CN111748089A - 一种生物素标记化合物以及确定化合物结合靶标蛋白的方法 - Google Patents

一种生物素标记化合物以及确定化合物结合靶标蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生物素标记化合物，以及利用生物素标记化合物确定化合物结合靶标蛋白的方法，可用于发现化合物结合靶标和化合物作用机制。尤其适用于研究在临床实践发现有疾病治疗效果或在药物表型筛选中发现有疾病相关表型调控作用的已知化合物的结合靶标和作用机制，为新药发现提供作用机理。

Description

一种生物素标记化合物以及确定化合物结合靶标蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种生物素标记化合物，以及利用生物素标记化合物确定化合物结合靶标蛋白的方法，可用于发现化合物结合靶标和化合物作用机制。尤其适用于研究在临床实践发现有疾病治疗效果或在药物表型筛选中发现有疾病相关表型调控作用的已知化合物的结合靶标和作用机制，为新药发现提供作用机理。
背景技术
药物发现有两条经典路径，一是通过表型筛选(Phenotypic screen)或动物实验找到有效的化合物，再进一步研究化合物的结合靶标和起效分子机制；二是伴随20世纪50年代现代分子生物学兴起建立的靶标筛选策略，即首选锁定疾病相关的分子靶标，再筛选与靶标有作用的化合物分子，最后验证在整体动物实验等是否有效。据相关统计，在全球first in class一类新药发现中，表型筛选策略成功率更高，但表型筛选的瓶颈是往往难以找到起效化合物的结合靶标、机理不明成为药物进一步优化的障碍。
寻找化合物结合靶标是制药研究领域持续关注的问题。目前相关技术手段涉及：蛋白组凝胶电泳、质谱分析、蛋白质组学研究、生物信息学手段，以及较为新近的向列蛋白组织沉淀技术(Nematic protein organization technique,NPOT)等。但上述方法均有一定局限，如蛋白组凝胶电泳的操作分析冗繁、检测灵敏度有限、生物信息学分析依赖于较为丰富的蛋白质结构数据库的构建，且预测结果与真实有差异等。
生物素标记化合物是从化学生物学角度发展起来的靶点研究技术，在功能蛋白质组学研究中十分有效。生物素对链霉亲和素有很强的亲和力，但是强亲和力也对靶标蛋白的洗脱带来困难。在小分子化合物中引入可断裂的连接基团，完成标记和富集后可切断连接，这样不仅使靶标充分洗脱，也避免了杂质蛋白的干扰。
发明内容
本发明首先提供了一种生物素标记化合物，它具有式I所示的通式：
Figure BDA0002426549820000011
其中，
X为分子量100～4000Da的工具化合物基团；
PEG1、PEG2分别独立为包含聚合度1～10的聚乙二醇基团的连接链。
进一步地，所述PEG1、PEG2中还包含接头基团，所述接头基团为亚氨基、羰基、亚烷基，PEG1、PEG2中接头基团的数量分别小于5。
更进一步地，所述PEG1为
Figure BDA0002426549820000021
所述PEG2为
Figure BDA0002426549820000022
在本发明的一些具体实施方案中，所述工具化合物基团为：
Figure BDA0002426549820000023
在本发明的一些具体实施方案中，式I所示的化合物具体为：
Figure BDA0002426549820000024
本发明还提供了一种利用式I的生物素标记化合物确定化合物结合蛋白靶标的方法，包括以下步骤：
a.使用反复冻融法温和裂解细胞获得细胞总蛋白；
b.在细胞裂解液中加入生物素标记化合物进行孵育；
c.加入链霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠进行孵育；
d.通过离心或磁体分离出靶标蛋白-生物素标记化合物-链霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠的复合物；
e.在特定波长下光照，使链霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠的部分被切除；
f.通过离心或磁体分离，得到上清液；
g.从上清液中确定潜在的靶标蛋白质。
进一步地，步骤a中反复冻融法为：将细胞悬于HBSS缓冲液中离心，弃上清，加入少量HBSS缓冲液将细胞重悬于离心管中，放置于液氮速冻，待样品完全冰冻后再放至冰上环缓慢融化，反复操作三次。
进一步地，步骤c中加入链霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠的量满足其可结合生物素的摩尔数大于反应体系中化合物总摩尔数的三倍。
进一步地，步骤d中分离前加入10倍体积的HBSS溶液，并重复3～5次离心或磁体分离，以除去未结合蛋白。
进一步地，步骤e中切除链霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠的条件为：用波长365nM的紫外光照射2-15小时。
进一步地，步骤g中使用蛋白组学的方法来确定潜在的靶标蛋白。
本发明中HBSS缓冲液是指Hank's平衡盐溶液。
本发明中生物素(Biotin)也称为D-生物素、维生素H等，化学名为5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酸或六氢-2-氧代-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-戊酸。
本发明利用光照切断生物素标记的化合物的连接链，直接将结合在磁珠、生物素上的无关蛋白伴随结合的磁珠一起沉淀实现最大程度排除干扰。
本发明方法可富集纯化化合物结合的未知靶标，再辅以下游质谱检测明确靶标性质。该方法通过可将大量无关背景蛋白洗脱，减少了信号噪音和数据分析的复杂程度，为快速发现起效化合物的结合靶标和药效学分子机制提供了一种相对操作简单、信号特异保真的方法。
本发明构建了包含特殊的光切断基团和特殊连接链的生物素标记化合物，适用于多种工具化合物，通过普通的链霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠即能捕获生物靶标。
本发明利用反复冻融法裂解细胞，细胞裂解后的生物靶标蛋白仍然能够维持原有性质，提高捕获到正确生物靶标的准确度。
本发明还提供了式I所示生物素标记化合物的特定光照断裂方法。本发明构建的生物素标记化合物在与生物靶标结合后，在本发明所述的光照断裂方法下断裂能够得到更高的生物靶标量，能够提高后续进一步确定生物靶标的准确度。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步地详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为利用本发明生物素标记化合物确定其结合靶标蛋白的方法示意图。
图2为本发明实施例5的SDS-PAGE图。其中泳道1：Hela细胞裂解液；泳道2：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠，剩余的细胞裂解液上清；泳道3：加入化合物24、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离0h后的上清；泳道4：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离0h后的上清；泳道5：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离1h后的上清；泳道6：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离2h后的上清；泳道7：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离15h后的上清；泳道8：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离20h后的上清；泳道9：加入化合物24、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离0h后的磁珠；泳道10：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离0h后的磁珠；泳道11：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离1h后的磁珠；泳道12：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离2h后的磁珠；泳道13：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离15h后的磁珠；泳道14：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离20h后的磁珠。
图3为本发明实施例5的免疫印迹图。泳道1：Hela细胞裂解液；泳道2：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠，剩余的细胞裂解液上清；泳道3：加入化合物24、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离0h后的上清；泳道4：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离0h后的上清；泳道5：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离1h后的上清；泳道6：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离2h后的上清；泳道7：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离15h后的上清；泳道8：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离20h后的上清；泳道9：加入化合物24、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离0h后的磁珠；泳道10：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离0h后的磁珠；泳道11：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离1h后的磁珠；泳道12：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离2h后的磁珠；泳道13：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离15h后的磁珠；泳道14：加入化合物B、磁珠孵育后，收集磁珠并重悬，紫外光照解离20h后的磁珠。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
本发明中AOP的结构为
Figure BDA0002426549820000051
Biotin-Linker的结构为
Figure BDA0002426549820000052
实施例1、本发明化合物A的合成
Figure BDA0002426549820000053
步骤1、化合物2的合成
在50mL反应瓶中将化合物1(283.00mg,1.00mmol)溶于6N HCl与乙酸乙酯的混合溶液(10mL),在室温下搅拌反应0.5小时，减压浓缩除去溶剂后得到化合物2(184.01mg,粗品)，C8H10NO2S,LCMS(ESI)[M+H]:184.03。
步骤2、化合物4的合成
100mL反应瓶中依次加入化合物2(184.01mg,粗品)，Fmoc-Osu(326.90mg,0.97mmol)，NaHCO3(336.00mg,4.00mmol)，THF(20mL)与H2O(10mL)，常温搅拌反应2小时后淬灭反应(LC-MS监测)，蒸干THF，饱和NaCl溶液(20mL)与乙酸乙酯(3×20mL)完成萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，柱层析分离，所用洗脱剂的体积比为石油醚/乙酸乙酯＝100:1～3:1，减压浓缩除去溶剂后得到化合物4(189.00mg,0.46mmol,92.6％产率)，C23H20NO4S,LCMS(ESI)[M+H]:406.10。
步骤3、化合物6的合成
在100mL固相多肽反应装置内加入经DCM(15mL)预处理的Resin-Cl(多肽固相合成树脂，500.00mg,0.46mmol)，化合物4(189.00mg,0.46mmol)，无水DMF(10mL)以及DIPEA(322.56mg,2.5mmol,442.00μL)。常温反应4小时，滤除液体，DMF(3×15mL)与DCM(3×15mL)交替清洗固体，DCM：MeOH：DIPEA(85:10:5)润洗固体完成封端，得化合物6(粗品)。
步骤4、化合物7的合成
在100mL固相多肽反应装置内加入化合物6(粗品)与20％哌啶-DMF溶液(20％,5mL)。常温反应20分钟，滤除液体，DMF(3×15mL)与DCM(3×15mL)交替清洗固体至哌啶含量为零，DMF(3×15mL)润洗固体，滤除溶液，保留固体，得化合物7(粗品)。
步骤5、化合物9的合成
在50mL烧杯中依次加入化合物8(152.00mg,0.46mmol)，DIPEA(119.97mg,0.93mmol,162.00μL)，HATU(177.51mg,0.46mmol)以及DMF(10mL)，0℃搅拌20分钟后，将该溶液泵入100mL固相多肽反应装置与化合物7混合，常温反应2小时，滤除液体，DMF(3×15mL)与DCM(3×15mL)交替清洗固体，至DIPEA含量为零，DCM(3×15mL)润洗固体，滤除溶液，保留固体，得化合物9(粗品)。
步骤6、化合物10的合成
在100mL固相多肽反应装置内加入化合物9(粗品)与20％哌啶-DMF溶液(20％,5mL)。常温反应20分钟，滤除液体，DMF(3×15mL)与DCM(3×15mL)交替清洗固体至哌啶含量为零，DMF(3×15mL)润洗固体，滤除溶液，保留固体，得化合物10(粗品)。
步骤7、化合物12的合成
在50mL烧杯中依次加入化合物11(93.00mg,0.46mmol)，DIPEA(180.61mg,1.40mmol,248.00μL)，HATU(177.51mg,0.46mmol)以及DMF(10mL)，0℃搅拌20分钟后，将该溶液泵入100mL固相多肽反应装置与化合物10混合，常温反应2小时，滤除液体，DMF(3×15mL)与DCM(3×15mL)交替清洗固体，至DIPEA含量为零，DCM(3×15mL)润洗固体，滤除溶液，保留固体，得化合物12(粗品)。
步骤8、化合物13的合成
在100mL固相多肽反应装置中依次加入化合物12(粗品)，HFIP(2mL)以及DCM(10mL)，常温反应20分钟后，过滤。固体重复上述操作至固体完全变色。收集滤液，减压蒸除溶剂后得化合物13(80.00mg,194.12μmol,65％产率)。C20H21N4O4S,LCMS(ESI)[M+H]:413.12
步骤9、化合物15的合成
50mL反应瓶中依次加入化合物13(30.00mg,72.79μmol)，DIPEA(4.10g,219.91μmol,38.70μL)，HATU(33.00mg,876.21μmol)与DMF(2.0mL)，待反应体系温度降至0℃后，加入化合物14(14.01mg,87.65μmol)，冰浴条件下搅拌反应0.5小时后淬灭反应(LC-MS监测)，饱和NaCl溶液(20mL)与乙酸乙酯(3×20mL)完成萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，经MPLC纯化，减压浓缩除去溶剂后得到化合物15(30.00mg,54.13μmol,70.12％产率)，C27H35N6O5S，LCMS(ESI)[M+H]:555.23。
步骤10、化合物A的合成
在50mL反应瓶中将化合物15(30.00mg,54.13μmol)溶于6N HCl与乙酸乙酯的混合溶液(10mL),在室温下搅拌反应0.5小时，减压浓缩除去溶剂后得到化合物A(26.00mg,57.25μmol,60％产率)，C22H27N6O3S,LCMS(ESI)[M+H]:455.17。
实施例2、本发明化合物B的合成：
Figure BDA0002426549820000071
Figure BDA0002426549820000081
步骤1、化合物16的合成
在100mL固相多肽反应装置内加入经DCM(15mL)预处理的Resin-Cl(1.96g,2.00mmol)，化合物AOP(975.08mg,2.00mmol)，无水DMF(10mL)以及DIPEA(1.29g,10.00mmol,1.74mL)。常温反应4小时，滤除液体，DMF(3×15mL)与DCM(3×15mL)交替清洗固体，DCM：MeOH：DIPEA(85:10:5)润洗固体完成封端，得化合物16(粗品)。
步骤2、化合物17的合成
在100mL固相多肽反应装置内加入化合物16(粗品)与20％哌啶-DMF溶液(20％,5mL)。常温反应20分钟，滤除液体，DMF(3×15mL)与DCM(3×15mL)交替清洗固体至哌啶含量为零，DMF(3×15mL)润洗固体，滤除溶液，保留固体，得化合物17(粗品)。
步骤3、化合物18的合成
在50mL烧杯中依次加入化合物AOP(975.08mg,2.00mmol)，DIPEA(646.22mg,5.00mmol,870.91μL)，HATU(912.00mg,2.40mmol)以及DMF(10mL)，0℃搅拌20分钟后，将该溶液泵入100mL固相多肽反应装置与化合物17混合，常温反应2小时，滤除液体，DMF(3×15mL)与DCM(3×15mL)交替清洗固体，至DIPEA含量为零，DCM(3×15mL)润洗固体，滤除溶液，保留固体，得化合物18(粗品)。
步骤4、化合物19的合成
在100mL固相多肽反应装置内加入化合物18(粗品)与20％哌啶-DMF溶液(20％,5mL)。常温反应20分钟，滤除液体，DMF(3×15mL)与DCM(3×15mL)交替清洗固体至哌啶含量为零，DMF(3×15mL)润洗固体，滤除溶液，保留固体，得化合物19(粗品)。
步骤5、化合物21的合成
在50mL烧杯中依次加入化合物20(864.85mg,2.00mmol)，DIPEA(646.22mg,5.00mmol,870.91μL)，HATU(912.00mg,2.40mmol)以及DMF(10mL)，0℃搅拌20分钟后，将该溶液泵入100mL固相多肽反应装置与化合物19混合，常温反应2小时，滤除液体，DMF(3×15mL)与DCM(3×15mL)交替清洗固体，至DIPEA含量为零，DCM(3×15mL)润洗固体，滤除溶液，保留固体，得化合物21(粗品)。
步骤6、化合物22的合成
在100mL固相多肽反应装置内加入化合物20(粗品)与20％哌啶-DMF溶液(20％,5mL)。常温反应20分钟，滤除液体，DMF(3×15mL)与DCM(3×15mL)交替清洗固体至哌啶含量为零，DMF(3×15mL)润洗固体，滤除溶液，保留固体，得化合物22(粗品)。
步骤7、化合物23的合成
在50mL烧杯中依次加入化合物Biotin-Linker(98.32mg,200.00μmol)，DIPEA(646.22mg,5.00mmol,870.91μL)，HATU(912.00mg,2.40mmol)以及DMF(10mL)，0℃搅拌20分钟后，将该溶液泵入100mL固相多肽反应装置与化合物22混合，常温反应2小时，滤除液体，DMF(3×15mL)与DCM(3×15mL)交替清洗固体，至DIPEA含量为零，DCM(3×15mL)润洗固体，滤除溶液，保留固体，得化合物23(粗品)。
步骤8、化合物24的合成
在100mL固相多肽反应装置中依次加入化合物23(粗品)，HFIP(2mL)以及DCM(10mL)，常温反应20分钟后，过滤。固体重复上述操作至固体完全变色。收集滤液，减压蒸除溶剂后得化合物24(100.00mg,123.41μmol,40.11％产率)。C36H55N6O13S,LCMS(ESI)[M+H]:811.35。
步骤9、化合物B的合成
50mL反应瓶中依次加入化合物24(57.60mg,48.88μmol)，DIPEA(18.95mg,146.64μmol,25.54μL)，HATU(18.57mg,48.88μmol)与DMF(0.5mL)，待反应体系温度降至0℃后，加入化合物A(24mg,48.88μmol)，冰浴条件下搅拌反应1小时后淬灭反应(LC-MS监测)，饱和NaCl溶液(20mL)与乙酸乙酯(3×20mL)完成萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，经MPLC纯化，减压浓缩除去溶剂后得到化合物B(26.00mg,15.91μmol,32.54％产率)，C58H79N12O15S2，LCMS(ESI)[M+H]:1147.51。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.38and 8.27(s,1H),8.17(d,J＝8.8Hz,1H),7.93(d,J＝8.4Hz,1H),7.89and 7.82(d,J＝8.9Hz,1H),7.66(d,J＝4.0Hz,2H),7.63-7.58(m,1H),7.51-7.48(m,1H),7.39(d,J＝14.6Hz,1H),5.77(t,J＝6.6Hz,1H),5.18-5.01(m,1H),4.48(dd,J＝7.8,5.0Hz,1H),4.30(dd,J＝7.6,4.4Hz,1H),4.07-4.02(m,1H),3.96-3.88(m,1H),3.74-3.62(m,7H),3.65-3.56(m,40H),3.53-3.46(m,9H),3.42-3.38(m,2H),3.24-3.17(m,1H),3.11(d,J＝21.7Hz,1H),2.99(d,J＝10.8Hz,1H),2.91(dt,J＝15.7,7.9Hz,2H),2.83-2.76(m,2H),2.70(d,J＝12.7Hz,1H),2.49-2.45(m,6H),2.21(t,J＝7.2Hz,2H),2.02-1.78(m,2H),1.77-1.52(m,4H),1.49-1.37(m,2H),1.11-1.04(m,3H).
实施例3、光照截断实验1
Figure BDA0002426549820000101
将B预先用乙腈配制成50mmol/L溶液，然后用乙腈稀释至浓度分别为0.1mmol/L，1mmol/L，10mmol/L三组，将三组溶液同时放置于波长等于365nm下光照，分别于1h，2h，20h取样，经HPLC检测分析其底物的转化率(表1)经试验分析发现，当浓度为1mmol/L时，反应在光照20小时后，B的转化率到达最高的97％。
表1反应浓度和时间对转换率的影响
Figure BDA0002426549820000111
实施例4、光照截断实验2
Figure BDA0002426549820000112
将B预先用乙腈配制成50mmol/L溶液，然后用缓冲溶液稀释至浓度分别为0.1mmol/L，1mmol/L，10mmol/L三组，将三组溶液同时放置于波长等于365nm下光照，分别于1h，2h，20h取样，经HPLC检测分析其底物的转化率(表2)经试验分析发现，当浓度为0.1mmol/L时，反应在光照20小时后，B的转化率到达最高的97％。
Table 2反应浓度和时间对转换率的影响
Figure BDA0002426549820000113
实施例5、利用生物素标记化合物确定靶标蛋白
培养Hela细胞，将1*107至5*107细胞悬于HBSS缓冲液离心，弃上清，加入少量HBSS缓冲液将细胞重悬于1.5mL离心管中，总体积在200-1000μL，放置于液氮速冻，待样品完全冰冻后再将之放在冰上慢慢融化，反复三次，其中，HBSS缓冲液不添加去垢剂、还原剂及蛋白酶或磷酸酶的抑制剂，pH值在7.2-7.4之间。
取细胞裂解液2500μL加入200μM的化合物B进行孵育(实验组)，另一组取细胞裂解液500μL加入200μM的化合物24，以同样的方式进行孵育(对照组)。将所得溶液分别同500μL、100μL的中性抗生物素蛋白包被磁珠(GE，#7815-2104-010350)孵育，利用生物素和中性抗生物素蛋白的亲和相互作用，使化合物B、化合物24及与其结合的蛋白被固定到中性抗生物素蛋白包被磁珠上，通过磁力收集磁珠。进一步对磁珠进行重悬洗脱，去除弱结合或非特异性结合的蛋白。
对照组得到的磁珠，重悬到100μL HBSS，光照0h。实验组得到的磁珠，重悬到500μLHBSS缓冲液，混合均匀后均匀分为5组(A、B、C、D及E组，每组100μL)，A、B、C、D、E组分别在365nm紫光下照射0h、1h、2h、15h、20h。光照结束后，混匀磁珠，磁力收集磁珠并回收上清，磁珠重悬后进行变性解离获取其表面结合蛋白。对获得的样品，分别取少量进行SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析。每个样品以相同的上样量，分别上两块SDS-PAGE胶，一块用于考马斯亮蓝染色，另一块用于免疫印迹检测。免疫印迹检测的步骤如下：采用4-12％预制胶进行蛋白电泳，上样量为每孔15μL，同一样品取相同体积分别在两块胶上同时进行电泳，电泳结束后，一块胶用于SDS-PAGE分析(考马斯亮蓝染色)，另一块胶用于免疫印迹分析，用于免疫印迹分析的电泳胶300毫安转膜80分钟，取出电转后的PVDF膜，用5％脱脂奶粉的TBST溶液封闭1小时，加入10mL含ROCK2单抗(CST，#9029，1:2000稀释)的5％脱脂奶粉TBST溶液，4℃孵育过夜。第二日，取出孵育后的印迹膜，TBST洗膜3次，加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗孵育2小时后，TBST洗膜3次，再加ECL底物孵育10秒后曝光。
SDS-PAGE检测结果如图1所示，3-8泳道观察到少量蛋白条带，表明富集蛋白的磁珠在HBSS缓冲液中重悬后，有部分蛋白从其表面解离；9-14泳道含有大量蛋白条带，表明多种无关蛋白非特异性结合到磁珠上；将10、11、12、13、14号泳道与9号对比，可见10-14号泳道在180kDa处明显增加了一条带(图中黑色箭头所示)，与ROCK2分子量接近。
对SDS-PAGE图中各泳道的相同样品进行免疫印迹检测ROCK2含量的结果如图2所示，1号泳道(细胞裂解液)中含有ROCK2，但2号泳道(与化合物B、磁珠进行孵育后剩下的细胞裂解液)基本检测不到ROCK2，表明ROCK2大部分结合到磁珠。3、9号泳道(加化合物24孵育后的上清、磁珠)均检测不到ROCK2，但同时，在10-14号泳道检测得到很高浓度的ROCK2，说明ROCK2通过与化合物的结合而被富集到磁珠表面。在光照后的上清组分4-8号泳道中，光照解离2h、15h后的上清组分中检测到了明显的ROCK2，而光照解离0h、1h、20h后的上清组分中基本检测不到ROCK2。结合纯化合物的光照截断实验结果，表明处理时间太短不能使连接链断裂，光照时间太长也会降低ROCK2的解离。对图3中6、7泳道的样品进行蛋白组学分析，通过比对蛋白组学信号差异，可以确定与化合物结合的蛋白。
综上，本发明的生物素标记化合物能够从复杂体系(如细胞裂解液)中分离出相关的靶标蛋白。本发明的生物素标记化合物含有对光或者酸不稳定的基团，在分离靶标蛋白的过程中，通过切断不稳定基团进一步排除无关蛋白(如结合在磁珠包被中性抗生物素蛋白、生物素和PEG上的无关蛋白等)，减少了信号噪音和数据分析的复杂程度，为快速发现起效化合物的靶标靶标和药效学分子机制提供了一种操作简单、信号特异保真的方法。

Claims (11)

1.一种生物素标记化合物，它具有式I所示的通式：
Figure FDA0002426549810000011
其中，
X为分子量100～4000Da的工具化合物基团；
PEG1、PEG2分别独立为包含聚合度1～10的聚乙二醇基团的连接链。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述PEG1、PEG2中还包含接头基团，所述接头基团为亚氨基、羰基、亚烷基，PEG1、PEG2中接头基团的数量分别小于5。
3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于：所述PEG1为
Figure FDA0002426549810000012
所述PEG2为
Figure FDA0002426549810000013
4.根据权利要求3所述的化合物，其特征在于：所述工具化合物基团为：
Figure FDA0002426549810000014
5.根据权利要求4所述的化合物，其特征在于：式I所示的化合物为：
Figure FDA0002426549810000015
6.一种利用式I的生物素标记化合物确定化合物结合蛋白靶标的方法，包括以下步骤：
a.使用反复冻融法温和裂解细胞获得细胞总蛋白；
b.在细胞裂解液中加入生物素标记化合物进行孵育；
c.加入链霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠进行孵育；
d.通过离心或磁体分离出靶标蛋白-生物素标记化合物-链霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠的复合物；
e.在特定波长下光照，使链霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠的部分被切除；
f.通过离心或磁体分离，得到上清液；
g.从上清液中确定潜在的靶标蛋白质。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤a中反复冻融法为：将细胞悬于HBSS缓冲液中离心，弃上清，加入少量HBSS缓冲液将细胞重悬于离心管中，放置于液氮速冻，待样品完全冰冻后再放至冰上环缓慢融化，反复操作三次。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤c中加入链霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠的量满足其可结合生物素的摩尔数大于反应体系中化合物总摩尔数的三倍。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤d中分离前加入10倍体积的HBSS溶液，并重复3～5次离心或磁体分离，以除去未结合蛋白。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤e中切除链霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠的条件为：用波长365nM的紫外光照射2-15小时。
11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤g中使用蛋白组学的方法来确定潜在的靶标蛋白。
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