CN117658991A - 一种异型双功能交联剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种异型双功能交联剂及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117658991A
CN117658991A CN202311657366.1A CN202311657366A CN117658991A CN 117658991 A CN117658991 A CN 117658991A CN 202311657366 A CN202311657366 A CN 202311657366A CN 117658991 A CN117658991 A CN 117658991A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dnim
nhs
reaction
compound
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311657366.1A
Other languages
English (en)
Inventor
罗群峰
华耀光
刘书利
谢赛赛
史林静
李俊成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanchang University
Original Assignee
Nanchang University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanchang University filed Critical Nanchang University
Priority to CN202311657366.1A priority Critical patent/CN117658991A/zh
Publication of CN117658991A publication Critical patent/CN117658991A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种异型双功能交联剂及其制备与应用，本发明提供的异形双功能交联剂是一类含有N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和二硝基咪唑官能团(DNIm)的双功能交联剂，可以将含有氨基的化合物与含有巯基的化合物连接在一起；本发明提供的交联剂的DNIm模块相比马来酰亚胺模块，性质更稳定；此外，DNIm与巯基的加成产物相比马来酰亚胺与巯基的加成产物也更稳定，在近中性的缓冲液中，LC‑MS分析未发现DNIm与氨基加成的副反应产物，即在该条件下，不与氨基发生加成反应；本发明提供的交联剂可应用于不同尺寸的环肽构建，以及蛋白质的巯基或氨基选择性单修饰，包括生物素化、PEG化、或引入荧光物质，以及单个蛋白分子的双修饰，包括生物素化与PEG化。

Description

一种异型双功能交联剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于异型双功能交联剂领域，具体涉及一种异型双功能交联剂及其制备方法与应用。
背景技术
异型双功能交联剂SMCC是一类含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂，可以分别将含有巯基和氨基的化合物键接在一起，作为链接子将抗体与毒素分子连接起来，在免疫实验、肿瘤成像的放射性标记中应用广泛。
然而，SMCC的马来酰亚胺模块性质不稳定，容易被水解；其与巯基的加成产物也易水解；而且该模块除了主要与巯基反应之外，一定程度上还会与氨基发生副反应。
因此，需要开发一种新的方案来改善以上问题。
发明内容
本发明旨在提供一种异型双功能交联剂及其制备方法与应用，改善现有的SMCC双功能交联剂中马来酰亚胺模块性质不稳定，容易被水解；其与巯基的加成产物也易水解；而且该模块除了主要与巯基反应之外，一定程度上还会与氨基发生副反应的问题。
一方面，本发明提供一种异型双功能交联剂，所述双功能交联剂命名为DNIm-NHS，结构式如式l所示：
第二方面，本发明提供一种异型双功能交联剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将化合物2、缩合剂、N-羟基丁二酰亚胺依次加入第一溶剂后，常温下搅拌15-16h，经浓缩纯化，制得如式I所示的异型双功能交联剂；所述化合物2为6-((1，4-二硝基-1H-咪唑-2-基)甲氧基)己酸；
可选地，将化合物2、缩合剂、N-羟基丁二酰亚胺依次加入第一溶剂步骤中，所述化合物2、缩合剂、N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1∶(1.0-1.2)∶(1.0-1.2)。
可选地，缩合剂包括化学合成中常用缩合剂，包括二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。
可选地，第一溶剂包括二氯甲烷、氯仿、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜。
可选地，第一溶剂可以为一种纯溶剂或多种可选溶剂的混合溶液。
可选地，纯化包括硅胶柱层析。
第三方面，本发明提供一种异型双功能交联剂在环肽构建中的应用。
第四方面，本发明提供一种异型双功能交联剂在蛋白质的化学修饰中的应用。
可选地，所述应用包括蛋白质生物素化、蛋白质PEG化、蛋白质中荧光物质的引入。
可选地，所述应用包括含N-羟基琥珀酰亚胺活性酯、二硝基咪唑官能团中至少一种的修饰试剂的制备。
第五方面，本发明提供一种异型双功能交联剂在药物制备中的应用。
本发明具备的有益效果包括：
(1)本发明提供的双功能交联剂DNIm-NHS的化学性质更稳定，保质期更久；
(2)本发明提供的双功能交联剂可应用于环肽的构建、蛋白质的单修饰，双修饰等领域；
(3)本发明提供的双功能交联剂反应产生的交联产物的化学性质更稳定，这也使得利用该交联剂DNIm-NHS所制备的药物分子等更稳定；
(4)本发明提供的交联剂中具备DNIm模块，相比马来酰亚胺模块而言，对巯基的选择性更高，因而本发明的交联剂DNIm-NHS对巯基、氨基有更好的生物正交性，可避免DNIm模块与氨基的加成副产物生成。
附图说明
图1为实施例1中异型双功能交联剂的制备方法示意图；
图2为实施例1中制备得到的交联剂DNIm-NHS的1H NMR谱图；
图3为实施例1中制备得到的交联剂DNIm-NHS的13C NMR谱图；
图4为实施例1中制备得到的化合物2的1H NMR谱图；
图5为实施例2中多肽P1与DNIm-NHS的大环化反应过程图及产物的HPLC表征结果；
图6为实施例3中多肽P2与DNIm-NHS的大环化反应过程图及产物的HPLC表征结果；
图7为实施例4中多肽P6与DNIm-NHS的大环化反应过程图及产物的HPLC表征结果；
图8为实施例5中DNIm-NHS与biotin-NH2的反应方程式及反应HPLC图；
图9为实施例5 DNIm-NHS与biotin-NH2反应产物11a的串联质谱碎片分析及其HRMS/MS图；
图10为实施例5中DNIm-NHS与Dansyl-NH2的反应方程式及反应的HPLC图；
图11为实施例5中DNIm-NHS与Dansyl-NH2反应产物12a的串联质谱碎片分析及其HRMS/MS图；
图12为为实施例5中DNIm-NHS与Dansyl-NH2反应副产物13a的串联质谱碎片分析及其HRMS/MS图
图13为实施例5中DNIm-NHS与Furazan-NH2的反应方程式及反应的HPLC图；
图14为实施例5中DNIm-NHS与Furazan-NH2反应产物14a的串联质谱碎片分析及其HRMS/MS图；
图15为实施例5中DNIm-NHS与Furazan-NH2反应副产物15a的串联质谱碎片分析及其HRMS/MS图；
图16为实施例5中DNIm-NHS与不同分子量NH2-PEG-OH或SH-PEG-OH的反应过程及反应HPLC图；
图17为实施例5中2000Da的NH2-PEG-OH的MALDI-TOF图及与DNIm-NHS反应后产物16a的MALDI-TOF图；
图18为实施例5中5000Da的NH2-PEG-OH的MALDI-TOF图及与DNIm-NHS反应后产物17a的MALDI-TOF图；
图19为实施例5中2000Da的SH-PEG-OH的MALDI-TOF图及与DNIm-NHS反应后产物18a的MALDI-TOF图；
图20为实施例1中制备的DNIm-NHS的DNIm模块与Ac-Cys的巯基的反应示意及其HPLC图；
图21为性能验证中DNIm模块与Ac-Cys的巯基的反应后的产物1a的串联质谱碎片分析及高分辨串联质谱图；
图22为性能验证中DNIm模块与Ac-Cys的巯基的反应后的产物2a的串联质谱碎片分析及高分辨串联质谱图；
图23为实施例1中制备的DNIm-NHS的NHS模块与Ac-Lys的氨基的反应示意及其HPLC图；
图24为性能验证中NHS模块与Ac-Lys的氨基的反应后的产物3a的串联质谱碎片分析及高分辨串联质谱图；
图25为性能验证中修饰剂与BSA、3CL、Lysozyme的反应示意图；
图26为性能验证中修饰剂与蛋白质反应得到的单修饰蛋白质修饰物的表征结果：
图27为性能验证中修饰剂与蛋白质反应得到的双修饰蛋白质修饰物的表征结果：
图28为DNIm-NHS应用于构建环肽、修饰蛋白的反应过程示意图。
具体实施方式
本发明将结合说明书附图，通过以下实施例作进一步说明。
一方面，本发明实施例提供一种异型双功能交联剂，所述双功能交联剂命名为DNIm-NHS，结构式如式I所示：
第二方面，本发明实施例提供一种异型双功能交联剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将化合物2、缩合剂、N-羟基丁二酰亚胺依次加入第一溶剂后，常温下搅拌15-16h，浓缩纯化，制得如式l所示的异型双功能交联剂；所述化合物2为6-((1，4-二硝基-1H-咪唑-2-基)甲氧基)己酸；
一些实施例中，将化合物2、缩合剂、N-羟基丁二酰亚胺依次加入第一溶剂步骤中，所述化合物2、缩合剂、N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1∶(1.0-1.2)∶(1.0-1.2)。
具体的，所述第一溶剂包括二氯甲烷、氯仿、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜中至少一种。
第三方面，本发明实施例提供一种异型双功能交联剂在环肽构建中的应用。
第四方面，本发明实施例提供一种异型双功能交联剂在蛋白质的化学修饰中的应用。
一些实施例中，所述应用包括蛋白质生物素化、蛋白质PEG化、蛋白质中荧光物质的引入。
具体地，所述应用包括含N-羟基琥珀酰亚胺活性酯、二硝基咪唑官能团中至少一种的修饰试剂的制备。
第五方面，本发明提供一种异型双功能交联剂在药物制备中的应用。
实施例1
本发明实施例1提供一种异型双功能交联剂(DNIm-NHS)的制备方法，包括以下步骤：
S1、将130mg(0.43mmol)化合物2、97mg(0.47mmol)DCC、54mg(0.47mmol)N-羟基丁二酰亚胺(NHS)依次加入单口烧瓶中，于25℃下搅拌15.5h；
S2、搅拌完成后通过旋转蒸发仪进行浓缩，得到浓缩物一；
将浓缩物一以快速硅胶柱层析进行纯化，石油醚和乙酸乙酯的体积比为10∶6；
纯化完成后，制得白色无定形固体127mg，产率为74％；经高分辨质谱(HRMS)及核磁共振(NMR)，白色无定形固体鉴定为式I所示异型双功能交联剂，即为目标化合物1：DNIm-NHS；化合物2为6-((1，4-二硝基-1H-咪唑-2-基)甲氧基)己酸，化合物2的结构式及实施例1中的反应过程如图1所示；
目标化合物1的1H NMR谱如图2所示，13C NMR谱如图3所示，表征数据如下所示：
1H NMR(400MHz，MeOD)δ9.02(s，1H)，4.85(s，2H)，3.64(t，J＝6.3Hz，2H)，2.83(s，4H)，2.63(t，J＝7.2Hz，2H)，1.75(m，2H)，1.66(m，2H)，1.50(m，2H).
13C NMR(100MHz，MeOD)δ170.5，168.9，142.3，142.2，116.3，70.9，65.0，30.1，28.6，25.1，24.9，24.0.
HRMS(ESI)m/z calcd.for C14H17N5NaO9 +[M+Na]+422.0918，found 422.0910.
在执行步骤S1前，需进行化合物2的合成，包括以下步骤：
S11、在0℃，向反应瓶中加入1.15g的化合物m0(1H-咪唑-2-羧酸乙酯，8.20mmol)和5.0mL浓H2SO4(93mmol)；用注射器向其中缓慢滴加1.0mL发烟HNO3(24mmol)；55℃下搅拌6h后冷却至室温。然后将反应混合物倒入冰块中，所得沉淀过滤，晾干，得白色固体化合物ml(0.91g，产率60％)；
S12、向装有冷凝器的25mL两颈圆底反应瓶中加入0.580g无水K2CO3(4.20mmol)和0.485g化合物m1(2.62mmol)，氮气保护下用注射器加入3.0mL含0.39mL对甲氧基氯化苄PMBCl(2.9mmol)的干燥DMF溶液；115℃下搅拌12h，在冰浴中冷却，过滤，所得沉淀物用乙酸乙酯洗涤；洗涤完成后，合并滤液，浓缩，经快速硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝10/3，v/v)，得白色固体m2(0.61g，产率76％)，低分辨质谱鉴定为目标物；
S13、将一单颈圆底烧瓶置于冰浴冷却，向其中加入0.305g化合物m2(1.0mmol)和6mL干燥的四氢呋喃THF；快速搅拌下，分批加入0.057g氢化铝锂LiAlH4(1.5mmol)。2h后，在0℃下，依次用2.0mL冰水和3.0mL饱和NaHCO3淬灭反应，所得鲜红色粘稠液体经硅藻土辅助过滤，用乙酸乙酯进行洗涤，合并滤液，滤液用无水硫酸钠干燥，浓缩，经快速硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/1，v/v)，得到白色固体m3(0.146g，收率56％)，核磁1H NMR鉴定为目标物；
S14、冰浴下，向单口烧瓶中加入1600mg化合物m9(6-羟基己酸乙酯，10.0mmol)、2mL三乙胺TEA(15.0mmol)和20.0mL二氯甲烷DCM；剧烈搅拌，然后将含2286mg对甲苯磺酰氯TsCl(12mmol)的DCM溶液(10.0mL)小心加入其中；室温反应5h；将反应液浓缩，经快速硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝10/1，v/v)得透明油状液体m8(2170mg，收率69％)；
S15、室温下，向一两颈烧瓶中加入130mg化合物m3(0.50mmol)和18mgNaH(0.75mmol)；在氩气Ar2保护下，通过注射器依次加入1.0mL干燥的DMF溶液和1mL溶解235mg化合物m8(0.75mmol)的DMF溶液；继续反应22h，用50mL DCM稀释，用饱和NH4Cl溶液中和；水层用DCM萃取(20mL×2)，将有机层合并，用饱和食盐水洗涤(5mL×2)，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩；经快速硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝10/7，v/v)，得化合物m4，黄绿色油状物(105mg，收率52％)；低分辨质谱鉴定为目标物；
S16、向一单颈烧瓶中依次加入80mg化合物m4(0.20mmol)、4.0mL三氟乙酸TFA和0.4mL茴香醚anisole；在95℃下反应2.5h，薄层色谱分析显示底物反应完成；混合物经浓缩、快速硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯/MeOH＝10/5/0.2，v/v/v)，得化合物m5，为透明油状物(37mg，收率66％)；低分辨质谱鉴定为目标物；
S17、向一单口烧瓶中依次加入37mg化合物m5(0.13mmol)、1.0mL THF、16mgLiOH·H2O(0.35mmol)和1mL水；室温下搅拌4h，然后用稀释的NaHCO3溶液中和；水层用乙醚(4mL×2)洗涤，甲酸酸化，然后用乙酸乙酯萃取(15mL×3)合并有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，真空干燥，得化合物m6，为白色固体(30mg，收率90％)；
S18、冰浴下，向一单口烧瓶中依次加入2mL CH3COOH、130μL Ac2O(1.33mmol)和50μL发烟HNO3(1.10mmol)；将混合物在室温下搅拌2h，然后在0℃下加入30mg化合物m6(0.12mmol)，然后将其转移到室温下继续搅拌8h，直到原料完全消耗；向反应瓶中加入二氯甲烷(20mL×3)及10mL水，有机相用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，真空干燥，得淡黄色固体(30mg，收率83％)；经核磁1H NMR鉴定为化合物2；
步骤S11-S18制得的化合物与已知文献的方法中制得的化合物(Dinitroimidazoles as bifunctional bioconjugation reagents for proteinfunctionalization and peptide macrocyclization)均一致；
化合物2的1H NMR谱图如图4所示，表征数据如下所示：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.54(s，1H)，4.83(s，2H)，3.58(t，J＝6.4Hz，2H)，2.34(t，J＝7.4Hz，2H)，1.67-1.57(m，4H)，1.39(m，2H).
实施例2
本发明实施例2提供一种DNIm-NHS在环肽4a构建中的应用，包括以下步骤：
取一定体积的浓溶液多肽P1，加入至1mL pH＝8.0的100mM的HEPES溶液中，使多肽P1的终浓度为1mM；
将实施例1中制备得到的DNIm-NHS溶于乙腈，配置浓溶液，取适量体积的该浓溶液，加入至上述HEPES缓冲液中，使DNIm-NHS终浓度为1mM；
25℃震荡混匀，反应0.5h，制得环肽4a，产率为90％。
实施例2构建环肽时的反应过程如图5A所示；DNIm-NHS与多肽P1的反应及其以多肽P1为对照组的高效液相色谱(HPLC)图如图5B所示；
并且，对多肽P1和环肽4a分别通过HRMS进行表征，数据如下：
多肽P1：HRMS(ESI)m/z calcd.for C26H46N10O10SK+[M+K]+729.2751，found729.2725.
环肽4a：HRMS(ESI)m/z calcd.for C36H57N13O14SK+[M+K]+966.3500，found966.3476.。
实施例3
本发明实施例3提供一种DNIm-NHS在环肽5a构建中的应用，与实施例2的不同之处在于构建时使用的多肽为多肽P2；以多肽P2为对照组；
实施例3构建环肽时的反应过程如图6A所示；DNIm-NHS与多肽P2的反应及其对照实验的HPLC图如图6B所示；多肽P2订购于江苏申琅生物科技有限公司；
环肽5a通过HRMS进行表征，数据如下：HRMS(ESI)m/z calcd.for C43H60N13O10S2 +[M+H]+982.4022，found 982.4040.。
实施例4
本发明实施例4提供一种DNIm-NHS在环肽10a构建中的应用，与实施例2的不同之处在于构建时使用的多肽为多肽P6；
实施例4构建环肽时的反应过程如图7A所示；DNIm-NHS与多肽P6的反应及其以多肽P6作为对照的HPLC图如图7B所示；
并且，对多肽P6和环肽10a分别通过HRMS进行表征，数据如下：
多肽P6：HRMS(ESI)m/z calcd.for C59H80N17O18S+[M+H]+1346.5582，found1346.5575.
环肽10a：HRMS(ESI)m/z calcd.for C69H91N20O22S+[M+H]+1583.6332，found1583.6338.。
实施例5
本发明实施例5提供一种含DNIm或NHS活性酯的功能修饰试剂的制备及其表征，包括以下步骤：
1.含有DNIm官能团的修饰试剂的制备：
D1、将DNIm-NHS分别与生物素胺biotin-NH2、荧光基团胺Dansyl-NH2、荧光基团胺Furazan-NH2、2000Da聚乙二醇胺NH2-PEG-OH和5000Da聚乙二醇胺NH2-PEG-OH溶解于pH 7.5的HEPES缓冲液中，25℃反应2h；反应体系中DNIm-NHS、biotin-NH2、Dansyl-NH2、Furazan-NH2、NH2-PEG-OH的终浓度均为1mM；
D2、反应完成后，DNIm-NHS与生物素胺biotin-NH2的反应一中制得含有DNIm官能团和生物素基团的修饰试剂11a；DNIm-NHS与荧光基团胺Dansyl-NH2的反应二中制得含有DNIm官能团和荧光基团Dansyl的修饰试剂12a，且生成副产物13a；DNIm-NHS与荧光基团胺Furazan-NH2的反应三中制得含有DNIm官能团和Furazan荧光基团的修饰试剂14a，且反应生成副产物15a；DNIm-NHS与2000Da的NH2-PEG-OH的反应四中制得含有DNIm官能团和PEG分子的修饰试剂16a；DNIm-NHS与5000Da的NH2-PEG-OH的反应五中制得含有DNIm官能团和PEG分子的修饰试剂17a；
D3、为了对反应四、五的产物进行MALDI-TOF分析，先将其以制备型HPLC分离纯化，所有产物峰一并收集，得到收集液；选择化合物7，7，8，8-四氰基醌二甲烷作为基质与收集液共孵育，以便进行MALDI-TOF分析；2000Da的NH2-PEG-OH和5000Da的NH2-PEG-OH作为对照，也通过MALDI-TOF进行分析；
D4、以高效液相色谱(HPLC)以及高分辨串联质谱(HRMS/MS)或基质辅助激光解析-飞行时间质谱(MALDI-TOF)技术对制得的修饰试剂及反应副产物进行表征：
反应一的反应过程如图8A所示及HPLC的表征结果如图8B所示，产物11a的串联质谱碎片分析如图9A所示，HRMS/MS表征如图9B所示；
反应二的反应过程如图10A所示及HPLC的表征结果如图10B所示，产物12a的串联质谱碎片分析如图11A所示，HRMS/MS表征如图11B所示；副产物13a的串联质谱碎片分析如图12A所示，HRMS/MS表征如图12B所示；
反应三的反应过程如图13A所示及HPLC的表征结果如图13B所示，产物14a串联质谱碎片分析如图14A所示，HRMS/MS表征如图14B所示；副产物15a的串联质谱碎片分析如图15A所示，HRMS/MS表征如图15B所示；
反应四、五的反应过程如图16A所示及HPLC的表征结果如图16B所示，2000Da的NH2-PEG-OH的MALDI-TOF图如17A所示，反应四的产物16a的MALDI-TOF图如图17B所示；5000Da的NH2-PEG-OH的MALDI-TOF图如18A所示，反应五的产物17a的MALDI-TOF图如图18B所示。
2.含有NHS活性酯官能团的修饰试剂的制备
F1、将DNIm-NHS与含有巯基(-SH)的2000Da聚乙二醇SH-PEG-OH溶于pH为7.0的HEPES缓冲液中，25℃混合均匀，反应0.5h，制得含有NHS活性酯官能团的修饰试剂18a；
F2、以高效液相色谱(HPLC)以及基质辅助激光解析-飞行时间质谱(MALDI-TOF)技术对制得的修饰试剂进行表征；
F3、为了对产物18a进行MALDI-TOF分析，先将其以制备型HPLC分离纯化，将产物峰收集，得到收集液；选择化合物7，7，8，8-四氰基醌二甲烷作为基质与收集液共孵育，以便进行MALDI-TOF分析；2000Da的SH-PEG-OH作为对照，也通过MALDI-TOF进行分析；
修饰试剂18a的反应过程如图16A所示及HPLC的表征结果如图16B所示；2000Da的SH-PEG-OH的MALDI-TOF图如19A所示，18a的MALDI-TOF图如图19B所示。
性能验证
1.实施例1中制备的交联剂DNIm-NHS的生物正交性验证：
J1、将DNIm-NHS与N-乙酰-L-半胱氨酸(Ac-Cys)在pH 6.5或7.4的HEPES缓冲液中反应2.5min；通过HPLC及HRMS/MS分析，表明发生反应的模块为DNIm；反应过程如图20A所示；反应产物1a的串联质谱碎片分析及碎片分子量如图21A所示，高分辨串联质谱图结果如21B所示；
将无NHS酯官能团的化合物3与Ac-Cys在pH7.4的HEPES缓冲液中的反应过程如图20B所示；反应产物2a的串联质谱碎片分析及碎片分子量如图22A所示，高分辨串联质谱图结果如22B所示；
DNIm-NHS及化合物3分别与Ac-Cys反应的HPLC分析结果如图20C所示；
J2、将DNIm-NHS与Nα-乙酰-L-赖氨酸(Ac-Lys)在pH 7.4或8.0的HEPES缓冲液中反应30min；通过HPLC及HRMS/MS分析，表明发生反应的模块为NHS；反应过程及结果如图23A所示；反应产物3a的串联质谱碎片分析及碎片分子量如图24A所示，高分辨串联质谱图结果如24B所示；
将无NHS官能团的化合物3与Ac-Lys在pH7.4或8.0的HEPES缓冲液中反应30mi，无反应发生，如图23B所示；
DNIm-NHS及化合物3分别与Ac-Lys反应的HPLC分析结果如图23C所示。
2.实施例5中制备的蛋白修饰剂对蛋白质的修饰作用的验证，包括以下步骤：
(1)蛋白质的单修饰：
G1、将实施例5制备得到的含官能团DNIm的修饰剂11a、12a、14a、16a、17a分别与蛋白质牛血清白蛋白(BSA)，25℃条件下，在中性HEPES缓冲溶液中孵育1h；12a、14a、16a、17a的反应过程如图25所示；11a的反应过程及结果在蛋白质的双修饰中说明、展示；
G2、将实施例5制备得到的含官能团DNIm的修饰剂12a、14a分别与新冠病毒主蛋白酶(3CL)，25℃条件下，在中性HEPES缓冲溶液中孵育1h，反应过程如图25所示；
G3、将实施例5制备得到的含官能团NHS的修饰剂18a分别与溶菌酶(Lysozyme)和BSA在pH＝7.5的HEPES缓冲液中，25℃孵育2.5h；反应过程如图25所示；
将相应的蛋白，包括BSA、3CL、Lysozyme加入HEPES缓冲液中，终浓度与对应的处理组保持一致，作为空白对照组；
G4、修饰剂11a中含生物素基团，使用westernblot进行分析，结果如图19A(泳道8、9)所示；结果均显示含有生物素基团，表明向BSA分子中成功引入生物素基团；
修饰剂12a分子中含Dansyl荧光基团，采用SDS-PAGE及302nm激发成像分析，结果如图26A和26C所示；
结果证明BSA成功引入Dansyl荧光基团；且对于3CL蛋白，随着修饰试剂浓度的增加，荧光强度增强；
14a分子中含Furazan荧光基团，采用SDS-PAGE及蓝光(440-485nm)激发成像分析，结果如图26B和26D所示，与对应的空白对照组相比，表明成功引入Furazan荧光基团；且对于3CL蛋白，随着修饰试剂浓度的增加，荧光强度增强；
16a与17a分别含PEG 2000Da、PEG 5000Da，采用SDS-PAGE分析，结果如图26F所示，与对应的空白对照组相比，结果表明成功引入PEG；
采用SDS-PAGE技术针对修饰试剂18a所含的特征性PEG基团进行鉴定分析，结果如图26E、F所示；
图中符号“++”均表示加入修饰剂为高浓度；“+”表示加入修饰剂浓度为低浓度；“-”表示不添加修饰剂；
各反应条件如表1所示，浓度均为反应体系中的终浓度：
表1蛋白质单修饰反应体系中各物质终浓度
(2)蛋白质的双修饰：
H1、将BSA与11a以摩尔比1∶10在pH＝8.0的HEPES缓冲液中混匀30min，得到混合溶液一；
H2、向混合溶液一中加入含18a的pH＝7.0的HEPES缓冲液，其中18a与H1中加入的BSA的摩尔比为10∶1，继续反应2.5h；BSA终浓度为25μM反应过程如图27A所示；
H3、反应完成后，所有样品经过Westernblot进行分析，结果如图27B中泳道5所示；
H4、图27B中泳道6与泳道5的不同之处在于加入11a和加入18a的顺序相反；
图27B中泳道7与泳道5的不同之处在于，11a与18a均减少至与BSA的摩尔比为5∶1；
图27B中泳道8、9和3与泳道5的不同之处在于BSA只与11a反应，为蛋白质单修饰，只发生了生物素化修饰；
图27B中框线部分以及图27C中箭头所指，均表明BSA不仅被生物素化修饰而且被PEG化修饰。
结果分析
参见图5-7，本发明实施例1中制备的异型双功能交联剂DNIm-NHS能够应用于环肽的构建；
参见图8-16，本发明提供了一种含DNIm或NHS活性酯的功能修饰试剂的制备；表征结果证实本发明制备得到的功能修饰剂包括了官能团DNIm或官能团NHS活性酯，可用于后续蛋白质的修饰；图16B中聚乙二醇分别与交联剂的反应的HPLC分析也呈现多个不对称的宽峰，可能与原料聚乙二醇为聚合物，均一性较低有关。
参见图17-19，与相应的起始原料PEG相比，产物的最强(中间)峰(各图的B部分)稍向右移动(增加约250m/z)，表明生成了含DNIm或NHS活性酯的PEG产物。
参见图20-24，本发明将两个反应模块DNIm与NHS以恰当的一条氧代脂肪链连接，一端连接至DNIm的C2原子，另一端连接至NHS的羧基碳原子，两个反应模块中间间隔7个原子，形成交联剂DNIm-NHS；当DNIm-NHS与Ac-Cys在pH 6.5或7.4的HEPES缓冲液中反应时，高效液相色谱(HPLC)及高分辨串联质谱(HRMS/MS)分析表明：只有DNIm模块与Ac-Cys的巯基发生了反应，而NHS模块不受影响；当交联剂与Ac-Lys在pH 7.4或8.0的HEPES缓冲液中反应时，HPLC及HRMS/MS分析表明：只有NHS模块与Ac-Lys的氨基发生了反应，而DNIm模块不受影响；这表明，交联剂的两个模块——DNIm与NHS，分别与巯基或氨基反应时，具有良好的生物正交性；
参见图25-27，BSA含1个游离的半胱氨酸巯基，3CL含12个半胱氨酸巯基；11a，12a，14a，16a，17a均含有DNIm活性官能团，可以与BSA和3CL的巯基发生反应，生成相应的修饰产物；实施例中修饰3CL蛋白仅展示了12a和14a修饰的结果；18a含NHS活性酯反应基团，Lysozyme含有6个赖氨酸，BSA含59个赖氨酸；18a可以与Lysozyme或BSA的赖氨酸残基侧链氨基反应，生成相应的蛋白修饰产物；
综上所述，本发明将DNIm与NHS活性酯通过有机合成方法连接，获得异型双功能交联剂DNIm-NHS，如图28所示；本发明制得的DNIm-NHS可应用于不同尺寸的环肽构建，以及蛋白质的巯基或氨基选择性单修饰，包括生物素化、PEG化、或引入荧光物质，以及单个蛋白分子的双修饰：生物素化与PEG化。
虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。

Claims (8)

1.一种异型双功能交联剂，其特征在于，所述双功能交联剂命名为DNIm-NHS，结构式如式I所示：
2.如权利要求1所述的一种异型双功能交联剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将化合物2、缩合剂、N-羟基丁二酰亚胺依次加入第一溶剂后，常温下搅拌15-16h，经浓缩纯化，制得如式l所示的异型双功能交联剂；所述化合物2为6-((1，4-二硝基-1H-咪唑-2-基)甲氧基)己酸。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将化合物2、缩合剂、N-羟基丁二酰亚胺依次加入第一溶剂步骤中，所述化合物2、缩合剂、N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1∶(1.0-1.2)∶(1.0-1.2)。
4.如权利要求1所述的异型双功能交联剂在环肽构建中的应用。
5.如权利要求1所述的异型双功能交联剂在蛋白质的化学修饰中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括蛋白质生物素化、蛋白质PEG化、蛋白质中荧光物质的引入。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括含N-羟基琥珀酰亚胺活性酯、二硝基咪唑官能团中至少一种的修饰试剂的制备。
8.如权利要求1所述的异型双功能交联剂在药物制备中的应用。
CN202311657366.1A 2023-12-05 2023-12-05 一种异型双功能交联剂及其制备方法与应用 Pending CN117658991A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311657366.1A CN117658991A (zh) 2023-12-05 2023-12-05 一种异型双功能交联剂及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311657366.1A CN117658991A (zh) 2023-12-05 2023-12-05 一种异型双功能交联剂及其制备方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117658991A true CN117658991A (zh) 2024-03-08

Family

ID=90080381

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311657366.1A Pending CN117658991A (zh) 2023-12-05 2023-12-05 一种异型双功能交联剂及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117658991A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Beal et al. Click-enabled heterotrifunctional template for sequential bioconjugations
JP6876002B2 (ja) 機能的要素を共有結合により係留させるための細胞透過性、細胞適合性、かつ開裂可能であるリンカー
CN112047996A (zh) 一种通过炔丙基型锍盐选择性修饰半胱氨酸的方法
CA2552304A1 (en) Labeling reagents, labeled analytes, including mixtures thereof, and fragment ions derived therefrom and methods for the analysis thereof
US20090136931A1 (en) Novel fluorescent labeling compound
EP2670755B1 (en) Trifunctional crosslinking reagents
US8435800B2 (en) Activated labeling reagents and methods for preparing and using the same
CN111187247A (zh) 一种微环境敏感型荧光探针的制备方法及其对hsa/bsa检测的应用
JP2002536428A (ja) タンパク質結合のための改良化化合物
CN114133425B (zh) 利用炔丙基锍盐修饰蛋白质半胱氨酸位点的方法及其应用
CN109824565A (zh) 一种光响应性多功能化学交联剂及其制备方法与应用
WO2020195302A1 (ja) 細胞膜透過性環状ペプチド作製用リンカー分子、及びその利用
CN117658991A (zh) 一种异型双功能交联剂及其制备方法与应用
WO2020195303A1 (ja) ペプチド複合体及びその製造方法、並びに前記ペプチド複合体の利用
JP2010533291A (ja) 三官能性擬ペプチド試薬、ならびにその使用および適用
JP3544549B2 (ja) ピリジン誘導体
CN111690039B (zh) 识别6xHis标签蛋白的自组装多肽探针、制备方法及应用
JPS63246382A (ja) ビオチニル試薬及びそれを用いるビオチニル化法
CN109369777B (zh) 一类生物亲和探针分子及其制备方法与应用
CN107383054A (zh) 一种含二硫键长臂生物素及其制备方法
US8710244B2 (en) Dyes and methods of marking biological material
WO2022224968A1 (ja) ポリスルフィド標識用アルキル化剤及びそれを用いたポリスルフィドの標識方法
CN115536566B (zh) 化学交联剂、其制备方法及应用
US20060099604A1 (en) Fluorescent affinity tag to enhance phosphoprotein detection and characterization
CN113121384B (zh) 蛋白质标记用化合物、蛋白质标记用试剂盒以及蛋白质定点标记方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination