CN112063685B - 谷胱甘肽s-转移酶抑制剂的筛选方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生化分析与药物筛选领域，公开了一种谷胱甘肽S‑转移酶抑制剂的筛选方法与应用。本发明的筛选方法包括以下步骤：在谷胱甘肽和谷胱甘肽S‑转移酶存在的情况下，将待筛选物质与探针进行混合I，筛选出不能恢复所述探针的荧光的物质，得到所述谷胱甘肽S‑转移酶抑制剂；其中，所述探针含有荧光基团和猝灭基团，所述谷胱甘肽S‑转移酶能够催化所述谷胱甘肽与所述探针中的缺电子识别位点结合，从而恢复所述探针的荧光。本发明的筛选方法能够有效筛选出对谷胱甘肽S‑转移酶活性具有抑制作用的物质，筛选过程快速、可视化。
Description
技术领域
本发明涉及生化分析与药物筛选领域，具体涉及一种谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的筛选方法与应用。
背景技术
谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase，GSTs)是一种重要的谷胱甘肽相关酶，定位于细胞质和细胞核，参与解毒、药物代谢、氧化还原调节、免疫过程。此外，GSTs作为肿瘤治疗的重要靶点，参与多种癌症的发生发展，例如肝癌。迄今为止，它已成为抗癌药物筛选的重要靶点，然而，GSTs的过表达可催化谷胱甘肽(GSH)与抗癌药物结合，从而诱导肿瘤耐药。因此，迫切需要建立一系列GSTs活性检测方法来发现和筛选GSTs抑制剂，这有利于提高抗癌药物的治疗效果。
到目前为止，GSTs活性检测策略的发展取得了许多成果，包括2，4-二硝基氯苯(CDNB)触发化学反应法、高效液相色谱法、质谱法、电化学法和荧光分析法。其中，荧光分析法因其灵敏度高、选择性高、简单方便、生物相容性好、直观检测等优点，最具开发潜力。根据设计的不同方案，已经开发了各种探针用于荧光成像和实时监测细胞内GSTs活性。然而，这些方法在筛选抗耐药的GSTs抑制剂方面的工作未见报道，因此，建立药物快速发现与分子荧光探针之间的联系，以克服这一领域的不足是十分必要的。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的筛选方法，该筛选方法能够有效筛选出对谷胱甘肽S-转移酶活性具有抑制作用的物质，筛选过程快速、可视化。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：在谷胱甘肽和谷胱甘肽S-转移酶存在的情况下，将待筛选物质与探针进行混合I，筛选出不能恢复所述探针的荧光的物质，得到所述谷胱甘肽S-转移酶抑制剂；其中，所述探针含有荧光基团和猝灭基团，所述谷胱甘肽S-转移酶能够催化所述谷胱甘肽与所述探针中的缺电子识别位点结合，从而恢复所述探针的荧光。
优选地，所述探针的所述荧光基团由试卤灵提供，所述猝灭基团由2，4-二硝基苯磺酰氯提供。
优选地，所述探针的制备方法包括以下步骤：在无氧条件下，在有机溶剂中将荧光剂与三乙胺进行混合II后，再与猝灭剂进行混合III；其中，所述荧光剂为试卤灵，所述猝灭剂为2，4-二硝基苯磺酰氯。
优选地，所述有机溶剂选自四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺和二甲基亚砜中的至少一种。
优选地，所述混合II至少满足以下条件：温度为15-25℃、搅拌时间为25-35min；所述混合III至少满足以下条件：温度为15-25℃、搅拌时间为10-15h。
优选地，所述探针的制备方法还包括：将所述混合III得到的混合液除去所述有机溶剂后，经硅胶层析纯化得到所述探针。
优选地，所述混合I中，以浓度为10μg/mL的谷胱甘肽S-转移酶为基准，所述探针的浓度为3-8μg/mL，所述谷胱甘肽的浓度为180-220μM，所述待筛选物质的浓度为15-25μM。
优选地，所述混合I的过程包括：将所述待筛选物质与所述谷胱甘肽S-转移酶进行混合I-1后，再与所述探针和所述谷胱甘肽进行混合I-2；
所述混合I-1至少满足以下条件：温度为0-40℃、时间为10-20min；
所述混合I-2至少满足以下条件：温度为35-40℃、时间为15-25min。
本发明第二方面提供由上述的方法筛选得到的谷胱甘肽S-转移酶抑制剂。
本发明第三方面提供上述的谷胱甘肽S-转移酶抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明中谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的筛选方法采用含有荧光基团和猝灭基团的双功能荧光探针作为筛选工具，基于谷胱甘肽S-转移酶抑制剂、谷胱甘肽S-转移酶活性与探针荧光信号的轴向关系，通过监测谷胱甘肽S-转移酶活性的变化，成功地在体外对靶向谷胱甘肽S-转移酶的抑制剂进行可视化、快速筛选；利用本发明中筛选方法筛选得到的谷胱甘肽S-转移酶抑制剂能够对谷胱甘肽S-转移酶活性产生干预作用，有利于提高抗癌药物的治疗效果。
附图说明
图1是本发明中制备例制得的探针RP的1H-NMR谱图；
图2是本发明中制备例制得的探针RP的13C-NMR谱图；
图3是本发明中探针RP用于测定GSTs时各溶液的荧光光谱图，其中a为RP+GSH+GSTs溶液、b为RP+GSH溶液；
图4是本发明中探针RP用于测定GSTs时各溶液的紫外光谱图，其中a为RP+GSH+GSTs溶液、b为RP+GSH溶液、c为RP+GSTs溶液、d为试卤灵、e为探针RP；
图5是本发明中探针RP用于测定GSTs时各溶液的高效液相色谱图，其中a为RP+GSH+GSTs溶液、b为RP+GSH溶液、c为RP+GSTs溶液、d为试卤灵、e为探针RP；
图6是本发明中探针RP对不同浓度GSTs的荧光强度与时间变化的关系图；
图7是本发明中探针RP与GSTs浓度的荧光强度变化图；
图8是本发明中在GSH存在下探针RP对各种干扰物质和GSTs的荧光响应；
图9是本发明中待筛选物质对GSTs作用后的反应溶液的荧光强度；
图10是本发明中C1对GSTs的抑制作用与C1浓度的关系图；
图11是本发明中C2对GSTs的抑制作用与C2浓度的关系图；
图12是本发明中C7对GSTs的抑制作用与C7浓度的关系图；
图13是本发明中HepG2细胞活力与探针RP浓度的关系图；
图14是本发明中分别采用C7(10μM)处理24h、EA(500μM)处理1h后，细胞裂解液提取物中GSTs活性荧光测试荧光光谱图，其中A为探针RP空白对照、B为对照组、C为EA组、D为C7组；
图15是本发明中分别采用C7(10μM)处理24h、EA(500μM)处理1h后，细胞裂解液提取物中GSTs活性荧光测试荧光强度柱状图；
图16是本发明中分别采用C7(10μM)处理24h、EA(500μM)处理1h后，细胞裂解液提取物中GSTs蛋白表达测试图；
图17是本发明中采用C7(10μM)处理24h和EA(500μM)处理1h后，HepG2细胞共聚焦荧光显微镜图像；
图18是本发明中采用C7(10μM)处理48h和EA(500μM)处理1h后，HepG2细胞共聚焦荧光显微镜图像。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了一种谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：在谷胱甘肽和谷胱甘肽S-转移酶存在的情况下，将待筛选物质与探针进行混合I，筛选出不能恢复所述探针的荧光的物质，得到所述谷胱甘肽S-转移酶抑制剂；其中，所述探针含有荧光基团和猝灭基团，所述谷胱甘肽S-转移酶能够催化所述谷胱甘肽与所述探针中的缺电子识别位点结合，从而恢复所述探针的荧光。
本发明提供的筛选方法采用含有荧光基团和猝灭基团的双功能荧光探针作为筛选工具，基于谷胱甘肽S-转移酶抑制剂(GSTs抑制剂)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)活性与探针荧光信号的轴向关系，通过监测GSTs活性的变化，成功地在体外对靶向GSTs的抑制剂进行可视化、快速筛选；GSTs通过催化谷胱甘肽(GSH)与探针中的缺电子识别位点结合，使得荧光基团释放，触发探针的荧光信号显著地增强，且荧光信号的变化与GSTs活性呈正相关，可用于监测GSTs抑制剂对GSTs的调控作用。
根据本发明，探针含有的荧光基团与猝灭基团因两者之间产生电子转移而使得探针发出非常微弱的荧光信号，在GSH存在下，GSTs可以催化GSH与探针中的缺电子识别位点结合，导致荧光基团的释放，探针猝灭的荧光信号可以通过GSTs进行恢复。优选情况下，所述探针的所述荧光基团由试卤灵提供，所述猝灭基团由2，4-二硝基苯磺酰氯提供。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，探针对GSTs活性具有更强的特异性、选择性和更高的灵敏度，且该探针的细胞毒性低，合成方法更加简单、成本降低。
根据本发明，所述探针的制备方法包括以下步骤：在无氧条件下，在有机溶剂中将荧光剂与三乙胺进行混合II后，再与猝灭剂进行混合III；其中，所述荧光剂为试卤灵，所述猝灭剂为2，4-二硝基苯磺酰氯。其中，无氧条件可以通过通入氮气或氩气的方式实现。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高探针的得率。
示例性地，所述探针的制备方法具体步骤包括：将猝灭剂溶于有机溶剂配制成猝灭剂溶液，将三乙胺溶于有机溶剂中与荧光剂进行混合II，再与猝灭剂溶液进行混合III。
本发明对探针制备时使用的有机溶剂没有特别地限定，能够用于荧光剂、三乙胺与猝灭剂的合成反应即可。优选情况下，所述有机溶剂选自四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺和二甲基亚砜中的至少一种。
本发明对探针制备时混合II和混合III的条件没有特别地限定，一般地，混合的条件包括温度、搅拌速度、搅拌时间。优选情况下，所述混合II至少满足以下条件：温度为15-25℃、搅拌时间为25-35min；所述混合III至少满足以下条件：温度为15-25℃、搅拌时间为10-15h。
根据本发明，所述探针的制备方法还包括：将所述混合III得到的混合液除去所述有机溶剂后，经硅胶层析纯化得到所述探针。示例性地，硅胶层析纯化的过程采用石油醚-乙酸乙酯混合液作为洗脱液，以提高纯化后的探针的纯度。
根据本发明，谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的筛选方法中，以浓度为10μg/mL的谷胱甘肽S-转移酶为基准，所述探针的浓度为3-8μg/mL，所述谷胱甘肽的浓度为180-220μM，所述待筛选物质的浓度为15-25μM。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，有利于提高本发明的筛选方法的灵敏度和准确性。
根据本发明，所述混合I的过程包括：将所述待筛选物质与所述谷胱甘肽S-转移酶进行混合I-1后，再与所述探针和所述谷胱甘肽进行混合I-2；所述混合I-1至少满足以下条件：温度为0-40℃、时间为10-20min；所述混合I-2至少满足以下条件：温度为35-40℃、时间为15-25min。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，先将待筛选物质与所述谷胱甘肽S-转移酶进行混合I-1，使得待筛选物质与GSTs混合均匀，从而在与GSH、探针进行混合I-2时，如待筛选物质对GSTs具有抑制作用，则探针的荧光变化具有更高的灵敏度。
第二方面，本发明提供了由上述的方法筛选得到的谷胱甘肽S-转移酶抑制剂。
第三方面，本发明提供了上述的谷胱甘肽S-转移酶抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。由于GSTs的过表达可催化GSH与抗癌药物结合，从而诱导肿瘤耐药，因此，在制备抗肿瘤药物中应用本发明筛选得到的GSTs抑制剂，能够提高抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤效率，进而提高抗肿瘤药物的治疗效果。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，紫外可见吸收光谱分析采用日本UV-1800紫外分光光度计，荧光测量采用日本F-2500分光光度计，高效液相色谱(HPLC)采用安捷伦1100，核磁共振波谱采用配备5毫米CPP BBO的Bruker Ascend 600MHz光谱仪(BrukerBiospin GmbH，Germany)在25℃下测量，共聚焦荧光成像采用奥林巴斯FY1200(物镜60倍)，细胞凋亡分析采用K2细胞测量仪(Nexcelom，美国)。
以下实施例中，GSTs、GSH、半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)购自美国SigmaAldrich公司，GSTs单克隆抗体购自美国Abbkine Scientific Co.，Ltd，胰蛋白酶、牛血清白蛋白(BSA)、细胞色素C(Cyt c)、溶菌酶(Lysozyme)、维生素c(Vc)购自Solarbio T，BCA蛋白检测试剂盒购自Beyotime，乙烯酸(EA)购自上海源野生物科技有限公司，试卤灵购自日本东京化工，2，4-二硝基苯磺酰氯购自中国能源化工集团，乙酰胆碱酯酶(AchE)和丁基胆碱酯酶(BchE)分别从脑和血中提取和纯化；其他原料和溶剂均为市售的HPLC级试剂；所有溶液用蒸馏水配制、4℃保存。
在没有特别说明的情况下，所述室温为25±5℃。
制备例
(1)在通入N2的条件下，将0.28mmol的2，4-二硝基苯磺酰氯溶于10mL四氢呋喃中得到猝灭剂溶液；
(2)在通入N2的条件下，将0.28mmol三乙胺加入5mL四氢呋喃中并与0.28mmol试卤灵粉末进行混合II，在20℃搅拌30min，再与步骤(1)得到的猝灭剂溶液进行混合III，在20℃搅拌12h后得到混合液；
(3)将步骤(2)得到的混合液蒸发去除四氢呋喃后，以石油醚-乙酸乙酯混合液(石油醚与乙酸乙酯体积比为2:1)为洗脱液进行硅胶层析纯化，得到探针RP(黄色固体，8.3mg，产率27.7％)。
探针RP的核磁共振分析
将制备例制得的探针RP进行核磁共振波谱分析，结果如图1和图2所示，核磁数据如下：
1H NMR(600MHz，CDCl3)：δ8.73(d J＝1.8Hz，1H)，8.58(dd，J＝8.4，2.2Hz，1H)，8.35(d J＝8.4Hz，1H)，7.45(d J＝10.2Hz，1H)，7.29(d J＝2.4Hz，1H)，7.27(dd，J＝8.4，2.4Hz，1H)，6.90(dd，J＝9.8，1.8Hz，1H)，6.35(d，J＝1.8Hz，1H)；
13CNMR(150MHz，CDCl3)分别为186.2，151.3，150.1，149.7，148.8，144.5，135.8，134.8，133.9，133.3，132.7，131.9，126.7，120.6，119.2，110.4，107.8。
探针RP对GSTs的荧光测定
取5份100μL pH为7.4的PBS缓冲液，分别配置成探针RP浓度为5μg/mL的RP溶液，探针RP浓度为5μg/mL、GSTs浓度为10μg/mL的RP+GSTs溶液，探针RP浓度为5μg/mL、GSH浓度为200μM的RP+GSH溶液，探针RP浓度为5μg/mL、GSTs浓度为10μg/mL、GSH浓度为200μM的RP+GSH+GSTs溶液，试卤灵浓度为10μg/mL的Resorufin溶液；将上述5种溶液分别进行荧光光谱分析、紫外光谱分析和高效液相色谱，结果如图3、图4和图5所示。
如图3所示，从RP+GSH+GSTs溶液的荧光光谱图可看出，在GSH存在的情况下，GSTs能够恢复探针RP的荧光，荧光发射峰位于585nm处；RP+GSTs溶液和RP+GSH溶液的荧光光谱图未观察到明显的荧光信号；如图4所示，RP溶液和RP+GSTs溶液未见紫外吸收峰，而Resorufin溶液、RP+GSH溶液和RP+GSH+GSTs溶液在585nm处分别出现了一个明显的吸收峰，这些结果清楚地表明，GSTs催化GSH与探针RP中的缺电子识别位点结合，导致亲电基团的去除和荧光团的释放，使得探针RP的荧光信号增强，因此，GSTs能够恢复探针RP的荧光，探针RP的荧光恢复能够用于检测GSTs活性。如图5所示，Resorufin溶液在3-4min出现了间苯二酚，但RP+GSTs溶液和RP溶液中并未出现，这一结果进一步表明，RP+GSH+GSTs溶液和RP+GSH溶液中，GSH与探针RP中的缺电子识别位点结合反应，探针RP的荧光信号增强的同时，释放了试卤灵基团。
探针RP的荧光恢复与GSTs浓度、孵育时间之间的关系
在pH为7.4的PBS缓冲液中加入制备例制得的探针RP和GSH，得到探针RP浓度为5μg/mL、GSH浓度为200μM的混合液A；
取14份100μL混合液A分别加入GSTs得到混合液C，使得混合液C中GSTs的浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL，室温孵育20min后，测定混合液C在不同波长下的荧光强度，并发现不同浓度GSTs的活性均在585nm处具有较强的荧光强度，且随着GSTs浓度的增加，荧光强度逐渐增大。
取4份100μL混合液A分别加入GSTs得到混合液B，使得混合液B中GSTs的浓度分别为0μg/mL、0.05μg/mL、0.5μg/mL、5μg/mL，室温孵育10min、20min、30min、40min、50min后，在585nm处测定混合液B的荧光强度。图6显示了不同GSTs浓度下探针RP的荧光响应时间依赖性，GSTs的催化能力随着GSTs水平的提高而增强，GSTs浓度越高，GSH与探针RP猝灭基团中的缺电子识别位点反应时间越短，荧光回收率越高，GSTs水平为5μg/mL时，荧光值在20min时趋于稳定。通过进一步研究GSTs浓度与荧光值的关系，如图7所示，GSTs的荧光回收效率(lg F)与GSTs浓度(lg[GSTs])之间存在良好的线性关系，即lg F＝3.1416+0.1369lg[GSTs](R2＝0.9918)。GSTs浓度范围为0-10μg/mL，检出限78.7ng/mL(S/N＝3)。结果表明，探针RP的荧光恢复对GSTs活性具有较高的敏感性，在药物筛选和生物检测中具有潜在的应用前景。
探针RP的荧光恢复对GSTs活性测定的选择性分析
在pH为7.4的PBS缓冲液中加入制备例制得的探针RP和GSH，得到探针RP浓度为5μg/mL、GSH浓度为200μM的混合液A；
取10份100μL混合液A，分别加入Vc、Hcy、AchE、BchE、溶菌酶、BSA、Cyt c、Cys、胰蛋白酶和GSTs得到混合液D，使得混合液D中Vc、Hcy、AchE、BchE、溶菌酶、BSA、Cyt c、Cys、胰蛋白酶的浓度为100μM，GSTs的浓度为5μg/mL，室温孵育20min后，在585nm处测定混合液D的荧光强度，结果见图8所示。Vc、Hcy、AchE、BchE、溶菌酶、BSA、Cyt c、Cys和胰蛋白酶均未能使得探针RP的荧光明显恢复，表明本发明的方法对GSTs的活性测定具有高选择性。
实施例
将獐牙菜中提取出的10种天然化合物作为待筛选物质(C1-C10)，10种待筛选物质的具体结构式见表1。
表1
取11份100μL含有GSTs的pH为7.4的PBS缓冲液，分别加入待筛选物质(C1-C10)和空白作为对照，使得C1-C10的浓度分别为20μM、GSTs的浓度为10μg/mL，然后在室温条件下相互作用15min后，与探针RP和GSH混合，使得探针RP的浓度为5μg/mL、GSH的浓度为200μM，在37℃调节下共孵育20min，观察各个反应溶液的颜色并测量荧光强度。
如图9所示，反应溶液颜色的可视变化表明，在相同的浓度(20μM)下，待筛选物质(C1-C10)对GSTs活性的影响是不同的，其中，3个化合物(C1，C2和C7)对GSTs活性有较强的抑制作用，三者的反应溶液近乎无色，即三者能够抑制GSTs的活性，无法触发GSH与探针RP中的缺电子识别位点结合，荧光信号释放的反应不能进行，导致探针RP的荧光基团不能得到释放，无法观察到红色的荧光。通过该筛选过程筛的C1，C2和C7为GSTs抑制剂。
测试例
1、C1，C2和C7的浓度与GSTs的抑制作用的关系
取3组100μL含有GSTs的pH为7.4的PBS缓冲液，分别为C1组、C2组和C7组，使得对应组别中GSTs的浓度为10μg/mL，C1、C2或C3的浓度分别为0μM、5μM、10μM、15μM、20μM，然后在室温条件下相互作用15min后，与探针RP和GSH混合，使得探针RP的浓度为5μg/mL、GSH的浓度为200μM，在37℃调节下共孵育20min，测量荧光强度。如图10、图11和图12所示，C1、C2、C7对GSTs的抑制作用呈浓度依赖性，IC50分别为9.626μM、9.626μM、9.410μM。
2、C1、C2、C7与GSTs的分子对接
利用分子对接软件(MOE.2015)进行分子对接研究，首先，通过Chem3D(PerkinElmer)将C1、C2、C7转化为3D模式，然后将化合物的能量质子化并最小化，从而获得稳定的3D结构并以“.moe文件”格式保存；在MOE中创建一个新的数据库，将保存的“.moe文件”导入到数据库，并从NCBI数据库(PDB代码：5x79)中下载GSTs氨基酸序列，变换GSTs的晶体结构并虚拟其活性结合位点与化合物对接。
分子对接的结果表明，C1通过氢键与氨基酸残基Ala 407和Thr 317结合，C2与Thr232和Ser 229结合，C7与Glu 78、Ser 114、Ser 116、Phe 57结合，该模型阐明了C1、C2、C7与GSTs可能的相互作用及对GSTs活性的调控机理。
3、C7调控下HepG2细胞内GSTs活性的荧光监测
探针RP的MTT测定：将HepG2细胞(5×103个细胞/孔)在100μL DMEM培养基(10％胎牛血清、1％链霉素、37℃、5％CO2)的96孔板中培养48h，PBS洗涤3次；每孔加入含有不同浓度的制备例制得的探针RP的培养基(1％胎牛血清)，探针RP的浓度分别为0μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、25μg/mL，进一步孵育48h；取去原DMEM后，每孔加入100μL的新鲜DMEM培养基，加1％MTT溶液(5mg/mL)，再孵育4h，最后每孔加入100μL DMSO，避光强摇15min，然后细胞活力测定。如图13所示，探针RP对HepG2细胞具有低细胞毒性。
HepG2细胞内GSTs活性的荧光监测：HepG2细胞在DMEM中(10％胎牛血清、1％链霉素、37℃、5％CO2)培养48h后，采用不同方法处理后(对照组的细胞不加任何药物处理，EA组的细胞中加入500μM EA孵育1h，C7组的细胞中加入10μM C7孵育24h)，分别获得细胞裂解液提取物，其中，EA是所有GST同工酶的有效抑制剂，EA组作为阳性对照；
细胞裂解液提取物的制备如下：收集细胞，胰蛋白酶处理和离心5min后，加入1mL冷PBS清洗细胞，用0.5mL冰冻细胞裂解液在冰上裂解30min后于冰上脉冲超声3次、每次5s，4℃下12000rpm离心20min，收集上清；用BCA试剂盒定量测定细胞上清液浓度(562nm)，用Western bolt检测GSTs在细胞提取物中的表达，用SDS-PAGE(1.5h)将蛋白(20μg)分离，转移到PVDF膜(Millipore，USA)上1.5h，5％脱脂牛奶在室温下封膜2h，检测GSTs蛋白表达水平，结果见图16；
将对照组、EA组和C7组的细胞裂解液提取物(1μL)分别与探针RP(终浓度5μg/mL)混合加入到100μL的PBS缓冲液(pH7.4)中，37℃孵育20min，然后进行荧光强度测定(Ex/Em＝572/585nm)，以含有探针RP(终浓度5μg/mL)的PBS缓冲液(pH7.4)为空白对照，结果见图14和图15。
HepG2细胞内GSTs活性的荧光成像监测：将HepG2细胞在12孔板上用1000μL的DMEM(10％胎牛血清、1％链霉素、37℃、5％CO2)孵育48h，PBS洗涤后，在含1％胎牛血清的DMEM培养基中分别与C7(10μM)孵育24h和48h，荧光显影前，先用乙基丙烯酸(EA，500μM)预处理细胞1h，然后分别用Hoechst 33342(150μL，30min)和探针RP(10μg/mL，20min)孵育，然后进行共焦激光扫描，观察荧光现象，结果见图17和图18。
如图17和图18所示，使用探针RP孵育后，HepG2细胞呈强烈的红色荧光，RP可以同时监测胞浆和细胞核中GSTs的活性，RP发出的红色荧光和Hoechst 33342发出的蓝色荧光叠加证实了这一点；相比之下，EA处理的细胞由于EA对GSTs的强烈抑制而表现出超弱的荧光，C7处理细胞的荧光信号也明显下降，说明C7对细胞内GSTs活性具有抑制作用。随着孵育时间延长至48h，C7处理的细胞荧光明显减弱，EA处理的细胞几乎没有明显的荧光。如图14-图16所示，荧光检测和western blot结果显示，EA处理的细胞中GSTs的表达最低，C7紧随EA之后，这与上述的荧光成像检测结果一致。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：在谷胱甘肽和谷胱甘肽S-转移酶存在的情况下，将待筛选物质与探针进行混合I，筛选出不能恢复所述探针的荧光的物质，得到所述谷胱甘肽S-转移酶抑制剂；
其中，所述探针含有荧光基团和猝灭基团，所述荧光基团由试卤灵提供，所述猝灭基团由2，4-二硝基苯磺酰氯提供，所述谷胱甘肽S-转移酶能够催化所述谷胱甘肽与所述探针中的缺电子识别位点结合，从而恢复所述探针的荧光；
所述探针的制备方法包括以下步骤：在无氧条件下，在有机溶剂中将荧光剂与三乙胺在温度为15-25℃下进行混合II后，再与猝灭剂在温度为15-25℃下进行混合III；所述荧光剂为试卤灵，所述猝灭剂为2，4-二硝基苯磺酰氯；
所述混合I中，以浓度为10μg/mL的谷胱甘肽S-转移酶为基准，所述探针的浓度为3-8μg/mL，所述谷胱甘肽的浓度为180-220μM，所述待筛选物质的浓度为15-25μM。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述有机溶剂选自四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺和二甲基亚砜中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述混合II至少满足以下条件：搅拌时间为25-35min；
所述混合III至少满足以下条件：搅拌时间为10-15h。
4.根据权利要求2或3所述的筛选方法，其特征在于，所述探针的制备方法还包括：将所述混合III得到的混合液除去所述有机溶剂后，经硅胶层析纯化得到所述探针。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述混合I的过程包括：将所述待筛选物质与所述谷胱甘肽S-转移酶进行混合I-1后，再与所述探针和所述谷胱甘肽进行混合I-2；
所述混合I-1至少满足以下条件：温度为0-40℃、时间为10-20min；
所述混合I-2至少满足以下条件：温度为35-40℃、时间为15-25min。
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