノチオラン塩酸塩（（１５ Ｍ）の原液を先に説明した〔ランパート等（１９７８年）、バイオケミストリー 、１７巻、５４０６−５４１６頁〕通りにして作る。反応はＮａＣ１（５０，ｍ 　Ｍ　）及びＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含有するｐＨ５８のビストリス−アセテート 緩衝液５ｍＭで平衡にさせたセファデックスＣ−２Ｓ（微細）のカラムに４℃で 通すゲルにろ過によって終了させる。この方法で抗体に導入したスルフヒドリル 基をエルマン（Ｅｌｌｍａｎ　）、Ａｒｃｈ。 Ｂｉｏｅｈ＠ｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　８２巻、７０−７７頁の方法によりスベ クシル光度測定法により定量する。 下記に説明する通りに、この誘導化抗体を、ゲｕニン１モル当り１１７基のマレ イミド置換基のレベルを有する化合物７の５倍モル過剰量と混合する。Ｊ５の置 換基の成される高分子量の凝集物の量を減少させる。ゲルろ過及びカルボキシメ チルセルレース精製した後の配合物の最終収率はＪ５に対して３７％である。 ＮａＣ１（５０ｍＭ）及びＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含有するｐＨ＆８のビストリス −アセテート４！！衝液５ｍＭ中の改質Ｊ５（８ｑ、α０５μモＡ／）に０℃に おいてＥＤＴＡ（１ｍ　Ｍ　）を含；Ｕするｐ　Ｈ７，０のリン酸ナトリウム緩 衝液１００ｍＭ（１１ｍＬ）中５倍モル過剰量の化合物７（ａｑのゲロニン）を 混合し、次いでｐＨ＆０の１５Ｍトリエタノールアミン−ＨＣｌ級衝緩衝液Ｌ１ ５ｍＭ）を混合して最終のｐＨを′１０にする。混合物を０℃において２時間培 養し、次いで新しく作ったエタノール（α２６ｍＬ）中Ｎ−エチルマレイミド（ １ｍ　Ｍ　）を加えて全ての残留遊離スルフヒドリル基をプルツクする。０℃に おいて３０分した後に、不混和性の限外ろ過ユニット（ミリボアコー〆レーショ ン、ＣＸ−１０フイルター）を使用して溶液を１５ｍＬに濃縮しながら氷上に保 つ。次いで、ＮａＣ１（１５ｍＭ）及びＮａＮ５（α４ｍＭ）を含有するｐＨ７ ，０のリン酸ナトリウム緩衝液５ｍＭで４℃において平衡にさせたセファクリル （５ｅｐｈａｅｒｙｌ　）　Ｓ　−３００のカラム（９５５ＩＸ　２．６　ｃｍ 　）に混合物をかける。ゲルろ過は配合物及び天然のＪ５（Ｍマ＝１６ＱＯＯＯ ）と非架橋ゲロニン（Ｍｙ　＝５０，５００　；ソープ（Ｔｈｏｒｐ＊）等（１ ９８１年）、Ｅｕｒｏ、　Ｊ、　Ｂｌｏｃｈａｍ、　１１６巻、４４７−４５４ 頁〕及びいくつかの高分子量凝集物とを分離する。分子量範囲１１，０００〜２ ２０，０００に相当しかつポリアクリルアミド／ナトリウムドデシルスル７エー トゲル電気泳動により天然の５５と架橋配合物８の両方を含有することが示され る主ピークをプールしかつ同じ緩衝液中で平衡にさせたカルボキシメチルセルロ ース（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ　）　ＣＭ−５２）のカニ７Ａ（５ｍＬの床 容積）の中に通す。カラムを１カラム容積の緩衝液で洗清しかつ溶離液を一緒に する。これらのイオン強度及びｐＨの精確な条件下で、天然のＪ５はカラムによ って留められ、他方タイプ８の架橋複合体は保持されないで通過する。装入材料 に関してモノクローナル抗体は異質である〔コワン（Ｃｏｗａｎ　）等（１’　 ９７３年）、ＦＥＢＳ　Ｌ・ｔｔ、３４３−３４６Ｊｊ）。 これらの実験で用いるＪ５の試料を変質する前に同じ条件下でカルボキシメチル セルロースカラムの中に通す。 カラムに留められたＪ５のみを架橋実験において用いる。 Ｊ５はｔＯＭのＮａＣ１を含有する緩衝液でカラムから溶出される（収率６６％ ）。 不混和性の限外ろ過膜（ミリボア、ｃｘ−ｓ　ｏ　）を用い、非架橋のモノマー タンパク質から分離した精製複合体８を含有する溶液を、トリエタノールアミン （α５ｍＭ）及びＮａＣ１（１４５ｍＭ）を含有するｐ　Ｈ７，８のリン酸ナト リウム緩衝液１０ｍＭに対して透析し、最終的にミレックｘ　（Ｍｉｌｌ＠ｘ　 ）−Ｇ　Ｖろ過膜（α２２μｍ１ミリボア）に通して無菌ろ過した後に４℃にお いて貯蔵する。 酸開裂 正常な細胞及びＪ５抗体によって認識される表面抗原を示す通常の急性リンパ芽 球白血病細胞を含む細胞集団に、精製複合体８又は上述した第２架橋剤例を用い て作った対応する複合体を施すことができる。複合体中のＪ５成分は、リッツ等 （１９８０年）、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２５巻、１５Ｃ１６−１５１４頁 に記載されている通りにナマルワ（Ｎ綿ａｌＷｍ）Ｊｌｌｌ胞におりる間接免疫 蛍光法にＪ：つ゛Ｃ判断されるように、表面抗原を有する細胞に選択的に結合す る能力を保持する。複合体８のゲロニン成分は、ニューインゲランド二二−クリ ゛γカンパニーから入手し得る系のようなラビット網状赤血球溶解産物系によっ てめられる通りに、４本来の非架橋ゲロニンに比べ゛Ｃタンパク質合成を停止° ６−る能力が低いことを示す。 このように、複合体は細制認、＃！能力栄イｒし、−担、抗体が細腺（ζ結８〜 ずれｌｆ、複合体が１飽区画の中に内在化され、そこＣ開裂が起＾る１、特←： 、受容体−仲介ボンドサイト−シスが内在化する受容体はエンドソー・）・又は リセブトソームとし５で知られ、２）酸性化区１ＩＩｌｉを通Ｗする（ｄｅＤｕ ｖｅ　（１９Ｂ　！ｉ年）、Ｅｕｒ、　・ＩＴ、　Ｂｌｏｅｂｅｎｔ。１５７巻 、６９１・５９１百〕。これ７エ”す、複合体を短時間活性アミ７基含、ｆ物質 を開裂端るのじ十６）な酸性ｐ　ｉｌに暴Ｘさ岨る。 複合体８からの本来のゲＴλニンの開裂（、

【、おＪ−イーｐ’ｋＸ５より低い ところで相対的に速く収率が良好アｔ）る１、４り１えば、３７℃及びｐＨ４に Ｊｄいで、全ゲｐニソの３０・バ以Ｊ−が５時間までに開裂さね、かつ５０％以 上がｉ　０　ｆＦ７１！１後に開裂される。ＩＩＨ５において、およそ１５μｓ が５時間後に開裂さｔ］、かつおよ＋２５％が１０時間後にｌｉＩ裂される。ｐ Ｈ６より―い所では、ゲロニンＩ＼のアミド結合は比較的に安ガ！である。 所定の薬剤−抗体複合体について、当栗者は収率及び放出速度を放出環境におい て経験するｐＨ及び温度条件について測定することができかつそれを基にして標 的細胞に十分な活性物質を付与するのに必要な複合体の量を決めることができ゛ る。例えば、薬剤放出はホ゛リアクリル゛Ｔミド／すｌ・リウムドデシルスルプ エートゲル電気泳動を使用し請求めることができる。 変動するｐｕ条件下でゲロニンの放出速度を試験する方法は下記の手順により例 示される。 ｓの、ｔＶ＋（０，５４キ／ｍ　Ｌ　）をクエン酸−ホスフエート禮術液１００ ｍＭで１：　２　（ｖ／マ）に希釈して最終の１１１１値４．０、民［）、６， ０にする。溶液を３７℃において培（シ、かつ、拭材を異る時間で抜き出してゲ ロニン活性を分析１１かつ、Ｉζリアクリルアミ：Ｓ／′ナトリウムドデシルス ルフニー　トゲＡ−電気泳ｒｉｂ　ｋ：　Ｊ：　！１分析する。前者用の試才・ ）はリニ・酸ナトリウム（９ｉｎ　Ｍ　）と、（丁ａｃ１（１８ｍＭ）、】−１ ４：の血清アルブミン（０２キ／　ｒｎ　Ｌ　）とを含−ａするｐ　Ｈ８，８の １−リスーＵＣｔ緩袖液１５ＱｎｉＭに１０倍に乳。 釈１１７、次いで検ｙｔする前！、二４°ｌ；（・−おいて保存する。最終のｐ Ｈ東は８５である。ホリアクリルアミドゲル分析用のＥｆ４（５０ｆｘｒ、）ば 、リン酸カリウム（５ｍ　Ｍ　）　Ｅ：びＮａＣＸ　（７０ｍＭ）’Ｐ金含有る ｐ　Ｂ：　７．８のトリエタノールアミン−ＭＣＩ緩衝液５ｍＭの、ヒに浮かぶ ＶＳＷＰ−０２５透析膜（ｉ　＋）　、１ｉア）の上に置き、かつ４℃において ２時間透析し、その後の試別のｐＨは′７．８である。 タンパク質複合体を特性表示する 最後に、架橋試薬６をランバート等（１９８１年）Ｊ。 Ｍｏ１．　Ｂｌｏｌ、１４９巻、４５１−４７６頁；ワンプ（Ｗａｎｇ）’ａ　 （１９７４年）、Ｉｓｒ、　Ｊ、　Ｃｈｓｍ、　１２巻、３７５−５８９頁；四 マン（Ｌｏｍａｎｔ　）等（１９７６年）Ｊ、Ｍｏｌ。 Ｂｌｏｌ、１０４巻、２４３−２６１頁ニルツタ−（Ｌｕｔｔｅｒ　）等（１９ ７４年）　ＦＥＢＳ　Ｌ＠ｔｔｅｒｓ　４８巻、２８８−２９２頁；又はコギン ズ（Ｃｏｇｇｉｎａ　）＠（１９７６年）バイオケミストリー１５巻、２５２７ −２５３２頁に記載されている通りに用いて多数のポリペプチド鎖を含有する複 合ゾ造を分析することができる。 感心のある鎖をスルフヒドリル基で機能化しかつ架橋試薬６にＥｈ列させる。隣 接する鎖のアミ７基はｐＨ７又はそれ以上において開裂性アミド結合を形成する 。錬を変性させないｐＨ（例えば、ｐＨ４〜５）におけるアミド結合の加水分解 は、例えば５Ｔ）Ｓゲル電気泳動によってたどって感心のある鎖に隣接する鎖を 同定することができる。非変性条件、非酸化及び非還元条件下で加水分解全制御 し得ることが特に＊、ｅである。また、架橋結合を任意のアミノ含有鎖部位に形 成することができ、かつ単に分子内にある遊離スルフヒドリル基の有効性に依存 しないことも近要である。 その他の実施態様 その他の実施態様は次の請求の範囲内にある。例えば、その他の薬剤送達複合体 及びタンパク質評価架橋剤は請求の範囲内にある。 Ｏ４ ＋ 口１ 手続補正書（方式） ％式％ 補正をする者 事件との関係　特許出願人 補正の対象 明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通補正の内容　別紙の通り 明細書及び請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更な「−手続補正書 昭和６１年１１月６日 特許虞官黒田明雄殿 事件の表示　−・・ ＰＣＴ／ＵＩ９８５１００９８０ ４男０名′１°　酸開裂性化合物 補正をする者 事件との関係　特許用Ｍ人 〒１０３ 住　所　東京都中央区日本橋３丁目１３番１１号油脂工業会館同 補正の対象 明細書及び請求の範囲の翻訳文の欄 補正の内容　別紙の通り ｔ　請求の範囲を別紙の通りに訂正する。 ２ｏ　明細書１頁下から１２〜１１行の「並びは」を「並びに」に訂正する。 ３、　同２頁下から４行の［ｃａｒｌｉｉｏｎ　Ｊを「ＣａｒｌｓｓｏｎＪに訂 正する。 ４、　同６頁１２行の「号」を１頁」に訂正する。 ５、　同４頁６行の［’　Ｃｈｅｍ、）　Ｊの後に１２５５咎、６９４７〜６９ ５３頁」を挿入する。 ＆　同同頁１０行の「ｔｌｊを「１．２」に訂正する。 ７、　同５頁１１行の「アミノ基含有基含有物質」を１−アミ７基含有物質−１ に訂正する。 ８、　同８頁８行の［結合さセる１を「結合される」に訂正する。 ９、　同９頁１２行の「調和」を「一致」に訂正する。 １０、同１１頁４行のｌ−８ｕｖＪをｌ”’　５ｕｒｖ　Ｊに訂正する。 １１、同１５頁１２行の「単位」を［構成要素（・ｎｔ、１ｔｙ）Ｊに訂正する 。 １２、同同頁１４行の［単位−１を「構成要素」に訂正する。 １３６　同同同行の１無水マレイン酸」の後に「構成要素Ｊを挿入する□ １４、同１６頁下から８行の「Ｃｈｅｍ、ｊを［ｃｈｉｍ、Ｊに訂正する。 １５同同頁下から５〜２行の「蒸発させて乾燥状態にしＪを「蒸発乾固させ」に 訂正する。 １６、同１７頁２〜３行の「蒸発させて乾燥状態にする。」を「蒸発乾固させる 。」に訂正する。 １７、同同頁下から７行の「乾燥状態にし」を「乾固させ」に訂正する。 １８、同１９頁１１行の「ゲルにろ過」を「ゲルろ過」に訂正する。 請求の範囲 ｔ　アミノ基含有物質と、スルフィド結合物質と、スルフィド結合物質とアミノ 基含有物質との間の酸開裂性リンカ−とを含み、下記の２つの単位：（式中、Ｘ 及びＹの内の１方はＯ−であり、Ｘ及びＹの内の他方はアミ７基含有物質であっ てそのアミン窒素はマレイン酸機能のカルボニル基とアミド結合を形成するもの の残基でありＩＺはスルフィド結合物質であり、その結合のイオウを含み寥Ｒ８ 及びＲ７は独立にＨ，Ｃ，又はそれ以下のアルキ／％／基から選びｓＡはブリッ ジ単位である）ｆ及び （式中、ＸＸＹｌＺ、、Ｒｔ及びＡ　ハ上に定ＭＬ、り通りであり、ｓ　＝　２ 〜５である） の内の１つを含むアミ７基含有物質を液体媒質に制御して放出する酸開裂性複合 体。 ２、Ａが下記の単位： （式中ＳＲ３％　１４　％　Ｒ５％　Ｒ６は独立にＨ１ハロゲン、Ｃ３又はそれ 以下のアルコキシ及びアルキル基、第三アミンから選びｔＢはマレイミド機能へ のリンカ−である） を含む請求の範囲第１項記載の複合体。 ！ｉ、ＲＢ　、Ｒ４、ＲＢ及びＢを、Ａの芳香族環に結合されたイオウが対応す るチオフェノールにおいて十分に低いｐ　Ｋ　ａを有し、そのためＡにおいてス ルフィド基を形成する間にＯＨ−の競争反応を回避する請求の範囲第２項記載の 複合体。 ４、ｐＫａが１ａＯより低い請求の範囲第３項記載の複合体。 ５、Ｂがアミド機能を含む請求の範囲第２項記載の複合体０ ６　Ｂが前記スルフィド機能に対しパラである請求の範囲第２項記載の複合体。 ７、ＢがＣ５又はそれ以下の直鎖のアルキル機能、或はアリール機能を含む請求 の範囲第２項記載の複合体。 ＆　Ｂが前記マレイミド基に結合され、かつまた前記チオフェノール基に該マレ イミド基への該結合に対しメタ又はパラの部位で結合されるアリール基を含む請 求の範囲第７項記載の複合体。 ９、Ａが、更にＡ単位のイオウをマレイン酸機能に結合させる下記の単位： （式中、ｋは１〜５である） を含む請求の範囲第２項記載の複合体。 １０、Ｂが下記の単位： （式中、ｑ＝１〜５である） を含み、Ｂの該窒素をＡの前記芳香族環に人の前記スルフィド機能に対しパラに 結合させる請求の範囲第７項記載の複合体。 １１、Ｂが下記の単位： 能に対してパラに結合させる請求の範囲第８項記載の複合体。 １２、スルフィド結合物質がポリマーである請求の範囲第１項記載の複合体。 １五　ポリマーがタンパク質を含む請求の範囲第１２項記載の複合体。 １４、タンパク質が抗体を含む請求のｍ［ｆｆｌ第１３項記載の複合体。 いての細胞結合パートナ−でありかつアミ７基含有物質が生物学的に活性であり 、それで複合体が活性物質を細胞に送達する請求の範囲第１項記載の複合体。 １＆前記細胞−表面受容体が抗原でありかつ前記結合パートナ−が該受容体を含 有する細胞膜を横断して輸送される該抗原に対する抗体であり、それで、複合体 が受容体に結合することができかつ膜を横断して輸送されることができ、局所細 胞内環境のｐＨを低下させる場合に生物学的に活性な物質を放出する請求の範囲 第１５項記載の複合体。 １ｚ生゛物学的に活性な物質がペプチドである請求の範囲第１５項記載の複合体 。 １８、前記生物学的な活性な物質が細胞毒素である請求の範囲第１５項記載の複 合体０ １９．前記細胞毒性物質がタンバタ質合成インヒビターであるＪ青水の範りｍ第 １８項記載の複合体。 ２（］、前記細胞毒素がリポソーム不活性化タンパク質である請求の範囲第１９ 項記載の複合体、３２１６前記細胞毒素がアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタン７ ・ぐり質、ゲロー、ン、リチンＡｌｔ　、、アゾリンＡ顔又はＵデＳ／ンＡ鎖Ａ ゛−含む請求の範囲第２（〕項記鞠の複合体。 ２２、前記細胞結合バー）　−Ｊ−−−一がＴ細胞表向抗原に゛。 対する抗体である請求の範囲第１ｉｊ項記載の捨合体。 ２５　前記Ｔ細胞表面抗原がＴ５、Ｔ４、Ｔ１１又はＴ１２、特許請求の範囲第 Ｓ′！２項記載の複合体。 ２４、前記細胞結合バート十−が腫瘍会合表面抗原に対する抗体である請求の範 囲第１５項記載のに１合体。 ２５入前記細胞結合バー１＝十〜が５５抗体である請求の範囲第１５項記載の複 合体１゜ ２６　細胞の特異な表面受容体についての細胞結合パートナ−と、 生物学的に活性な物質と、 結合パートナ−と生物学的に活性な物質との間の醜性開裂性リンカ−とを含み、 該リンカ−は生物学的に適合し得るｐＨ及び温度レベル（・＝おいて物質の生物 学的活性を破壊し７ないで開裂され、それで細胞−表面受容体に結合することが できかつ該活性物質を該ｍ胞の内部に送達することができる生物学的に活性な物 質苔・選択細胞に送達し。 かつ放出する酸開裂性複合体。 ２Ｚ　下記の単位ｇ （式中、Ｒ，及びＲ２は独立にＨ，Ｃ，又はそれ以下のアルキル基から選び、人 はブリッジ単位を含む）ε 及び （式中、Ｒ７及びＡは上に定義した通りであり、思＝２〜５である） の内の１つを含むアミ７基含有物質のアミノ窒素とスルフヒドリル機能を含有す る物質との間の酸開裂性架橋を形成するのに適した架橋試薬。 ２８、Ａが下記の単位： （式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６Ｇプ独立にＨ１ハロゲン、Ｃ５又はそれ以下の アルコキシ及びアルキル基、第三アミンから選び、Ｂはマレイミド機能へのリン カ−である） を含む請求の範囲第２７項記載の試薬。 ２９　前記複合体が下記の単位： 〔式中、ｎ　＝　１〜５であり、Ｒ１及びＲ１は習（立ユにＩＨ，Ｃ，又はそれ 以下のアルキル基から選び、Ｗは（ＣＨり９（ｑ＝１〜５）である〕１或は下記 の単位： の内の１つを含む請求の範囲第２８項記載の試薬。 ３α　ｎ　−１であり、かつ”＝（Ｃｕｔ）ｓである請求の範囲第２９項記載の 架橋試薬。 開裂性架橋を形成するのに適した架橋試薬を製造するに際し、活性化置換マレイ ン酸機能を与え、該活性化置換マレ−イン酸機能をチオフェノール含有機能を含 む複合体に、該チオフェノールのスルフヒドリル基をイオン化させる程に高いｐ Ｈにおいて行なう置換反応によって結合させ、該チオフェノール含有機能をマレ イミド窒素に結合させる ３２、前記ｐＨが９５〜１ｔ５である請求の範囲第３１項記載の方法。 ３五前記マレイン酸機能をカルボキシル基にアルファの炭素におけるハロゲン化 アルキル機能によって活性化させる請求の範囲第３１項記載の方法。 ３４、前記チオフェノール含有機能がアミンを含み、かつ前記マレイミド機能を アミノ窒素に窒素とのスルフィド結合物質とアミ７基含有物質との間の酸開裂性 リンカ−とを含み、下記の２つの単位：の内の１つを含むアミノ基含有物質を液 体媒質に橋複合体のマレイン酸機能のカルボニル基との間のアミド結合を加水分 解する程に低いｐＨに露呈させることにより生物学的に活性なアミノ基含有物質 を選択的に細胞集団の膜に送達する方法。 ３６、細胞結合パートナ−が病気にかかった細胞の細胞−表面抗原について特異 な抗体であり、かつ生物学的に活性な物質が細胞毒性ペプチドである請求の範囲 第３５項記載の方法。 ３ｚ　抗原を含有する細胞膜を横断して抗体を輸送し、かつ架橋複合体を細胞内 に輸送しそこでアミド結合を開裂する程に低いｐｍを有する細胞部位において活 性物質を放出する請求の範囲第３５項記載の方法。 ３８、細胞が病気にかかった細胞であり・かつ活性物質がリポソーム不活性化＄ 素である請求Ｌ：１）範囲第５６項記載の′：ｊｊ法１゜ 国際調査報告 国際調査報告 ｔｎｌａｌａｓｍＩｖ、ｌ＾ｌ＋０１１ｃｓａａｎＮａ、　ｐａＴ／ｕｓ８５１ ００９８０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アミノ基含有物質と、スルフイド結合物質と、スルフイド結合物質とアミノ 基含有物質との間の酸開裂性リンカーとを含み、下記の２つの単位： １）▲数式、化学式、表等があります▼（式中、Ｘ及びＹの内の１方は０−であ り、Ｘ及びＹの内の他方はアミノ基含有物質であつてそのアミノ窒素はマレイン 酸機能のカルボニル基とアミド結合を形成するものの残基であり；Ｚはスルフイ ド結合物質であり、その結合のイオウを含み；Ｒ１及びＲ２は独立にＨ、Ｃ５又 はそれ以下のアルキル基から選び；Ａはブリツジ単位である）； 及び ２）▲数式、化学式、表等があります▼（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ２及びＡは上に 定義した通りであり、ａ＝２〜５である） の内の１つを含むアミノ基含有物質を液体媒質に制御して放出する酸開裂性複合 体。 ２．Ａが下記の単位： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は独立にＨ、ハロゲン、Ｃ５又はそれ以下のア ルコキシ及びアルキル基、第三アミンから選び；Ｂはマレイミド機能へのリンカ ーである）を含む請求の範囲第１項記載の複合体。 ３．Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＢを、Ａの芳香族環に結合されたイオウが対応するチ オフエノールにおいて十分に低いｐＫａを有し、そのためＡにおいてスルフイド 基を形成する間にＯＨ−の競争反応を回避する請求の範囲第２項記載の複合体。 ４．ｐＫａが１０．０より低い請求の範囲第３項記載の複合体。 ５．Ｂがアミド機能を含む請求の範囲第２項記載の複合体。 ６．Ｂが前記スルフイド機能に対しバラである請求の範囲第２項記載の複合体。 ７．ＢがＣ５又はそれ以下の直鎖のアルキル機能、或はアリール機能を含む請求 の範囲第２項記載の複合体。 ８．Ｂが前記マレイミド基に結合され、かつまた前記チオフエノール基に該マレ イミド基への該結合に対しメタ又はパラの部位で結合されるアリール基を含む請 求の範囲第７項記載の複合体。 ９．Ａが、更にＡ単位のイオウをマレイン酸機能に結合▲数式、化学式、表等が あります▼ （式中、ｋは１〜５である） を含む請求の範囲第２項記載の複合体。 １０．Ｂが下記の単位： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｑ＝１〜５である） を含み、Ｂの該窒素をＡの前記芳香族環にＡの前記スルフイド機能に対しパラに 結合させる請求の範囲第７項記載の複合体。 １１．Ｂが下記の単位： ▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式、表等があります▼を含 み、Ｂの窒素をＡの芳香族環にスルフイド機能に対してパラに結合させる請求の 範囲第８項記載の複合体。 １２．スルフイド結合物質がポリマーである請求の範囲第１項記載の複合体。 １３．ポリマーがタンパク質を含む請求の範囲第１２項記載の複合体。 １４．タンパク質が抗体を含む請求の範囲第１３項記載の複合体。 １５．スルフヒドリル結合化合物が細胞−表面受容体についての細胞結合パート ナーでありかつアミノ基含有物質が生物学的に活性であり、それで複合体が活性 物質を細胞に送達する請求の範囲第１項記載の複合体。 １６．前記細胞−表面受容体が抗原でありかつ前記結合パートナーが該受容体を 含有する細胞膜を横断して輸送される該抗原に対する抗体であり、 それで、複合体が受容体に結合することができかつ膜を横断して輸送されること ができ、局所細胞内環境のｐＨを低下させる場合に生物学的に活性な物質を放出 する請求の範囲第１５項記載の複合体。 １７．生物学的に活性な物質がペプチドである請求の範囲第１５項記載の複合体 。 １８．前記生物学的な活性な物質が細胞毒素である請求の範囲第１５項記載の複 合体。 １９．前記細胞毒性物質がタンパク質合成インヒビターである請求の範囲第１８ 項記載の複合体。 ２０．前記細胞毒素がリボソーム不活性化タンパク質である請求の範囲第１９項 記載の複合体。 ２１．前記細胞毒素がアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、リ チンＡ鎖、アブリンＡ鎖又はモデシンＡ鎖を含む請求の範囲第２０項記載の複合 体。 ２２．前記細胞結合パートナーがＴ細胞表面抗原に対する抗体である請求の範囲 第１５項記載の複合体。 ２３．前記Ｔ細胞表面抗原がＴ３、Ｔ４、Ｔ１１又はＴ１２である請求の範囲第 ２２項記載の複合体。 ２４．前記細胞結合パートナーが腫瘍会合表面抗原に対する抗体である請求の範 囲第１５項記載の複合体。 ２５．前記細胞結合パートナーがＪ５抗体である請求の範囲第１５項記載の複合 体。 ２６．細胞の特異な表面受容体についての細胞結合パートナーと、 生物学的に活性な物質と、 結合パートナーと生物学的に活性な物質との間の酸性開裂性リンカーとを含み、 該リンカーは生物学的に適合し得るｐＨ及び温度レベルにおいて物質の生物学的 活性を破壊しないで開裂され、 それで細胞−表面受容体に結合することができかつ該活性物質を該細胞の内部に 送達することができる生物学的に活性な物質を選択細胞に送達しかつ放出する酸 開裂性複合体。 ２７．下記の単位： （１）▲数式、化学式、表等があります▼（式中、Ｒ１及びＲ２は独立にＨ、Ｃ ５又はそれ以下のアルキル基から選び、Ａはブリツジ単位を含む）；及び （２）▲数式、化学式、表等があります▼（式中、Ｒ２及びＡは上に定義した通 りであり、ｓ＝２〜５である） の内の１つを含むアミノ基含有物質のアミノ窒素とスルフヒドリル機能を含有す る物質との間の酸開裂性架橋を形成するのに適した架橋試薬。 ２８．Ａが下記の単位： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は独立にＨ、ハロゲン、Ｃ５又はそれ以下のア ルコキシ及びアルキル基、第三アミンから選び、Ｂはマレイミド機能へのリンカ ーである）を含む請求の範囲第２７項記載の試薬。 ２９．前記複合体が下記の単位： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｎ＝１〜５であり、Ｒ１及びＲ２は請求の範囲第１項の化合物１）にお いて定義した通りであり、Ｗは（ＣＨ２）ｑ（ｑ＝１〜５）である〕；或は下記 の単位： ▲数式、化学式、表等があります▼及び▲数式、化学式、表等があります▼の内 の１つを含む請求の範囲第２８項記載の試薬。 ３０．ｎ＝１であり、かつＷ＝（ＣＨ２）３である請求の範囲第２９項記載の架 橋試薬。 ３１．活性化置換マレイン酸機能を与え、該活性化置換マレイン酸機能をチオフ エノール含有機能を含む複合体に、該チオフエノールのスルフヒドリル基をイオ ン化させる程に高いｐＨにおいて行う置換反応によつて結合させ、 該チオフエノール含有機能をマレイミド窒素に結合させる ことを含む請求の範囲第２７項の架橋試薬の製造方法。 ３２．前記ｐＨが９．５〜１１．５である請求の範囲第３１項記載の方法。 ３３．前記マレイン酸機能をカルボキシル基にアルフアの炭素におけるハロゲン 化アルキル機能によつて活性化させる請求の範囲第３１項記載の方法。 ３４．前記チオフエノール含有機能がアミンを含み、かつ前記マレイミド機能を アミノ窒素に窒素とのアミド結合を形成することによつて結合させる請求の範囲 第３１項記載の方法。 ３５．細胞を請求の範囲第１５項の複合体に露呈させ、それで複合体をアミノ基 含有物質のアミノ基の窒素と架橋複合体のマレイン酸機能のカルボニル基との間 のアミド結合を加水分解する程に低いｐＨに露呈させることにより生物学的に活 性なアミノ基含有物質を選択的に細胞集団の膜に送達する方法。 ３６．細胞結合パートナーが病気にかかつた細胞の細胞−表面抗原について特異 な抗体であり、かつ生物学的に活性な物質が細胞毒性ペプチドである請求の範囲 第３５項記載の方法。 ３７．抗原を含有する細胞膜を横断して抗体を輸送し、かつ架橋複合体を細胞内 に輸送しそこでアミド結合を開裂する程に低いｐＨを有する細胞部位において活 性物質を放出する請求の範囲第３５項記載の方法。 ３８．細胞が病気にかかつた細胞であり、かつ活性物質がリボソーム不活性化毒 素である請求の範囲第３６項記載の方法。