JP4342934B2 - Ｐｅｐｔ−２輸送体を介した薬剤の投与 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、2002年3月1日に出願された米国特許出願第60/361,002号および2001年6月11日に出願された米国特許出願第60/297,732号からの優先権に由来しており、これらは両方とも、全目的についてその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
発明の背景
製薬産業における近年の発展により、多数の可能性ある治療薬が形成されるようになった。しかし、効果的な、経口的な生物学的利用能の化合物を製剤化することは、取り込みおよび代謝酵素に対する高感受性に関連した問題のために困難であることが判明している。
天然輸送体タンパク質は、細胞中へのおよび/または細胞を通る、種々の分子の取り込みに関与している。一般に、2つの主要な輸送系、すなわち溶質担体により媒介される系および受容体により媒介される系が存在する。担体により媒介される系では、典型的には複数の膜貫通ループにより細胞膜に固定され、かつ、その基質をエネルギー依存的フリップフロップまたは、交換およびその他の促進的もしくは平衡的な機構などその他の機構により輸送することにより機能する、輸送タンパク質が使用される。担体により媒介される輸送系は、ビタミン、糖、およびアミノ酸などの多くの重要な栄養分の能動的促進輸送または非能動的促進輸送に関与している。担体系により、血液もしくは管腔から腸細胞への輸送、および上皮細胞層を横切り管腔から血液への輸送（吸収）または血液から管腔への輸送（分泌）が行われる。担体により媒介される輸送体はまた、肝臓および腎臓などの臓器にも存在し、ここでタンパク質は循環化合物の排泄または再吸収に関与している。
受容体により媒介される輸送系は、これらの系が細胞膜をたった1回しか貫通していないタンパク質を通常利用する点で、担体により媒介される系とは異なる。さらに、基質が結合すると陥入過程および封入過程が引き起こされ、これにより種々の輸送ビヒクルが形成されて、基質（および時には他の分子）が細胞中におよび細胞を通って輸送される。特定の基質の内部移行をもたらしかつ続いて細胞質中の特定の位置を標的化するこの膜変形過程は、一般に、エンドサイトーシスと称される。
細胞膜を構成する脂質二重層を横切って、極性または親水性の化合物が透過するにはかなりのエネルギー的ペナルティーがあるので、これら化合物は通常動物の腸を介してはほとんど吸収されない。動物が摂取した食物の消化から生じる多くの栄養分、例えばアミノ酸、ジペプチドおよびトリペプチド、単糖、ヌクレオシド、ならびに水溶性ビタミンは極性化合物であり、その取り込みは動物の生存に必須である。これらの物質について、腸上皮を横切り溶質分子を能動輸送するための特異的機構が存在する。この輸送は、濃度勾配を低下させるイオンの共輸送によりエネルギー付与されることが多い。
溶質担体系の既知の例には、2つのペプチド輸送体、すなわちPEPT1およびPEPT2が含まれる。これらの輸送体の内因性基質は、2個または3個のアミノ酸からなる小ペプチドである。これらの輸送体は、食事タンパク質の消化から生じるペプチドの吸収（小腸）および糸球体ろ過液に存在するペプチドの再吸収において機能する。
ヒト腸ペプチド輸送体（PEPT1）およびヒト腎臓ペプチド輸送体（PEPT2）は、アミノ酸レベルで約48％の同一性を示す。どちらのペプチド輸送体も他の既知の哺乳動物配列に対して有意な配列同一性を示さず、PHT1およびPHT2に対してどちらも約20％の同一性を有する。2つの輸送体には、基質としてのβ-ラクタム抗生物質の認識における違いがいくつかあり、かつ、多くの基質に対する親和性には顕著な違いがある。従って、PEPT1は高容量で親和性の低い輸送体であり、PEPT2は親和性の高い輸送体である。両方の輸送体が基質として小ペプチドを受け入れ、膜貫通電気化学的H+勾配により駆動される。
PEPT1およびPEPT2は、異なるヒト組織において異なる発現パターンを示すと報告されている。PEPT1は、主に腸で、かつまた腎臓（曲部）および肝臓で発現され、脳および膵臓でも少量発現されることが報告されている。Feiら、Nature 386:563-566(1994)およびMiyamotoら、Biochimica et Biophysica Acta 1305:34-38(1996)。それに対して、PEPT2は、腎臓および脳で発現されること、肺、肝臓および心臓ではほとんど発現されないこと、および小腸では全く発現されないことが報告されている。Liuら、Biochimica et Biophysica Acta 1235:461-466(1995)およびBollら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93:284-289(1996)およびSaitoら、Biochimica et Biophysica Acta 1280:173-177(1996)。腸においてPEPT1が発現されPEPT2が発現されないという観点から、ペプチド輸送体を介した薬物の経口送達を改善するための現在の努力は、PEPT1の基質であるかまたはPEPT1の基質となるように修飾できる、薬理学的薬剤の同定に焦点が当てられている。
発明の概要
本発明は、PEPT2輸送体の基質である接合体部分に連結した薬学的薬剤を含む接合体を提供する。接合体のVmaxは、PEPT2輸送体に対するGly-Sarの少なくとも1％である。PEPT2に対する接合体のVmaxは、薬学的薬剤のみ、すなわち接合体部分を含まないものよりも大きい。
好ましくは、PEPT2輸送体に対する接合体のVmaxは、PEPT2に対する基質Gly-SarのVmaxのそれぞれ少なくとも5％、より好ましくは少なくとも10％、さらにより好ましくは少なくとも20％、さらにより好ましくは少なくとも約50％、最も好ましくは少なくとも100％である。
好ましくは、接合体部分を含まない薬学的薬剤の、PEPT2輸送体に対するVmaxは、PEPT2に対する基質Gly-SarのVmaxの1％未満である。
好ましくは、接合体とGly-Sarの間のVmax比は、PEPT1輸送体に対してよりもPEPT2輸送体に対しての方が大きく、より好ましくはPEPT2輸送体における比は、PEPT1輸送体における比のそれぞれ少なくとも2倍、さらにより好ましくは少なくとも10倍、最も好ましくは少なくとも100倍である。
本発明はまた、薬理学的に有効量の接合体を患者に投与する段階を含む治療法、および、接合体を薬学的に許容される担体と共に製剤化する段階を含む薬学的組成物の製造法を提供する。
本発明はさらに、薬理学的投与のために薬学的薬剤、接合体および/または接合体部分をスクリーニングする方法を提供する。本方法には、PEPT2輸送体を発現する細胞を提供する段階、細胞を薬剤、接合体または部分と接触させる段階、ならびに薬剤、接合体、または部分が輸送体により細胞中に入るおよび/または細胞を透過するかどうかを判定する段階が含まれる。好ましくは、細胞を、PEPT2輸送体をコードするDNAでトランスフェクトする。より好ましくは、細胞は、PEPT2輸送体をコードする核酸が注入された卵母細胞である。さらにより好ましくは、細胞は、検出可能なPEPT1受容体を全く示さない。
本発明はまた、薬学的組成物の製造法を提供する。このような方法には、薬剤を接合体部分に連結させて接合体を形成する段階が含まれ、ここで、接合体は、基質Gly-SarのVmaxの少なくとも1％のVmaxを有するPEPT2輸送体により輸送される。その後、接合体は、薬学的組成物として担体と共に製剤化される。
定義
タンパク質に言及する場合の「特異的に結合する」または、抗体に言及する場合の「特異的に免疫反応する」という用語は、タンパク質および他の生物製剤の異種個体群の存在下におけるタンパク質の存在の決定因子である、結合反応を意味する。従って、指定した条件下で、特異的リガンドは特定のタンパク質に優先的に結合し、試料中に存在する他のタンパク質には有意な量では結合しない。タンパク質に特異的に結合する抗体などの分子の会合定数は、少なくとも106M-1または107M-1、好ましくは108M-1から109M-1、より好ましくは約1010M-1から1011M-1またはそれ以上であることが多い。しかし、輸送体の基質のいくつか、特にPEPT1は、10〜103M-1オーダーというはるかに低い親和性しか有さないが、結合は依然として特異的であると示すことができる。様々な免疫アッセイ形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択できる。例えば、固相ELISA免疫アッセイを慣用的に使用して、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択する。特異的免疫反応性の決定に使用できる免疫アッセイ形式および条件の説明については、例えば、HarlowおよびLane(1988)「抗体、実験マニュアル（Antibodies, A Laboratory Manual）」、Cold Spring Harbor Publications、New Yorkを参照されたい。
「輸送タンパク質」とは、細胞中におよび/または細胞を通過して分子を輸送する上で直接的または間接的役割を果たすタンパク質である。本用語には、例えば、基質を認識して、担体により媒介される輸送体、または受容体により媒介される輸送により、基質の細胞への進入または細胞からの排出を実施する膜結合タンパク質が含まれる。これらのタンパク質は、輸送タンパク質と称されることがある。本用語にはまた、細胞を通るまたは細胞外への基質の運搬に関与する細胞内発現タンパク質が含まれる。本用語にはまた、基質を直接輸送しないが、基質に結合して基質を細胞中へのまたは細胞を通る基質の進入を実施する受容体または輸送体タンパク質の近位に保持する、細胞の表面上に露出したタンパク質または糖タンパク質が含まれる。担体タンパク質の例には、腸および肝臓胆汁酸輸送体、ジペプチド輸送体、オリゴペプチド輸送体、単糖輸送体（例えばSGLT1）、リン酸輸送体、モノカルボン酸輸送体、P-糖タンパク質を含む輸送体、有機アニオン輸送体（OATP）、および有機カチオン輸送体が含まれる。受容体により媒介される輸送タンパク質の例には、ウイルス受容体、免疫グロブリン受容体、細菌毒素受容体、植物レクチン受容体、細菌接着受容体、ビタミン輸送体、およびサイトカイン増殖因子受容体が含まれる。
輸送タンパク質の「基質」とは、細胞中への取り込みまたは細胞を介した透過が輸送タンパク質により促進されるような化合物である。
輸送タンパク質の「リガンド」という用語には、細胞に取り込まれたり細胞を通過することなく、輸送タンパク質に結合する、基質および他の化合物が含まれる。いくつかのリガンドは、輸送タンパク質に結合することにより、輸送タンパク質による基質の取り込みまたは細胞を通る基質の透過を阻害もしくは拮抗する。いくつかのリガンドは、輸送タンパク質に結合することにより、輸送タンパク質または別の輸送タンパク質による化合物の取り込みまたは透過を促進するまたは困難にする。例えば、ある輸送タンパク質へのリガンドの結合は、第一輸送タンパク質の近位にある第二輸送タンパク質による基質の取り込みを促進できる。
「薬剤」という用語は、薬理活性を有するかまたは有し得る、化合物を説明するために使用される。薬剤には、既知の薬物である化合物、薬理活性が同定されているがさらなる治療的評価を受けている化合物、および薬理活性についてスクリーニング対象である集合およびライブラリのメンバーである化合物が含まれる。
薬剤は、経口経路を介して投与された場合に薬理活性を発揮できる場合に「経口的に活性」である。
「接合体部分」とは、それ自体は薬理活性を示さないが、薬剤と連結して、薬理活性を有する接合体を形成できる、化合物または化合物の一部を意味する。典型的には、薬剤は、接合体部分を有さなくても薬理活性を有する。接合体部分は、輸送体を介した薬剤の取り込みを促進することにより、薬剤の治療的使用を容易にする。接合体部分は、それ自体が輸送体の基質であってもよく、または、化合物（例えばバラシクロビル）に連結した場合に基質となってもよい。従って、化合物および接合体部分から形成された接合体部分は、化合物または部分単独よりも高い取り込み活性を有することができる。
「薬理」活性とは、薬剤が疾病の予防または治療に有用であるかまたは有用であり得ることを示すようなスクリーニング系において、薬剤が少なくとも活性を示すことを意味する。スクリーニング系は、インビトロ、細胞、動物、またはヒトであり得る。疾病の治療における実際の予防的または治療的有用性を確立するためにはさらなる試験が必要であり得るが、薬剤は薬理活性を有すると記載することができる。
輸送体に対する化合物のVmaxおよびKmは、慣習に従って定義される。Vmaxとは、化合物の飽和濃度において1秒間あたりに輸送される化合物の分子数である。Kmとは、化合物がVmaxの半分で輸送される、化合物の濃度である。一般に、輸送体の基質には高いVmax値が望ましい。低濃度の化合物の輸送には低いKm値が望ましく、高濃度の化合物の輸送には高いKm値が望ましい。Vmaxは、輸送体の固有のターンオーバー速度（分子数 / 輸送体タンパク質）、および、発現レベルに依存した形質膜中の輸送体密度の両方により影響を受ける。これらの理由から、特定の輸送体による輸送対象の化合物の固有容量は、通常、化合物のVmax / 輸送体の基質であることが知られる対照化合物のVmax比として表現される。
配列比較用に、典型的には、1つの配列が参照配列としての役割を果たすが、この参照配列と被験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要であればその後の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。その後、配列比較アルゴリズムは、指定したプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する被験配列の配列同一率を計算する。
比較のために最適な配列整列化は、例えばSmith & Waterman、Adv.Appl.Math.2:482(1981)の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch、J.Mol.Biol.48:443(1970)の相同性整列化アルゴリズムにより、Pearson & Lipman、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)の類似検索法により、これらのアルゴリズムのコンピューター実行により（Wisconsin Genetics Software PackageのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、WI州マディソン所在）、または視覚的観察により（一般に、Ausubelら、前記を参照されたい）実施できる。
配列同一率および配列類似率の決定に適したアルゴリズムの別の例はBLASTアルゴリズムであり、これはAltschulら、J.Mol.Biol.215:403-410(1990)に記載されている。BLAST解析を実施するソフトウェアは、米国生物工学情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）により公的に入手可能である。このアルゴリズムではまず、クエリー配列中の長さWの短いワードを同定することにより、最もスコアの高い配列対（high scoring sequence；HSP）が同定されるが、これは、データベース配列の同じ長さのワードと整列化させた場合に、いくつかの正の閾値スコアTと一致するまたは満足する、。Tは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschulら、前記）。これらの初期の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを発見するための探索を開始するための起源としての役目を持つ。その後、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータM（一対の一致残基に対するリワードスコア；常に＞0）およびN（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜0）を使用して計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリクスを使用して、累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Xだけ下降した場合に、1つ以上の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積により累積スコアが0以下になった場合に、または、いずれかの配列が末端に達した場合に、各方向へのワードヒットの伸張が停止する。核酸またはポリペプチドが本発明の範囲内であるかどうかの同定には、BLASTプログラムのデフォルトパラメータが適切である。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列について）では、デフォルトとしてワード長（W）11、期待値（E）10、M＝5、N＝-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムでは、デフォルトとしてワード長（W）3、期待値（E）10、およびBLOSUM62スコアリングマトリクスを使用する。TBLATNプログラム（ヌクレオチド配列についてはタンパク質配列を使用する）では、デフォルトとしてワード長（W）3、期待値（E）10、BLOSUM62スコアリングマトリクスを使用する（Henikoff & Henikoff、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989)を参照されたい）。
配列同一率の計算に加えて、BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計学的解析を実施する（例えば、Karlin & Altschul、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993)を参照されたい）。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の1つの測定値は、最小の総和確率（sum probability）（P（N））であり、これにより、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる指標が提供される。例えば、参照核酸と試験核酸を比較した最小の総和確率が約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合に、核酸は参照配列と類似していると判断される。
輸送体は、発現がmRNA解析、タンパク質解析、抗体組織化学法、または機能的輸送アッセイにより検出できる場合、特定の組織、例えば空腸に発現されている。典型的には、検出可能なmRNA発現は、同組織中のβアクチンの少なくとも約0.01％というレベルである。好ましい輸送体は、所望の組織において少なくとも0.1％、または1％もしくは10％のβアクチンの発現レベルを示す。逆に、前記の技術のいずれかにより、前記実験誤差より上の値の発現が検出されない場合には、輸送体は特定の組織（例えば下行結腸）において発現されない。従って、特定の組織に発現されない輸送体は、βアクチンの0.1％未満の発現レベルを示し、通常、βアクチンの0.01％未満の発現レベルを示す。
徐放性とは、従来の薬物製剤の経口投与により達成される時間に比べて長時間にわたる、治療量または予防量の薬物またはその活性代謝物の、全身循環血への放出を意味する。
発明の詳細な説明
1.序論
本発明は、PEPT2輸送体を介して基質として輸送されるべき容量について、薬剤、接合体、または、薬剤に連結したもしくは連結可能な接合体部分をスクリーニングする方法を提供する。本発明はまた、単独でもしくは接合体部分への連結の結果としてPEPT2輸送体の基質となる薬剤の経口送達を伴う治療法を提供する。本発明の方法は一部、ヒト腸、特に胃、空腸、回腸、回盲弁、盲腸、および上行結腸でPEPT2が発現されていることが示された、発明者らの結果を前提とする。以前の研究者の報告では、PEPT2は、脳および腎臓には存在するが、腸には存在しない。本発明の結果と以前の研究の間の矛盾は、PEPT2が発現されている組織を決定するための以前の研究の大半が、ヒトではなくラットで実施されていたこと、および、本発明の実施例に使用した定量的PCRの検出感度がずっと高いことに起因しうる。
PEPT2がヒト腸で発現されているという洞察により、この輸送体を介した薬物の設計および送達のための新しい戦略が開拓された。PEPT1とPEPT2の基質特異性が異なることから、PEPT1の不十分な基質であるいくつかの薬剤、接合体または接合体部分は、PEPT2によってより大量に輸送される。それ故、PEPT1の代替的な輸送体としてPEPT2を利用できることにより、腸を通過できるかまたは腸の透過を容易にできる薬剤、接合体および接合体部分の範囲が広がる。したがって、スクリーニングアッセイにおいてPEPT1により不十分にしか輸送されないことが判明した薬剤、接合体または接合体部分は、必ずしも廃棄すべきではなく、PEPT2を介した輸送について再試験できる。薬剤、接合体、または接合体部分はまた、意図される標的としてPEPT2を用いて設計またはスクリーニングできる。腎臓におけるPEPT2の発現により、PEPT2用の薬剤または接合体が腎臓から全身循環系に戻る再循環がもたらされうる。再取り込みにより、薬物または接合体部分の半減期は増加し、従って、必要な投与量は減少する。PEPT2の利点は、基質に対する高い親和性により、候補基質の濃度がPEPT1よりも低い状態で、候補基質を試験できることである。ごく少量しか入手できないか、または溶解度がわずかしかない候補基質では、基質濃度が低い状態で基質特性を決定できることは重要な利点である。
2.PEPT1およびPEPT2
ヒトPEPT1は、Liang、Journal of Biological Chemistry 270:6456-6463(1995)により、2263bpのcDNAとしてクローニングされ、これは、708アミノ酸のタンパク質をコードする2127bpのオープンリーディングフレームを有する。PEPT1への言及には、Liangのアミノ酸配列、その対立遺伝子、同族体、および誘導変種が含まれる。通常、このような変種は、Liangの例示的配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す。ヒトPEPT1配列の同族型は、ウサギおよびラット組織からクローニングされている。それぞれ、Fei、Nature 368:563-566(1994)、およびMiyamoto、Biochimica et Biophysica Acta 1305:34-38(1996)。
ヒトPEPT2は、Liuら、Biochimica et Biophysica Acta 1235:461-466(1995)によりクローニングされている。PEPT2に対する言及には、Liuらのアミノ酸配列、その対立遺伝子、同族体、および誘導変種が含まれる。通常このような変種は、Liuの例示的配列に対して少なくとも90％の配列同一性を示す。Saitoら、Biochimica et Biophysica Acta 1280、173-177(1996)には、ラットH+結合ペプチド輸送体PEPT2をコードするcDNAの単離が記載されている。PEPT2 cDNAは3938bpを有し、これは分子量81kDa、729アミノ酸のタンパク質をコードする。全体的なアミノ酸同一性は、ラットPEPT1に対して48％の同一性である。ラットPEPT2は、12個の推定膜貫通αへリックス、および、α-へリックス9と10の間の予想される大きな細胞外ループにおいて4個の潜在的N連結グリコシル化部位を有する。ラットPEPT2は、ヒトPEPT2に対して83％のアミノ酸同一性を示した。実施例に記載の実験により、ヒトPEPT2が、他の組織に比べてとりわけ、腎臓、膵臓、肝臓、脳、肺、回腸、空腸、および十二指腸に発現されていることが示される。PEPT2はまた、腸細胞に由来するCaCo2細胞系にも発現されている。
3.PEPT2受容体の基質である薬剤、接合体、または接合体部分を同定する方法
薬理活性を有することが知られているか、または疑われる薬剤を、PEPT2輸送体の基質として作用する容量について直接スクリーニングできる。または、接合体部分を基質としてスクリーニングでき、接合体部分は、薬理活性を有することが知られているか、または疑われる薬剤に連結している。このような方法において、接合体部分は、スクリーニング過程中に、接合体として薬剤または他の分子に連結できる。別の分子を使用する場合には、分子は、薬学的使用のために接合体部分に連結することが最終的に意図される薬剤の構造に似るように選択されることがある。スクリーニングは、典型的には、PEPT2輸送体を発現している細胞上で実施する。いくつかの方法では、細胞を、PEPT2輸送体をコードするDNAでトランスフェクトする。別の方法では、PEPT2輸送体を発現している天然細胞を使用する。いくつかの方法では、PEPT2は、発現されている唯一の輸送体であるかまたは唯一のペプチド輸送体である。別の方法では、細胞は、他の輸送体と組み合せてPEPT2を発現している。例えば、いくつかの方法では、PEPT1およびPEPT2の両方を発現している細胞を使用する。さらに別の方法では、薬剤、接合体、または接合体部分を、異なる輸送体を発現している異なる細胞上でスクリーニングする。例えば、薬剤または接合体は、PEPT2を発現している細胞上で、および、PEPT1を発現している細胞上でスクリーニングできる。輸送体を有する細胞を介した透過について薬剤、接合体、または接合体部分をスクリーニングする方法は、国際公開公報第01/20331号に記載されている。
輸送体を介した透過を立証する化合物の内部移行は、様々なレポーターのいずれかに由来する細胞内からのシグナルを検出することにより検出できる。レポーターは、蛍光、発色団、放射性同位体などの標識のように単純であってよい。共焦点画像法も、細胞表面上の蛍光と細胞内の蛍光を識別するに十分な空間的分離を提供するので、標識の内部移行の検出に使用でき、または、共焦点画像法は、化合物の動きを経時的に追跡するのに使用できる。別のアプローチでは、化合物の内部移行は、細胞内で発現される酵素の基質であるレポーターを使用して検出される。複合体が内部移行したら、基質は酵素により代謝されて、取り込みの指標となる光学的シグナルまたは放射能崩壊を生じる。発光は、市販のPMT系の装置またはCCD系の画像システムによりモニタリングできる。さらに、輸送活性の指標となる輸送化合物または電気生理学的シグナルのLCMSによる検出を利用したアッセイ法も使用されている。
いくつかの方法では、複数の薬剤、接合体、または接合体部分を同時にスクリーニングし、各薬剤または接合体の実体を、薬剤、接合体、または接合体部分に連結したタグを使用して追跡する。いくつかの方法では、予備段階を実施して、薬剤または接合体部分のPEPT2への結合を決定する。PEPT2に結合する全ての薬剤または接合体が輸送体の基質であるわけではないが、結合の観察は、最初のレパートリーからの候補基質の数の減少を可能にする指標となる。いくつかの方法では、薬剤または接合体部分の基質容量を、PEPT2の参照基質と比較して試験する。人工的ジペプチドであるGly-Sarは、PEPT1の参照として使用されることが多いが、PEPT2の参照としても使用できる。比較は、別々の並行アッセイ法において実施でき、ここで試験下の薬剤または接合体部分とGly-Sarを、同じ細胞の別々の試料における取り込みについて比較する。または競合形式で比較することもでき、ここでは、試験下の薬剤または接合体部分とGly-Sarを同じ細胞に適用する。典型的には、薬剤または接合体部分とGly-Sarは、このようなアッセイでは異なって標識される。
このような比較アッセイにおいて、被験薬剤、被験接合体部分、または薬剤および接合体部分を含む被験接合体のVmaxを、Gly-Sarと比較できる。薬剤、接合体部分、または接合体のVmaxが、PEPT2輸送体に対するGly-Sarの少なくとも1％、好ましくは少なくとも5％、より好ましくは少なくとも10％、さらにより好ましくは少なくとも20％、最も好ましくは少なくとも50％である場合、薬剤、接合体部分または接合体は、PEPT2に対する基質であると判断できる。一般に、Gly-SarのVmaxと比べて、薬剤、接合体部分、または接合体のVmaxが高ければ高いほどよい。したがって、PEPT2に対するGly-SarのVmaxの少なくとも50％、100％、150％、または200％のVmaxを有する薬剤、接合体部分、または接合体を、いくつかの方法でスクリーニングする。接合体部分が連結した薬剤は、単独で、PEPT2に対する検出可能な基質活性を殆どまたは全く示すことができない（例えば、Gly-SarのVmaxに対するVmaxは0.1％または1％未満）。
いくつかの方法において、薬剤、接合体部分、または接合体のVmaxはまた、輸送体PEPT1に対するGly-Sarに対して決定される。このようなスクリーニングにより、薬剤、接合体部分、または接合体は、PEPT1よりもPEPT2のより良好な基質であることが判明し得る。PEPT2およびPEPT1の基質の相対容量は、それぞれの輸送体に対する薬剤、接合体部分、または接合体とGly-SarのVmax比を比較することにより比較できる。例えば、薬剤、接合体部分、または接合体と、Gly-SarのVmax比がPEPT1に対するよりもPEPT2に対する方が大きい場合、薬剤、接合体部分、または接合体は、PEPT1よりもPEPT2のより良好な基質である。いくつかの方法において、Vmax比は、PEPT1に対するよりもPEPT2に対して少なくとも2倍、10倍、20倍、50倍、または100倍高い。いくつかの方法において、PEPT1における、薬剤、接合体部分、または接合体と、Gly-Sarの比は、0.1％、1％、または10％未満である。別の方法では、薬剤、接合体部分、または接合体は、PEPT1の基質である（PEPT1におけるGly-SarのVmaxの少なくとも10％、50％、100％、150％、または200％のVmax。PEPT1およびPEPT2の両方について頑強なアッセイが利用可能であり、これにより、PEPT1もしくはPEPT2のどちらかまたは両方の基質（または阻害剤）活性をもつ化合物の設計および特徴付けが可能となる。従来の知識に基づくと、PEPT1に対する基質活性を欠いた化合物は、経口送達の候補としては拒絶されるが、しかし、ヒト腸における有意なPEPT2発現の本発明者らの検出に基づくと、PEPT2により輸送される化合物が認識されかつヒト腸におけるPEPT2輸送体を介した経口送達について最適化されうる）。
4.スクリーニング対象となる薬剤、接合体、および接合体部分
スクリーニング対象となる薬剤、接合体、または接合体部分を構成する化合物は、天然分子でも合成分子でもよい。天然供給源には、例えば海洋微生物、藻、植物、および真菌などの供給源が含まれる。または、スクリーニング対象となる化合物は、ペプチドまたは小分子を含む薬剤のコンビナトリアルライブラリから、または、例えば化学産業、製薬産業、環境産業、農業産業、海洋産業、化粧品産業、薬品産業、およびバイオテクノロジー産業などの産業において合成される既存の化学的化合物のレパートリーに由来しうる。化合物には、例えば、医薬品、治療薬、環境物質、農薬、または産業品、汚染物質、化粧品、薬物、有機化合物、脂質、グルココルチコイド、抗体、ペプチド、糖、炭水化物、およびキメラ分子などが含まれる。
様々な方法が、ペプチドライブラリの作製に利用できる（例えば、Lamら、Nature、354:82、1991および国際公開公報第92/00091号；Geysenら、J Immunol Meth、102:259、1987：Houghtenら、Nature、354:84、1991および国際公開公報第92/09300号およびLeblら、Int J Pet Prot Res、41、201、1993を参照されたい）。ペプチドライブラリも、ファージディスプレイ法により作製できる。例えば、Dower、米国特許第5,723,286号を参照されたい。
漸進的様式で合成できる多くのタイプの化合物についてコンビナトリアルライブラリを作製できる（例えばEllman & Bunin、J Amer Chem Soc、114:10997、1992（ベンゾジアゼピン鋳型）、国際公開公報第95/32184号（オキサゾロンおよびアミニジン鋳型）、国際公開公報第95/30642号（ジヒドロベンゾピラン鋳型）および国際公開公報第95/35278号（ピロリジン鋳型）を参照されたい）。化合物のライブラリは、通常、粒子上の固相化学反応により合成される。しかし、液相ライブラリ合成も有用であり得る。コンビナトリアル合成の戦略は、Dol+Le & Nelson、J.Combinatorial Chemistry 1、235-282(1999)により記載されている（その全体が全目的について本明細書に組み入れられる）。合成は、典型的には、環状式で、異なるモノマーもしくは他の成分を各回の合成に添加しながら実施される。いくつかの方法は、最初のプールを連続的に分画することにより実施される。例えば、初回の合成を全ての支持体上で実施する。その後、支持体を2つのプールに分割し、別々の合成反応を各プールで実施する。その後、2つのプールをさらに分割し、その各々をさらに2つのプールに分割し、以後同様である。他の方法は、分割および再プールの両方を使用する。例えば、初回の合成後、化合物のプールを第二回の別々の合成のために2つに分割する。その後、別々のプールからのアリコートを第三回目の合成のために混合する。分割法およびプール法により、混合化合物のプールが得られる。これらの方法は、以下でより詳細に記載するように、タグ化を特に受けやすい。このような方法により作製したライブラリのサイズは、2つの別々の化合物から、104、106、108、または1010、またはその間の任意の範囲まで変化し得る。
コードされたライブラリの調製は、Needelsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993、90、10700；Niら、J.Med.Chem.1996、39、1601、国際公開公報第95/12608号、国際公開公報第93/06121号、国際公開公報第94/08051号、国際公開公報第95/35503号、および国際公開公報第95/30642号（各々全体が全目的について参照として組み入れられる）を含む、様々な刊行物に記載されている。コードされたライブラリの合成法には、典型的には、ランダムなコンビナトリアルアプローチならびに、モノマー単位の化学的および/または酵素的アセンブリが含まれる。例えば、本方法には、典型的には、（a）複数の固相支持体を複数の反応容器に分配する段階；（b）異なる第一モノマーとタグの組合せを使用して、第一モノマーおよび第一タグを、各反応容器中の支持体に、各々異なる反応容器中でカップリングする段階；（c）支持体をプールする段階；（d）支持体を複数の反応容器に分配する段階；（e）第一モノマーに第二モノマーをカップリングし、異なる第二モノマーと第二タグの組合せを使用して、固相支持体または第一タグに第二タグを、各々異なる反応容器中でカップリングする段階；ならびに、異なるタグおよび異なるモノマーを用いて、カップリング段階および分配段階を、1回〜20回またはそれ以上繰り返す段階が含まれる。モノマーセットは、段階毎に拡大または縮小できるか；または、モノマーセットは次の段階で完全に変更できる（例えばある段階ではアミノ酸、別の段階ではヌクレオシド、別の段階では炭水化物）。ペプチド合成用のモノマー単位には、例えば、単一のアミノ酸もしくはより大きなペプチド単位、または両方が含まれる。
このような方法により合成可能な化合物には、ポリペプチド、βターン模倣体、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーN置換グリシン、およびオリゴカルバメートが含まれる。調製されたコンビナトリアルライブラリはまた、業者（例えばChemRx、CA州サウスサンフランシスコ所在）から入手可能である。
スクリーニング対象となる化合物のいくつかは、既知の輸送体の基質の変種である。これらの輸送体の天然機能とは、食用タンパク質の消化（小腸）から生じるペプチドを輸送し、糸球体ろ過（腎臓）におけるペプチドの消失を防ぐことである。スクリーニング対象となる化合物のいくつかは、ペプチド、アミノ酸変種、双イオン性抗生物質、糖もしくはヌクレオシド、またはこれらのいずれかの構造的変種である。スクリーニング対象となる化合物にはまた、既知の基質の変種、例えばβ-ラクタム抗生物質、抗がん剤ベスタチン、およびアンギオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤が含まれる。経口で生物学的に利用可能な抗生物質は、PEPT1およびPEPT2とは異なって相互作用する。一般に、不変ではないが、α-アミノ基を有するβ-ラクタム抗生物質（セファドロキシル、セフラジン、アモキサシリン、およびシクラシリン）は、PEPT1よりもPEPT2に対してより良好な基質である。α-アミノ基を含まないβ-ラクタム抗生物質（セフチブテン、セフィキシム、およびセフジニル）は、PEPT2のに対してそれほど良好な基質ではないが、PEPT1に対しては中程度の基質である。
5.薬剤の接合体部分への連結
PEPT2または他の輸送体の基質である接合体部分を、様々な手段により、薬理活性を有する薬剤に付着させるまたは薬剤中に組み込むことができる。薬剤を接合体部分に直接接合すること（得られる共有結合はインビボで切断可能である）、または、薬剤と共に二官能基リンカー前駆体を接合体部分に共有結合的にカップリングすることのいずれかにより、本発明の接合体を調製できる。リンカー前駆体は、薬剤上の少なくとも1つの反応性官能基および接合体部分上の少なくとも1つの反応性官能基に相補的である少なくとも1つの反応性官能基を含むように選択される。このような相補的反応基は、下記に示したように、当技術分野において公知である。
相補的結合化学
Figure 0004342934
薬剤および接合体部分の両方に対する、リンカー上の官能基の相補的化学に加えて、リンカー（使用する場合）はまた、インビボで切断可能であるように選択される。切断可能なリンカーは当技術分野において公知であり、薬剤を接合体部分に付着させているリンカーの共有結合の少なくとも1つがインビボで破壊され得るように選択され、これにより薬剤またはその活性代謝物が全身循環血中で利用可能となる。リンカーは、切断可能な共有結合の破壊に必要とされる反応が、薬剤（またはその活性代謝物）を全身循環血中に放出可能にするインビボ生理学的部位において有利なように選択される。全身循環血への放出用の有効な濃度の薬剤またはその活性代謝物の提供に適した切断可能なリンカーの選択は、内因性酵素を用いた、当技術分野において公知の、接合体からの薬剤またはその活性代謝物のインビボ切断に対する関連を提供するための標準的なインビトロアッセイで評価することができる。勿論、接合体がインビボでいくつかの形状で切断し、全身循環血に薬剤またはその活性代謝物を持続的に放出する限り、使用される正確な切断機構は本発明の方法に重要ではないことが理解されよう。
別のアプローチでは、接合体部分および薬剤は、各々、互いに相互親和性を有する部分に付着している（例えば、アビジンもしくはストレプトアビジンとビオチン、またはヘキサヒスチジンとNi2＋）。別のアプローチでは、薬剤および接合体部分の両方が固相に連結している。このような支持体の例には、ナノ粒子（例えば米国特許第5,578,325号および第5,543,158号を参照されたい）、分子骨格、リポソーム（例えばDeshmuck,D.S.ら、Life Sci.28:239-242(1990)、およびAramaki,Yら、Pharm.Res.10:1228-1231(1993)を参照されたい）、タンパク質共キレート剤（安定なタンパク質-リン脂質-カルシウム沈降物；例えばChenら、J.Contr.Rel.42:263-272(1996)を参照されたい）、および包接複合体が含まれる。これらの支持体を使用して他の活性分子を付着できる。ナノ粒子などの特定の支持体を使用して、所望の化合物を封入することもできる。切断可能な連結を介して薬剤を支持体に連結することができ、これにより、輸送体を介した取り込み後の薬剤の分離が可能になる。
前述のような用途に適した切断可能なリンカーの例には、1つもしくは複数の制限部位を有する核酸、またはプロテアーゼ切断部位を有するペプチド（例えば米国特許第5,382,513号を参照されたい）が含まれる。使用できる他の例示的リンカーは、イリノイ州ロックフォード所在のPierce Chemical Companyから入手できるが、適切なリンカーはまた、欧州特許第188,256号；米国特許第4,671,958号；第4,659,839号；第4,414,148号；第4,669,784号；第4,680,338号、第4,569,789号および第4,589,071号；およびEggenweiler,H.M.、Drug Discovery Today、3:552(1998)に記載されており、各々の全文が全目的について本明細書に組み入れられる。
多くの既存の薬物の取り込みを、腸を通して改善できる。腸から取り込みの可能なプロドラッグへの変換に適した薬物は、典型的に、プロドラッグ用部分が接合し得るような下記の官能基を1つまたは複数含む：1級アミノ酸もしくは2級アミノ基、ヒドロキシル基、カルボン酸基、ホスホン酸基、またはリン酸基。
カルボキシル基を含む薬物の例には、例えば以下が含まれる：アレカプリル（alecapril）、カプトプリル、1-[4-カルボキシ-2-メチル-2R,4R-ペンタノイル]-2,3-ジヒドロ-2S-インドール-2-カルボン酸、エナラプリル酸、リシノプリル、N-シクロペンチル-N-[3-[(2,2-ジメチル-1-オキソプロピル)チオ]-2-メチル-1-オキソプロピル]グリシン、ピボプリル（pivopril）、キナプリラート（quinaprilat）、(2R,4R)-2-ヒドロキシフェニル)-3-(3-メルカプトプロピオニル)-4-チアゾリジンカルボン酸、(S)ベンズアミド-4-オキソ-6-フェニルヘキセノイル-2-カルボキシピロリジン、[2S-1[R*(R*))]]2α,3αβ,7αβ]-1[2-[[1-カルボキシ-3-フェニルプロピル]-アミノ]-1-オキソプロピル]オクタヒドロ-1H-インドール-2-カルボン酸、[3S-1[R*(R*))]],3R*]-2-[2-[[1-カルボキシ-3-フェニルプロピル]-アミノ]-1-オキソプロピル]-1,2,3,4-テトラヒドロ-3-イソキノロンカルボン酸、およびチオプロニンなどのアンギオテンシン変換酵素阻害剤；セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン（cefazedone）、セファザフロール（cefazuflur）、セファゾリン、セフブペラゾン、セフィキシム、セフメノキシム、セフメタゾール、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォテファン、セフォチアム、セフォキシチン、セフピミゾール、セフピロム、セフポドキシム、セフロキサジン、セフスロジン、セフピラミド、セフタジジム、セフテゾール、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファセトリル、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロスポリン、セファノン、セフラジン、およびラタモキセフなどのセファロスポリン抗生物質；アモキシシリン、アンピシリン、アパルシリン、アジドシリン、アズロシリン、ベンジルペニシリン、カルベニシリン、カルフェシリン、カリンダシリン、クロキサシリン、シクラシリン、ジクロキサシリン、エピシリン、フルクロキサシリン、ヘタシリン、メチシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、フェネチシリン、ピペラジリン、スルベニシリン、テモシリン、およびチカルシリンなどのペニシリン類；アルガトロバン、メラガトラン、およびナプサガトランなどのトロンビン阻害剤；ザナミビルおよびペラミビルなどのインフルエンザノイラミニダーゼ阻害剤；アカメタシン、アルクロフェナク、アルミノプロフェン、アスピリン（アセチルサリチル酸）、4-ビフェニル酢酸、ブクロキシ（bucloxic）酸、カルプロフェン、シンコフェン、シンメタシン、クロメタシン、クロニキシン、ジクロフェナク、ジフルニサール、エトドラク、フェンブフェン、フェンクロフェナク、フェンクロシン（fenclosic）酸、フェノプロフェン、フェロブフェン、フルフェナム酸、フルフェニサル、フルルビプロフェン、フルプロフェン、フルチアジン、イブフェナク、イブプロフェン、インドメタシン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ケトロラック、ロナゾラック（lonazolac）、ロキソプロフェン、メクロフェナム酸、メフェナム酸、2-(8-メチル-10,11-ジヒドロ-11-オキソジベンゾ[b,f]オキセピン-2-イル)プロピオン酸、ナプロキセン、ニフルミン（nifluminic）酸、O-(カルバモイルフェノキシ)酢酸、オキソプロジン、ピルプロフェン、プロドル酸、サリチル酸、サリチルサリチル酸、スリンダク、スプロフェン、チアプロフェン酸、トルフェナム酸、トルメチン、およびゾペミラク（zopemirac）などの非ステロイド系抗炎症剤；シプロステン（ciprostene）、16-デオキシ-16-ヒドロキシ-16-ビニルプロスタグランジンE2、6,16-ジメチルプロスタグランジンE2、エポプロストステノール（epoprostostenol）、メテネプロスト（meteneprost）、ニレプロスト（nileprost）、プロスタサイクリン、プロスタグランジンE1、E2、またはF2α、およびトロンボキサンA2などのプロスタグランジン類；アクロソキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、フルメキン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキソリニン酸、ペフロキサシン、ピペミド酸、およびピロミド酸などのキノロン抗生物質；アズトレナム、イミペネム、メロペネム、および関連カルボペネム抗生物質などその他の抗生物質。
アミン基を含む代表的薬物には、以下が含まれる：アセブタロール、アルブテロール、アルプレノロール、アテノロール、ブノロール、ブプロピオン、ブトパミン、ブトキサミン、カルブテロール、カルテオロール、コルテロール、デテレノール、デクスプロパノノール、ジアセトロール、ドブタミン、エキサプロロール、エクスプレノロール（exprenolol）、フェノテロール、フェニリポール、ラボトロール（labotolol）、レボブノロール（levobunolol）、メトロール、メタプロテレノール、メトプロロール、ナドロール、パマトロール、ペンブタロール（penbutalol）、ピンドロール、ピルブテロール、プラクトロール、プレナルテロール、プリミドロール（primidolol）、プリジジロール（prizidilol）、プロカテロール、プロパノロール、キレンテレノール、リミテロール、リトドリン、ソロトール（solotol）、ソテレノール、スルフィニオロール（sulfiniolol）、スルフィンテロール（sulfinterol）、スリクチジル（sulictidil）、タザオロール（tazaolol）、テルブタリン、チモロール、チプレノロール、チプリジル（tipridil）、トラモロール、チアベンダゾール、アルベンダゾール、アルブトイン、アレンドロネート、アリニジン、アリザプリド（alizapride）、アミロリド、アミノレックス、アプリノシド（aprinocid）、カムベンダゾール、シメチジン、シサプリド、クロニジン、シクロベンダゾール、デラビルジン、エフェガトリン（efegatrin）、エチンチジン（etintidine）、フェンベンダゾール、フェンメタゾール（fenmetazole）、フルベンダゾール、フルドレクス、ガバペンチン、イカドロネート、ロベンダゾール、メベンダゾール、メタゾリン（metazoline）、メトクロプラミド、メチルフェニデート、メキシレチン、ネリドロネート、ノコダゾール、オキシフェンダゾール、オキシベンダゾール、オキシメチジン（oxmetidine）、パミドロネート、パルベンダゾール、プラミペキソール、プラゾシン、プレガバリン、プロカインアミド、ラニチジン、テトラヒドラゾリン、チアメニジン、チナゾリン（tinazoline）、チオチジン、トカイニド、トラゾリン、トラマゾリン、キシロメタゾリン、ジメトキシフェネチルアミン、N-[3(R)-[2-ピペリジン-4-イル]エチル]-2-ピペリドン-1-イル]アセチル-3(R)-メチル-β-アラニン、アドレノロン、アレタミン、アミデフリン、アンフェタミン、アスパルテーム、バメタン、ベタヒスチン、カルビドーパ、クロルプレナリン、クロルテルミン、ドーパミン、L-Dopa、エピネフリン、エトリプタミン、フェンフルラミン、メチルドーパミン、ノルエピネフリン、トカイニド、エンビロキシム（enviroxime）、ニフェジピン、ニモジピン、トリアムテレン、ノルフロキサシン、ならびに、ピペデミン（pipedemic）酸、1-エチル-6-フルオロ-1,4-ジヒドロ-4-オキソ-7-(1-ピペラジニル)-1,8-ナフチリジン-3-カルボン酸、1-シクロプロピル-6-フルオロ-1,4-ジヒドロ-4-オキソ-7-(ピペラジニル)-3-キノリンカルボン酸などの類似化合物。
水酸基を含む代表的な薬物には、以下が含まれる：アリルストレノール（allylestrenol）、シンゲストール、デヒドロエピアンドロステロン、ジエノストロール（dienostrol）、ジエチルスチルベストロール、ジメチステロン、エチネロン、エチノジオール、エストラジオール、エストロン、エチニルエストラジオール、エチステロン、リネストレノール、メストラノール、メチルテストステロン、ノルエチンドロン、ノルゲストレル、ノルビンステロン（norvinsteron）、オキソゲストン、キネストロール（quinestrol）、テストステロン、およびチゲストールなどのステロイドホルモン；ドフェキサゼパム（dofexazepam）、ヒドロキシジン、ロラゼパム、およびオキサゼパムなどの精神安定剤；アセトフェナジン（acetophenazine）、カルフェナジン、フルフェナジン、ペルフェナニン、およびピペラセタジンなどの神経遮断薬；アクラルビシン、シタラビン、デシタビン、ダウノルビシン、ジヒドロ-5-アザシチジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、フルダラビン、ゲンシタビン、7-ヒドロキシクロルプロマジン、ネララビン（nelarabine）、ネプラノシンA、ペントスタチン、ポドフィロトキシン、テザシタビン、トロキサシタビン（troxacitabine）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビンデシンなどの細胞増殖抑止剤；ブセリリン、ゴナドリベリン、イカチブラント（icatibrant）、および酢酸ロイプロレリンなどのホルモンおよびホルモンアンタゴニスト；テルフェナジンなどの抗ヒスタミン剤；ジフルニサール、ナプロキソール、パラセタモール、サリチルアミド、およびサリチル酸などの鎮痛薬；アジダムフェニコール（azidamphenicol）、アジトロマイシン、カンプトテシン、セファマンドール、クロラムフェニコール、クラリスロマイシン、クラブラン酸、クリンダマイシン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、イミペネム、ラタモキセフ、メトロニダゾール、ネオマイシン、ノボビオシン、オレアンドマイシン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、チアメニコール（thiamenicol）、およびトブラマイシンなどの抗生物質；アシクロビル、ジデオキシジデヒドロシチジン、ジデオキシシトシン、1-(2-デオキシ-2-メチレン-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)シチジン、フルオロジデオキシジデヒドロシチジン、フルオロジデオキシシトシン、FMAU（1-(2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル)チミン）、デオキシ-5-フルオロ-3'-チアシチジン、2'-フルオロ-アラ-ジデオキシイノシン、ガンシクロビル、ラミブジン、ペンシクロビル、SddC、スタブジン、5-トリフルオロメチル-2'-デオキシウリジン、ザルシタビン、およびジドブジンなどの抗ウイルス剤；EB-1053（1-ヒドロキシ-3-(1-ピロリジニル)プロピリデン-1,1-ビスホスホネート）、エチドロネート、イバンドロネート、オルパドロネート、レジドロネート（residronate）、1-ヒドロキシ-2-(イミダゾ[1,2-a]ピリジン-3-イル)エチリデン]-ビスホスホン酸、およびゾレンドロネートなどのビスホスホネート；シプロキレン（ciprokiren）、エナルキレン（enalkiren）、リトナビル、サクイナビル（saquinavir）、およびテルラキレン（terlakiren）などのプロテアーゼ阻害剤；アルバプロスチル（arbaprostil）、カルボプロスト、ミソプロスチル、およびプロスタシジン（prostacydin）などのプロスタグランジン；8-ヒドロキシクロルイミプラミンおよび2-ヒドロキシイミプラミンなどの抗うつ薬；ソタロールおよびフェノルドパムなどの抗高血圧剤；ビペリジン、プロシクリジン、およびトリヘキシルフェニダールなどの抗コリン作用薬；クロモリンなどの抗アレルギー薬；ベタメタゾン、ブデノシド（budenosid）、クロルプレドニゾン、クロベタゾール、クロベタゾン、コルチコステロン、コルチゾン、コルトデキソン（cortodexon）、デキサメタゾン、フルコルトロン（flucortolon）、フルドロコルチゾン（fludrocortisone）、フルメタゾン、フルニソリド、フルプレドニソロン、フルランドレノリド、フルランドレノロンアセトニド、ヒドロコルチゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニソロン、パラメタゾン、プレドニソロン、プレドニソール、トリアムシノロン、およびトリアムシノロンアセトニドなどのグルココルチコイド；アポモルヒネ、ブプレノルフィン、ブトルファノール、コデイン、シクラゾシン、ヒドロモルホン、ケトベミドン、レバロルファン、レボルファノール、メタゾシン、モルヒネ、ナルブフィン、ナルメフェン、ナロキソン、ナロルフィン、ナルトレキソン、オキシコドン、オキシモルホン、およびペンタゾシンなどの麻薬作用薬および麻薬拮抗薬；アスマジンドール（asmazindol）および偽エフェドリンなどの刺激剤；ヒドロキシジオンおよびプロポフォールなどの麻酔薬；アセブトロール、アルブテロール、アルプレノロール、アテノロール、ベタゾロール、ブシンドロール、カルテロロール、セリプロロール、セタモロール、ラベタロール、レボブネロール、メトプロロール、メチプラノロール、ナドロール、オキシプレノロール、ピンドロール、プロパノロール、およびチモロールなどのβ-受容体遮断薬；アドレナリン、メタラミノール、ミドドリン、ノルフェネフリン、オクタパミン、オキセドリン（oxedrin）、オキシロフリン（oxilofrin）、オキシメタゾリン、およびフェニレフリンなどのα-交感神経興奮剤；バメタン、クレンブテロール、フェノテロール、ヘキソプレナリン、イソプレナリン、イソクスプリン、オルシプレナリン、レプロテロール、サルブタモール、およびテルブタリンなどのβ-交感神経興奮剤；カルブテロール、ジフィリン、エトフィリン（etophyllin）、フェノテロール、ピルブテロール、リミテロール、およびテルブタリンなどの気管支拡張薬；ジギトキシン、ドブタミン、エチレフリン、およびプレナルテロールなどの強心薬；アムホテリシンB、クロルフェネシン、ナイスタチン、およびペリマイシンなどの抗真菌薬；アセノクマロール、ジクマロール、フェンプロクーモン、およびワーファリンなどの抗凝固薬；バメタン、ジピリマドール、ジプロフィリン、イソクスプリン、ビンカミン、およびキサンチノールニコチナートなどの血管拡張薬；コンパクチン、エプタスタチン（eptastatin）、メビノリン、およびシンバスタチンなどの抗低コレステロール血症薬；ブロムペリドール（抗精神病薬）、ジトラノール（乾癬）、エルゴタミン（偏頭痛）、イベルメクチン（抗蟯虫薬）、メトロニダゾールおよびセクニザドール（抗原虫薬）、ナンドロロン（タンパク同化薬）、プロパフェノンおよびキナジン（抗不整脈薬）、クエチアピン（CNS）、セロトニン（神経伝達物質）、およびシリビン（肝障害）などその他種々の薬物。
ホスホン酸部分を含む代表的な薬物には、以下が含まれる：アデフォビル（adefovir）、アレンドロネート、（N6-[2-メチルチオ）エチル]-2-[3,3,3-トリフルオロプロピルチオ]-5'-アデニル酸、BMS-187745（Bristol-Mayers Squibb Inc.のスクアレンシンターゼ阻害剤）、セロナプリル、CGP-24592（Novartis, Inc.）、DL-(E)-2-アミノ-4-メチル-5-ホスホノ-3-ペンテノン酸；4-メチル-APPA、CGP-39551（（DL-[E]-2-アミノ-4-メチル-5-ホスホノ-3-ペンテノン酸）のエチルエステル）、CGP-40116（Novartis, Inc.による競合的NMDAアンタゴニスト）、シドフォビル、クロドロネート、EB-1053（1-ヒドロキシ-3-(1-ピロリジニル)プロピリデン-1,1-ビスホスホネート）、エチドロネート、ファナパネル（fanapanel）、フォスカルネット、ホスホマイシン、フォシノプリル、フォシノプリラート（fosinoprilat）、イバンドロネート、ミダフォテル、ネリドロネート、オルパドロネート、パミドロネート、レシドロネート（residronate）、テノフォビル、チルドロネート、[2-(8,9-ジオキソ-2,6-ジアザビシクロ[5.2.0]ノン-1(7)-エン-2-イル)エチル]ホスホン酸、1-ヒドロキシ-2-(イミダゾ[1,2-a]ピリジン-3-イル)エチリデン]-ビスホスホン酸、およびゾレンドロネート。
リン酸部分を含む代表的な薬物には、以下が含まれる：ブクラデシン、コリンアルフォセレート（alfoscerate）、シトコリン（citocoline）、リン酸フルダラビン、ホソパミン（fosopamine）、GP-668、ペリホシン（perifosine）、リン酸トリシリビン（triciribine）、および、活性にためにはリン酸化が必要であるヌクレオシド類似体のリン酸誘導体、例えばラミブジン、アシクロビル、アジドチミジン、E-5-(2-ブロモビニル)-2'-デオキシウリジン、ジデオキシシトシン、ジデオキシイノシン、FMAU（1-(2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル)チミン）、デオキシ-5-フルオロ-3'-チアシチジン、ガンシクロビル、ゲンシタビン、(R)-9-[4-ヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)ブチル]グアニン、ラミブジン、ペンシクロビルなど。
腸吸収が可能かつ徐放性製剤への取り込みが可能なプロドラッグへと修飾するのに好ましい薬物には、下記の化合物が含まれる：アセトアミノフェン、ブプレノルフィン、ジクロフェナク、ジフルニサール、フェノプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メフェナム酸、メプタジノール、モルヒネ、オキシコドン、ペンタゾシン、ペチジン、トルメチン、およびトラマドールからなる群より選択される鎮痛剤および/または抗炎症剤；カプトプリル、ジルチアゼム、メチルドーパ、メトプロロール、プラゾシン、プロプラノロール、キナプリル、ソタロール、およびチモロールからなる群より選択される抗高血圧剤；アモキシシリン、アンピシリン、アズトレオナム、セファクロル、セファドロキシル、セフィキシム、セフォタキシム、セフォキシチン、セフポドキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファレキシン、シプロフラキサシン、クリンダマイシン、エリスロマイシン、イミペネム、マンドール、メロペネム、メトロニダゾール、およびトブラマイシンからなる群より選択される抗生物質；アシクロビル、デラビルジン、ジダノシン、フォスカルネット、ガンシクロビル、インジナビル、ラミブジン、ネルフィナビル、ペンシクロビル、リトナビル、サキナビル、スタブジン、ザルシタビン、およびジドブジンからなる群より選択される抗ウイルス剤；サルブタモールおよびテルブタリンからなる群より選択される気管支拡張剤および/または抗喘息剤；メキシレチン、プロカインアミド、およびトカイニドからなる群より選択される抗不整脈剤；バクロフェン、ベンセラジド、ブプロピオン、カルビドーパ、ガバペンチン、レボドパ、メチルフェニデート、プラミペキソール、プレガバリン、クエチアピン、ロピニロール、およびビガバトリンからなる群より選択される中枢に作用する物質；シタラビン、デシタビン、ドセタキサル（docetaxal）、フルタミド、ゲンシタビン、パクリタキセル、およびペントスタチンからなる群より選択される細胞増殖抑止剤および転移阻害剤；ならびに、シサプリド、メトクロプラミド、およびミソプロストロールからなる群より選択される消化管疾患の治療剤。
6.薬学的組成物および治療法
それ自体がPEPT2の基質であるか、または、PEPT2の基質である接合体部分に連結している薬剤を、薬学的組成物に取り込むことができる。通常、必ずとは限らないが、このような薬学的組成物は経口投与用に設計されている。このような組成物の経口投与により、PEPT2を介して腸を通じて取り込まれ、全身循環系へと進入する。従って、薬学的組成物を、生体中の様々な組織に効率的に送達できる。PEPT2に対する組成物の特異性によって、組成物は、高レベルでPEPT2を発現している脳（脈絡叢を含む）および腎臓に取り込まれ易くなる。しかし、本方法はまた、PEPT2が有意な程度に発現されている脳、腎臓、肺、および脾臓の疾患を有さない患者における様々な疾病の治療にも有用である。このような方法において、腎臓におけるPEPT2の発現により、薬学的組成物の全身循環系への再吸収が増加し、これによりその半減期は増加して、よって必要な投与量が減少する。いくつかの方法において、薬剤または接合体部分は、PEPT2およびPEPT1の両方の基質である。いくつかの方法において、薬剤または接合体部分はPEPT2の基質であって、PEPT1の基質ではない、または不十分な基質である。
接合体部分に任意に連結した薬剤を、動物またはヒトへの投与用の薬学的組成物の製剤化に一般的に使用されるビヒクルとして定義されている希釈剤の薬学的に許容された無毒性担体と併用する。希釈剤は、組合せの生物活性に有害作用を与えないように選択される。このような希釈剤の例は蒸留水、緩衝水、生理的食塩水、PBS、リンガー液、デキストロース溶液、およびハンク液である。さらに、薬学的組成物または製剤は、他の担体、補助剤、または非治療的かつ非免疫原性の無毒性安定剤、賦形剤などを含めることもできる。組成物はまた、生理的条件に近づけるための物質、例えばpH調整剤および緩衝剤、毒性調節剤、湿潤化剤、界面活性化剤などを含むことができる（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mace Publishing Company、PA州フィラデルフィア所在、第17版、（1985）を参照されたい；薬物送達法の概説については、Langer、Science 249:1527-1533(1990)を参照されたい；各々の全文が参照として組み入れられる）。
経口投与用の薬学的組成物は、例えば、錠剤、丸剤、散剤、ロゼンジ（lozenge）、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳濁剤、液剤、またはシロップ剤の形状であり得る。適切な賦形剤のいくつかの例には、乳糖、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トランガカントゴム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロースが含まれる。メチルヒドロキシベンゾエートおよびプロピルヒドロキシベンゾエートなどの保存剤；甘味剤；および芳香剤も含めることができる。製剤に応じて、組成物は、患者への投与後に活性成分を迅速に、持続的に、または遅延して放出できる。本発明の錠剤または丸剤はコーティングしてもよく、またはさもなくば調合して持続的作用という利点をもたらす様な剤形としてもよい。例えば、錠剤または丸剤は、内部投与量および外部投与成分を含むことができ、後者は前者表面の被膜の形状である。2つの成分は、胃における崩壊に耐え、かつ内部成分が十二指腸へと無傷で移行できる、または放出を遅延できるような、作用する腸溶層により分離されうる。様々な材料を、このような腸溶層またはコーティングに使用でき、このような材料には多くのポリマー酸ならびに、ポリマー酸と、シェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースなどの材料との混合物が含まれる。
錠剤などの固形組成物を調製するために、基本活性成分を、薬学的賦形剤と混合して、本発明の化合物の均一混合物を含む固体の製剤化前組成物を形成する。これらの製剤化前組成物を均一と称する場合には、組成物が錠剤、丸剤、およびカプセル剤などの等しく有効な単位剤形に容易に亜分割され得るように、活性成分が組成物全体に均一に分散されていることを意味する。その後、この前製剤固体を、例えば0.1mg〜約2gの活性薬剤を含む、前記した種類の単位剤形へと亜分割する。
組成物を、予防的および/または治療的処置のために投与できる。治療量は、疾病状態もしくは症状を軽減するか、またはさもなくば疾病または任意の他の望ましくない症状の進行を任意の方式で予防、妨害、遅延、または回復させるのに十分な量である。予防的適用では、組成物を、特定の疾病または感染に罹患し易い患者またはさもなくばそのリスクを有する患者に投与する。従って、「予防的に有効な量」とは、疾病状態またはその症状を予防、妨害、または遅延させるのに十分な量である。いずれの場合でも、組成物中に含まれる化合物の正確な量は、患者の健康状態および体重に依存する。
薬学的組成物の適切な投与量は、いくつかの十分確立されたプロトコルのいずれかに従って容易に決定される。例えば、動物試験（例えばマウス、ラット）を一般に使用して、体重1kgあたりの生物活性薬剤の最大耐量を決定する。一般に、試験する動物種の少なくとも1種は哺乳動物である。動物試験の結果に基づいて、例えばヒトなどの別の種に使用する用量を決定できる。
薬学的組成物は、様々な異なる方法で投与できる。例として、薬学的に許容される担体を含む組成物を、経口、鼻腔内、直腸、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、真皮下、経皮、くも膜下腔内、および頭蓋内方法を介して投与する段階が含まれる。投与経路は一部、活性化合物の化学的組成および任意の担体に依存する。
薬学的組成物の成分は、好ましくは高純度であり、かつ潜在的に有害な混入物質を実質的に含まない（例えば、少なくとも食品局（National Food、NF）等級、一般的には少なくとも分析等級、より典型的には少なくとも製薬等級）。所与の化合物を使用前に合成する限り、得られる産物は典型的には、任意の潜在的毒性物質、特に、合成過程または精製過程中に存在し得る任意の内毒素を実質的に含まれない。非経口投与用の組成物も無菌であり、実質的に等張であり、GMP条件の下で製造されている。経口投与用の組成物は、無菌または実質的に等張である必要はないが、通常GMP条件下で製造される。
実施例
1.輸送体発現のPCR解析
ヒトPEPT1（GenBankを使用して2セット）またはPEPT2（GenBankを使用して2セット）中の特定の配列を増幅するために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。正プライマー配列および逆プライマー配列は、以下であった
（3'UTRの147塩基対を増幅するPEPT1#1
Figure 0004342934
（配列番号：1）および
Figure 0004342934
（配列番号：2）；終止コドンを横切り197塩基対を増幅するPEPT1#2
Figure 0004342934
（配列番号：3）および
Figure 0004342934
（配列番号：4）；PEPT2オープンリーディングフレーム中の533塩基対を増幅するPEPT2#1
Figure 0004342934
（配列番号：5）および
Figure 0004342934
（配列番号：6）；PEPT2オープンリーディングフレーム中の最後の376塩基対を増幅するPEPT2#2
Figure 0004342934
（配列番号：7）および
Figure 0004342934
（配列番号：8））。全てのプライマーのアニーリング温度が55℃を超えており、特異性を確認するために生成物をシークエンシングした。
輸送体発現は、リアルタイムPCR（Cepheid Smartcycler PCR装置およびパーキンエルマーSYBR-緑色試薬；全てのプロトコルは製造業者の説明書による）を使用したPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）の増幅により定量した。一本鎖cDNAを、ヒトmRNA（Clontech、BioChain、およびStratageneから購入）または分化Caco-2細胞（キアゲンRNA精製カラム）から、Thermoscript（Stratagene）逆転写キットを使用して調製した。前記に列挙したプライマーセットを使用してリアルタイムPCRを実施し、ヒトPEPT1またはPEPT2の断片を増幅した。さらに、全mRNA存在量を、各組織におけるβ-アクチンレベルの測定により標準化した（Clontechプライマーセット）。PEPT1またはPEPT2の閾値サイクルを決定して、既知のプラスミドコピー数の増幅から得られた較正因子を使用して転写数を計算することにより、転写物存在量を測定した。異なる組織を比較するために、全データを、β-アクチン転写レベルの分数として表現する。
表1は、同じ組織におけるβアクチンmRNAの発現レベルの比率として表現されたPEPT1およびPEPT2のmRNAの発現レベルを示す。ヒト空腸、回腸、回盲部、および盲腸でPEPT2の実質的な発現が得られ、他のいくつかの腸組織で検出可能な発現が得られることがわかる。ラット十二指腸、空腸および回腸、ならびに結腸における発現レベルは殆ど検出不可能であった。
（表１）種々の組織および細胞系におけるPEPT1およびPEPT2の発現
Figure 0004342934
GB# = GenBankアクセッション番号
Sto = 胃
Eso = 食道
Duo = 十二指腸
Jej = 空腸
Ile = 回腸
Il-Ce = 回腸−盲腸弁
Cec = 盲腸
Acol = 上行結腸
Tcol = 全結腸
Dcol = 下行結腸
Hea = 心臓
Bra = 脳
Lun = 肺
SMus = 平滑筋
Kid = 腎臓
Pan = 膵臓
Liv = 肝臓
thy = 胸腺
spl = 脾臓
Leu = 白血球
Pla = 血小板
Pros = 前立腺
test = 精巣
Ova = 卵巣
2.PEPT1およびPEPT2の機能的解析
完全なオープンリーディングフレームを、アフリカツメガエル卵母細胞発現プラスミドにクローニングして直線化し、cRNAを、T7ポリメラーゼを使用した流出転写により作製した。アフリカツメガエル卵母細胞を調製し、前記（Collinsら、1997）されているように維持し、10ng〜30ngのRNAを注入した。輸送電流を、2電極電圧固定（Axon Instruments社）を使用して注入の2日〜4日後に測定した。全実験は、修飾した卵母細胞リンガー液（90mM NaCl、2mM KCl、1.8mM CaCl2、1mM MgCl2、および10mM NaHEPES、pH6.8）を使用して実施した。卵母細胞の膜電位を-60mVに保持し、PowerLabソフトウェアを使用して電流の軌跡を得た。化合物に対する応答を、PEPT1およびPEPT2に対する特定の非輸送阻害剤（XP10973）の存在下および非存在下で測定した。データは、XP10973により遮断される電流として表現する。
CHOK1細胞の安定なクローンを、電気穿孔法、G418での選択、およびフロー活性化セルソーター（Cytomation）を用いた単一クローンへの選別により得た。PEPT1またはPEPT2を発現している安定なクローンは、放射標識したGly-Sarの取り込み増強により同定した。細胞取り込み試験では、CHOK1クローンを、ポリリジンでコーティングした96ウェルのマイクロタイタープレートに接種し、2日〜3日間増殖した。細胞を、実験溶液（放射標識化合物と非標識化合物の組合せ）と共に30分間インキュベートし、4回洗浄し、シンチレーション溶液中または水中のいずれかで溶解した。非標識化合物の取り込みは、LC/MS/MSにより定量した。
表2は、対照Gly-SarのVmaxと比較した、PEPT1またはPEPT2をトランスフェクトした卵母細胞における数個の市販化合物のVmaxを示す。表はまた、阻害剤XP10973の存在下におけるVmaxを示す。
Figure 0004342934
XP10973は、PEPT1およびPEPT2の両方の特異的阻害剤である。セフラジン、セファドロキシル、セファクロル、およびアモキサシリンは、PEPT1でトランスフェクトした細胞のGly-Sarに比べると比較的弱い基質であることと考えられる。しかし、これらの化合物のVmaxは、PEPT2でトランスフェクトした細胞のGly-Sarと同等またはそれよりも高く、これは、この化合物がPEPT2の比較的良好な基質であることを示す。この結論は、XP10973阻害剤の存在下でのデータにより強調される。XP10973がPEPT1およびPEPT2トランスフェクト細胞の両方における輸送を阻害するという結果により、このような細胞における輸送は、それぞれPEPT1輸送体およびPEPT2輸送体に、少なくとも一部起因することが示される。PEPT1に対する基質の大半における阻害の程度がPEPT2に比べて少ないことから、非特異的輸送機構により、PEPT1でトランスフェクトした細胞において相対的寄与がより有意になった。セファドロキシルを除き、XP1097による処理により、PEPT2でトランスフェクトした卵母細胞に比べて、PEPT1でトランスフェクトした卵母細胞のVmaxの減少率がより低くなる。端的に言えば、本実験により、セファクロル、セファドロキシル、およびセフラジンは、PEPT1よりも、PEPT2に対してより良好な基質であることが示される。市販の化合物は経口的に利用可能であることが知られているので、PEPT2など別の輸送体による機構を介して取り込まれると考えられる。
（表２）
Figure 0004342934
3.Caco-2分化細胞における取り込みの解析
Caco-2細胞を、ミリポアトランスウェルフィルターに播種し、18日〜22日間分化させた。単層の完全性は、単層を横切る放射標識イヌリン輸送の消失により確認した。化合物を頂端チャンバーに加え、側底チャンバーにおける化合物の様子を、シンチレーション計測またはLC/MS/MSにより種々の時点において測定した。
図1および図2は、XP10973阻害剤の存在下および非存在下におけるCaco-2細胞によるセフラジンおよびセファドロキシルの取り込みを示す。表1に示したように、Caco-2細胞は、PEPT1輸送体およびPEPT2輸送体の両方を発現する。しかし、前記したように、セフラジンおよびセファドロキシルは、PEPT1の不十分な基質であり、PEPT2の良好な基質である。図は、セフラジンおよびセファドロキシルの両方が、Caco-2細胞により取り込まれること、およびその取り込みがXP10973により阻害されることを示す。これらの結果から、セフラジンおよびセファドロキシルは、PEPT2輸送体を介して取り込まれることが推測できる。
4.PEPT2特異的基質を探索するためのライブラリの調製手順
21個の50mlアルテック（Alltech）チューブに、ポリスチレン-クロロトリチルクロリド樹脂（各5g）、ジクロロメタン（25mL）、ならびに3当量のFmoc-アミノ酸（構造については図3を参照されたい）、および6当量のジエチルイソプロピルアミンを加える。反応液を室温で30分間振とうする。樹脂を流し、メタノール（2回）、ジクロロメタン（3回）、およびN,N-ジメチルホルムアミド（3回）で洗浄する。その後、樹脂を20％ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液で1時間処理する。樹脂を流し、メタノール（2回）、ジクロロメタン（3回）、およびN,N-ジメチルホルムアミド（3回）で洗浄する。各樹脂を4つの25mlアルテックチューブに分割し、N,N-ジメチルホルムアミド（10mL）を加えた。各4つの異なるチューブに、5当量のBoc-Allocアミノ酸（図4）、5当量のHATU、および10当量のジエチルイソプロピルアミンの混合物を含む10mLのN,N-ジメチルホルムアミド溶液を加えた。反応液を周囲温度で20時間振とうする。樹脂を流し、メタノール（2回）、ジクロロメタン（3回）、およびN,N-ジメチルホルムアミド（3回）で洗浄する。各樹脂を、0.1当量のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）を含むN,N-ジメチルホルムアミド（10mL）溶液で20時間処理し、allocを脱保護する。樹脂を流し、メタノール（2回）、ジクロロメタン（3回）、およびN,N-ジメチルホルムアミド（3回）で洗浄する。各樹脂を、12個の4mLアルテックチューブに分割し、ジクロロメタン（1mL）を加えた。各12個の別々のチューブに、5当量のカルボン酸（図5）、5当量のHATU、および10当量のジエチルイソプロピルアミンの混合物を含む1mLのN,N-ジメチルホルムアミド溶液を加える。反応液を周囲温度で20時間振とうする。樹脂を流し、メタノール（2回）、ジクロロメタン（3回）、N,N-ジメチルホルムアミド（3回）、およびジクロロメタン（3回）で洗浄する。得られた1008個のチューブを、90％トリフルオロ酢酸を含むジクロロメタン（0.5mL）溶液で3時間処理し、チューブを12個の2mL深型96ウェルプレートに流す。溶媒を減圧下でGeneVacを使用して除去する。得られた残渣をDMSOに溶解させてほぼ100mMの濃度とし、生物学的アッセイに供して、PEPT2を介した輸送容量について試験した（例えば、前述のようなPEPT2でトランスフェクトした卵母細胞を使用して）。
5.PEPT2特異的基質を探索するためのライブラリの調製手順
4個の250mLのペプチド容器に、ポリスチレン-クロロトリチルクロリド樹脂（各20g）、ジクロロメタン125mL、ならびに3当量のFmoc-alloc-アミノ酸（構造については図6を参照されたい）、および6当量のジエチルイソプロピルアミンを加える。反応液を周囲温度で30分間振とうする。樹脂を流し、メタノール（2回）、ジクロロメタン（3回）、およびN,N-ジメチルホルムアミド（3回）で洗浄する。その後、樹脂を20％ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液で1時間処理する。樹脂を流し、メタノール（2回）、ジクロロメタン（3回）、およびN,N-ジメチルホルムアミド（3回）で洗浄する。各樹脂を21個の25mLアルテックチューブに分割し、N,N-ジメチルホルムアミド（10mL）を加える。4つの別々のチューブそれぞれに、5当量のBoc-アミノ酸（図7）、5当量のHATU、および10当量のジエチルイソプロピルアミンの混合物を含む10mLのN,N-ジメチルホルムアミド溶液を加える。反応液を周囲温度で20時間振とうする。樹脂を流し、メタノール（2回）、ジクロロメタン（3回）、およびN,N-ジメチルホルムアミド（3回）で洗浄する。各樹脂を、0.1当量のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）を含むN,N-ジメチルホルムアミド（10mL）溶液で20時間処理し、alloc脱保護を行なう。樹脂を流し、メタノール（2回）、ジクロロメタン（3回）、およびN,N-ジメチルホルムアミド（3回）で洗浄する。各樹脂を12個の4mLアルテックチューブに分割し、ジクロロメタン（1mL）を加えた。12個の別々のチューブそれぞれに、5当量のカルボン酸（図5）、5当量のHATU、および10当量のジエチルイソプロピルアミンの混合物を含む1mLのN,N-ジメチルホルムアミド溶液を加える。反応液を周囲温度で20時間振とうする。樹脂を流し、メタノール（2回）、ジクロロメタン（3回）、N,N-ジメチルホルムアミド（3回）、およびジクロロメタン（3回）で洗浄する。得られた1008個のチューブを90％トリフルオロ酢酸を含むジクロロメタン（0.5ml）溶液で3時間処理し、チューブを11個の2mL深型96ウェルプレートに流した。溶媒を減圧下でGeneVacを使用して除去する。得られた残渣をDMSOに溶解させてほぼ100mMの濃度とし、生物学的アッセイに供して、PEPT2を介した輸送容量について試験した（例えば、前述のようなPEPT2でトランスフェクトした卵母細胞を使用して）。
Caco-2細胞によるセフラジンの取り込みを示す。 Caco-2細胞によるセファドロキシルの取り込みを示す。 Fmoc-アミノ酸を示す。 Boc-Allocアミノ酸を示す。 カルボン酸を示す。 Fmoc-alloc-アミノ酸を示す。 Boc-アミノ酸を示す。

Claims (5)

  1. ヒト腸組織におけるヒトＰＥＰＴ２輸送体を介した輸送について薬剤、接合体、または接合体部分をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
    ヒトＰＥＰＴ２輸送体を発現する細胞を提供する段階；
    細胞を薬剤、接合体、または接合体部分と接触させる段階；ならびに
    薬剤、接合体、または接合体部分が、輸送体によって細胞中に入るかどうか、および／または細胞を透過するかどうかを判定する段階。
  2. 細胞を、ヒトＰＥＰＴ２輸送体をコードするＤＮＡでトランスフェクトする、請求項１記載の方法。
  3. 細胞が、検出可能なヒトＰＥＰＴ１輸送体を全く有さない、請求項１記載の方法。
  4. ヒトＰＥＰＴ１輸送体を発現しかつヒトＰＥＰＴ２輸送体を欠失している第二細胞を提供する段階；
    細胞を、薬剤、接合体、または接合体部分と接触させる段階；および
    薬剤、接合体、または接合体部分がＰＥＰＴ１輸送体によって細胞中に入るかどうか、および／または細胞を透過するかどうかを判定する段階
    をさらに含む、請求項１記載の方法。
  5. 薬剤、接合体、または接合体部分が、ヒトＰＥＰＴ１輸送体ではなくヒトＰＥＰＴ２輸送体によって輸送される、請求項１記載の方法。
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