JPH0684372B2 - 酸開裂性架橋試薬 - Google Patents
酸開裂性架橋試薬Info
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- JPH0684372B2 JPH0684372B2 JP3211453A JP21145391A JPH0684372B2 JP H0684372 B2 JPH0684372 B2 JP H0684372B2 JP 3211453 A JP3211453 A JP 3211453A JP 21145391 A JP21145391 A JP 21145391A JP H0684372 B2 JPH0684372 B2 JP H0684372B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D207/44—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
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- C07D207/452—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having two doubly-bound oxygen atoms directly attached in positions 2 and 5 with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms directly attached to other ring carbon atoms, e.g. maleimide with hydrocarbon radicals, substituted by hetero atoms, directly attached to the ring nitrogen atom
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
- C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
- C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
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Description
【0001】
【発明の背景】本発明はアミノ基を有する物質の液体媒
質への制御された放出及びかかる放出において用いる架
橋試薬に関する。
質への制御された放出及びかかる放出において用いる架
橋試薬に関する。
【0002】アミノ含有物質の液体媒質への放出を制御
することが望ましい状態が多数有る。例として、細胞集
団或は細胞集団の内の特定部分へのアミノ基含有薬剤又
は細胞毒素の放出を制御するのが望ましいことがあろ
う。また、例えば、ペプチド或はタンパク質等の大きな
アミノ基含有分子の複合体における空間的関係を分析す
る際に、種々の架橋タンパク質或はペプチドの開裂を制
御するのが望ましいこともあろう。[「ペプチド」なる
用語は、本出願中、タンパク質を、いかに大きいもので
あっても、並びに短い鎖のペプチドを含むのに用い
る。]
することが望ましい状態が多数有る。例として、細胞集
団或は細胞集団の内の特定部分へのアミノ基含有薬剤又
は細胞毒素の放出を制御するのが望ましいことがあろ
う。また、例えば、ペプチド或はタンパク質等の大きな
アミノ基含有分子の複合体における空間的関係を分析す
る際に、種々の架橋タンパク質或はペプチドの開裂を制
御するのが望ましいこともあろう。[「ペプチド」なる
用語は、本出願中、タンパク質を、いかに大きいもので
あっても、並びに短い鎖のペプチドを含むのに用い
る。]
【0003】制御した放出が望ましい特定の状態の1つ
は、生物学的に活性な化合物を細胞膜を通して内細胞構
造に送達し、例えば、そこで化合物は細胞膜の外側媒質
中に捕えられるならば低い又は減じた作用を有するが、
細胞内で一担放出されれば一層効力が出る。
は、生物学的に活性な化合物を細胞膜を通して内細胞構
造に送達し、例えば、そこで化合物は細胞膜の外側媒質
中に捕えられるならば低い又は減じた作用を有するが、
細胞内で一担放出されれば一層効力が出る。
【0004】また、生物学的に活性な化合物を異種細胞
集団中の選択細胞に送達することも望ましい。例えば、
ウィルス感染細胞或は変化した細胞或は悪性細胞等の病
気にかかった或は感染した細胞を治療する際に、細胞毒
素を病気にかかった細胞或は悪性の細胞に送達すること
が望ましく、正常の細胞に送達することは望ましくな
い。
集団中の選択細胞に送達することも望ましい。例えば、
ウィルス感染細胞或は変化した細胞或は悪性細胞等の病
気にかかった或は感染した細胞を治療する際に、細胞毒
素を病気にかかった細胞或は悪性の細胞に送達すること
が望ましく、正常の細胞に送達することは望ましくな
い。
【0005】悪性細胞を生物学的に活性な化合物の目標
にするのに開示される1つのアプローチは、抗体−毒素
結合体(conjugate)を用いる。抗体は悪性細
胞に対して特異でありかつ毒素を悪性細胞に送達する。
このような系は、有効であるためには、標的細胞への選
択性の高い毒素を、活性物質の効能を不必要に低減させ
ないで送達すべきである。これらの問題は、目標が生体
内で正常の細胞を害しないで感染した或は病気にかかっ
た細胞を破壊することである場合に特に重要である。
にするのに開示される1つのアプローチは、抗体−毒素
結合体(conjugate)を用いる。抗体は悪性細
胞に対して特異でありかつ毒素を悪性細胞に送達する。
このような系は、有効であるためには、標的細胞への選
択性の高い毒素を、活性物質の効能を不必要に低減させ
ないで送達すべきである。これらの問題は、目標が生体
内で正常の細胞を害しないで感染した或は病気にかかっ
た細胞を破壊することである場合に特に重要である。
【0006】種々の開裂性二官能価の架橋剤が知られて
いる。ランバート(Lambert)等(1981年)
のJ.Mol.Biol.149巻、451〜476頁
及びワング(Wang)等(1974年)のIsr.
J.Chem.12巻、375〜389頁は、開裂性ジ
スルフィド結合を含有する二官能価架橋試薬を開示して
いる。この試薬は生化学系の特性を示すのに用いられ
る。ルッター(Lutter)等(1974年)のFE
BS Letters 48巻、288〜292頁は、
過ヨウ素酸塩酸化によって開裂することのできるvic
−グリコール結合を有する二官能価架橋試薬を開示して
いる。
いる。ランバート(Lambert)等(1981年)
のJ.Mol.Biol.149巻、451〜476頁
及びワング(Wang)等(1974年)のIsr.
J.Chem.12巻、375〜389頁は、開裂性ジ
スルフィド結合を含有する二官能価架橋試薬を開示して
いる。この試薬は生化学系の特性を示すのに用いられ
る。ルッター(Lutter)等(1974年)のFE
BS Letters 48巻、288〜292頁は、
過ヨウ素酸塩酸化によって開裂することのできるvic
−グリコール結合を有する二官能価架橋試薬を開示して
いる。
【0007】カールソン(Carlsson)等(19
78年)のBiochem J.173巻、723〜7
37頁は、二官能価試薬N−スクシンイミジル−3−
(2−ピリジルジチオ)プロピオネートを用いて2つの
異るタンパク質間にジスルフィド結合を形成する手順に
ついて開示している。
78年)のBiochem J.173巻、723〜7
37頁は、二官能価試薬N−スクシンイミジル−3−
(2−ピリジルジチオ)プロピオネートを用いて2つの
異るタンパク質間にジスルフィド結合を形成する手順に
ついて開示している。
【0008】より詳細には、ある種のモノクローナル抗
体、毒素及びそれらの結合体が知られている。ビテッタ
(Vitetta)等(1983年)、サイエンス、2
19巻、644〜650頁及びエドワーズ(Edwar
ds)(1983年)、Pharmacol、The
r. 23巻、147〜177頁は、細胞−表面構造に
特異な毒素とモノクロナール抗体とのジスルフィド結合
した結合体を開示している。これらの結合体を用いて毒
素を抗体が認識する表面構造を有する特異細胞を標的に
している。
体、毒素及びそれらの結合体が知られている。ビテッタ
(Vitetta)等(1983年)、サイエンス、2
19巻、644〜650頁及びエドワーズ(Edwar
ds)(1983年)、Pharmacol、The
r. 23巻、147〜177頁は、細胞−表面構造に
特異な毒素とモノクロナール抗体とのジスルフィド結合
した結合体を開示している。これらの結合体を用いて毒
素を抗体が認識する表面構造を有する特異細胞を標的に
している。
【0009】ラマクリシュナン(Ramakrishn
an)等(1984年)キャンサーリサーチ、44巻、
1398〜1404頁は、アメリカヤマゴボウ(pok
ewood)抗ウィルス性タンパク質(PAP)をモノ
クローナル抗体である抗チミン(Thy)1.1に接合
させることを開示している。この結合体を用いてチミン
1.1−陽性標的白血病細胞におけるタンパク質合成を
選択的に抑制している。この結合体を形成するのに用い
るリンカーはN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジ
ルジチオ)プロピオネートである。ジスルフィド結合を
開裂すれば、遊離のPAP毒素を産生する。
an)等(1984年)キャンサーリサーチ、44巻、
1398〜1404頁は、アメリカヤマゴボウ(pok
ewood)抗ウィルス性タンパク質(PAP)をモノ
クローナル抗体である抗チミン(Thy)1.1に接合
させることを開示している。この結合体を用いてチミン
1.1−陽性標的白血病細胞におけるタンパク質合成を
選択的に抑制している。この結合体を形成するのに用い
るリンカーはN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジ
ルジチオ)プロピオネートである。ジスルフィド結合を
開裂すれば、遊離のPAP毒素を産生する。
【0010】リッツ(Ritz)等(1980年)、ネ
ーチャー、283巻、583〜585頁は、通常の急性
リンパ芽球白血病抗原に特異なモノクローナル抗体(J
5)を開示している。
ーチャー、283巻、583〜585頁は、通常の急性
リンパ芽球白血病抗原に特異なモノクローナル抗体(J
5)を開示している。
【0011】バービエリ(Baibieri)等(19
82年)バイオケミストリージャーナル、203巻、5
5〜59頁はアメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質
−S(「PAP−S」)として知られる抗ウィルスタン
パク質の精製及び部分特性表示について開示している。
82年)バイオケミストリージャーナル、203巻、5
5〜59頁はアメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質
−S(「PAP−S」)として知られる抗ウィルスタン
パク質の精製及び部分特性表示について開示している。
【0012】スターペ(Stirpe)等(1980
年)、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー
(J.Biol.Chem.),255巻、6947〜
6953頁はタンパク質毒素であるゲロニン(gelo
nin)の製造法について開示している。
年)、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー
(J.Biol.Chem.),255巻、6947〜
6953頁はタンパク質毒素であるゲロニン(gelo
nin)の製造法について開示している。
【0013】ネビル(Neville)等の米国特許
4,359,457号は抗チミン1.2モノクローナル
抗体とリシン(ricin)との結合体をリンパ腫に対
する腫瘍抑制組成物として使用することを開示してい
る。使用する結合剤はm−マレイミドベンゾイル−N−
ヒドロキシスクシンイミドである。
4,359,457号は抗チミン1.2モノクローナル
抗体とリシン(ricin)との結合体をリンパ腫に対
する腫瘍抑制組成物として使用することを開示してい
る。使用する結合剤はm−マレイミドベンゾイル−N−
ヒドロキシスクシンイミドである。
【0014】上記のアプローチは抗体−毒素結合体の毒
性に依存するか、或は毒素の放出を標的細胞に送達する
前に一時的に制御し及び空間的に回避するのが困難であ
り得る現象であるジスルフィド結合開裂に依存する。
性に依存するか、或は毒素の放出を標的細胞に送達する
前に一時的に制御し及び空間的に回避するのが困難であ
り得る現象であるジスルフィド結合開裂に依存する。
【0015】カービィ(Kirby)等(1970
年)、Proc.Biochem.Soc.Symp.
31巻、99〜103頁は、マレイン酸アミドがpH3
より低い所で急速に加水分解され、かつマレインアミド
酸の置換がその速度を増大させ、t−ブチル置換基が最
大の増加を与え、メチル置換基が最小の増加を与えるこ
とを開示している。
年)、Proc.Biochem.Soc.Symp.
31巻、99〜103頁は、マレイン酸アミドがpH3
より低い所で急速に加水分解され、かつマレインアミド
酸の置換がその速度を増大させ、t−ブチル置換基が最
大の増加を与え、メチル置換基が最小の増加を与えるこ
とを開示している。
【0016】ジクソン(Dixon)等(1968
年)、Biochem J.109巻、312〜314
頁は無水2−メチルマレイン酸(「シトラコン酸」)を
ブロッキング剤として使用するアミノ基の可逆ブロッキ
ングについて開示している。シトラコニル残基とインシ
ュリンのリジン残基との間のアミド基はpH6.5にお
いて開裂されなかった。pHを3.5に下げ一晩中20
℃においた場合にブロッキング基の全放出があり、イン
シュリンは変わらないままであった。
年)、Biochem J.109巻、312〜314
頁は無水2−メチルマレイン酸(「シトラコン酸」)を
ブロッキング剤として使用するアミノ基の可逆ブロッキ
ングについて開示している。シトラコニル残基とインシ
ュリンのリジン残基との間のアミド基はpH6.5にお
いて開裂されなかった。pHを3.5に下げ一晩中20
℃においた場合にブロッキング基の全放出があり、イン
シュリンは変わらないままであった。
【0017】
【発明の要約】温和な酸性条件下でアミノ基含有物質の
制御された放出を可能にする一群の架橋剤を見出した。
発明は、一面において、アミノ基含有物質のアミノ窒素
と第二化合物のスルフヒドリル機能との間の酸開裂性結
合を形成するのに適した架橋試薬を特徴とする。架橋試
薬は下記の単位:
制御された放出を可能にする一群の架橋剤を見出した。
発明は、一面において、アミノ基含有物質のアミノ窒素
と第二化合物のスルフヒドリル機能との間の酸開裂性結
合を形成するのに適した架橋試薬を特徴とする。架橋試
薬は下記の単位:
【0018】
【化11】 (式中、R1及びR2は独立に、H,C5又はそれ以下
のアルキル基から選び、Aは橋(ブリッジ)単位を含
む)を含む。或は、架橋試薬は下記の単位:
のアルキル基から選び、Aは橋(ブリッジ)単位を含
む)を含む。或は、架橋試薬は下記の単位:
【0019】
【化12】 (式中、R2はH,C5又はそれ以下のアルキル基から
選び、Aはブリッジ単位を含み、s=2〜5である)を
含む。
選び、Aはブリッジ単位を含み、s=2〜5である)を
含む。
【0020】発明は、第2の面において、アミノ基含有
化合物をスルフヒドリル基含有化合物と架橋させて生じ
る架橋ヘテロダイマー複合体を特徴とする。アミノ基含
有化合物は複合体から、アミド結合を加水分解してアミ
ノ基含有化合物を再生する程に媒質のpHを下げること
によって放出される。発明の初めの2つの面の好ましい
実施態様において、ブリッジは下記の単位A:
化合物をスルフヒドリル基含有化合物と架橋させて生じ
る架橋ヘテロダイマー複合体を特徴とする。アミノ基含
有化合物は複合体から、アミド結合を加水分解してアミ
ノ基含有化合物を再生する程に媒質のpHを下げること
によって放出される。発明の初めの2つの面の好ましい
実施態様において、ブリッジは下記の単位A:
【0021】
【化13】 (ここで、R3−R6は独立にH、ハロゲン、C5又は
それ以下のアルコキシ及びアルキル基、第三アミンから
選び;Bはマレイミド機能へのリンカーであり、アミド
結合及びフェニレン基又は(CH2)q(q=1〜5)
を含む)を含む。R3−R6及びBは、単位Aの環に結
合されたイオウが対応するチオフェノール化合物におい
て、Aにおいてスルフィド基を形成する間にOH−によ
って引き起こされる競争副反応を回避するような十分に
低いpKaを有するように選ぶ。例えば、チオフェノー
ルのpKaは10.0より低い。
それ以下のアルコキシ及びアルキル基、第三アミンから
選び;Bはマレイミド機能へのリンカーであり、アミド
結合及びフェニレン基又は(CH2)q(q=1〜5)
を含む)を含む。R3−R6及びBは、単位Aの環に結
合されたイオウが対応するチオフェノール化合物におい
て、Aにおいてスルフィド基を形成する間にOH−によ
って引き起こされる競争副反応を回避するような十分に
低いpKaを有するように選ぶ。例えば、チオフェノー
ルのpKaは10.0より低い。
【0022】また、好ましい実施態様において、Aにお
ける芳香族環のスルフィド機能を(CH2)k(kは1
〜5である)を含む基によってマレイン酸機能に結合さ
せる。最も好ましくは、Bはアミド機能であってその窒
素をAの芳香族環にスルフィド機能に対しパラに結合さ
せかつそのカルボニル機能を(CH2)q(q=1〜5
である)或はアリール基[最も好ましくは、マレイミド
結合がカルボニル結合に対しメタ或はパラである未置換
アリール基]によってマレイミド基の窒素に結合させた
ものを含む。
ける芳香族環のスルフィド機能を(CH2)k(kは1
〜5である)を含む基によってマレイン酸機能に結合さ
せる。最も好ましくは、Bはアミド機能であってその窒
素をAの芳香族環にスルフィド機能に対しパラに結合さ
せかつそのカルボニル機能を(CH2)q(q=1〜5
である)或はアリール基[最も好ましくは、マレイミド
結合がカルボニル結合に対しメタ或はパラである未置換
アリール基]によってマレイミド基の窒素に結合させた
ものを含む。
【0023】また、生成した架橋複合体の好ましい実施
態様において、アミノ基含有物質は選択細胞に送達され
るべき生物学的に活性な物質であり、かつスルフヒドリ
ル基含有化合物はそれらの細胞について選択性の結合物
を含む。化合物は、発明の第4の面に関連して下記に一
層完全に説明する通りの活性物質を選択細胞に送達する
方法で用いる。
態様において、アミノ基含有物質は選択細胞に送達され
るべき生物学的に活性な物質であり、かつスルフヒドリ
ル基含有化合物はそれらの細胞について選択性の結合物
を含む。化合物は、発明の第4の面に関連して下記に一
層完全に説明する通りの活性物質を選択細胞に送達する
方法で用いる。
【0024】発明は、第3の面において、チオフェノー
ル含有機能を含む化合物に活性化置換マレイン酸誘導体
を結合させる置換反応によって架橋剤を合成する方法を
特徴とする。反応はチオフェノールのスルフヒドリル基
をイオン化し、それによって競争SN2’置換反応を回
避する程に高くかつOH−の競争反応を回避する程に低
いpHにおいて行う。次いで、生成した中間体をマレイ
ミド機能に結合させる。合成方法の好適な実施態様にお
いて、置換反応をpH約9.5〜11.5において行
い、最も好ましくはpHは10.5〜11.5、又は約
11.0である。また、好適な実施態様において、チオ
フェノール含有機能はアミン窒素を含むアミド結合によ
ってマレイミド機能に結合されるアミンを含む。
ル含有機能を含む化合物に活性化置換マレイン酸誘導体
を結合させる置換反応によって架橋剤を合成する方法を
特徴とする。反応はチオフェノールのスルフヒドリル基
をイオン化し、それによって競争SN2’置換反応を回
避する程に高くかつOH−の競争反応を回避する程に低
いpHにおいて行う。次いで、生成した中間体をマレイ
ミド機能に結合させる。合成方法の好適な実施態様にお
いて、置換反応をpH約9.5〜11.5において行
い、最も好ましくはpHは10.5〜11.5、又は約
11.0である。また、好適な実施態様において、チオ
フェノール含有機能はアミン窒素を含むアミド結合によ
ってマレイミド機能に結合されるアミンを含む。
【0025】発明は、第4の面において、活性物質を選
択細胞の細胞−表面受容体に特異なスルフヒドリル−機
能化細胞−結合物に架橋させて形成した複合体に細胞を
露呈させることによって、生物学的に活性なアミノ基含
有物質を異質細胞集団の選択部分に送達する方法を特徴
とする。化合物は選択的にそれらの細胞に結合し、かつ
活性物質と架橋のマレイン酸機能との間のアミド結合を
開裂する程に低いpHに暴露されて活性物質を複合体か
ら放出する。
択細胞の細胞−表面受容体に特異なスルフヒドリル−機
能化細胞−結合物に架橋させて形成した複合体に細胞を
露呈させることによって、生物学的に活性なアミノ基含
有物質を異質細胞集団の選択部分に送達する方法を特徴
とする。化合物は選択的にそれらの細胞に結合し、かつ
活性物質と架橋のマレイン酸機能との間のアミド結合を
開裂する程に低いpHに暴露されて活性物質を複合体か
ら放出する。
【0026】第4の面の好適な実施態様において、生物
学的に活性な物質はペプチド又はタンパク質であり、最
も好ましくはリボソームを不活性化してタンパク質合成
を不活性化する細胞毒性物質である。細胞結合物はJ5
抗体或はT3,T4,T11又はT12のT細胞表面抗
原に対する抗体等の細胞−表面抗原を認識する抗体、例
えばモノクローナル抗体である。
学的に活性な物質はペプチド又はタンパク質であり、最
も好ましくはリボソームを不活性化してタンパク質合成
を不活性化する細胞毒性物質である。細胞結合物はJ5
抗体或はT3,T4,T11又はT12のT細胞表面抗
原に対する抗体等の細胞−表面抗原を認識する抗体、例
えばモノクローナル抗体である。
【0027】また、好適な送達方法において、抗体は表
面抗原を含有する細胞の膜を横断して輸送されるもので
あり、そのため架橋複合体が細胞内に移送される。複合
体は一担細胞の中に入れば活性物質、例えばリボソーム
不活性化毒素を放出するのに十分な酸性度を自然に示す
特異な細胞画分に暴露され、こうして活性物質を有効か
つ選択的に放出する。
面抗原を含有する細胞の膜を横断して輸送されるもので
あり、そのため架橋複合体が細胞内に移送される。複合
体は一担細胞の中に入れば活性物質、例えばリボソーム
不活性化毒素を放出するのに十分な酸性度を自然に示す
特異な細胞画分に暴露され、こうして活性物質を有効か
つ選択的に放出する。
【0028】発明はアミノ基含有物質か或は液体媒質系
の他の成分のどちらかを変質させ得る酸化又は還元条件
又は極端なpH値を必要としない点で温和な注意深く制
御する条件下でアミノ基含有物質を液体媒質に送達する
ことを可能にする。その上、開裂は生体内系と一致する
程に温和であるだけでなく実際天然に起きる細胞内現象
によってもたらされるpHにおいて起きる。有利なこと
に、アミノ含有物質はそのpHにおいて確実に放出され
るが、より高いpH値において安定に結合される。好ま
しくは、アミノ置換基の放出はpH3.5〜5.5にお
いて、最も好ましくはpH4.0〜5.0、又は約4.
5において達成される。その上、架橋及び放出プロセス
はユニットをアミノ基含有物質に付加したり、或はアミ
ノ基含有物質からユニットを減じたりしない。
の他の成分のどちらかを変質させ得る酸化又は還元条件
又は極端なpH値を必要としない点で温和な注意深く制
御する条件下でアミノ基含有物質を液体媒質に送達する
ことを可能にする。その上、開裂は生体内系と一致する
程に温和であるだけでなく実際天然に起きる細胞内現象
によってもたらされるpHにおいて起きる。有利なこと
に、アミノ含有物質はそのpHにおいて確実に放出され
るが、より高いpH値において安定に結合される。好ま
しくは、アミノ置換基の放出はpH3.5〜5.5にお
いて、最も好ましくはpH4.0〜5.0、又は約4.
5において達成される。その上、架橋及び放出プロセス
はユニットをアミノ基含有物質に付加したり、或はアミ
ノ基含有物質からユニットを減じたりしない。
【0029】その他の特徴及び利点は下記の好適な実施
態様の説明及び請求の範囲の記載から明らかになるもの
と思う。
態様の説明及び請求の範囲の記載から明らかになるもの
と思う。
【0030】
【好適な実施態様の説明】今、発明の好適な実施態様の
説明にとりかかり、初めに図面を簡潔に説明する。
説明にとりかかり、初めに図面を簡潔に説明する。
【0031】発明の特に好ましい2つの実施態様があ
る。1つは上述した通りに生物学的に活性なタンパク質
又はペプチドを細胞に送達する細胞送出(cell−d
elivery)剤である。他方はリボソーム複合体又
は多ユニット酵素等の大きなアミノ基含有分子を1個又
はそれ以上含む複合体を評価する道具である。複合体の
架橋部材によって、架橋成分を切り離し、次いで架橋成
分を分析するためにそれらの構造を変更しないで架橋成
分の結合を断つ(decouple)ことが可能であ
る。複合体の部材及び架橋物質の出現及び消失を分析す
ることは、生命系の成分を評価し、かつそれによりこれ
らの系の治療の効果及びこれらの系における異常を追跡
する道具を提供する。
る。1つは上述した通りに生物学的に活性なタンパク質
又はペプチドを細胞に送達する細胞送出(cell−d
elivery)剤である。他方はリボソーム複合体又
は多ユニット酵素等の大きなアミノ基含有分子を1個又
はそれ以上含む複合体を評価する道具である。複合体の
架橋部材によって、架橋成分を切り離し、次いで架橋成
分を分析するためにそれらの構造を変更しないで架橋成
分の結合を断つ(decouple)ことが可能であ
る。複合体の部材及び架橋物質の出現及び消失を分析す
ることは、生命系の成分を評価し、かつそれによりこれ
らの系の治療の効果及びこれらの系における異常を追跡
する道具を提供する。
【0032】
【細胞送出実施態様】細胞に送達されるべき好ましい生
物学的に活性な物質はタンパク質又はペプチド薬剤又は
酵素である。特に好適な実施態様において、活性物質は
選択細胞に送達されるべき細胞毒素である。このような
毒素は上述しかつアービン(Irvin)(1975
年)、Pharmac.Ther. 21巻、371〜
387頁におけるアメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパ
ク質PAP、PAPII及びPAP−Sを含む。その他
のペプチド細胞毒素はリシンA鎖、アブリンA鎖、モデ
シン(modeccin)A鎖並びにゲロニン及びバー
ビエリ(Barbieri)等(1982年)、Can
cer Surv 1巻、489〜520頁に記載され
ているようなその他の単一鎖リボソーム不活性化タンパ
ク質を含む。
物学的に活性な物質はタンパク質又はペプチド薬剤又は
酵素である。特に好適な実施態様において、活性物質は
選択細胞に送達されるべき細胞毒素である。このような
毒素は上述しかつアービン(Irvin)(1975
年)、Pharmac.Ther. 21巻、371〜
387頁におけるアメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパ
ク質PAP、PAPII及びPAP−Sを含む。その他
のペプチド細胞毒素はリシンA鎖、アブリンA鎖、モデ
シン(modeccin)A鎖並びにゲロニン及びバー
ビエリ(Barbieri)等(1982年)、Can
cer Surv 1巻、489〜520頁に記載され
ているようなその他の単一鎖リボソーム不活性化タンパ
ク質を含む。
【0033】ペプチド毒素は試薬に容易に結合されかつ
細胞内に極めて微小な量で存在すれば細胞タンパク質合
成を抑制する極めて効力のある毒素であるが故に好まし
い。しかしながら、ペプチドでないその他のアミノ基含
有細胞毒素もまた発明の範囲内にある。かかる細胞毒素
又は細胞毒性薬剤の例はメルファラン、ブレオマイシ
ン、アドリアマイシン、ダウノマイシンである。
細胞内に極めて微小な量で存在すれば細胞タンパク質合
成を抑制する極めて効力のある毒素であるが故に好まし
い。しかしながら、ペプチドでないその他のアミノ基含
有細胞毒素もまた発明の範囲内にある。かかる細胞毒素
又は細胞毒性薬剤の例はメルファラン、ブレオマイシ
ン、アドリアマイシン、ダウノマイシンである。
【0034】上述した活性物質は、結合物を細胞表面の
特徴に結合させることによって選択細胞に送達する。好
適な結合物は細胞表面抗原に対する抗体である。特に好
適なものは、病気にかかった、感染した、トランスホー
ムした或は悪性の細胞に特異であるが正常の細胞に特異
でない細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体であ
る。特に、しかし排除するものでなく、それらは細胞に
よって取り上げられる抗体である。細胞による活性物質
のかなりの取り上げを可能にする十分な数の抗原が正常
細胞に存在しないならば、正常な(すなわち、非標的)
細胞が特異的な抗原を完全に欠くことは必要でない。
特徴に結合させることによって選択細胞に送達する。好
適な結合物は細胞表面抗原に対する抗体である。特に好
適なものは、病気にかかった、感染した、トランスホー
ムした或は悪性の細胞に特異であるが正常の細胞に特異
でない細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体であ
る。特に、しかし排除するものでなく、それらは細胞に
よって取り上げられる抗体である。細胞による活性物質
のかなりの取り上げを可能にする十分な数の抗原が正常
細胞に存在しないならば、正常な(すなわち、非標的)
細胞が特異的な抗原を完全に欠くことは必要でない。
【0035】かかる抗体の1つは、ハイアリアフロリ
ダ、コウルターイミュノロジー(Coulter Im
munology)から入手し得る上述したJ5であ
る。その他の例はイマイ等(1983年)、Cance
r Imm、15巻、206頁以降に記載されているよ
うなメラノーマ表面抗原に対する抗体である。コウルタ
ーイミュノロジーから入手し得るその他の適当な抗体は
T細胞、T3,T4,T11,T12等のT細胞リンパ
腫に見られる表面抗原に対する抗体を含む。本実施態様
におけるその他の結合物はトランスフェリン等の非抗体
細胞膜輸送因子及びインシュリン等のタンパク質ホルモ
ンを含む。
ダ、コウルターイミュノロジー(Coulter Im
munology)から入手し得る上述したJ5であ
る。その他の例はイマイ等(1983年)、Cance
r Imm、15巻、206頁以降に記載されているよ
うなメラノーマ表面抗原に対する抗体である。コウルタ
ーイミュノロジーから入手し得るその他の適当な抗体は
T細胞、T3,T4,T11,T12等のT細胞リンパ
腫に見られる表面抗原に対する抗体を含む。本実施態様
におけるその他の結合物はトランスフェリン等の非抗体
細胞膜輸送因子及びインシュリン等のタンパク質ホルモ
ンを含む。
【0036】生物学系評価 架橋によって評価すべき好適な系はリボソーム、膜等の
細胞構造及び複合タンパク質を含む。系の1つの成分を
スルフヒドリル基で機能化し、かつ上述した架橋剤を用
いてその成分をスルフヒドリル基に隣接したアミノ基含
有物質に架橋させる。例えば、機能化した酵素基質を用
いて酵素触媒反応の進行の間に架橋することにより酵素
の結合領域を確立することができる。
細胞構造及び複合タンパク質を含む。系の1つの成分を
スルフヒドリル基で機能化し、かつ上述した架橋剤を用
いてその成分をスルフヒドリル基に隣接したアミノ基含
有物質に架橋させる。例えば、機能化した酵素基質を用
いて酵素触媒反応の進行の間に架橋することにより酵素
の結合領域を確立することができる。
【0037】架橋剤 上に挙げた2つの実施態様の内のいずれかにおいて、ア
ミノ基含有物質とスルフヒドリル基とを連結させるリン
カーが極めて重要である。アミノ基含有物質は、その活
性を変えないで、好ましくはその構造を変えないでリン
カーに連結されかつリンカーから開放されるべきであ
る。
ミノ基含有物質とスルフヒドリル基とを連結させるリン
カーが極めて重要である。アミノ基含有物質は、その活
性を変えないで、好ましくはその構造を変えないでリン
カーに連結されかつリンカーから開放されるべきであ
る。
【0038】こうして、アミノ結合はタンパク質構造に
影響を与えない温和な条件下で形成されるべきである。
同時に、結合は早過ぎて開裂されず、しかも生物学的系
の繊細な成分に適合し得る温和な条件下で開裂される強
いものであるべきである。開裂部位はアミノ基含有物質
のアミノ基とリンカーとの結合位置になるべきであり、
それによりこの物質は付加成分を伴わずかつ何らの切除
を受けることなくそのまま開放される。
影響を与えない温和な条件下で形成されるべきである。
同時に、結合は早過ぎて開裂されず、しかも生物学的系
の繊細な成分に適合し得る温和な条件下で開裂される強
いものであるべきである。開裂部位はアミノ基含有物質
のアミノ基とリンカーとの結合位置になるべきであり、
それによりこの物質は付加成分を伴わずかつ何らの切除
を受けることなくそのまま開放される。
【0039】上述したように、アミノ基含有物質の窒素
への開裂性アミド結合を形成するのに無水マレイン酸機
能が適当である。また、複合体の第2化合物のスルフヒ
ドリル機能への安定な結合を形成するのにマレイミド構
成要素(entity)が適している。
への開裂性アミド結合を形成するのに無水マレイン酸機
能が適当である。また、複合体の第2化合物のスルフヒ
ドリル機能への安定な結合を形成するのにマレイミド構
成要素(entity)が適している。
【0040】上記のマレイミド構成要素と無水マレイン
酸構成要素との間のブリッジが自然のプロセスにより
(すなわち、生体内系における酵素により)望ましくな
い時又は場所において開裂されるならば、結合物の選択
性が失われ、かつ毒素又は潜在的毒性活性を有する化合
物が細胞の外の媒質中に標的細胞を選択する手段を持た
ないで存在することになるから、該ブリッジは重要であ
る。ブリッジに関するその他の制約は複合体の他の成分
に関する適合性及び不活性でありかつそれらの成分を害
しない条件下での形成の容易性である。
酸構成要素との間のブリッジが自然のプロセスにより
(すなわち、生体内系における酵素により)望ましくな
い時又は場所において開裂されるならば、結合物の選択
性が失われ、かつ毒素又は潜在的毒性活性を有する化合
物が細胞の外の媒質中に標的細胞を選択する手段を持た
ないで存在することになるから、該ブリッジは重要であ
る。ブリッジに関するその他の制約は複合体の他の成分
に関する適合性及び不活性でありかつそれらの成分を害
しない条件下での形成の容易性である。
【0041】好適なブリッジについては、上記「発明の
要約」において詳細に説明している。
要約」において詳細に説明している。
【0042】
【実施例】実施例1 今、例示のために、次式:
【化14】 を有する下記の好適な架橋試薬の2つの特定の代表例の
合成及び使用について説明する。
合成及び使用について説明する。
【0043】本実施例中、第1の例においてWは(CH
2)5であり、第2の例においてWは
2)5であり、第2の例においてWは
【化15】 である。
【0044】架橋試薬の合成 第1例の合成を第1図に示す。かいつまんで言えば、架
橋試薬6は下記の主工程によって合成することができ
る: 1.2−ブロモメチルマレイン酸無水物(化合物2)を
加水分解する; 2.生成したマレイン酸誘導体(化合物3)に4−アミ
ノチオフェノールを反応させて化合物4とする; 3.化合物4に6−マレイミド−カプロン酸のアシルク
ロリドを反応させて二酸を作り、これを脱水させて化合
物6を生成する。 無水物(2)を希薄水溶液中で加水分解しかつ完全に加
水分解した後すぐに二酸(3)を中和して2−(ブロモ
メチル)マレイン酸(3)の対応するフマレート類似体
への異性化を回避する工程を採用する。生成したブロモ
メチルフマル酸誘導体はすべて下記に一層詳細に説明す
る通りに化合物(4)を精製する際に除く。
橋試薬6は下記の主工程によって合成することができ
る: 1.2−ブロモメチルマレイン酸無水物(化合物2)を
加水分解する; 2.生成したマレイン酸誘導体(化合物3)に4−アミ
ノチオフェノールを反応させて化合物4とする; 3.化合物4に6−マレイミド−カプロン酸のアシルク
ロリドを反応させて二酸を作り、これを脱水させて化合
物6を生成する。 無水物(2)を希薄水溶液中で加水分解しかつ完全に加
水分解した後すぐに二酸(3)を中和して2−(ブロモ
メチル)マレイン酸(3)の対応するフマレート類似体
への異性化を回避する工程を採用する。生成したブロモ
メチルフマル酸誘導体はすべて下記に一層詳細に説明す
る通りに化合物(4)を精製する際に除く。
【0045】反応混合物のpHを、p−アミノチオフェ
ノールを対応するチオフェノレートアニオンに転化させ
る程に上げてブロモメチルマレイン酸の(望ましいSN
2置換よりもむしろ)望ましくないSN2’置換反応を
抑制する。上述した合成の特定の詳細は次の通りであ
る。
ノールを対応するチオフェノレートアニオンに転化させ
る程に上げてブロモメチルマレイン酸の(望ましいSN
2置換よりもむしろ)望ましくないSN2’置換反応を
抑制する。上述した合成の特定の詳細は次の通りであ
る。
【0046】 1.2[2−(4−アミノフェニル−2−チアエチル]
−マレイン酸(4) ローセン(Laursen)等(1971年)、J.M
ed.Chem.14巻、619〜621頁の方法のグ
リーンリー(Greenlee)及びウッドワード(W
oodward)(1980年)、テトラヘドロン、3
6巻、3367〜3375頁による変法に従って、化合
物1から2−(ブロモメチル)−マレイン酸無水物
(2)を作る。この物質(2g)を水(20ml)中室
温において約1時間加水分解して2−(ブロモメチル)
−マレイン酸(3)とし、かつ溶液を1N NaOH
(21.2mL)で中和し、ガス抜きし、N2下に保
つ。溶液を、脱気した1N NaOH(11.6mL)
中にN2下穏やかに加熱しながら溶解しかつろ過して不
溶性二量体を除いておいたあらかじめ調製しておいた4
−アミノチオフェノール(1.51g)の溶液に加え
る。ろ液を脱気水(12mL)で希釈した後に上記化合
物3の溶液に加える。最終反応溶液を1N NaOHで
約pH11.0にもたらしかつN2下室温において一晩
中撹拌する。次いで、溶液をろ過して少量のビス−(4
−アミノフェニル)−ジスルフィドを除き、氷冷し、1
N HClで酸性にして黄色沈殿を与える。n−ブタノ
ールを加え(40mL)かつ混合物を氷上5分間激しく
撹拌する。これは化合物4のフマル酸類似体を除く。次
いで、固体をろ過によって集め、0.1N HCl及び
水で続けて洗浄し、最後に真空デシケーター中P2O5
で乾燥して中和化合物4を生じる。
−マレイン酸(4) ローセン(Laursen)等(1971年)、J.M
ed.Chem.14巻、619〜621頁の方法のグ
リーンリー(Greenlee)及びウッドワード(W
oodward)(1980年)、テトラヘドロン、3
6巻、3367〜3375頁による変法に従って、化合
物1から2−(ブロモメチル)−マレイン酸無水物
(2)を作る。この物質(2g)を水(20ml)中室
温において約1時間加水分解して2−(ブロモメチル)
−マレイン酸(3)とし、かつ溶液を1N NaOH
(21.2mL)で中和し、ガス抜きし、N2下に保
つ。溶液を、脱気した1N NaOH(11.6mL)
中にN2下穏やかに加熱しながら溶解しかつろ過して不
溶性二量体を除いておいたあらかじめ調製しておいた4
−アミノチオフェノール(1.51g)の溶液に加え
る。ろ液を脱気水(12mL)で希釈した後に上記化合
物3の溶液に加える。最終反応溶液を1N NaOHで
約pH11.0にもたらしかつN2下室温において一晩
中撹拌する。次いで、溶液をろ過して少量のビス−(4
−アミノフェニル)−ジスルフィドを除き、氷冷し、1
N HClで酸性にして黄色沈殿を与える。n−ブタノ
ールを加え(40mL)かつ混合物を氷上5分間激しく
撹拌する。これは化合物4のフマル酸類似体を除く。次
いで、固体をろ過によって集め、0.1N HCl及び
水で続けて洗浄し、最後に真空デシケーター中P2O5
で乾燥して中和化合物4を生じる。
【0047】 2.マレイミド−二酸5. ケラー(Keller)及びルディンガー(Rudin
ger)(1974年)、Helv.Chim.Act
a,58巻、531〜541頁の方法に従って6−マレ
イミド−カプロン酸を作り、かつ塩化チオニルでその酸
塩化物に変える。6−マレイミド−カプロン酸(1.0
6g)を乾燥THF(10mL)中に溶解し、SOCl
2(0.51mL)で処理し、溶液を水分を除外して
1.5時間還流する。溶液を真空で蒸発乾固させ、かつ
残留油を乾燥THF(5ml)中に溶解する。この溶液
を乾燥THF(15ml)及びN−エチルモルホリン
(2.16mL)中化合物4(1.16g)の溶液に1
0分かけて滴下する。2時間後、溶液を減圧下で蒸発乾
固させ、残留油を取り上げて酢酸エチルに入れかつ溶液
を冷0.1N HClで、次いで水で洗浄する。酢酸エ
チル溶液を乾燥させかつ溶媒を蒸発によって除く。次い
で、溶離液として酢酸2%を含有するCHCl3−Me
OH(95:5、v/v)を有するシリカゲルのフラッ
シュクロマトグラフィーによって粗生成物を精製する。
最後に純生成物をMeOH−H2O(1:2、v/v)
中Dowex 50(H+形)のカラムの中に通す。溶
媒を蒸発しかつ油状残留物を高真空下で乾燥して脆性固
形フォームを収率55%(976mg)で与える。
ger)(1974年)、Helv.Chim.Act
a,58巻、531〜541頁の方法に従って6−マレ
イミド−カプロン酸を作り、かつ塩化チオニルでその酸
塩化物に変える。6−マレイミド−カプロン酸(1.0
6g)を乾燥THF(10mL)中に溶解し、SOCl
2(0.51mL)で処理し、溶液を水分を除外して
1.5時間還流する。溶液を真空で蒸発乾固させ、かつ
残留油を乾燥THF(5ml)中に溶解する。この溶液
を乾燥THF(15ml)及びN−エチルモルホリン
(2.16mL)中化合物4(1.16g)の溶液に1
0分かけて滴下する。2時間後、溶液を減圧下で蒸発乾
固させ、残留油を取り上げて酢酸エチルに入れかつ溶液
を冷0.1N HClで、次いで水で洗浄する。酢酸エ
チル溶液を乾燥させかつ溶媒を蒸発によって除く。次い
で、溶離液として酢酸2%を含有するCHCl3−Me
OH(95:5、v/v)を有するシリカゲルのフラッ
シュクロマトグラフィーによって粗生成物を精製する。
最後に純生成物をMeOH−H2O(1:2、v/v)
中Dowex 50(H+形)のカラムの中に通す。溶
媒を蒸発しかつ油状残留物を高真空下で乾燥して脆性固
形フォームを収率55%(976mg)で与える。
【0048】 3.架橋用試薬6. 乾燥THF(3ml)中の化合物5(200mg)を乾
燥THF(2mL)中ジシクロヘキシルカルボジイミド
(110mg)の溶液で0℃において処理する。反応混
合物を室温において45分間撹拌し、次いでろ過して沈
降ジシクロヘキシル尿素をなくす。ろ液を真空で濃縮し
て乾固させ、生成した油を乾燥ジオキサン(2mL)中
に溶解しかつ再度ろ過する。最後に、ジオキサンを凍結
乾燥して除き、茶色がかつた固体が残った。1HNMR
(Me2SO−d6)δ1.1−1.9(m,6H),
2.30(t,J=6Hz,2H),3.15−3.5
5(m,4H),6.97(s,2H),7.46及び
7.68(A’B’,d,J=9Hz,4H),及び
7.76(t,J=1.5Hz,1H)。架橋用試薬の
第2例は、上記工程2の6−マレイミドカプロン酸クロ
リドの代りにp−マレイミドベンゾイルクロリドを用い
上述した化合物6と同じ方法で作った。
燥THF(2mL)中ジシクロヘキシルカルボジイミド
(110mg)の溶液で0℃において処理する。反応混
合物を室温において45分間撹拌し、次いでろ過して沈
降ジシクロヘキシル尿素をなくす。ろ液を真空で濃縮し
て乾固させ、生成した油を乾燥ジオキサン(2mL)中
に溶解しかつ再度ろ過する。最後に、ジオキサンを凍結
乾燥して除き、茶色がかつた固体が残った。1HNMR
(Me2SO−d6)δ1.1−1.9(m,6H),
2.30(t,J=6Hz,2H),3.15−3.5
5(m,4H),6.97(s,2H),7.46及び
7.68(A’B’,d,J=9Hz,4H),及び
7.76(t,J=1.5Hz,1H)。架橋用試薬の
第2例は、上記工程2の6−マレイミドカプロン酸クロ
リドの代りにp−マレイミドベンゾイルクロリドを用い
上述した化合物6と同じ方法で作った。
【0049】実施例2 次に、例示のために、次式:
【化16】 (式中、Aはブリッジ単位を含む)を有する好適な2つ
の特定の代表例(化合物9’及び18’)について説明
するが、その前に、先ず、化合物A’の合成について説
明する。
の特定の代表例(化合物9’及び18’)について説明
するが、その前に、先ず、化合物A’の合成について説
明する。
【0050】化合物A ’ 図3において、化合物A’は下記のようにして合成され
る。1,4−シクロヘキサジエニル−1,2−ジカルボ
ン酸ジ−t−ブチルエステル(1’)をブタジエン及び
アセチレンジカルボン酸ジ−t−ブチルエステルからW
eberら(1980)Chem.Ber.113:5
31に記載されたようにして製造し、次いで、テトラヒ
ドロフラン中のジボランによる標準ハイドロボレーショ
ン反応にかけた。手短に記せば、ジエン1’(9.82
g、35ミリモル)を乾燥テトラヒドロフラン(100
mL)に溶かし、0℃で等モル量のボラン−THF複合
体で処理した。0.5時間0℃に置いた後、水(7m
L)を加え、次いで、3N NaOH(7mL)及び3
0%過酸化水素(7mL)を加えた。その溶液を室温で
2時間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残留物をエ
ーテルで3回抽出し、合わせたエーテル溶液を水で洗
い、乾燥し、粘性油へと濃縮した。この粗生成物を、更
に、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによ
り石油エーテル−酢酸エチル(7:3v/v)を溶出液
として精製し、純粋なアルコール4−ヒドロキシ−1−
シクロヘキセニル−1,2−ジカルボン酸ジ−t−ブチ
ルエステル2’を与えた。
る。1,4−シクロヘキサジエニル−1,2−ジカルボ
ン酸ジ−t−ブチルエステル(1’)をブタジエン及び
アセチレンジカルボン酸ジ−t−ブチルエステルからW
eberら(1980)Chem.Ber.113:5
31に記載されたようにして製造し、次いで、テトラヒ
ドロフラン中のジボランによる標準ハイドロボレーショ
ン反応にかけた。手短に記せば、ジエン1’(9.82
g、35ミリモル)を乾燥テトラヒドロフラン(100
mL)に溶かし、0℃で等モル量のボラン−THF複合
体で処理した。0.5時間0℃に置いた後、水(7m
L)を加え、次いで、3N NaOH(7mL)及び3
0%過酸化水素(7mL)を加えた。その溶液を室温で
2時間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。残留物をエ
ーテルで3回抽出し、合わせたエーテル溶液を水で洗
い、乾燥し、粘性油へと濃縮した。この粗生成物を、更
に、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによ
り石油エーテル−酢酸エチル(7:3v/v)を溶出液
として精製し、純粋なアルコール4−ヒドロキシ−1−
シクロヘキセニル−1,2−ジカルボン酸ジ−t−ブチ
ルエステル2’を与えた。
【0051】アミン 4−アミノ−1−シクロヘキセニ
ル−1,2−ジカルボン酸ジ−t−ブチルエステル3’
は、中間体の精製なしで、妥当な収率(約55%)で、
アルコール2’から3段階で調製出来た。アルコール
2’(7.14g、23.9ミリモル)及びp−トルエ
ンスルホニルクロリド(6.49g、33.5ミリモ
ル)を乾燥ピリジン(43mL)に溶かし、その溶液を
一晩周囲の温度で撹拌した。水を、それから、加え
(0.66mL)、撹拌を更に0.5時間続けた。その
溶液を、次いで、減圧下で冷却して濃縮し、残留物をエ
ーテルに加え、冷1M硫酸、1M重炭酸ナトリウム溶液
及び水で洗った。乾燥及びエーテルの除去の後、粗トシ
レートを高真空の下で4時間乾燥し、次いで、乾燥アセ
トニトリル(90mL)中に溶解した。アジ化ナトリウ
ム(1.94g、200ミリモル)及び15−クラウン
−5(0.95g、4.3ミリモル)を加え、その溶液
をN2(g)の下で一晩還流した。冷却した溶液を、次
いで、濾過し、油へと濃縮し、それを乾燥エーテル(1
00mL)に溶かし、第2の濾過にかけた。エーテルの
除去は、黄色味を帯びた油を与えたが、アジド基を還元
するためにそれを乾燥メタノール(75mL)に溶かし
た。1,3−プロパンジチオール(6.49g、60ミ
リモル)及びトリエチルアミン(6.07g、60ミリ
モル、1−ナフチルイソシアネートから蒸留)を加え、
その溶液を40時間N2(g)下で室温で撹拌した。反
応混合物を、次いで、濾過し、濾液を穏やかに加熱して
アスピレーターで濃縮して橙色の油を生成し、それをフ
ラッシュクロマトグラフィーによりシリカゲル上で精製
した。カラム(200mL)は、先ず、CHCl3(5
00mL)及びCHCl3−MeOH(95:5v/
v,300mL)で洗い、次ぎに、CHCl3−MeO
H(80:20v/v)で溶出した。純粋なアミン3’
を無色の油として回収した。
ル−1,2−ジカルボン酸ジ−t−ブチルエステル3’
は、中間体の精製なしで、妥当な収率(約55%)で、
アルコール2’から3段階で調製出来た。アルコール
2’(7.14g、23.9ミリモル)及びp−トルエ
ンスルホニルクロリド(6.49g、33.5ミリモ
ル)を乾燥ピリジン(43mL)に溶かし、その溶液を
一晩周囲の温度で撹拌した。水を、それから、加え
(0.66mL)、撹拌を更に0.5時間続けた。その
溶液を、次いで、減圧下で冷却して濃縮し、残留物をエ
ーテルに加え、冷1M硫酸、1M重炭酸ナトリウム溶液
及び水で洗った。乾燥及びエーテルの除去の後、粗トシ
レートを高真空の下で4時間乾燥し、次いで、乾燥アセ
トニトリル(90mL)中に溶解した。アジ化ナトリウ
ム(1.94g、200ミリモル)及び15−クラウン
−5(0.95g、4.3ミリモル)を加え、その溶液
をN2(g)の下で一晩還流した。冷却した溶液を、次
いで、濾過し、油へと濃縮し、それを乾燥エーテル(1
00mL)に溶かし、第2の濾過にかけた。エーテルの
除去は、黄色味を帯びた油を与えたが、アジド基を還元
するためにそれを乾燥メタノール(75mL)に溶かし
た。1,3−プロパンジチオール(6.49g、60ミ
リモル)及びトリエチルアミン(6.07g、60ミリ
モル、1−ナフチルイソシアネートから蒸留)を加え、
その溶液を40時間N2(g)下で室温で撹拌した。反
応混合物を、次いで、濾過し、濾液を穏やかに加熱して
アスピレーターで濃縮して橙色の油を生成し、それをフ
ラッシュクロマトグラフィーによりシリカゲル上で精製
した。カラム(200mL)は、先ず、CHCl3(5
00mL)及びCHCl3−MeOH(95:5v/
v,300mL)で洗い、次ぎに、CHCl3−MeO
H(80:20v/v)で溶出した。純粋なアミン3’
を無色の油として回収した。
【0052】分析のためにアジド中間体4−アジド−1
−シクロヘキセニル−1,2−ジカルボン酸ジ−t−ブ
チルエステルを、シリカゲル(石油エーテル−酢酸エチ
ル95:5v/v)上のフラッシュクロマトグラフィー
により小規模の反応から精製し、無色の油として得た。
−シクロヘキセニル−1,2−ジカルボン酸ジ−t−ブ
チルエステルを、シリカゲル(石油エーテル−酢酸エチ
ル95:5v/v)上のフラッシュクロマトグラフィー
により小規模の反応から精製し、無色の油として得た。
【0053】ジ−t−ブチルエステル3’(0.122
g、0.41ミリモル)をトリフルオロ酢酸(1mL)
に溶かし、その均質な溶液を、1時間周囲の温度で撹拌
した。その溶液を、次いで、蒸発し、油性の残留物を乾
燥エーテルで処理し、白色の固体を与えた。1H−NM
R分析は、エステルは完全に開裂されたが試料がエーテ
ルを含むことを示し、それは高真空において長時間乾燥
しても除去されなかった。それ故、試料を水(3mL)
に溶かし、その溶液を濾過し、凍結乾燥して、4−アミ
ノ−1−シクロヘキセニル−1,2−ジカルボン酸トリ
フルオロ酢酸塩4’を白色の固体として生成した。
g、0.41ミリモル)をトリフルオロ酢酸(1mL)
に溶かし、その均質な溶液を、1時間周囲の温度で撹拌
した。その溶液を、次いで、蒸発し、油性の残留物を乾
燥エーテルで処理し、白色の固体を与えた。1H−NM
R分析は、エステルは完全に開裂されたが試料がエーテ
ルを含むことを示し、それは高真空において長時間乾燥
しても除去されなかった。それ故、試料を水(3mL)
に溶かし、その溶液を濾過し、凍結乾燥して、4−アミ
ノ−1−シクロヘキセニル−1,2−ジカルボン酸トリ
フルオロ酢酸塩4’を白色の固体として生成した。
【0054】化合物4’は、活性化された酸基(普通に
用いられるN−ヒドロキシスクシンイミドエステル又は
p−ニトロフェノールエステル等)を有する高分子キャ
リアーに結合されて、化合物4A’を形成し得る。化合
物4A’は保存可能な二酸である。化合物A’の合成を
所望するときは、下記のように、二酸を対応する無水物
(4B’)に変換するが、それは、下記のように、アミ
ノ基含有化合物を架橋するのに用いて化合物A’を生成
することができる。
用いられるN−ヒドロキシスクシンイミドエステル又は
p−ニトロフェノールエステル等)を有する高分子キャ
リアーに結合されて、化合物4A’を形成し得る。化合
物4A’は保存可能な二酸である。化合物A’の合成を
所望するときは、下記のように、二酸を対応する無水物
(4B’)に変換するが、それは、下記のように、アミ
ノ基含有化合物を架橋するのに用いて化合物A’を生成
することができる。
【0055】特に、化合物4A’等の二酸を化合物4
B’等の無水物に変換するために、典型的には、乾燥D
MSO中の二酸の1%溶液(w/v)を、1時間、室温
で、1.2モル当量のジシクロヘキシルカルボジイミド
で処理する。その溶液を、次いで、濾過し、生成物を乾
燥エーテルで沈殿させる。反応をマイクロリットル規模
で行なうときは、濾過は遠心分離で置き換え、その上清
は、直接蛋白質の修飾に用いるか又は10容の乾燥エー
テル中に滴下した。反応の定量的性質は、シリカゲル
(ガラス板)上の薄層クロマトグラフィーにより、溶媒
系トルエン−ジオキサン−酢酸(9:9:2)において
判定する事が出来る。
B’等の無水物に変換するために、典型的には、乾燥D
MSO中の二酸の1%溶液(w/v)を、1時間、室温
で、1.2モル当量のジシクロヘキシルカルボジイミド
で処理する。その溶液を、次いで、濾過し、生成物を乾
燥エーテルで沈殿させる。反応をマイクロリットル規模
で行なうときは、濾過は遠心分離で置き換え、その上清
は、直接蛋白質の修飾に用いるか又は10容の乾燥エー
テル中に滴下した。反応の定量的性質は、シリカゲル
(ガラス板)上の薄層クロマトグラフィーにより、溶媒
系トルエン−ジオキサン−酢酸(9:9:2)において
判定する事が出来る。
【0056】化合物4A’(20mg)を乾燥ジメチル
スルホキシド(0.4mL)に溶かし、N,N’ジシク
ロヘキシルカルボジイミド(DCC、8mg)で1時間
室温で処理して化合物4B’を製造するが、それは乾燥
エーテル(5mL)で沈殿させる事により回収する。次
いで、4B’をジメチルスルホキシド(0.4mL)に
再溶解させ、アドリアマイシン塩酸塩(17mg)及び
トリエチルアミン(0.005mL)を加えた。1時間
後、高分子薬剤キャリアーA’をジエチルエーテル(5
mL)で沈殿させた。
スルホキシド(0.4mL)に溶かし、N,N’ジシク
ロヘキシルカルボジイミド(DCC、8mg)で1時間
室温で処理して化合物4B’を製造するが、それは乾燥
エーテル(5mL)で沈殿させる事により回収する。次
いで、4B’をジメチルスルホキシド(0.4mL)に
再溶解させ、アドリアマイシン塩酸塩(17mg)及び
トリエチルアミン(0.005mL)を加えた。1時間
後、高分子薬剤キャリアーA’をジエチルエーテル(5
mL)で沈殿させた。
【0057】化合物9 ’ 化合物3’(その合成は上述してある)から出発して、
化合物9’(本実施例において合成される架橋試薬の第
1の例)を図4に示すようにして合成する。6−マレイ
ミドカプロン酸をKellerとRudinger(1
974)の方法によって製造した。6−マレイミドカプ
ロン酸(1.53g、7.26ミリモル)及びN−エチ
ルモルホリン(836mg、7.26ミリモル)の乾燥
THF(15mL)中の溶液を−15℃でイソ−ブチル
クロロホルメート(992mg、7.26ミリモル)で
処理し、−15℃で0.5時間撹拌した。冷THF(1
0mL)中のアミン3’(1.96g、6.6ミリモ
ル)を、次いで、加え、そしてその反応混合物をゆっく
りと周囲の温度にまで暖めた。2時間後、その溶液を濾
過し、THFを蒸発させ、そして残留物を酢酸エチルに
溶かして、冷0.1M塩酸、0.1M重炭酸ナトリウム
溶液及び水で洗った。乾燥及び濃縮の後、粘性油が得ら
れ、それは、更に、シリカゲル上のフラッシュクロマト
グラフィーにより石油エーテル−酢酸エチル(50:5
0、v/v)で精製されて純粋なジエステルN−(6−
マレイミドカプロニル)−4−アミノ−1−シクロヘキ
セニル−1,2−ジカルボン酸ジ−t−ブチルエステル
5’を粘性油として与えた。
化合物9’(本実施例において合成される架橋試薬の第
1の例)を図4に示すようにして合成する。6−マレイ
ミドカプロン酸をKellerとRudinger(1
974)の方法によって製造した。6−マレイミドカプ
ロン酸(1.53g、7.26ミリモル)及びN−エチ
ルモルホリン(836mg、7.26ミリモル)の乾燥
THF(15mL)中の溶液を−15℃でイソ−ブチル
クロロホルメート(992mg、7.26ミリモル)で
処理し、−15℃で0.5時間撹拌した。冷THF(1
0mL)中のアミン3’(1.96g、6.6ミリモ
ル)を、次いで、加え、そしてその反応混合物をゆっく
りと周囲の温度にまで暖めた。2時間後、その溶液を濾
過し、THFを蒸発させ、そして残留物を酢酸エチルに
溶かして、冷0.1M塩酸、0.1M重炭酸ナトリウム
溶液及び水で洗った。乾燥及び濃縮の後、粘性油が得ら
れ、それは、更に、シリカゲル上のフラッシュクロマト
グラフィーにより石油エーテル−酢酸エチル(50:5
0、v/v)で精製されて純粋なジエステルN−(6−
マレイミドカプロニル)−4−アミノ−1−シクロヘキ
セニル−1,2−ジカルボン酸ジ−t−ブチルエステル
5’を粘性油として与えた。
【0058】一般的に、5’等のジエステルは、化合物
4’を形成するために上述した技術を用いて、二酸7’
へ変換し得る。これらの二酸は保存可能であり、4A’
を4B’に変換するために上述したようにして、無水物
9’へ、新鮮に、変換し得る。同様に、二酸16’は、
同様の工程により無水物18’へ変換し得る。
4’を形成するために上述した技術を用いて、二酸7’
へ変換し得る。これらの二酸は保存可能であり、4A’
を4B’に変換するために上述したようにして、無水物
9’へ、新鮮に、変換し得る。同様に、二酸16’は、
同様の工程により無水物18’へ変換し得る。
【0059】それ故、ジ−t−ブチルエステル5’
(1.27g、2.59ミリモル)をトリフルオロ酢酸
(12mL)で、4’の製造のために記載したようにし
て処理した。得られた白色の固体を細かくすり砕いて高
真空下で48時間乾燥して、化合物N−(6−マレイミ
ドカプロニル)−4−アミノ−1−シクロヘキセニル−
1,2−ジカルボン酸7’を与えた。
(1.27g、2.59ミリモル)をトリフルオロ酢酸
(12mL)で、4’の製造のために記載したようにし
て処理した。得られた白色の固体を細かくすり砕いて高
真空下で48時間乾燥して、化合物N−(6−マレイミ
ドカプロニル)−4−アミノ−1−シクロヘキセニル−
1,2−ジカルボン酸7’を与えた。
【0060】化合物7’は、安定な二酸化合物であり、
そのままで保存され、そして、下記のように、化合物
B’の直接製造に用いる場合は、対応する無水物化合物
9’へ変換される。
そのままで保存され、そして、下記のように、化合物
B’の直接製造に用いる場合は、対応する無水物化合物
9’へ変換される。
【0061】化合物18 ’ 化合物18’(本実施例において合成される架橋試薬の
第2の例)を図5に示すようにして合成する。 t−ブ
チル−1,3−ブタジエン−1−カルバメート(1
1’)(10g、59.1ミリモル)をOverman
ら(1978)の手順に従って製造し、等モル量のジメ
チルアセチレンジカルボキシレート(8.4g)と沸騰
ベンゼン中で4時間反応させた。次に、溶媒を蒸発さ
せ、残留物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフ
ィー(石油エーテル−酢酸エチル、80:20v/v)
により精製してジエステルN−t−ブチルオキシカルボ
ニル−3−アミノ−1,4−シクロヘキサジエニル−
1,2−ジカルボン酸ジメチルエステル12’を与え
た。
第2の例)を図5に示すようにして合成する。 t−ブ
チル−1,3−ブタジエン−1−カルバメート(1
1’)(10g、59.1ミリモル)をOverman
ら(1978)の手順に従って製造し、等モル量のジメ
チルアセチレンジカルボキシレート(8.4g)と沸騰
ベンゼン中で4時間反応させた。次に、溶媒を蒸発さ
せ、残留物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフ
ィー(石油エーテル−酢酸エチル、80:20v/v)
により精製してジエステルN−t−ブチルオキシカルボ
ニル−3−アミノ−1,4−シクロヘキサジエニル−
1,2−ジカルボン酸ジメチルエステル12’を与え
た。
【0062】酢酸エチル(70mL)中のジエン12’
(6.7g、21.6ミリモル)をH2で、パラジウム
触媒(炭素上10%、347mg)上で、1気圧の下で
水素化した。その反応を追跡して異なる時点で1HNM
R分析用に試料を回収し、1時間後に完全であることが
判明した。触媒を濾過により除去し、純枠なジエステル
N−t−ブチルオキシカルボニル−3−アミノ−1−シ
クロヘキセニル−1,2−ジカルボン酸ジメチルエステ
ル13’を溶媒の蒸発の後に得た。
(6.7g、21.6ミリモル)をH2で、パラジウム
触媒(炭素上10%、347mg)上で、1気圧の下で
水素化した。その反応を追跡して異なる時点で1HNM
R分析用に試料を回収し、1時間後に完全であることが
判明した。触媒を濾過により除去し、純枠なジエステル
N−t−ブチルオキシカルボニル−3−アミノ−1−シ
クロヘキセニル−1,2−ジカルボン酸ジメチルエステ
ル13’を溶媒の蒸発の後に得た。
【0063】ジメチルエステル13’(6.6g、2
1.1ミリモル)をエタノール(65mL)中の10%
水酸化カリウムに溶かし、その溶液をN2(g)の下で
0.5時間還流させた。その冷溶液を、それから、冷1
N塩酸上に注ぎ、生成物を酢酸エチルで抽出した。抽出
物を水で洗い、乾燥し、そして濃縮して黄色みを帯びた
油を与えたが、それは、更に、シリカゲル上のフラッシ
ュクロマトグラフィーにより1%酢酸を含むCHCl3
−MeOH(9:1v/v)を溶出液として精製され
た。純粋な生成物N−t−ブチルオキシカルボニル−3
−アミノ−1−シクロヘキセニル−1,2−ジカルボン
酸14’を、高真空の下で乾燥することにより凝固した
泡として得た(3.2g、12.6ミリモル、58
%)。
1.1ミリモル)をエタノール(65mL)中の10%
水酸化カリウムに溶かし、その溶液をN2(g)の下で
0.5時間還流させた。その冷溶液を、それから、冷1
N塩酸上に注ぎ、生成物を酢酸エチルで抽出した。抽出
物を水で洗い、乾燥し、そして濃縮して黄色みを帯びた
油を与えたが、それは、更に、シリカゲル上のフラッシ
ュクロマトグラフィーにより1%酢酸を含むCHCl3
−MeOH(9:1v/v)を溶出液として精製され
た。純粋な生成物N−t−ブチルオキシカルボニル−3
−アミノ−1−シクロヘキセニル−1,2−ジカルボン
酸14’を、高真空の下で乾燥することにより凝固した
泡として得た(3.2g、12.6ミリモル、58
%)。
【0064】二酸14’(135mg、0.53ミリモ
ル)をジオキサン(0.5mL)中の4NHCl中に室
温で20分間保った。その溶液を、次に、濃縮して乾燥
し、残留物を乾燥エーテルで洗った。最後に、その固体
を水(10mL)中に溶かし、その溶液を濾過し、凍結
乾燥して純粋な3−アミノ−1−シクロヘキセニル−
1,2−ジカルボン酸塩酸塩15’を与えた。
ル)をジオキサン(0.5mL)中の4NHCl中に室
温で20分間保った。その溶液を、次に、濃縮して乾燥
し、残留物を乾燥エーテルで洗った。最後に、その固体
を水(10mL)中に溶かし、その溶液を濾過し、凍結
乾燥して純粋な3−アミノ−1−シクロヘキセニル−
1,2−ジカルボン酸塩酸塩15’を与えた。
【0065】化合物15’は、上記の化合物5’の合成
において一般的に記したようにして、6−マレイミドカ
プロン酸で濃縮することにより化合物16’に変換する
ことが出来る。他の二酸の様に、化合物16’は、化合
物D’を形成するための架橋試薬として用いられるヘテ
ロ二官能性の無水物18’へ変換することが出来る。
において一般的に記したようにして、6−マレイミドカ
プロン酸で濃縮することにより化合物16’に変換する
ことが出来る。他の二酸の様に、化合物16’は、化合
物D’を形成するための架橋試薬として用いられるヘテ
ロ二官能性の無水物18’へ変換することが出来る。
【0066】実施例3 架橋 実施例1で合成した架橋試薬を用いて下記に説明する通
りにペプチド薬剤又は毒素を細胞−特異抗体に架橋させ
ることができる。説明する特定例は上述した毒素ゲロニ
ン及びモノクローナル抗体J5を利用する。第2図はこ
れらの工程を図解する。
りにペプチド薬剤又は毒素を細胞−特異抗体に架橋させ
ることができる。説明する特定例は上述した毒素ゲロニ
ン及びモノクローナル抗体J5を利用する。第2図はこ
れらの工程を図解する。
【0067】ゲロニンは、上に挙げたスターペ等(19
80年)が記載する通りにゲロニウムムルチフロラム
(Geloniummultiflorum)(トウダ
イグサ科(Euphorbiaceae)からの種子か
ら得られる。種子はインド、カルカッター1、クライブ
ロウ10、ユナイティッドケミカルアンドアライドプロ
ダクツからニュージャージー、ノースバーゲン、ミア
(Meer)コーポレーションから入手し得る。pH
7.2のリン酸ナトリウム緩衝液100mM中のゲロニ
ン(1.47mg/mL)の試料を、DMSO中の12
倍過剰量の化合物6で20℃において30分間処理す
る。次いで、EDTA(1mM)を含有するpH7.0
のリン酸ナトリウム緩衝液100mMで平衡にさせた4
℃のセファデックス(Sephadex)G−25(超
微細(superfine))のカラムに試料をかけて
新しく生成された化合物7から過剰の化合物6を除く。
80年)が記載する通りにゲロニウムムルチフロラム
(Geloniummultiflorum)(トウダ
イグサ科(Euphorbiaceae)からの種子か
ら得られる。種子はインド、カルカッター1、クライブ
ロウ10、ユナイティッドケミカルアンドアライドプロ
ダクツからニュージャージー、ノースバーゲン、ミア
(Meer)コーポレーションから入手し得る。pH
7.2のリン酸ナトリウム緩衝液100mM中のゲロニ
ン(1.47mg/mL)の試料を、DMSO中の12
倍過剰量の化合物6で20℃において30分間処理す
る。次いで、EDTA(1mM)を含有するpH7.0
のリン酸ナトリウム緩衝液100mMで平衡にさせた4
℃のセファデックス(Sephadex)G−25(超
微細(superfine))のカラムに試料をかけて
新しく生成された化合物7から過剰の化合物6を除く。
【0068】次いで、化合物7を用いて、抗体1モル当
り2.0モルのスルフヒドリル基を導入するために下記
に説明する通りに2−イミノチオランで改質しておいた
モノクローナル抗体J5への架橋結合を形成する。
り2.0モルのスルフヒドリル基を導入するために下記
に説明する通りに2−イミノチオランで改質しておいた
モノクローナル抗体J5への架橋結合を形成する。
【0069】リン酸カリウム(7mM)と、NaCl
(100mM)と、EDTA(1mM)とを含有するp
H8.0のトリエタノールアミン−HCl緩衝液60m
M中のJ5抗体(2mg/ml)をガス抜きし、次いで
2−イミノチオラン(mM)で窒素下0℃において90
分間処理する。2−イミノチオラン塩酸塩(0.5M)
の原液を先に説明した[ランバート等(1978年)、
バイオケミストリー、17巻、5406〜5416頁]
通りにして作る。反応はNaCl(50mM)及びED
TA(1mM)を含有するpH5.8のビストリス−ア
セテート緩衝液5mMで平衡にさせたセファデックスG
−25(微細)のカラムに4℃で通すゲルろ過によって
終了させる。この方法で抗体に導入したスルフヒドリル
基をエルマン(Ellman)、Arch.Bioch
em.Biophys.382巻、70〜77頁の方法
によりスペクトル光度測定法により定量する。
(100mM)と、EDTA(1mM)とを含有するp
H8.0のトリエタノールアミン−HCl緩衝液60m
M中のJ5抗体(2mg/ml)をガス抜きし、次いで
2−イミノチオラン(mM)で窒素下0℃において90
分間処理する。2−イミノチオラン塩酸塩(0.5M)
の原液を先に説明した[ランバート等(1978年)、
バイオケミストリー、17巻、5406〜5416頁]
通りにして作る。反応はNaCl(50mM)及びED
TA(1mM)を含有するpH5.8のビストリス−ア
セテート緩衝液5mMで平衡にさせたセファデックスG
−25(微細)のカラムに4℃で通すゲルろ過によって
終了させる。この方法で抗体に導入したスルフヒドリル
基をエルマン(Ellman)、Arch.Bioch
em.Biophys.382巻、70〜77頁の方法
によりスペクトル光度測定法により定量する。
【0070】下記に説明する通りに、この誘導化抗体
を、ゲロニン1モル当り0.7基のマレイミド置換基の
レベルを有する化合物7の5倍モル過剰量と混合する。
J5の置換基のレベルが高くなれば抗体に対する収率を
増大させ、他方、ゲロニンの置換基の低いレベルは架橋
反応混合部中に生成される高分子量の凝集物の量を減少
させる。ゲルろ過及びカルボキシメチルセルロース精製
した後の結合体の最終収率はJ5に対して37%であ
る。
を、ゲロニン1モル当り0.7基のマレイミド置換基の
レベルを有する化合物7の5倍モル過剰量と混合する。
J5の置換基のレベルが高くなれば抗体に対する収率を
増大させ、他方、ゲロニンの置換基の低いレベルは架橋
反応混合部中に生成される高分子量の凝集物の量を減少
させる。ゲルろ過及びカルボキシメチルセルロース精製
した後の結合体の最終収率はJ5に対して37%であ
る。
【0071】NaCl(50mM)及びEDTA(1m
M)を含有するpH5.8のビストリス−アセテート緩
衝液5mM中の改質J5(8mg、0.05μモル)に
0℃においてEDTA(1mM)を含有するpH7.0
のリン酸ナトリウム緩衝液100mM(11mL)中5
倍モル過剰量の化合物7(8mgのゲロニン)を混合
し、次いでpH8.0の0.5Mトリエタノールアミン
−HCl緩衝液(0.15mM)を混合して最終のpH
を7.0にする。混合物を0℃において2時間培養し、
次いで新しく作ったエタノール(0.26mL)中N−
エチルマレイミド(1mM)を加えて全ての残留遊離ス
ルフヒドリル基をブロックする。0℃において30分し
た後に、不混和性の限外ろ過ユニット(ミリポアコーポ
レーション、CX−10フィルター)を使用して溶液を
13mLに濃縮しながら氷上に保つ。次いで、NaCl
(15mM)及びNaN3(0.4mM)を含有するp
H7.0のリン酸ナトリウム緩衝液5mMで4℃におい
て平衡にさせたセファクリル(Sephacryl)S
−300のカラム(95cm×2.6cm)に混合物を
かける。ゲルろ過は結合体及び天然のJ5(Mv=16
0,000)と非架橋ゲロニン[Mv=30,500;
ソープ(Thorpe)等(1981年)、Euro.
J.Biochem.116巻、447〜454頁]及
びいくつかの高分子量凝集物とを分離する。分子量範囲
160,000〜220,000に相当しかつポリアク
リルアミド/ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動によ
り天然のJ5と架橋結合体8の両方を含有することが示
される主ピークをプールしかつ同じ緩衝液中で平衡にさ
せたカルボキシメチルセルロース(ワットマン(Wha
tman)CM−52)のカラム(5mLの床容積)の
中に通す。カラムを1カラム容積の緩衝液で洗浄しかつ
溶離液を一緒にする。これらのイオン強度及びpHの精
確な条件下で、天然のJ5はカラムによって留められ、
他方タイプ8の架橋複合体は保持されないで通過する。
電荷に関してモノクローナル抗体は不均一である[コワ
ン(Cowan)等(1973年)、FEBS Let
t.343〜346頁]。これらの実験で用いるJ5の
試料を変質する前に同じ条件下でカルボキシメチルセル
ロースカラムの中に通す。カラムに留められたJ5のみ
を架橋実験において用いる。J5は1.0MのNaCl
を含有する緩衝液でカラムから溶出される(収率66
%)。
M)を含有するpH5.8のビストリス−アセテート緩
衝液5mM中の改質J5(8mg、0.05μモル)に
0℃においてEDTA(1mM)を含有するpH7.0
のリン酸ナトリウム緩衝液100mM(11mL)中5
倍モル過剰量の化合物7(8mgのゲロニン)を混合
し、次いでpH8.0の0.5Mトリエタノールアミン
−HCl緩衝液(0.15mM)を混合して最終のpH
を7.0にする。混合物を0℃において2時間培養し、
次いで新しく作ったエタノール(0.26mL)中N−
エチルマレイミド(1mM)を加えて全ての残留遊離ス
ルフヒドリル基をブロックする。0℃において30分し
た後に、不混和性の限外ろ過ユニット(ミリポアコーポ
レーション、CX−10フィルター)を使用して溶液を
13mLに濃縮しながら氷上に保つ。次いで、NaCl
(15mM)及びNaN3(0.4mM)を含有するp
H7.0のリン酸ナトリウム緩衝液5mMで4℃におい
て平衡にさせたセファクリル(Sephacryl)S
−300のカラム(95cm×2.6cm)に混合物を
かける。ゲルろ過は結合体及び天然のJ5(Mv=16
0,000)と非架橋ゲロニン[Mv=30,500;
ソープ(Thorpe)等(1981年)、Euro.
J.Biochem.116巻、447〜454頁]及
びいくつかの高分子量凝集物とを分離する。分子量範囲
160,000〜220,000に相当しかつポリアク
リルアミド/ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動によ
り天然のJ5と架橋結合体8の両方を含有することが示
される主ピークをプールしかつ同じ緩衝液中で平衡にさ
せたカルボキシメチルセルロース(ワットマン(Wha
tman)CM−52)のカラム(5mLの床容積)の
中に通す。カラムを1カラム容積の緩衝液で洗浄しかつ
溶離液を一緒にする。これらのイオン強度及びpHの精
確な条件下で、天然のJ5はカラムによって留められ、
他方タイプ8の架橋複合体は保持されないで通過する。
電荷に関してモノクローナル抗体は不均一である[コワ
ン(Cowan)等(1973年)、FEBS Let
t.343〜346頁]。これらの実験で用いるJ5の
試料を変質する前に同じ条件下でカルボキシメチルセル
ロースカラムの中に通す。カラムに留められたJ5のみ
を架橋実験において用いる。J5は1.0MのNaCl
を含有する緩衝液でカラムから溶出される(収率66
%)。
【0072】不混和性の限外ろ過膜(ミリポア、CX−
30)を用い、非架橋のモノマータンパク質から分離し
た精製複合体8を含有する溶液を、トリエタノールアミ
ン(0.5mM)及びNaCl(145mM)を含有す
るpH7.8のリン酸ナトリウム緩衝液10mMに対し
て透析し、最終的にミレックス(Millex)−GV
ろ過膜(0.22μm、ミリポア)に通して無菌ろ過し
た後に4℃において貯蔵する。
30)を用い、非架橋のモノマータンパク質から分離し
た精製複合体8を含有する溶液を、トリエタノールアミ
ン(0.5mM)及びNaCl(145mM)を含有す
るpH7.8のリン酸ナトリウム緩衝液10mMに対し
て透析し、最終的にミレックス(Millex)−GV
ろ過膜(0.22μm、ミリポア)に通して無菌ろ過し
た後に4℃において貯蔵する。
【0073】酸開裂 正常な細胞及びJ5抗体によって認識される表面抗原を
示す通常の急性リンパ芽球白血病細胞を含む細胞集団
に、精製複合体8又は上述した第2架橋剤例を用いて作
った対応する複合体を施すことができる。複合体中のJ
5成分は、リッツ等(1980年)、J.Immuno
l.125巻、1506〜1514頁に記載されている
通りにナマルワ(Namalwa)細胞における間接免
疫蛍光法によって判断されるように、表面抗原を有する
細胞に選択的に結合する能力を保持する。複合体8のゲ
ロニン成分は、ニューイングランドニュークリアカンパ
ニーから入手し得る系のようなウサギ網状赤血球溶解産
物系によって求められる通りに、本来の非架橋ゲロニン
に比べてタンパク質合成を停止する能力が低いことを示
す。
示す通常の急性リンパ芽球白血病細胞を含む細胞集団
に、精製複合体8又は上述した第2架橋剤例を用いて作
った対応する複合体を施すことができる。複合体中のJ
5成分は、リッツ等(1980年)、J.Immuno
l.125巻、1506〜1514頁に記載されている
通りにナマルワ(Namalwa)細胞における間接免
疫蛍光法によって判断されるように、表面抗原を有する
細胞に選択的に結合する能力を保持する。複合体8のゲ
ロニン成分は、ニューイングランドニュークリアカンパ
ニーから入手し得る系のようなウサギ網状赤血球溶解産
物系によって求められる通りに、本来の非架橋ゲロニン
に比べてタンパク質合成を停止する能力が低いことを示
す。
【0074】このように、複合体は細胞認識能力を有
し、一担、抗体が細胞に結合すれば、複合体が細胞区画
の中に吸収され、そこで開裂が起きる。特に、受容体−
介在エンドサイト−シスにより吸収される受容体はエン
ドソーム又はリセプトソームとして知られる酸性化区画
を通過する[de Duve(1983年)、Eur.
J.Biochem.137巻、391〜397頁]。
こうして、複合体を短時間活性アミノ基含有物質を開裂
するのに十分な酸性pHに暴露させる。
し、一担、抗体が細胞に結合すれば、複合体が細胞区画
の中に吸収され、そこで開裂が起きる。特に、受容体−
介在エンドサイト−シスにより吸収される受容体はエン
ドソーム又はリセプトソームとして知られる酸性化区画
を通過する[de Duve(1983年)、Eur.
J.Biochem.137巻、391〜397頁]。
こうして、複合体を短時間活性アミノ基含有物質を開裂
するのに十分な酸性pHに暴露させる。
【0075】複合体8からの本来のゲロニンの開裂は、
およそpH5より低いところで相対的に速く収率が良好
である。例えば、37℃及びpH4において、全ゲロニ
ンの30%以上が5時間までに開裂され、かつ50%以
上が10時間後に開裂される。pH5において、およそ
15%が5時間後に開裂され、かつおよそ25%が10
時間後に開裂される。pH6より高い所では、ゲロニン
へのアミド結合は比較的に安定である。
およそpH5より低いところで相対的に速く収率が良好
である。例えば、37℃及びpH4において、全ゲロニ
ンの30%以上が5時間までに開裂され、かつ50%以
上が10時間後に開裂される。pH5において、およそ
15%が5時間後に開裂され、かつおよそ25%が10
時間後に開裂される。pH6より高い所では、ゲロニン
へのアミド結合は比較的に安定である。
【0076】所定の薬剤−抗体複合体について、当業者
は収率及び放出速度を放出環境において経験するpH及
び温度条件について測定することができかつそれを基に
して標的細胞に十分な活性物質を付与するのに必要な複
合体の量を決めることができる。例えば、薬剤放出はポ
リアクリルアミド/ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳
動を使用して求めることができる。
は収率及び放出速度を放出環境において経験するpH及
び温度条件について測定することができかつそれを基に
して標的細胞に十分な活性物質を付与するのに必要な複
合体の量を決めることができる。例えば、薬剤放出はポ
リアクリルアミド/ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳
動を使用して求めることができる。
【0077】変動するpH条件下でゲロニンの放出速度
を試験する方法は下記の手順により例示される。8の試
料(0.54mg/mL)をクエン酸−ホスフェート緩
衝液100mMで1:2(v/v)に希釈して最終のp
H値4.0,5.0,6.0,にする。溶液を37℃に
おいて培養し、かつ試料を異る時間で抜き出してゲロニ
ン活性を分析し、かつポリアクリルアミド/ドデシル硫
酸ナトリウムゲル電気泳動により分析する。前者用の試
料はリン酸ナトリウム(9mM)と、NaCl(18m
M)と、牛の血清アルブミン(0.2mg/mL)とを
含有するpH8.8のトリス−HCl緩衝液150mM
に10倍に希釈し、次いで検定する前に4℃において保
存する。最終のpHは8.5である。ポリアクリルアミ
ドゲル分折用の試料(50μL)は、リン酸カリウム
(5mM)及びNaCl(70mM)を含有するpH
7.8のトリエタノールアミン−HCl緩衝液5mMの
上に浮かぶVSWP−025透析膜(ミリポア)の上に
置き、かつ4℃において2時間透析し、その後の試料の
pHは7.8である。
を試験する方法は下記の手順により例示される。8の試
料(0.54mg/mL)をクエン酸−ホスフェート緩
衝液100mMで1:2(v/v)に希釈して最終のp
H値4.0,5.0,6.0,にする。溶液を37℃に
おいて培養し、かつ試料を異る時間で抜き出してゲロニ
ン活性を分析し、かつポリアクリルアミド/ドデシル硫
酸ナトリウムゲル電気泳動により分析する。前者用の試
料はリン酸ナトリウム(9mM)と、NaCl(18m
M)と、牛の血清アルブミン(0.2mg/mL)とを
含有するpH8.8のトリス−HCl緩衝液150mM
に10倍に希釈し、次いで検定する前に4℃において保
存する。最終のpHは8.5である。ポリアクリルアミ
ドゲル分折用の試料(50μL)は、リン酸カリウム
(5mM)及びNaCl(70mM)を含有するpH
7.8のトリエタノールアミン−HCl緩衝液5mMの
上に浮かぶVSWP−025透析膜(ミリポア)の上に
置き、かつ4℃において2時間透析し、その後の試料の
pHは7.8である。
【0078】タンパク質複合体を特性表示する 最後に、架橋試料6をランバート等(1981年)J.
Mol.Biol.149巻、451〜476頁;ワン
グ(Wang)等(1974年)、Isr.J.Che
m.12巻、375〜389頁;ロマン(Loman
t)等(1976年)J.Mol.Biol.104
巻、243〜261頁;ルッター(Lutter)等
(1974年)FEBS Letters48巻、28
8〜292頁;又はコギンズ(Coggins)等(1
976年)バイオケミストリー15巻、2527〜25
32頁に記載されている通りに用いて多数のポリペプチ
ド鎖を含有する複合構造を分析することができる。
Mol.Biol.149巻、451〜476頁;ワン
グ(Wang)等(1974年)、Isr.J.Che
m.12巻、375〜389頁;ロマン(Loman
t)等(1976年)J.Mol.Biol.104
巻、243〜261頁;ルッター(Lutter)等
(1974年)FEBS Letters48巻、28
8〜292頁;又はコギンズ(Coggins)等(1
976年)バイオケミストリー15巻、2527〜25
32頁に記載されている通りに用いて多数のポリペプチ
ド鎖を含有する複合構造を分析することができる。
【0079】関心のある鎖をスルフヒドリル基で機能化
しかつ架橋試薬6に暴露させる。隣接する鎖のアミノ基
はpH7又はそれ以上において開裂性アミド結合を形成
する。鎖を変性させないpH(例えば、pH4〜5)に
おけるアミド結合の加水分解は、例えばSDSゲル電気
泳動によって追跡し、関心のある鎖に隣接する鎖を同定
することができる。非変性条件、非酸化及び非還元条件
下で加水分解を制御し得ることが特に重要である。ま
た、架橋結合を任意のアミノ含有鎖部位に形成すること
ができ、かつ単に分子内にある遊離スルフヒドリル基の
有効性に依存しないことも重要である。
しかつ架橋試薬6に暴露させる。隣接する鎖のアミノ基
はpH7又はそれ以上において開裂性アミド結合を形成
する。鎖を変性させないpH(例えば、pH4〜5)に
おけるアミド結合の加水分解は、例えばSDSゲル電気
泳動によって追跡し、関心のある鎖に隣接する鎖を同定
することができる。非変性条件、非酸化及び非還元条件
下で加水分解を制御し得ることが特に重要である。ま
た、架橋結合を任意のアミノ含有鎖部位に形成すること
ができ、かつ単に分子内にある遊離スルフヒドリル基の
有効性に依存しないことも重要である。
【0080】実施例4 架橋 架橋剤9’及び18’は、無水物機能を含み、下記のよ
うにアミノ基含有薬剤との反応に用いられ得る(無水物
4B’はアミノ基含有薬剤と同様にして結合され得
る)。記載した特定の実施例は蛋白質毒素ゲロニンを利
用する。
うにアミノ基含有薬剤との反応に用いられ得る(無水物
4B’はアミノ基含有薬剤と同様にして結合され得
る)。記載した特定の実施例は蛋白質毒素ゲロニンを利
用する。
【0081】ゲロニンは、実施例3に記載のように、G
elonium multiflorum(トウダイグ
サ科)の種子から得られる。リン酸ナトリウム緩衝液、
pH7.0中のゲロニン試料を12倍の過剰量のDMS
O中の無水物架橋剤と20℃で30分間処理する。その
試料を、次いで、過剰の無水物架橋剤を除去するために
EDTA(1mM)を含む100mMリン酸ナトリウム
緩衝液、pH7.0で平衡化したセファデックスG−2
5(超微細)のカラムに4℃でかける。
elonium multiflorum(トウダイグ
サ科)の種子から得られる。リン酸ナトリウム緩衝液、
pH7.0中のゲロニン試料を12倍の過剰量のDMS
O中の無水物架橋剤と20℃で30分間処理する。その
試料を、次いで、過剰の無水物架橋剤を除去するために
EDTA(1mM)を含む100mMリン酸ナトリウム
緩衝液、pH7.0で平衡化したセファデックスG−2
5(超微細)のカラムに4℃でかける。
【0082】この方法で、化合物9A’及び18A’を
形成する。化合物9A’及び18A’に対して、機能化
した抗体を、次に、代表的抗体、J5に対して下に記す
ようにして化合物に結合することが出来る。
形成する。化合物9A’及び18A’に対して、機能化
した抗体を、次に、代表的抗体、J5に対して下に記す
ようにして化合物に結合することが出来る。
【0083】先ず、J5抗体を、抗体1モル当り2.0
モルのスルフヒドリル基を導入するために下記のように
して2−イミノチオランで修飾する。リン酸カリウム
(7mM)、NaCl(100mM)、EDTA(1m
M)を含む60mMトリエタノールアミンHCl中のJ
5抗体(2mg/mL)を脱気し、次いで、2−イミノ
チオラン(1mM)で90分間0℃で窒素下で処理す
る。2−イミノチオラン塩酸塩(0.5M)の原液は、
以前に記載された(Lambertら(1978)Bi
ochemistry17:5406−5416)よう
にして調製する。反応は、NaCl(50mM)及びE
DTA(1mM)を含む5mMビストリスアセテート緩
衝液、pH5.8で平衡化したセファデックスG−25
(微細)のカラムを通して4℃でゲル濾過することによ
り停止する。この方法で抗体に導入されたスルフヒドリ
ル基は、Ellman(1959)Arch.Bioc
hem.Biophys.82:70−77の方法によ
り分光測光的に定量される。
モルのスルフヒドリル基を導入するために下記のように
して2−イミノチオランで修飾する。リン酸カリウム
(7mM)、NaCl(100mM)、EDTA(1m
M)を含む60mMトリエタノールアミンHCl中のJ
5抗体(2mg/mL)を脱気し、次いで、2−イミノ
チオラン(1mM)で90分間0℃で窒素下で処理す
る。2−イミノチオラン塩酸塩(0.5M)の原液は、
以前に記載された(Lambertら(1978)Bi
ochemistry17:5406−5416)よう
にして調製する。反応は、NaCl(50mM)及びE
DTA(1mM)を含む5mMビストリスアセテート緩
衝液、pH5.8で平衡化したセファデックスG−25
(微細)のカラムを通して4℃でゲル濾過することによ
り停止する。この方法で抗体に導入されたスルフヒドリ
ル基は、Ellman(1959)Arch.Bioc
hem.Biophys.82:70−77の方法によ
り分光測光的に定量される。
【0084】生じた誘導体化されたJ5抗体は、下記の
ように、過剰(例えば、5倍モル)の化合物9A’又は
18A’(ゲロニン1モル当り0.7基のマレイミド置
換の水準を有する)と混合される。J5のより高い置換
の水準は抗体についての収率を上げるが、他方で、ゲロ
ニンの低水準の置換が、架橋反応混合物中で形成される
高分子量凝集物の量を減らす。
ように、過剰(例えば、5倍モル)の化合物9A’又は
18A’(ゲロニン1モル当り0.7基のマレイミド置
換の水準を有する)と混合される。J5のより高い置換
の水準は抗体についての収率を上げるが、他方で、ゲロ
ニンの低水準の置換が、架橋反応混合物中で形成される
高分子量凝集物の量を減らす。
【0085】特定的には、緩衝液(pH5.8)中の修
飾されたJ5を、EDTAを含む燐酸ナトリウム緩衝液
中の5倍過剰の薬剤結合化合物(9A’又は18A’)
と混合し、次いで、トリエタノールアミン−HCl緩衝
液(pH8.0)と混合して最終pHを7.0にする。
0℃で30分置いた後、溶液のpHを、1.5Mトリス
塩基を加えることにより8.5に高め、その溶液を不混
和性の限外濾過ユニット(Milipore Corp
oration、CX−10フィルター)を用いて少量
(=6mL)に濃縮した。その混合物を、次いで、5m
M燐酸カリウム、pH7.5を含む100mMトリス−
塩酸塩で4℃で平衡化したセファクリルS−300のカ
ラム(95cm×2.6cm)にかけた。ゲル濾過は、
この結合物及び自然のJ5(Mr=160,000)を
非架橋ゲロニン(Mr=30,500Thorpeら
(1981)Euro.J.Biochem.116:
447−454)から、及び幾つかの高分子量の凝集物
から分離する。分子量範囲160,000〜220,0
00に対応し、ポリアクリルアミド/ドデシル硫酸ナト
リウムゲル電気泳動により自然のJ5及び架橋した化合
物(例えば、B’又はD’)の両方を含む事が示された
主要ピークをプールし、同緩衝液で平衡化したヒドロキ
シルアパタイト(Bio−GelHTP)のカラム(6
mLベッドボリューム)を通す。このカラムを5カラム
容の緩衝液で洗い、次いで、結合した蛋白質を、上記緩
衝液中の5〜200mMの燐酸カリウム線形勾配で溶出
した。このカラムから溶出された結合体は非結合性抗体
を含まない。精製した結合体を、最後に、後の使用のた
めに、燐酸緩衝塩溶液、pH8.2に対して透析し、保
存した。
飾されたJ5を、EDTAを含む燐酸ナトリウム緩衝液
中の5倍過剰の薬剤結合化合物(9A’又は18A’)
と混合し、次いで、トリエタノールアミン−HCl緩衝
液(pH8.0)と混合して最終pHを7.0にする。
0℃で30分置いた後、溶液のpHを、1.5Mトリス
塩基を加えることにより8.5に高め、その溶液を不混
和性の限外濾過ユニット(Milipore Corp
oration、CX−10フィルター)を用いて少量
(=6mL)に濃縮した。その混合物を、次いで、5m
M燐酸カリウム、pH7.5を含む100mMトリス−
塩酸塩で4℃で平衡化したセファクリルS−300のカ
ラム(95cm×2.6cm)にかけた。ゲル濾過は、
この結合物及び自然のJ5(Mr=160,000)を
非架橋ゲロニン(Mr=30,500Thorpeら
(1981)Euro.J.Biochem.116:
447−454)から、及び幾つかの高分子量の凝集物
から分離する。分子量範囲160,000〜220,0
00に対応し、ポリアクリルアミド/ドデシル硫酸ナト
リウムゲル電気泳動により自然のJ5及び架橋した化合
物(例えば、B’又はD’)の両方を含む事が示された
主要ピークをプールし、同緩衝液で平衡化したヒドロキ
シルアパタイト(Bio−GelHTP)のカラム(6
mLベッドボリューム)を通す。このカラムを5カラム
容の緩衝液で洗い、次いで、結合した蛋白質を、上記緩
衝液中の5〜200mMの燐酸カリウム線形勾配で溶出
した。このカラムから溶出された結合体は非結合性抗体
を含まない。精製した結合体を、最後に、後の使用のた
めに、燐酸緩衝塩溶液、pH8.2に対して透析し、保
存した。
【0086】酸開裂 複合体B’及びD’について、実施例3におけるのと同
様にして、酸開裂をなうことが出来る。ただし、複合体
B’及びD’からの本来のゲロニンの開裂は、およそp
H6.5より低いところで相対的に速く収率が良好であ
る。
様にして、酸開裂をなうことが出来る。ただし、複合体
B’及びD’からの本来のゲロニンの開裂は、およそp
H6.5より低いところで相対的に速く収率が良好であ
る。
【0087】所定の薬剤−抗体複合体について、当業者
は収率及び放出速度を放出環境において経験するpH及
び温度条件について測定することができかつそれを基に
して標的細胞に十分な活性物質を付与するのに必要な複
合体の量を決めることができる。例えば、薬剤放出はポ
リアクリルアミド/ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳
動を使用して求めることができる。
は収率及び放出速度を放出環境において経験するpH及
び温度条件について測定することができかつそれを基に
して標的細胞に十分な活性物質を付与するのに必要な複
合体の量を決めることができる。例えば、薬剤放出はポ
リアクリルアミド/ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳
動を使用して求めることができる。
【0088】関心あるポリペプチド鎖をスルフヒドリル
基で機能化しかつ架橋試薬9’及び18’に暴露させ
る。隣接する鎖のアミノ基はpH7又はそれ以上におい
て開裂性アミド結合を形成する。鎖を変性させないpH
(例えば、pH4〜5)におけるアミド結合の加水分解
は、例えばポリアクリルアミド/SDSゲル電気泳動に
よって追跡し、関心のある鎖に隣接する鎖を同定するこ
とができる。非変性条件、非酸化及び非還元条件下で加
水分解を制御し得ることが特に重要である。また、架橋
結合を任意のアミノ含有鎖部位に形成することができ、
かつ単に分子内にある遊離スルフヒドリル基の有効性に
依存しないことも重要である。
基で機能化しかつ架橋試薬9’及び18’に暴露させ
る。隣接する鎖のアミノ基はpH7又はそれ以上におい
て開裂性アミド結合を形成する。鎖を変性させないpH
(例えば、pH4〜5)におけるアミド結合の加水分解
は、例えばポリアクリルアミド/SDSゲル電気泳動に
よって追跡し、関心のある鎖に隣接する鎖を同定するこ
とができる。非変性条件、非酸化及び非還元条件下で加
水分解を制御し得ることが特に重要である。また、架橋
結合を任意のアミノ含有鎖部位に形成することができ、
かつ単に分子内にある遊離スルフヒドリル基の有効性に
依存しないことも重要である。
【0089】その他の実施態様 その他の実施態様は次の請求の範囲内にある。例えば、
その他の薬剤送達複合体及びタンパク質評価架橋剤は請
求の範囲内にある。
その他の薬剤送達複合体及びタンパク質評価架橋剤は請
求の範囲内にある。
【図1】一群の架橋試薬を調製するフローダイヤグラム
である。
である。
【図2】第1図において調製した試薬によって架橋した
特定の複合体を調製するフローダイヤグラムである。
特定の複合体を調製するフローダイヤグラムである。
【図3】化合物A’の合成におけるステップを示すフロ
ーダイヤグラムである。
ーダイヤグラムである。
【図4】化合物9’及びB’の合成におけるステップを
示すフローダイヤグラムである。
示すフローダイヤグラムである。
【図5】化合物18’及びD’の合成におけるステップ
を示すフローダイヤグラムである。
を示すフローダイヤグラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラムバート,ジョン エム. アメリカ合衆国 02146 マサチューセッ ツ,ブルックライン,リンデン プレイス 21 (72)発明者 センター,ピーター ディー. アメリカ合衆国 02130 マサチューセッ ツ,ジャメイカ プレイン,ワン リージ ェント サークル (番地なし)
Claims (7)
- 【請求項1】 下記の化合物: 【化1】 [式中、R1及びR2は独立にH,C5又はそれ以下の
アルキル基から選び、Aは下記の単位からなる 【化2】 (式中、R3、R4、R5及びR6は独立にH、ハロゲ
ン、C5又はそれ以下のアルコキシ及びアルキル基、及
び第三アミンから選び、Bはアミド結合及びフェニレン
基又は(CH 2 ) q (q=1〜5)からなるリンカーで
ある)]、及び 【化3】 [式中、R 2 は上に定義した通りであり、s=2〜5で
あり、Aは上に定義したもの又は下記の単位からなる 【化4】 (式中、n=1〜5)]の内の1つを含む架橋試薬。 - 【請求項2】 下記の単位: 【化5】 [式中、n=1〜5であり、R1及びR2は独立にH,
C5又はそれ以下のアルキル基から選び、Wは(C
H2)q(q=1〜5)であるか或は下記の単位: 【化6】 の内の1つである]を含む請求項1記載の試薬。 - 【請求項3】 n=1であり、かつW=(CH2)5で
ある請求項2記載の架橋試薬。 - 【請求項4】 アミノ基含有物質のアミノ窒素とスルフ
ヒドリル機能を含有する物質との間の酸開裂性架橋を形
成するのに適した架橋試薬を製造する方法であって、前
記架橋試薬が下記の単位: 【化7】 [式中、R1及びR2は独立にH,C5又はそれ以下の
アルキル基から選び、Aは下記の単位からなる 【化8】 (式中、R 3 、R 4 、R 5 及びR 6 は独立にH、ハロゲ
ン、C 5 又はそれ以下のアルコキシ及びアルキル基、及
び第三アミンから選び、Bはアミド結合及びフェニレン
基又は(CH 2 ) q (q=1〜5)からなるリンカーで
ある)]、及び 【化9】 [式中、R 2 は上に定義した通りであり、s=2〜5で
あり、Aは上に定義したもの又は下記の単位からなる 【化10】 (式中、n=1〜5)]の内の1つを含み、活性化置換
マレイン酸機能を与え、該活性化置換マレイン酸機能を
チオフェノール含有機能を含む複合体に、該チオフェノ
ールのスルフヒドリル基をイオン化させる程に高いpH
において行なう置換反応によって結合させ、該チオフェ
ノール含有機能をマレイミド窒素に結合させることを含
む、前記架橋試薬の製造方法。 - 【請求項5】 前記pHが9.5〜11.5である請求
項4記載の方法。 - 【請求項6】 前記マレイン酸機能をカルボキシル基に
アルファの炭素におけるハロゲン化アルキル機能によっ
て活性化させる請求項4記載の方法。 - 【請求項7】 前記チオフェノール含有機能がアミンを
含み、かつ前記マレイミド機能をアミノ窒素に窒素との
アミド結合を形成することによって結合させる請求項4
記載の方法。
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