CZ302510B6

CZ302510B6 - Efektivní zpusob biotinylace sloucenin s karboxylovou skupinou pomocí syntézy na pevné fázi pro potreby afinitní chromatografie

Info

Publication number: CZ302510B6
Application number: CZ20100230A
Authority: CZ
Inventors: Soural@Miroslav; Hlavác@Jan; Hradil@Pavel
Original assignee: Univerzita Palackého v Olomouci
Priority date: 2010-03-29
Filing date: 2010-03-29
Publication date: 2011-06-22
Also published as: CZ2010230A3

Abstract

Imobilizované deriváty biotinu obecného vzorce 7, kde n predstavuje pocet ethylenoxy jednotek a nabývá hodnot 1 až 5 a symbol Pol predstavuje polystyrenovou pryskyrici tvorenou kopolymerem styrenu a divinylbenzenu, zpusob jejich prípravy a jejich použití pro efektivní derivatizaci sloucenin obsahujících ve své strukture karboxylovou skupinu pro potreby afinitní chromatografie, cehož se využívá zejména ve farmaceutickém výzkumu pri urcování molekulárního cíle biologicky aktivních látek.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká přípravy a použití imobilizováných derivátů biotinu s různě dlouhými řetězci polyethylenglykolů s využitím principu syntézy na pevné fázi. Popsaný koncept syntézy na pevné fázi umožňuje efektivní přípravu daných derivátů ajejich následné použití pro jednoduchou deri10 vatizaci sloučenin obsahujících ve své struktuře karboxylovou skupinu. Takto deri váti zo vane látky mohou být po odštěpení z pevné fáze použity pro zachycení na stacionární fázi pokryté avidinem. Komplex vzniklý specifickou vazbou avidin-biotín případně streptavidm biotin je pak metodou afinitní chromatografíe využíván především ve farmaceutickém výzkumu pri identifikaci molekulárních cílů potenciálních léčiv.

Dosavadní stav techniky

Derivatizace biologicky aktivních sloučenin molekulou biotinu je známý prostředek pro jejich

2o studium za účelem identifikace enzymů s kterými dané sloučeniny interagují, což výrazně přispívá ke zjištění mechanismu účinku těchto látek v buněčném systému. Biotinylované deriváty lze snadno imobilizovat metodou nekovalentní biospecifické interakce na chromatografíeké koloně vybavené stacionární fází pokrytou avidinem/streptavidinem. Pri následném použití mobilní fáze obsahující buněčný lyzát dochází k zachycení cílových enzymů na koloně, jejich následné elucí a identifikaci. Tento druh separační metody se nazývá afinitní chromatografíe a patří mezi nej frekventovanější metody studia molekulárních cílů nových typů biologicky aktivních sloučenin (tj. potenciálních léčiv).

Za nejvhodnější typ derivátů biotinu používaných pro modifikaci látek za účelem jejich studia .io afinitní chromatografií jsou považovány deriváty obecného struktury 1, kde lineární řetězec (tzv. raménko) sestávající se z různého počtu ethylenoxy jednotek je na jednom konci derivatizován biotinem, přičemž druhý konec řetězce je zakončen vhodnou funkční skupinou umožňující derivatizací příslušné látky. Vhodný počet ethylenoxy jednotek (tj. délka raménka) není přesně definován, neboť se jedná o proměnlivou veličinu závislou na způsobu interakce mezi studovali 5 nou látkou a cílovým enzymem.

X - NH, O

Y - COOH, ΝΗ_χ OH, OSO₃Me, OSO₃Ph...

(O

Pro derivatizaci látek obsahujících ve své struktuře karboxylovou skupinu jsou v literatuře nej40 častěji popisovány deriváty typu 1 (nebo jejich analoga s alternativní strukturou raménka) obsahující terminální primární aminoskupinu. Níže jsou uvedeny některé příklady takových derivátů.

V literatuře je hojně popsána příprava a použití derivátů 2 pomocí syntézy v roztoku. Některé z těchto derivátů jsou i komerčně dostupné.

- 1 C7. 30251« B6

Znázorněný typ raménka (tj. pouze na bázi uhlíkatého skeletu) však není považován pro účely afínitní chromatografie za zcela vhodný z důvodů jeho efektivního zkrácení způsobeného hydro5 fobnímí interakcemi methylenových skupin a nebude mu proto zde věnována další pozornost. Uvedeny budou pouze některé konkrétní příklady derivátů s raménkem na bázi ethylenoxidy jednotek nebo deriváty s raménky podobné struktury, která jsou prostá hydrofobních interakcí a jsou obecně považována z pohledu struktury za optimální.

κι V literatuře je popsána příprava derivátu 3 s dvěma ethylenoxy jednotkami. Sloučenina je připravována pomocí syntézy v roztoku, a to biotinylací příslušného mono Boc chráněného diaminu s výtěžkem až 83 %. Derivát 3 byl následně použit pro derivatizaci a studium různých typů látek pomocí afínitní chromatografie (Zhong, Chun-Long; Yao, Zhu-Jun, Huaxue Xuebao 2008, 66(9), 1074 až 1078; Sekine, Mitsuo; Okada, Kazuhisa; Seio, Kohji; Obata, Tohru; Sasaki, Taku15 ma; Kakeya, Hideaki; Osada, Horoyuki, Bioorganic Medicinal Chemistry 2004, 12(24), 6343 až 6349).

(3)

2o Popsána je rovněž příprava derivátu 4 s třemi ethylenoxy jednotkami připraveného biotinylací 2[2-[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]ethoxy]ethanaminu a následnou redukcí terminálního azidu trífenylfosfinem. Syntéza je opět prováděna v roztoku (Fusz, Stefan; Srivatsan, Seergazhi G.; Ackermann, Damian; Famulok, Michael, Journal of Organic Chemistry 2008, 73(13), 5069 až 5077).

(4)

Dále je popsána příprava a použití derivátu 5 s raménkem v kombinaci ethylenoxy a propylenoxy jednotek. Daný derivát je připravován biotinylací odpovídajícího diaminu v roztoku s výtěžkem pouhých 22 % (Zhang, Zhídong; Edwards, Patrick, J.; Roeske, Roger W., Guo, Lili, Bioconjugate Chemistry 2005, 16(2), 458 až 464).

Podobný derivát 6 s kombinací ethylenoxy a propylenoxy jednotek byl rovněž připraven syntézou v roztoku a použit ke studiu derivátů nitroltrioctové kyseliny (Huang, Zhaohua; Park, s Joshua I.; Watson, Douglas S.; Hwang, Peter; Szoka, Francis C., Jr., Bioconjugate Chemistry

2006, 17(6), 1592 až 1600).

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu jsou imobilizované deriváty biotinu obecného vzorce 7

kde n představuje počet ethylenoxy jednotek a nabývá hodnot 1 až 5 a symbol Pol představuje polystyrénovou pryskyřici tvořenou kopolymerem styrenu a divinylbenzenu.

Podstatou vynálezu je dále příprava daných derivátů pomocí syntézy na pevné fázi, přičemž tato syntéza zahrnuje následující kroky (viz Schéma 1):

• Imobilizaci 2-(2 arninoethoxyj- ethanolu pomocí reduktivní aminace na polymemí pryskyřici obsahující navázaný 4-oxy-2-methoxybenzaIdehyd za vzniku derivátu 8

- j CZ 302510 B6 • Derivatizaci imobilizovaného 2-(2-aminoethoxy)ethanolu fluorenylmethoxykarbonylovou protektivní skupinou za vzniku derivátu 9 • Aeylaci hydroxyskupiny v derivátu 9 hiotínem a následnou deprotekei aminoskupiny za vzniku derivátu 7a • Esterifíkaci hydroxyskupiny ve sloučenině 9 pomocí chloridu kyseliny methansu lionové, ptoluensulfonové nebo trifluormethansulfonanhydridem za vzniku sloučeniny 10 • Reakci esteru sulfonové kyseliny 10 s alkalickými solemi diethylenglykolu, triethylenglykolu nebo tetraethylenglykolu za vzniku sloučeniny I 1 • Derivatizaci sloučeniny 11 fluorenylmethoxykarbonylovou protektivní skupinou, následnou aeylaci hydroxyskupiny biotinem a deprotekei aminoskupiny za vzniku derivátu 7b-d

Pol

-OH

Pol

Pol (8) (9)

Fmoc ✓k í >^OH

Pol ''L^O

Pol o

(10)

NH ίΛ (12)

Schéma 1

Předmětem vynálezu je rovněž způsob použití derivátů 7a-d, kdy jsou tyto deriváty podrobeny reakci se sloučeninou obsahující karboxylovou skupinu za vzniku látek 12 a následně působením kyseliny trifluoroetové je odštěpen polymer za vzniku sloučenin 13 (viz Schéma 2).

Pol

HN·

R^O «

NH Η θ (12) (13)

Schéma 2

Syntéza na pevné fázi ve srovnání se syntézou v roztoku obecně poskytuje řadu výhod. Mezi největší výhody patří především jednoduché instrumentální vybavení a jednoduché experimentální provedení syntézy, dále snadná příprava malých množství látek (i pri mnohastupňových syntézách) a zejména velmi jednoduchá izolace produktů syntézy často bez nutnosti následného čištění. Zvláště poslední dvě jmenované výhody mají zásadní význam pro použití syntézy na pevné fázi pro účel popsaný ve vynálezu, neboť biotinylované látky pro studium afinitní chroma-4CZ 302510 B6 tografíí je často potřeba syntetizovat v omezeném množství, přičemž vlivem nepříznivých vlastností produktů může docházet ke značným ztrátám a obtížím při jejich izolaci, které se zvyšují při nutnosti jejich purifikace.

To, že biotinylační jednotka je imobilizovaná na pevné fázi, tedy přináší výhody především v jednoduché a rychlé přípravě, snadné manipulaci s připravenými systémy a jednoduché finální izolaci cílových produktů. Vzhledem ktomu, že pouze některé typy biotinylačních jednotek pro derivatizaci látek v roztoku jsou komerčně dostupné, a to většinou v malém množství za nepříznivou cenu, představuje popsaný vynález efektivní způsob alternativního řešení dané problematiky.

V nespolední řadě je výhodou popsané metodiky její variabilita. Volbou reaktantů lze měnit sterické parametry cílových derivátů, tj. délku raménka, která může při provedení afinitní chromatografie značným způsobem ovlivňovat kvalitu interakce mezi studovanou látkou a cílovým enzymem. Jednoduchým způsobem tedy lze připravit a kombinovat jednotlivé typy biotinylaě15 nich jednotek.

Popsaný koncept syntézy na pevné fázi, který přináší výše uvedené praktické výhody jak při vlastní přípravě, tak při použití derivátů 7, nebyl dosud v literatuře popsán.

Příklady provedení vynálezu

Podstata přípravy a použití derivátů podle vynálezu je blíže objasněna v následujících příkladech. Tyto příklady mají pouze ilustrativní charakter a v žádném případě neomezují rozsah vynálezu.

Postup přípravy derivátů 7:

Příklad 1

Příprava imobilizovaného derivátu 7a (n = 1)

300 mg Amínomethylové piyskyřice vybavené BAL linkerem (loading systému 0,63 mmol/g) bylo suspendováno v roztoku 10% kyseliny octové v suchém AfY-dimethylfonnamidu (DMF) (3 ml) obsahujícího 1 mmol 2-(2-aminoethoxy)ethanolu. Reakční směs byla třepána přes noc za teploty místnosti. Poté byl přidán 1 mmol tríacetoxyborohydridu sodného v roztoku 5% kyseliny octové v suchém DMF (1.5 ml). Reakční směs byla třepána 3 hodiny za teploty místnosti, poté promyta 3x DMF, následně třepána 10 min s roztokem 10% piperidinu v DMF (3 m), promyta 3x DMF a 3x dichlormethanem (DCM). Obdržená pryskyřice byla třepána v 0,2M roztoku fluorenylmethoxykarbonyl(hydroxysukcinimidu) (Fmoc-OSu) s ekvivalentem diisopropylethylaminu (DIEA) v DCM (3 ml) 2 hodiny za teploty místnosti a pak promyta 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v DMF (3 ml) obsahující 1 mmol 1-hydroxybenzotriazolu (BtOH),

1 mmol jV,?V'-diisopropylkarbodiimidu (DiC), 1 mmol biotinu a 1 mmol DIEA přes noc za teploty místnosti, poté byla pryskyřice promyta 3x DMF. Tento reakční krok byl následně zopakován za stejných podmínek. Obdržená pryskyřice byla suspendována v roztoku 10% piperidinu v DMF (3 ml), třepána 15 minut za teploty místnosti, promyta 3x DMF, 3x DCM, 3x MeOH a vysušena v proudu dusíku.

-5 CZ 302510 B6

Analýza produktu: 10 mg pryskyřice bylo třepáno v 0,5M roztoku Fmoc-OSu a DIEA v DCM (1 ml) 30 min za teploty místnosti, pak byla pryskyřice promyta 3x DCM a třepána v 50% roztoku kyseliny trifluoroctové (TFA) v DCM (0,5 ml). Poté byl vzorek odpařen dosucha v proudu dusíku a odparek analyzován pomocí 11PLC-IJV—MS, přičemž byl detekován produkt 7a jako odpovídající Fmoc-derivát, FSI-MS m/z = 554,6, [M+H]'; čistota 98 %.

Příklad 2

Příprava ímobtlizovaného derivátu 7b (n - 3)

Pol

300 mg Aminomethylové pryskyřice vybavené BAL linkerem (loading 0,63 mmol/g) bylo suspendováno v roztoku 10% kyseliny octové v suchém DMF (3 ml) obsahujícího l mmol 2-(2aminoethoxy)ethanolu. Reakční směs byla třepána přes noc za teploty místnosti. Poté byl přidán 1 mmol triacetoxyborohydridu sodného v roztoku 5% kyseliny octové v suchém DMF (1,5 ml). Reakční směs byla třepána 3 hodiny za teploty místnosti, poté promyta 3x DMF, následně třepána 10 min s roztokem 10% piperidinu v DMF (3 ml), promyta 3x DMF a 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla suspendována v 0,2M roztoku Fmoc-OSu s ekvivalentem DIEA v DCM (3 ml), třepána 2 hodiny za teploty místnosti a pak promyta 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0,2M roztoku methansulfonylchloridu v pyridinu (3 ml) dvě hodiny za teploty místnosti, pak promyta 3x DMF. Obdržená pryskyřice byla třepána v IM roztoku diethylenglykolátu lithného v dimethylsulfoxidu (DMSO) (3 ml) (roztok byl připraven smícháním ekvivalentu BuLÍ a diethylenglykolu za teploty místnosti), třepána přes noc za teploty místnosti, poté promyta 3x DMF, třepána 10 minut s 20% roztokem kyseliny octové v DMF, 10 minut s 20% roztokem piperidinu v DMF, promyta 3x DMF a 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0,2M roztoku Fmoc-OSu s ekvivalentem DIEA v DCM (3 ml) 2 hodiny za teploty místnosti a pak promyta 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v DMF (3 ml) obsahující 1 mmol BtOH, 1 mmol DIC, 1 mmol biotinu a 1 mmol DIEA přes noc za teploty místnosti, poté byla pryskyřice promyta 3x DMF. Tento reakční krok byl následně zopakován za stejných podmínek. Obdržená pryskyřice byla suspendována v roztoku 10% piperidinu v DMF (3 ml), třepána 15 minut za teploty místnosti, pak promyta 3x DMF, 3x DCM, 3x MeOH a vysušena v proudu dusíku.

Analýza produktu: 10 mg pryskyřice bylo třepáno v 0,5M roztoku Fmoc-OSu a DIEA v DCM (1 ml)30minza teploty místnosti, pak byla pryskyřice promyta 3x DCM a třepána v 50% roztoku TFA v DCM (0,5 ml). Poté byl vzorek odpařen dosucha v proudu dusíku a odparek analyzován pomocí HPLC-UV-MS, přičemž byl detekován produkt 7b jako odpovídající Fmoc-derivát, ESI-MS m/z - 642,7, [M+H]⁺; čistota 95 %.

Příklad 3

Příprava imobilizovaného derivátu 7c (n = 4)

Pol

NH

-6CZ 302510 B6

300 mg Aminomethylové pryskyřice vybavené BAL linkerem (loading 0,63 mmol/g) bylo suspendováno v roztoku 10% kyseliny octové v suchém DMF (3 ml) obsahujícího 1 mmol 2-(2aminoethoxy)ethanolu. Reakční směs byla třepána přes noc za teploty místnosti. Poté byl přidán I mmol triacetoxyborohydridu sodného v roztoku 5% kyseliny octové v suchém DMF (1,5 ml).

Reakční směs byla třepána 3 hodiny za teploty místnosti, poté promyta 3x DMF, následně třepána 10 min s roztokem 10% piperidinu v DMF (3 ml), promyta 3x DMF a 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla suspendována v 0,2M roztoku Fmoc-OSu s ekvivalentem DIEA v DCM (3 ml), třepána 2 hodiny za teploty místnosti a pak promyta 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0,2M roztoku methansulfonylchloridu v pyridinu (3 ml) dvě hodiny za teploty místnosti, pak promyta 3x DMF. Obdržená pryskyřice byla třepána v IM roztoku triethylenglýkolátu lithného v DMSO (3 mi) (roztok byl připraven smícháním ekvivalentu BuLi a triethylenglykolu za teploty místnosti), třepána přes noc za teploty místnosti, poté promyta 3x DMF, třepána 10 minut s 20% roztokem kyseliny octové v DMF, 10 minut s 20% roztokem piperidinu v DMF, promyta 3x DMF a 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0,2M roztoku Fmoc-OSu s ekvivalentem DIEA v DCM (3 ml) 2 hodiny za teploty místnosti a pak promyta 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v DMF (3 ml) obsahující 1 mmol BtOH, 1 mmol DIC, 1 mmol biotinu a 1 mmol DIEA přes noc za teploty místnosti, poté byla pryskyřice promyta 3x DMF. Tento reakční krok byl následně zopakován 2x za stejných podmínek. Obdržená pryskyřice byla suspendována v roztoku 10% piperidinu v DMF (3 ml), třepána 15 minut za teploty místnosti, pak promyta 3x DMF, 3x DCM, 3x MeOH a vysušena v proudu dusíku.

Analýza produktu: 10 mg pryskyřice bylo třepáno v 0,5M roztoku Fmoc-OSu a DIEA v DCM (1 ml) 30 min za teploty místnosti, pak byla pryskyřice promyta 3x DCM a třepána v 50% roztoku TFA v DCM (0,5 ml). Poté byl vzorek odpařen dosucha v proudu dusíku a odparek analyzován pomocí HPLC-UV-MS, přičemž byl detekován produkt 7c jako odpovídající Fmoc-derivát, ESI-MS m/z = 686,8, [M+Hf; čistota 95 %.

Příklad 4

Příprava imobilizovaného derivátu 7d (n = 5)

300 mg Aminomethylové pryskyřice vybavené BAL linkerem (loading 0,63 mmol/g) bylo suspendováno v roztoku 10% kyseliny octové v suchém DMF (3 ml) obsahujícího 1 mmol 2-(2aminoethoxy)ethanolu. Reakční směs byla třepána přes noc za teploty místnosti. Poté byl přidán mmol triacetoxyborohydridu sodného v roztoku 5% kyseliny octové v suchém DMF (1,5 ml).

Reakční směs byla třepána 3 hodiny za teploty místnosti, poté promyta 3x DMF, následně třepána 10 min s roztokem 10% piperidinu v DMF (3 ml), promyta 3x DMF a 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla suspendována v 0,2M roztoku Fmoc-OSu s ekvivalentem DIEA v DCM (3 ml), třepána 2 hodiny za teploty místnosti a pak promyta 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0,2M roztoku methansulfonylchloridu v pyridinu (3 ml) dvě hodiny za teploty místnosti, pak promyta 3x DMF. Obdržená pryskyřice byla suspendována v 2M roztoku tetraethylenglykolátu sodného v DMSO (3 ml) (roztok byl připraven smícháním ekvivalentu NaH a tetraethylenglykolu za teploty místnosti), třepána přes noc za teploty místnosti, poté promyta 3x DMF, třepána 10 minut s 20% roztokem kyseliny octové v DMF, 10 minut s 20% roztokem piperidinu v DMF, promyta 3x DMF a 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0,2M roztoku Fmoc-OSu s ekvivalentem DIEA v DCM (3 ml) 2 hodiny za teploty místnosti a pak promyta 3x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána vDMF (3ml) obsahující 1 mmol BtOH, 1 mmol DIC, 1 mmol biotinu a 1 mmol DIEA přes noc za teploty místnosti, poté byla pryskyřice promyta 3x

-7 CZ 302510 B6

DMF. Tento reakční krok byl následně zopakován za stejných podmínek. Obdržená pryskyřice byla suspendována v roztoku 10% piperidinu v DMF (3 ml), třepána 15 minul za teploty místnosti. pak promyta 3x DMF, 3x DCM, 3x MeOH a vysušena v proudu dusíku.

Analýza produktu: 10 mg pryskyřice bylo třepáno v 0,5M roztoku Fmoc-OSu a DIEA v DCM (I ml) 30 min za teploty místnosti, pak byla pryskyřice promyta 3x DCM a třepána v 50% roztoku TFA v DCM (0,5 ml). Poté byl vzorek odpařen dosucha v proudu dusíku a odparek analyzován pomocí HPLC-UV-MS, přičemž byl detekován produkt 7d jako odpovídající Fmoc-derivát, ES1-MS m/z - 730,8, [M+H]'; čistota 90 %.

Příklad 5

Postup použití derivátů 7;

Obecný postup derivatizace sloučenin s karboxylovou skupinou použitím imobilizovaných derivátů 7:

250 mg výchozí aminomethylové pryskyřice bylo podrobeno syntéze derivátů 7 dle výše uvedených postupů. Výsledná pryskyřice byla třepána s roztokem 0,5 mmol příslušné karboxylové kyseliny, 0,5 mmol BtOH a 0,5 mmol D1C ve směsi DMF a DCM (1:1,2,5 ml) přes noc za teploty místnosti. Obdržená pryskyřice byla promyta 3x DMF, 3x DCM a poté třepána v 50% roztoku TFA v DCM (2,5 ml). Poté byla pryskyřice odfiltrována, filtrát odpařen dosucha v proudu dusíku a odparek sonifikován v diethyletheru. Vysrážená pevná látka byla odsáta a promyta diethyletherem. V případě, že vzhledem k rozpustnosti látky nebylo možné produkt vysrážet diethyletherem, byl odparek rozpuštěn v chloroformu (5 ml) a protřepán s 5% roztokem hydrogenuhličitanu sodného (5 ml). Organická vrstva byla oddělena, vysušena síranem sodným a zahuštěna dosucha. V obou případech se výtěžky pohybují v rozmezí 70 až 90 % teorie.

Příklady použití

Studovaná karboxylová kyselina	Biotiny lační jednotka	Sloučenina 13 m/z ([M+H]) (HPLC-UV-MS)	Sloučenina 13 Čistota (%) (HPLC-UV-MS)
Fmoc-L-Ala	7a	625,7	95
Benzoová kyselina	7a	436,2	95
Nikotinová kyselina	7a	437,4	93
Propionová kyselina	7a	388,2	95
Fmoc-L-Ala	7b	713,8	92
Benzoová kyselina	7b	524,6	93
Nikotinová kyselina	7b	526,6	91
Propionová kyselina	7b	490,6	92
Fmoc-L-Ala	7c	757,8	93
Benzoová kyselina	7c	568,7	90
Nikotinová kyselina	7c	569,7	89

-8CZ 302510 B6

Propionová kyselina	7c	534,6	90
Fmoc-L-Ala	7d	801,8	88
Benzoová kyselina	7d	612,7	84
Nikotinová kyselina	7d	613,7	85
Propionová kyselina	7d	578,7	85

Struktura vybraných derivátů 13 byla potvrzena pomocí ^]H a ^l3C NMR spektrometrie.

Průmyslová využitelnost

Imobilizované deriváty obecného vzorce 7 jsou vhodné pro efektivní derivatizaci sloučenin obsahujících ve své struktuře karboxylovou skupinu a mohou tak sloužit k rutinní derivatizaci takových sloučenin a následnému studiu jejich vlastností pomocí afinitní chromatografie. To je využitelné zejména ve farmaceutickém výzkumu při určování molekulárního cíle biologicky aktivních látek.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Imobilizované deriváty biotinu obecného vzorce 7 kde n představuje počet ethylenoxy jednotek a nabývá hodnot 1 až 5 a symbol Pol představuje polystyrénovou pryskyřici tvořenou kopolymerem styrenu a divinylbenzenu.
2. Způsob přípravy derivátů podle nároku 1, vyznačující se tím, že sloučeniny vzorce 7a až 7d se připravují pomocí syntézy na pevné fázi, která zahrnuje následující kroky:

• Imobilizaci 2~(2-aminoethoxy)ethanolu pomocí reduktivní aminace na polystyrénovou pryskyřici obsahující navázaný 4-oxy-2~methoxybenzaldehyd za vzniku derivátu 8

-9CZ 302510 B6

Pol

I

-OH (8)

Derívatizaci ímobilízovaného 2-(2- atninocthoxy) ethanolu Huorenylmethoxykarbonylovou protektivní skupinou za vzniku derivátu 9 • Acylací hydroxyskupiny v derivátu 9 biotinem a následnou deprotekci aminoskupiny za vzniku derivátu 7a

Esterifikaci hydroxyskupiny ve sloučenině 9 pomocí chloridu kyseliny methansulfonové, p~ toluensulfonové nebo trifluormethansulfonanhydridem za vzniku sloučeniny 10 (10) • Reakci esteru sulfonové kyseliny 10 s alkalickými solemi diethylenglykolu, triethylenglykolu nebo tetraethylenglykolu za vzniku sloučeniny 11

H 3-5 (11)

Derívatizaci sloučeniny 11 fluorenylmethoxykarbonylovou protektivní skupinou, následnou acylací hydroxyskupiny biotinem a deprotekci aminoskupiny za vzniku derivátu 7b-d

- 10CZ 302510 B6

Z^NH (7b-d)
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se sloučeniny vzorce 7a až 7d podrobí reakci se sloučeninou obsahující karboxylovou skupinu za vzniku sloučeniny 12 a následně působením kyseliny trifluoroctové se odštěpí polymer za vzniku sloučenin 13.