CN111537622B - 一种度格列汀及其盐的杂质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了杂环硼酸化合物度格列汀或其盐的杂质(II)‑(IV)及其盐、杂质(I)‑(IV)或其盐的检测方法。度格列汀或其盐中杂质(I)‑(IV)在常规检测条件下无法有效检出，本发明使用长链离子对试剂SDS溶液和有机溶剂的混合溶液洗脱，分两次分别检测出杂质(I)‑(III)和杂质(IV)。本发明提供的杂质可作为参比标准或对照品，用于度格列汀或其盐原料和/或制剂中的质量控制和研究，保证其用药安全。

Description

一种度格列汀及其盐的杂质的检测方法
技术领域
本发明属于医药分析技术领域，具体涉及杂环硼酸化合物度格列汀及其盐的杂质(I)-(IV)或(I)-(IV)的盐，以及杂质(I)-(IV)或其盐的检测方法。
背景技术
二肽基肽酶IV(DPP-IV，dipeptidyl peptidase IV)是二肽基肽酶家族成员之一，可参与葡萄糖调控。抑制DPP-IV可改善血糖控制。但是，如果抑制剂同时可以抑制二肽基肽酶家族的其他成员，如DPP-VIII，则可引起毒性作用。因此，临床可用的DPP-IV抑制剂需要表现出相对二肽基肽酶家族其他成员的对DPP-IV的选择性。
度格列汀L-酒石酸盐(Dutogliptin L-Tartrate)为选择性的DPP-IV抑制剂，口服有效，且不引起体重增加，单独使用或与常用II型糖尿病药物联合使用时均安全可靠。与常规抗糖尿病药物不同，度格列汀L-酒石酸盐不会导致低血糖。更为重要的是，度格列汀L-酒石酸盐对DPP-IV的选择性抑制作用强度是对DPP-II和 DPP-IX的15余倍，对DPP-VIII的200多倍，具有非常好的选择性，避免了副作用的产生。
度格列汀为杂环硼酸化合物，其结构如下：
Figure GDA0003142878660000011
度格列汀、其盐及中间体的性质不稳定，在合成或放置过程中会产生很多杂质。目前，鲜有文献公开相关杂质结构及检测方法。为有效控制度格列汀或其盐原料药及制剂中的杂质，保证药品质量，参照药品杂质分析指导原则规定及注册标准，需要对其杂质生成情况及各杂质进行分析研究及有效控制。
度格列汀或其盐的杂质检测难度在于，在合成过程中产生的杂质较多，不易完全分离。可能产生的杂质包括关键起始物料、残留中间产品、副反应产物、降解杂质等多种杂质。因此，必须寻找合适的方法对各杂质进行鉴定与控制。
发明内容
本发明的目的是提供度格列汀及其盐的杂质(II)-(IV)或(II)-(IV)的盐及杂质(I)-(IV)或其盐的检测分析方法。通过使用两种分析条件，分别检测杂质(I)-(III)、(IV)，实现了度格列汀及其盐中难检测杂质的分析检测，为其质量控制提供了依据。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
本发明首先提供度格列汀及其盐的杂质(II)-(IV)或(II)-(IV)的盐，其中，杂质(II)-(IV)分别具有以下结构：
Figure GDA0003142878660000021
本发明中的盐指的是度格列汀或其杂质与有机酸或无机酸结合后形成的盐，包括但不限定为L-酒石酸盐、对甲苯磺酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐或盐酸盐。
本发明同时提供检测度格列汀及其盐中杂质(I)-(IV)或(I)-(IV)的盐的方法，该方法使用两种检测条件，分别检测杂质(I)-(III)或其盐、杂质(IV)或其盐，
其中，杂质(I)具有如下结构：
Figure GDA0003142878660000022
本申请发明人为了检测杂质(I)-(III)，研究了多种流动相的分离效果，根据不同的流动相和洗脱效果对色谱柱及洗脱梯度进行进一步的优化。结果表明：使用常用的流动相，如乙酸铵/乙腈、磷酸二氢钾/乙腈时，多种色谱柱条件下，主峰均无法较好分离，只有使用长链离子对试剂SDS溶液，且在合适的流动相下洗脱，才能较好地将杂质与主峰分离。
杂质(I)-(III)或其盐的检测步骤为：
(1)、溶液制备：取度格列汀的盐适量，精密称定，加入流动相A做溶剂，溶解并制成每1mL中约含度格列汀的盐0.8mg的溶液，作为供试品溶液；
精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，作为自身对照溶液；
另称取度格列汀的盐约8mg，置10mL量瓶中，加0.1％双氧水1.0mL放置10分钟，加流动相A稀释至刻度，作为分离度溶液；
(2)、检测方法：分别取供试品溶液、对照溶液和分离度溶液，注入液相色谱仪，以流动相A和B洗脱，记录色谱图；
(3)、含量计算：按自身对照法计算(I)-(III)的含量；
其中，流动相A和B均为由SDS水溶液、乙腈和三氟乙酸组成的混合溶液。
在一种优选实施方式中，该检测方法使用的流动相A中SDS水溶液:乙腈: 三氟乙酸＝600:400:1，流动相B中SDS水溶液:乙腈:三氟乙酸＝400:600:1，洗脱方式为梯度洗脱。
在一种优选实施方式中，流动相A和B中SDS水溶液的浓度均为23-27 mmol/L，优选25±1mmol/L。
在一种优选实施方式中，梯度洗脱的条件为：
时间(分钟) 流动相A(％V/V) 流动相B(％V/V)
0 100 0
25 100 0
45 0 100
60 0 100
60.1 100 0
70 100 0
本发明提供的杂质(IV)或其盐的检测步骤为：
(1)、溶液制备：取度格列汀的盐适量，精密称定，加流动相A溶解并制成每1mL中约含度格列汀的盐6.4mg的溶液，作为供试品溶液；
精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，作为自身对照溶液；
另称取杂质(IV)对照品适量，加流动相A溶解并定量稀释制成每1mL含0.5 μg杂质(IV)的溶液，作为杂质定位溶液；
检测方法：分别取供试品溶液、对照溶液和杂质定位溶液，注入液相色谱仪，以流动相A和B洗脱，记录色谱图；
(3)、含量计算：按自身对照法计算杂质(IV)的含量；
其中，流动相A和B均为由SDS水溶液、乙腈和三氟乙酸组成的混合溶液。
在一种优选实施方式中，流动相A为：25±1mmol/L的SDS水溶液:乙腈: 三氟乙酸＝800:200:1，流动相B为：25±1mmol/L的SDS水溶液:乙腈:三氟乙酸＝500:500:1，洗脱的方式为梯度洗脱。
在一种优选实施方式中，梯度洗脱的条件为：
时间(分钟) 流动相A(％V/V) 流动相B(％V/V)
0.0 100 0
35.0 100 0
36.0 0 100
50.0 0 100
50.1 100 0
70 100 0
本申请发明人发现，若仅使用杂质(I)-(III)或其盐的检测条件，杂质(IV)或其盐的出峰位置过早，溶剂峰存在干扰，无法准确检测；而仅使用杂质(IV)或其盐的检测条件检测时，杂质(I)与主成分度格列汀一起出峰，无法实现分离。调节流动相中SDS的浓度以及和乙腈的比例，也无法取得很好地将杂质(I)-(IV)一次分离的满意效果。
本发明提供的杂质(II)-(IV)或其盐，可用作标准品或对照品对度格列汀或其盐的原料药及制剂进行质量控制和研究。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果有：
本发明提供了度格列汀及其盐的杂质(II)-(IV)或(II)-(IV)的盐，及杂质(I)-(IV) 或其盐的检测方法。解决了度格列汀及其盐中杂质多，极性大，难以分离检测的技术问题。该方法各杂质之间分离度好，各杂质与度格列汀分离彻底，操作简单，结果可靠，成本低廉，为有效控制度格列汀或其盐中杂质的含量提供了依据，从而确保产品的安全性和有效性。
附图说明
图1为杂质(II)可能的裂解途径；
图2为负离子模式下杂质(II)可能的裂解途径；
图3为杂质(III)的1HNMR图；
图4为杂质(IV)的1HNMR图；
图5为实施例1中160701-DGLT-S批次检测的HPLC谱图；
图6为实施例5中160701-DGLT-S批次检测的HPLC谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述，但这些实施例对本发明不构成任何限制。
1、仪器：
高效液相色谱仪型号为Agilent Infinity1260、色谱柱为Waters XTerra MS C18，4.6×150mm，3.5um，以十八烷基键合硅胶为填充剂。
2、试剂：
纯水
乙腈(色谱纯)，生产商：ACS；
SDS(电泳级)，生产商：J&K。
3、样品：
本发明所用硼酸类化合物为本公司通过常规方法制备或市售购得。
实施例1杂质(I)-(III)或其盐的检测
色谱条件：
流动相：25mmol/L SDS水溶液:乙腈:三氟乙酸＝600:400:1为流动相A，25 mmol/LSDS水溶液:乙腈:三氟乙酸＝400:600:1为流动相B；
柱温：60±5℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：60uL；
检测波长：210nm；
洗脱条件如下表1所示：
时间(分钟) 流动相A(％V/V) 流动相B(％V/V)
0 100 0
25 100 0
45 0 100
60 0 100
60.1 100 0
70 100 0
1、溶液配制及检测
A、供试品溶液的制备：
取度格列汀L-酒石酸盐适量，精密称定，加流动相A溶解并制成每1mL中约含度格列汀L-酒石酸盐0.8mg的溶液，作为供试品溶液；
精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，作为自身对照溶液；
B、分离度溶液的制备：
另称取度格列汀的盐约8mg，置10mL量瓶中，加0.1％双氧水1.0mL放置10 分钟，加流动相A稀释至刻度，作为分离度溶液；
C、检测方法：
取60μL分离度溶液注入液相色谱仪，要求主峰和杂质(I)的分离度不小于 1.0。再精密量取供试品溶液和自身对照溶液各60μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按自身对照法计算杂质(I)-(III)的含量。
2、测定结果
按照上述方法，分别对批号为160701-DGLT-S、160702-DGLT-S和 160801-DGLT-S的三批度格列汀L-酒石酸盐供试品进行检测，结果见表2：
表2
杂质 (M+H)<sup>+</sup> RRT(min) 平均含量(％)
杂质(I) 214.15 1.09 0.13
杂质(II) 368.25 2.42 0.15
杂质(III) 439.32 2.85 0.12
对160701-DGLT-S批次供试品的检测方法进行方法学验证，具体验证结果见下表：
Figure GDA0003142878660000061
Figure GDA0003142878660000071
通过以上方法学验证，各项目均符合要求，说明本方法准确，灵敏，专属性良好，可以用来检测杂质(I)-(III)的含量。
实施例2杂质(II)的结构确认
将RRT2.42的流份收集并去除SDS后进行下述检测：
1、LCMS检测
得出其其分子离子峰[M+H]+为368.25，同时可见390.23的加钠峰，350.24的脱水峰和332.23的脱两水峰，同时，根据同位素丰度，可推出其含有一个硼原子；
2、高分辨质谱
经检测，该组分的精确分子量为368.2470，推断分子式为C16H31BN5O4，含有5个不饱和度。
3、二级质谱MS/MS
参考度格列汀的裂解规律，对该组分的裂解进行分析，推测可能的结构和裂解方式如附图1所示。
为了获得更多的杂质裂解信息，用负离子模式对二级质谱进行了测定，得到该组分母离子365.3经过碰撞后的二级碎片信息，结果见附图2。其中较强的两个碎片348、222按当前结构都能得到较好的归属。
4、重水交换实验
将该组分经重水交换后进行MS检测，[M+H]368增加为[M+D]+374，可见杂质分子中含有5个活泼氢，与推测结构一致。
综上，杂质(II)的结构为：
Figure GDA0003142878660000081
实施例3杂质(III)的结构确认
将RRT2.85的流份收集并去除SDS后进行下述检测：
1、飞行时间质谱
经检测，该组分的分子离子峰为439.3197，推断分子式为C20H39BN6O4。
2、二级质谱MS/MS
通过离子的逐级捕获和碎裂，得到杂质(III)的裂解途径为：
Figure GDA0003142878660000082
3、成酯反应
基于同位素丰度可知该组分中含由硼原子，又由于在质谱分析只用可见明显的脱水、脱二水峰，推测其结构中含由硼酸结构。
使丙三醇与该组分在碳酸氢钠和甲醇条件下50℃反应2小时，后对反应产物进行液质分析，得到目标分子的离子峰495.3471。验证了该组分结构中含有硼酸结构。
Figure GDA0003142878660000083
4、重水交换实验
将样品用重水溶解后立即进行质谱检测，结果表明有3个活泼H发生了快速重水交换；将样品用超声溶解后再进行质谱检测，结果表明有6个活泼H发生了充分的重水交换，与推测结构一致。
5、核磁检测
对该组分分别进行1HNMR，13CNMR，DEPT135，COSY，NOESY，HSQC 和HMBC核磁检测，为便于分析，将推测结构分为A、B、C、D四个子结构区域。
Figure GDA0003142878660000091
通过峰的归属，发现该组分结构中含有度格列汀的类似骨架结构，表明子结构A的存在。
氢谱化学位移3.8-3.9ppm处的dd峰以及碳谱在162.6ppm处的峰在HMBC 谱上具有远程耦合，表明子结构B的存在。
氢谱3.15-3.2ppm、1.56-1.7ppm、1.4-1.53ppm的峰以及碳谱21.5、25.2、 38.6、55.2ppm的峰表明子结构B的存在。碳谱162.6ppm的峰与氢谱3.15-3.2ppm 的峰在HMBC谱上具有远程耦合，说明了子结构B与子结构C是相连的。
由于子结构D和部分子结构A的结构类似，氢谱和碳谱的峰与子结构A多有重合，并且存在一些杂质峰的干扰，因此子结构D在核磁谱上不能完全确证。
本申请发明人还通过分析其他结构相近的中间体的裂解碎片和裂解途径，进一步验证该组分的裂解和结构信息，发现可以很好地归属各相关物质的碎片离子和裂解途径。
综上，杂质(III)的结构为：
Figure GDA0003142878660000092
实施例4杂质(IV)的制备
第一步、中间体2的制备
Figure GDA0003142878660000093
中间体1(36g，193.6mmol)和甲酸乙酯在密封管中100℃下回流2小时，冷却至室温后减压除去溶剂得到中间体2粗品。所得粗品经硅胶柱色谱分离提纯(EA:PE(v/v)＝1:3)得到白色固体中间体2(36g，收率：90％)。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ8.11(s，1H)，7.17(s，1H)，4.02-3.93(m，1H)， 3.63-3.58(m，1H)，3.48-3.20(m，3H)，2.03-1.98(m，1H)，1.81-1.70(m，1H)，1.39(s， 9H)。
第二步、中间体3的制备
Figure GDA0003142878660000101
中间体2(36g，168.2mmol)的DMF溶液冷却至0℃，加入NaH(8.1g，336.4 mmol)和溴苯(43.2g，252.3mmol)。体系在室温下搅拌过夜。向反应液中加入水，用乙酸乙酯萃取后减压浓缩除去溶剂得到中间体3粗品，直接用于下一步。
第三步、中间体4的制备
Figure GDA0003142878660000102
将上步所得中间体3溶于DCM(300mL)中，加入TFA(300mL)，室温搅拌过夜。减压浓缩除去溶剂。加入水和DCM萃取，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩。残留物用硅胶柱色谱纯化(EA:PE(v/v)＝1:1)得到白色固体中间体4(18 g，收率：84％)。
第四步、中间体5的制备
Figure GDA0003142878660000103
0℃下向中间体4(18g，88.2mmol)的DMF溶液中加入NaH(8.1g，176.5mmol) 和溴乙酸叔丁酯(26g，132.4mmol)。室温反应过夜。反应混合物中加入水，用乙酸乙酯萃取。减压浓缩除去溶剂，残留物经硅胶柱色谱纯化(EA:PE(v/v)＝1:3) 得到无色液体中间体5(24g，收率：85％)。
MS(ESI)m/z＝319.3(M+H)+
第五步、中间体6的制备
Figure GDA0003142878660000111
中间体5(24g，75.5mmol)溶于DCM(300mL)中，加入TFA(300mL)，室温反应4h。减压浓缩除去溶剂。残留物经制备液相纯化得到白色固体中间体6(7.5g，收率：38％)。
MS(ESI)m/z＝263.2(M+H)+。
第七步、中间体7的制备
Figure GDA0003142878660000112
反应瓶中加入中间体6(7.5g，28.6mmol)，2-甲基四氢呋喃(50mL)和4-甲基吗啉(10mL)。冷却至0℃，加入氯甲酸异丁酯(5.86g，42.9mmol)，0℃搅拌0.5h 后，加入(R)-2-((3aS,4S,6S,7aR)-3a,5,5-三甲基六氢-4,6-甲基苯并[d][1,3,2]二氧杂硼杂环戊二烯-2-基)吡咯烷盐酸盐的4-甲基吗啉溶液(5mL)，室温反应2h。加入 NaHCO3溶液淬灭反应，用MTBE萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物经制备色谱纯化得到白色固体中间体7(4.6g，收率：33％)。
第八步、中间体8的制备
Figure GDA0003142878660000121
中间体7(4.6g，9.3mmol)的甲醇(200mL)溶液中加入Pd/C(500mg)，室温下通入氢气氢化反应过夜。垫硅藻土过滤，滤液减压浓缩，得到中间体8粗品，直接用于下一步反应。
第九步、杂质(IV)的制备
Figure GDA0003142878660000122
上步所得中间体8粗品中加入水(200mL)，室温下加入苯硼酸(1.25g，10.3 mmol)和MTBE(200mL)，室温反应1h。去除MTBE层后再加入MTBE，重复此操作5次。去除MTBE后水相经冻干，得到浅黄色固体杂质(IV)(1.25g，收率：49.8％)。
1H NMR(500MHz，CD3OD+CF3CO2D)δ8.21(s，1H)，4.07-3.96(m，3H)，3.85-3.81(m，2H)，3.68-3.34(m，4H)，3.33-3.32(m，1H)，2.46-2.43(m，1H)， 2.17-2.01(m，4H)，1.79-1.73(m，1H)。
实施例5杂质(IV)的检测
色谱条件：
流动相：25mmol/L SDS水溶液:乙腈:三氟乙酸＝800:200:1为流动相A，25 mmol/LSDS水溶液:乙腈:三氟乙酸＝500:500:1为流动相B；
柱温：60±5℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：50uL；
检测波长：210nm；
洗脱条件如下表3所示：
时间(分钟) 流动相A(％V/V) 流动相B(％V/V)
0.0 100 0
35.0 100 0
36.0 0 100
50.0 0 100
50.1 100 0
70 100 0
1、溶液配制及检测
A、供试品溶液的制备：
取度格列汀L-酒石酸盐适量，精密称定，加流动相A溶解并制成每1mL中约含度格列汀L-酒石酸盐6.4mg的溶液，作为供试品溶液；
精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，作为自身对照溶液；
B、另称取杂质(IV)对照品适量，加流动相A溶解并定量稀释制成每1mL 分别含0.5μg的溶液，作为杂质定位溶液；
C、检测方法：
分别精密量取供试品溶液、对照溶液及杂质定位溶液各50μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按自身对照法计算杂质(IV)的含量。
2、测定结果
按照上述方法，对三批度格列汀的盐供试品进行检测，结果见表4：
表4
样品批号 杂质(IV)含量(％)
160701-DGLT-S 0.06
160702-DGLT-S 0.05
160801-DGLT-S 0.07
对该检测方法进行方法学验证，结果表明：该方法1)、能分离酸、碱、氧化、光照、高温、高湿破坏的降解物及各个杂质，各杂质与主峰分离度良好；2)、杂质(IV)的标准曲线在0.0044-0.0888mg/mL(相当于供试品溶液的0.069％～1.388％) 浓度范围内，回归方程为y＝55903x-4.2644，R2＝0.9999；3)、杂质(IV)的最低定量浓度为677.7ng/mL(相当于供试品溶液的0.0106％)，最低定量限为33.88ng； 4)、该方法的准确度、精密度高，耐受性好。
对比实施例6
仅改变实施例1中SDS溶液的浓度，其他条件不变，按照实施例1的检测条件试验不同SDS浓度时的检测结果，结果见表5。
表5
Figure GDA0003142878660000141
由试验结果可知，在试验的SDS浓度大于23mmol/L时，主峰与在后杂质(I) 的分离度大于1.5，可满足检测要求。考虑到SDS浓度增大对系统的伤害，选择 SDS浓度范围为23-27mmol/L。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种度格列汀及其盐的杂质(I)-(III)的检测方法，所述杂质(I)-(III)具有以下结构：
Figure FDA0003278700190000011
其特征在于采用以下步骤检测：
(1)、溶液制备：取度格列汀的盐适量，精密称定，加入流动相A做溶剂，溶解并制成每1mL中约含度格列汀的盐0.8mg的溶液，作为供试品溶液；
精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，作为自身对照溶液；
另称取度格列汀的盐约8mg，置10mL量瓶中，加0.1％双氧水1.0mL放置10分钟，加流动相A稀释至刻度，作为分离度溶液；
(2)、检测方法：分别取供试品溶液、自身对照溶液和分离度溶液，注入液相色谱仪，以流动相A和B洗脱，记录色谱图；
(3)、含量计算：按自身对照法计算杂质(I)-(III)的含量；
其中，流动相A和B均为由SDS水溶液、乙腈和三氟乙酸组成的混合溶液；
所述检测方法使用的流动相A中SDS水溶液:乙腈:三氟乙酸＝600:400:1，流动相B中SDS水溶液:乙腈:三氟乙酸＝400:600:1，洗脱方式为梯度洗脱。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述流动相A和B中SDS水溶液的浓度均为23-27mmol/L。
3.一种度格列汀及其盐的杂质(IV)的检测方法，所述杂质(IV)具有以下结构：
Figure FDA0003278700190000012
其特征在于采用以下步骤检测：
(1)、溶液制备：取度格列汀的盐适量，精密称定，加流动相A溶解并制成每1mL中约含度格列汀的盐6.4mg的溶液，作为供试品溶液；
精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，作为自身对照溶液；
另称取杂质(IV)对照品适量，加流动相A溶解并定量稀释制成每1mL分别含0.5μg的溶液，作为杂质定位溶液；
(2)、检测方法：分别取供试品溶液、对照溶液和杂质定位溶液，注入液相色谱仪，以流动相A和B洗脱，记录色谱图；
(3)、含量计算：按自身对照法计算杂质(IV)的含量；
其中，流动相A和B均为由SDS水溶液、乙腈和三氟乙酸组成的混合溶液；
所述检测方法中使用的流动相A为25±1mmol/L的SDS水溶液:乙腈:三氟乙酸＝800:200:1，流动相B为：25±1mmol/L的SDS水溶液:乙腈:三氟乙酸＝500:500:1。
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