WO2020195303A1 - ペプチド複合体及びその製造方法、並びに前記ペプチド複合体の利用 - Google Patents

ペプチド複合体及びその製造方法、並びに前記ペプチド複合体の利用 Download PDF

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WO2020195303A1
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慶士 高津
敏裕 鹿倉
優佳 石場
達也 馬渡
博文 前田
寛士 北
北野　光昭
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株式会社カネカ
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
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    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a cell membrane penetrating peptide complex and a method for producing the same, a peptide library containing the peptide complex, and a method for screening a functional peptide using the peptide library.
  • therapeutic agents for specific diseases and molecules having a high affinity for target molecules have been selected from a peptide (polypeptide) library having various amino acid sequences.
  • a ribosome display method using a ribosome display complex containing a peptide chain, an mRNA molecule, and a ribosome is known (for example, a patent). Reference 1).
  • the RD method if they have in vitro translation system and mRNA, only mixing them, in which very good useful which can be produced 10 12 or more peptide library in a few minutes.
  • Techniques for incorporating the active ingredient into the cell include, for example, a method of fusing the amino acid sequences of a cell membrane penetrating peptide containing a large amount of basic amino acids, and a dendrimer which is a dendrimer polymer having a regularly branched structure from the center.
  • the method to be used see, for example, Patent Document 2 and the like are known.
  • the cell membrane permeability of the active ingredient is low in a short period of time, most of the active ingredient is metabolized before it is taken up by the cells, which may make it difficult to show the drug effect. Therefore, the uptake of the active ingredient into the cell is difficult. It is preferably performed in a short time.
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems in the past and to achieve the following objects. That is, the present invention provides a peptide complex having excellent cell membrane permeability in a short period of time, a method for producing the same, a peptide library containing the peptide complex, and a method for screening a functional peptide using the peptide library. The purpose.
  • the present inventors have a dendritic structure having four or more branches, and of the four or more branches, at least four branches have basic functional groups at the ends. It was found that the cell-penetrating permeability of the peptide complex in a short period of time can be remarkably enhanced by introducing the cell-penetrating-imparting group having the peptide into the peptide.
  • the present invention is based on the above-mentioned findings of the present inventors, and the means for solving the above-mentioned problems are as follows. That is, ⁇ 1> A peptide and a cell membrane permeability-imparting group introduced into the peptide are included.
  • the cell membrane permeability-imparting group has a dendritic structure having four or more branches, and has a dendritic structure. It is a peptide complex characterized by having a basic functional group at the end of at least four of the four or more branches.
  • a step of introducing a cell membrane penetrating molecule into a peptide is included.
  • a method for screening a functional peptide which comprises a step of screening a functional peptide using the peptide library according to the above ⁇ 3>.
  • a peptide complex capable of solving the above-mentioned problems in the past and achieving the above object and having excellent cell membrane permeability in a short time and a method for producing the same, a peptide library containing the peptide complex, and the like. And a method for screening a functional peptide using the peptide library can be provided.
  • the peptide complex of the present invention contains at least a peptide and a cell membrane permeability-imparting group introduced into the peptide, and further contains other configurations as necessary.
  • the peptide is not particularly limited as long as the cell membrane permeability-imparting group can be introduced, and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the type of amino acid in the peptide is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, and may be a natural amino acid, an unnatural amino acid, or a D-form. It may be present or it may be L-form.
  • the peptide may be a modified peptide such as a lipopeptide.
  • the amino acid residue (hereinafter, may be referred to as “reactive amino acid residue”) used for introducing the cell membrane permeability-imparting group is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • reactive amino acid residue for example, cysteine residue, lysine residue, histidine residue, tryptophan residue, tyrosine residue, serine residue, threonine residue and the like can be mentioned.
  • the alcohol side chain at the amino acid residue may be used. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the number of the reactive amino acid residues in the peptide is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the number of the reactive amino acid residues in the peptide is preferably 2 or more.
  • the upper limit of the number of the reactive amino acid residues in the peptide is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but the number of cell membrane permeability-imparting groups that bind to the peptide as the number of reaction sites increases. 10 or less is preferable because the position and position may not be stable and it may be difficult to compare the characteristics of peptides derived from the amino acid sequence.
  • the reactive amino acid residue may be separately introduced into the peptide. preferable.
  • the position of the reactive amino acid residue in the peptide is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • RNA chain an mRNA molecule, a peptide chain which is a translation thereof (hereinafter, may be referred to as “polypeptide chain”), and a ribosome display complex containing ribosome (hereinafter, referred to as “RD complex”).
  • RD complex a ribosome display complex containing ribosome
  • it is a portion protruding from the exit tunnel (exit tunnel) of the ribosome, and specifically, the position (N) from the second N-terminal to the 30th C-terminal. It is preferable to set it between (including the second position from the terminal and the 30th position from the C terminal) in that the modification reaction by the linker molecule can be less likely to be sterically inhibited by the ribosome.
  • the position from the C-terminal the 50th position from the C-terminal is preferable, and the 100th position is more preferable.
  • the position can be appropriately set according to the chain length of the peptide, and is, for example, the 2nd to 1,000th position from the N-terminal.
  • the 2nd to 100th positions from the N-terminal are preferable, and the 2nd to 50th positions from the N-terminal are more preferable.
  • the method for producing the RD complex is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected. Examples thereof include the method described in International Publication No. 2017/213158. It can also be manufactured using a commercially available kit.
  • the amino acid sequence of the peptide is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but one containing a random sequence at a specific position is preferable so as to be useful as a peptide library. From such a random sequence, a useful amino acid sequence can be specified according to a predetermined purpose.
  • the position of the random sequence in the peptide is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the position is not particularly limited. It is preferably between the 2nd position from the N-terminal to the 30th position from the C-terminal (including the 2nd position from the N-terminal and the 30th position from the C-terminal). That is, the reactive amino acid residue is preferably contained in a random sequence. Therefore, the preferred position of the random sequence can be set from the same range as the preferred position of the reactive amino acid residue.
  • the number of the random sequences in the peptide may be one or two or more.
  • the upper limit of the number of the random sequences is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 10 or less.
  • the number of amino acid residues per random sequence is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, and may be, for example, 1 or more and 30 or less. The longer one random sequence and the larger the number of random sequences, the greater the diversity of the peptide library.
  • the peptide may further contain a sequence for purifying a polypeptide chain such as a FLAG® sequence or a polyHis sequence, a sequence selectively cleaved by a protease or the like, a spacer sequence, or the like.
  • a sequence for purifying a polypeptide chain such as a FLAG® sequence or a polyHis sequence, a sequence selectively cleaved by a protease or the like, a spacer sequence, or the like.
  • the number of amino acid residues of the peptide is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, it may be 10 or more and 5,000 or less, but the upper limit thereof is 800 or less. Is preferable, 400 or less is more preferable, and 200 or less is particularly preferable.
  • the method for synthesizing the peptide is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected.
  • the cell membrane permeability-imparting group can be represented by, for example, the following general formula (1).
  • ABC ⁇ ⁇ ⁇ General formula (1) In the general formula (1), "A” represents a peptide linking group, “B” represents a linking group or a single bond, and “C” represents a group having a dendritic structure.
  • the peptide linking group contributes to the introduction of the cell membrane permeability-imparting group into the peptide by reacting with the reactive amino acid residue in the peptide.
  • the reactive amino acid residue is an amino acid residue that reacts with the peptide linking group, may be an amino acid residue that directly reacts with the peptide linking group, or can react with the peptide linking group. It may be an amino acid residue modified to.
  • the peptide-linking group is not particularly limited as long as it can be linked to the peptide, and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the thiol group of the cysteine residue and the side chain amino of the lysine residue can be selected. Examples thereof include a group (-NH 2 ), a group capable of reacting with a side chain amino group (> NH) of a histidine residue or a tryptophan residue to form a bond, and the like.
  • Specific examples of the peptide linking group include alkyl halide groups, activated carbonyl groups, and unsaturated hydrocarbon groups described in paragraphs [0067] to [0076] of International Publication No. 2017/213158.
  • Examples thereof include an epoxy group, a sulfonyl-containing group, an isocyanate group, a thioisocyanate group, a carben generating group, a disulfide bond-containing group and a thiol group.
  • a group represented by the following structural formula can be used as the peptide linking group.
  • the linking group is a group that links the peptide linking group and the group having a dendritic structure.
  • the structure of the linking group is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the cell membrane permeability-imparting group has a dendritic structure having four or more branches, and has a basic functional group at the end of at least four of the four or more branches.
  • the group having a dendritic structure is a group that imparts cell membrane permeability to the peptide.
  • the number of branches in the dendritic structure of the cell membrane permeability-imparting group is not particularly limited as long as it is 4 or more, and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include 6 or more and 9 or more. ..
  • "having 4 or more branches” means the total number of branches of the dendritic structure in the cell membrane permeability-imparting group.
  • the cell membrane permeability-imparting group may have one dendritic structural unit having four or more branches, or may have one dendritic structural unit having three or less branches, and the plurality.
  • the total number of branches in the dendritic structure unit may be 4 or more.
  • the number of dendritic structural units in the cell membrane permeability-imparting group is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, and may be one or two or more.
  • the number of branches per dendritic structural unit is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but 3 or more is preferable.
  • the structure of the branch of the dendritic structure is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the method for producing the group having a dendritic structure is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the group is produced by the method described in US Pat. No. 7,862,807. be able to.
  • the basic functional group is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a guanidino group, an amino group and an imidazole group. Among these, it is preferable to have a guanidino group.
  • the basic functional group may be used alone or in combination of two or more.
  • the number of the basic functional groups is not particularly limited as long as it is 4 or more, and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include 6 or more and 9 or more.
  • the basic functional group preferably has 4 or more guanidino groups.
  • the position of the basic functional group in the cell membrane permeability-imparting group is not particularly limited as long as the basic functional group is located at least at the end of four branches of the dendritic structure, and is appropriately selected according to the purpose. can do.
  • the dendritic structure unit of the group having the dendritic structure include those represented by the following general formula (C).
  • the general formula (C) represents a dendritic structural unit having 3 branches, and "Y" in the formula represents a basic functional group.
  • the basic functional group may be formed at the ends of all branches, or may be formed at the ends of some branches.
  • the cell-penetrating permeability-imparting group is introduced into the peptide by reacting the peptide-linking group in the cell-penetrating-imparting group with a reactive amino acid residue in the peptide. During the reaction, the structure of the peptide linking group changes.
  • cell membrane permeability-imparting group examples include compounds represented by the following structural formulas.
  • the cell membrane permeability-imparting group represented by the following structural formula has a group capable of binding to a peptide by the oximuligation method as a linking group for a peptide, and has a dendritic structure at all ends of three branches. This is an example in which two dendritic structural units having a guanidino group as a basic functional group are linked, and the peptide linking group and the dendritic group are linked via a linking group.
  • "*" represents a linking site with a peptide.
  • the cell membrane permeability-imparting group represented by the following structural formula has a group capable of binding to a peptide by the oximuligation method as a linking group for a peptide, and has a dendritic structure at all ends of all three branches. This is an example in which there are three dendritic structural units having a guanidino group as a basic functional group, and the peptide linking group and the group having the dendritic structure are linked via a linking group.
  • "*" represents a linking site with a peptide.
  • the other constitution of the peptide complex is not particularly limited as long as the effect of the present invention is not impaired, and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • a luminescent substance such as a fluorescent substance, a dye, a radioactive substance, etc.
  • examples thereof include drugs, toxins, nucleic acids, amino acids, sugars, lipids, and various polymers. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the fluorescent substance is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include fluorescent dyes such as fluorescein, rhodamine, coumarin, pyrene and cyanine.
  • the other constitution can be attached to the above-mentioned peptide, for example, directly or via a linking group or the like.
  • the peptide complex of the present invention has excellent cell membrane permeability in a short period of time. Therefore, for example, by using a peptide complex library containing a random sequence and performing screening, a useful amino acid sequence such as excellent cell membrane permeability in a short time and high affinity for a target substance can be identified.
  • the method for producing a peptide complex of the present invention includes at least an introduction step of introducing a cell membrane penetrating molecule into a peptide, and further includes other steps as necessary.
  • the introduction step is a step of introducing a cell membrane penetrating molecule into a peptide (hereinafter, may be referred to as “binding”, “inserting”, or “linking”).
  • the cell membrane permeability-imparting group in the above item peptide complex
  • the cell membrane penetrating group may be introduced into at least one peptide in the reaction product, but it is preferable that the cell membrane penetrating group is introduced into all the peptides.
  • the peptide is the same as that described in the item ⁇ Peptide> of the above (peptide complex).
  • the peptide may be in the form of a peptide library.
  • the cell membrane penetrating molecule is introduced into a peptide and exists as a cell membrane penetrating group in the above item (peptide complex). Therefore, the cell membrane-permeable molecule can be the same as the ⁇ cell membrane permeability-imparting group> of the above-mentioned (peptide complex).
  • the method for producing the cell membrane penetrating molecule is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • a step of forming a cell membrane penetrating group precursor and a peptide in the cell membrane penetrating group precursor For example, a step of forming a cell membrane penetrating group precursor and a peptide in the cell membrane penetrating group precursor.
  • the method of introduction is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • a method of reacting a peptide linking group in the cell membrane penetrating molecule with a reactive amino acid residue in the peptide is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the conditions such as the temperature and time of the reaction are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the other steps are not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a peptide complex purification step.
  • the method for confirming whether or not the obtained peptide complex has a desired structure is not particularly limited, and a known analysis method can be appropriately selected. For example, mass spectrometry and proton nuclear magnetic resonance spectroscopy can be selected. Analytical methods such as method, carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy, ultraviolet spectroscopy, and infrared spectroscopy can be mentioned.
  • the peptide library of the present invention contains at least the peptide complex of the present invention, and further contains other configurations as required.
  • the peptide library may consist only of the peptide complex of the present invention, or may contain a peptide into which the cell membrane permeability-imparting group has not been introduced.
  • the peptide library can be produced in the same manner as described above (method for producing a peptide complex).
  • the method for screening a functional peptide of the present invention includes at least a step of screening a functional peptide using the peptide library of the present invention, and further includes other steps as necessary.
  • the screening method is not particularly limited as long as the peptide library of the present invention is used, and a known method can be appropriately selected.
  • a desired target substance and the peptide library are mixed, a bound peptide complex (for example, RD complex) is selected, RNA is dissociated from the RD complex, and DNA is prepared from the RNA.
  • a bound peptide complex for example, RD complex
  • RNA is dissociated from the RD complex
  • DNA is prepared from the RNA. Examples thereof include a method of screening for a functional peptide having an affinity for the target substance by repeating the step of transcribing to mRNA and preparing an RD complex library again after amplification.
  • the compound C3 represented by the above structural formula was synthesized by the above reaction formula. Specifically, compound C1 (50 mg, 0.159 mmol) was dissolved in methylene chloride (5 mL) and cooled to 0 ° C.
  • compounds C2 (284 mg, 0.239 mmol) and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloric acid synthesized by the same method as described in US Pat. No. 7,862,807.
  • Salt (EDC / HCl) 45.8 mg, 0.239 mmol
  • 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) 32.2 mg, 0.239 mmol
  • the identification data of the compound C4 by 1H NMR was as follows.
  • the cell membrane penetrating molecule G3 represented by the above structural formula was synthesized by the above reaction formula. Specifically, a dioxane hydrochloride solution (4N; 1.0 mL) was added to compound C4 to prepare a solution, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 2 hours. The precipitated white solid was obtained by centrifugation and further washed with diethyl ether (3 times at 3 mL) to obtain a cell membrane penetrating molecule G3 (90 mg, quantitative yield).
  • the identification data of the compound G3 by matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) were as follows. MALDI-TOF MS C 24 H 50 N 14 O 8 Calculated value (M + H +) 663.401, measured value 663.402
  • the resin on which the peptide was formed was used as trifluoroacetic acid (TFA) / water / triisopropylsilane / 3,6-dioxa-1,8-octanedithiol (92.5 / 2.5 / 2.5 / 2.5 (92.5 / 2.5 / 2.5 / 2.5).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the peptide was excised from the resin by immersing it in (volume ratio)) for 3 hours.
  • the obtained peptide (55.0 mg, 30.0 ⁇ mol) was dissolved in DMF (2.5 mL), and 1,3-dibromo-2-propanone (20 mM DMF solution; 1.5 mL, 30 ⁇ mol) and N-methylmorpholine ( 10 mM DMF solution; 6.0 mL, 60 ⁇ mol) was added and stirred at 25 ° C. for 1 hour. Diethyl ether (100 mL) was added thereto to remove the supernatant, and the residue was washed with diethyl ether (100 mL) to obtain compound C5 as a white solid (54.6 mg, 28.9 ⁇ mol, yield 97%). ..
  • CMLYIVPYFSVGC in the structural formula of compound C5 represents the amino acid sequence of the peptide.
  • the identification data of the compound C5 by matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) were as follows. MALDI-TOF MS C 94 H 128 N 15 O 20 S 3 + Calculated value (M + H +) 1882.862, Measured value 1883.140
  • the compound C6 represented by the above structural formula was synthesized by the above reaction formula. Specifically, compound C5 (30 mg, 0.0159 mmol), cell membrane penetrating molecule G3 (52.7 mg, 0.0796 mmol), DMF (0.5 mL) and water (0.05 mL) were mixed and 25 ° C. Was stirred for 24 hours. Diethyl ether (5 mL) was added and centrifugation was performed to remove the supernatant. The crude product of compound C6 was obtained by washing the residue with diethyl ether (3 times at 3 mL). Compound C6 (3.8 mg, 0.00150 mmol, yield 9%) was obtained by purification by reverse phase HPLC (high performance liquid chromatography) and lyophilization.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the peptide complex G3-P represented by the above structural formula was synthesized by the above reaction formula. Specifically, compound C6 and a 20% piperidine / DMF solution (1.0 mL) were mixed and stirred at 25 ° C. for 2 hours using a vortex mixer. Nitrogen gas was sprayed to volatilize the solvent. The residue was washed with diethyl ether (1 mL 3 times). Here, fluorescein isothiocyanate (FITC) (0.8 mg, 0.002 mmol), diisopropylethylamine (iPr 2 EtN) (0.0022 mL, 0.0124 mmol) and DMF (0.5 mL) are mixed and 20 at 25 ° C. Stirred for hours.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • iPr 2 EtN diisopropylethylamine
  • DMF 0.5 mL
  • the resin on which the peptide was formed was used as trifluoroacetic acid (TFA) / water / triisopropylsilane / 3,6-dioxa-1,8-octanedithiol (92.5 / 2.5 / 2.5 / 2.5 (92.5 / 2.5 / 2.5 / 2.5).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the peptide was excised from the resin by immersing it in (volume ratio)) for 3 hours.
  • the solvent was distilled off by spraying nitrogen gas, and the residue was washed with diethyl ether (10 mL) to obtain compound C7 represented by the following structural formula as a white solid (quantitative yield).
  • the compound C9 represented by the above structural formula was synthesized by the above reaction formula. Specifically, compound C8 (74 mg, 25.5 mmol) and a 20% piperidine / DMF solution (1.0 mL) were mixed and stirred at 25 ° C. for 1 hour. The solvent was volatilized by blowing nitrogen gas onto the reaction solution to obtain a crude compound C9 product as a colorless transparent oil.
  • the cell membrane penetrating molecule G6 represented by the above structural formula was synthesized by the above reaction formula. Specifically, a dioxane hydrochloride solution (4N; 1.0 mL) was added to the crude compound C9 product to prepare a solution, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 2 hours. The precipitated white solid was obtained by centrifugation and further washed with diethyl ether (3 times at 1 mL) to obtain the cell membrane permeable molecule G6 (117 mg, quantitative yield) as a white solid.
  • the compound C10 represented by the above structural formula was synthesized by the above reaction formula. Specifically, compound C5 (30 mg, 0.0159 mmol), cell membrane penetrating molecule G6 (117 mg, 0.0796 mmol), DMF (0.5 mL) and water (0.05 mL) were mixed and 92 at 25 ° C. Stirred for hours. Diethyl ether (5 mL) was added and centrifugation was performed to remove the supernatant. The crude product of compound C10 was obtained by washing the residue with diethyl ether (3 times at 3 mL). Compound C10 (4.7 mg, 0.00141 mmol, yield 9%) was obtained as a white solid by purification by reverse phase HPLC and lyophilization.
  • the peptide complex G6-P represented by the above structural formula was synthesized by the above reaction formula. Specifically, compound C10 and a 20% piperidine / DMF solution (1.0 mL) were mixed and stirred at 25 ° C. for 2 hours using a vortex mixer. Nitrogen gas was sprayed to volatilize the solvent. The residue was washed with diethyl ether (1 mL 3 times). Here, FITC (0.8 mg, 0.002 mmol), diisopropylethylamine (0.0022 mL, 0.0124 mmol) and DMF (0.5 mL) were mixed, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 24 hours.
  • the resin on which the peptide was formed was used as trifluoroacetic acid (TFA) / water / triisopropylsilane / 3,6-dioxa-1,8-octanedithiol (92.5 / 2.5 / 2.5 / 2.5 (92.5 / 2.5 / 2.5 / 2.5).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the peptide was excised from the resin by immersing it in (volume ratio)) for 3 hours.
  • the solvent was distilled off by spraying nitrogen gas, and the residue was washed with diethyl ether (10 mL) to obtain compound C11 represented by the following structural formula as a white solid (quantitative yield).
  • the compound C12 represented by the above structural formula was synthesized by the above reaction formula. Specifically, methylene chloride (10 mL) was added to compound C11 (50 mg, 0.073 mmol) to prepare a solution, which was cooled to 0 ° C. To this, compound C2 (391 mg, 0.329 mmol), EDC / HCl (63.0 mg, 0.329 mmol) and HOBT (44.1 mg, 0.329 mmol) were added in this order, and the mixture was stirred at 0 ° C. for 14 hours. Water (30 mL) was added and the organic layer was separated. The aqueous layer was further extracted with methylene chloride (twice at 30 mL) and the organic layer was mixed.
  • the compound C13 represented by the above structural formula was synthesized by the above reaction formula. Specifically, compound C12 (93 mg, 22.1 mmol) and a 20% piperidine / DMF solution (1.0 mL) were mixed to prepare a solution, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 30 minutes. Nitrogen gas was blown onto the reaction solution to volatilize the solvent. The obtained residue was washed with hexane (3 times at 5 mL) to obtain compound C13 (101 mg, quantitative yield) as a white solid.
  • the cell membrane penetrating molecule G9 represented by the above structural formula was synthesized by the above reaction formula. Specifically, compound C13 and a dioxane hydrochloride solution (4N; 1.0 mL) were mixed to prepare a solution, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 2 hours. The precipitated white solid was obtained by centrifugation and further washed with diethyl ether (3 times at 5 mL) to obtain the cell membrane permeable molecule G9 (148 mg, quantitative yield) as a white solid.
  • the compound C14 represented by the above structural formula was synthesized by the above reaction formula. Specifically, compound C5 (28 mg, 0.0148 mmol), cell membrane penetrating molecule G9 (161 mg, 0.074 mmol), DMF (0.5 mL) and water (0.05 mL) were mixed to prepare a solution. After stirring at 25 ° C. for 12 hours using a vortex mixer, nitrogen gas was blown to volatilize the solvent. The residue was washed with diethyl ether (3 times at 5 mL) to give compound C14 crude product. The compound C14 (6.6 mg, 0.00163 mmol, yield 11%) was obtained as a white solid by purification by reverse phase HPLC and lyophilization.
  • the peptide complex G9-P represented by the above structural formula was synthesized by the above reaction formula. Specifically, compound C14 and a 20% piperidine / DMF solution (1 mL) were mixed and stirred at 25 ° C. for 2 hours using a vortex mixer. Nitrogen gas was sprayed to volatilize the solvent. The residue was washed with diethyl ether (1 mL 3 times). Here, FITC (0.8 mg, 0.002 mmol), diisopropylethylamine (0.0022 mL, 0.0124 mmol) and DMF (0.5 mL) were mixed, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 60 hours.
  • HeLa cells Human cervix adenocarcinoma cell
  • a cell culture medium containing 2 ⁇ M of the peptide complex synthesized in Examples 1 and 2 or Comparative Example 1 under the conditions of 5% (v / v) CO 2 , 37 ° C. Cultured for hours.
  • FluroBrite D-MEM manufactured by Thermo Fisher
  • FCS fetal bovine serum
  • 10% (v / v) GlutaMax manufactured by Thermo Fisher
  • Examples of aspects of the present invention include the following.
  • a peptide and a cell membrane permeability-imparting group introduced into the peptide are included.
  • the cell membrane permeability-imparting group has a dendritic structure having four or more branches, and has a dendritic structure. It is a peptide complex characterized by having a basic functional group at the end of at least four of the four or more branches.
  • ⁇ 2> The peptide complex according to ⁇ 1>, wherein the basic functional group has 4 or more guanidino groups.
  • ⁇ 3> The peptide complex according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 2>, wherein the number of amino acid residues of the peptide is 200 or less.
  • ⁇ 4> The peptide complex according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the cell membrane permeability-imparting group has a dendritic structural unit represented by the following general formula (C).
  • C general formula
  • "Y" represents a basic functional group.
  • the cell membrane permeability-imparting group is the peptide complex according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4> represented by the following structural formula.
  • "*" represents a linking site with a peptide.
  • the cell membrane permeability-imparting group is the peptide complex according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4> represented by the following structural formula.
  • "*" represents a linking site with a peptide.
  • a step of introducing a cell membrane penetrating molecule into a peptide is included.
  • ⁇ 9> The method for producing a peptide complex according to any one of ⁇ 7> to ⁇ 8>, wherein the number of amino acid residues of the peptide is 200 or less.
  • ⁇ 12> The method for producing a peptide complex according to any one of ⁇ 7> to ⁇ 10>, wherein the cell membrane permeability-imparting group is represented by the following structural formula.
  • "*" represents a linking site with a peptide.
  • ⁇ 13> A peptide library comprising the peptide complex according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>.
  • ⁇ 14> A method for screening a functional peptide, which comprises a step of screening a functional peptide using the peptide library according to ⁇ 13>.

Abstract

ペプチドと、前記ペプチドに導入された細胞膜透過性付与基とを含み、前記細胞膜透過性付与基が、４以上の枝を有する樹状構造を有し、前記４以上の枝のうち、少なくとも４つの枝の末端に塩基性官能基を有するペプチド複合体である。

Description

ペプチド複合体及びその製造方法、並びに前記ペプチド複合体の利用
　本発明は、細胞膜透過性のペプチド複合体及びその製造方法、前記ペプチド複合体を含むペプチドライブラリ、及び前記ペプチドライブラリを用いた機能性ペプチドのスクリーニング方法に関する。
　近年、様々なアミノ酸配列のペプチド（ポリペプチド）ライブラリの中から、特定の疾患に対する治療薬や、標的分子に親和性の高い分子などを選択することが行われるようになっている。
　前記ペプチドライブラリの作製方法として、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系の方法として、ペプチド鎖、ｍＲＮＡ分子、及びリボソームを含むリボソームディスプレイ複合体を用いるリボソームディスプレイ法（ＲＤ法）が知られている（例えば、特許文献１参照）。前記ＲＤ法は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系とｍＲＮＡさえあれば、それらを混合するだけで、１０１２種類以上のペプチドライブラリを数分で作製することができる非常に優れた有用なものである。
　また、医薬品の開発においては、タンパク質や核酸などの様々な有効成分を細胞内に効率良く取り込めるようにする技術も重要である。
　有効成分を細胞内に取り込む技術としては、例えば、塩基性アミノ酸を多く含む細胞膜透過ペプチドのアミノ酸配列を融合する方法や、中心から規則的に分枝した構造を有する樹状高分子であるデンドリマーを用いる方法（例えば、特許文献２参照）などが知られている。
　有効成分の短時間での細胞膜透過性が低いと、細胞に取り込まれる前に有効成分の多くが代謝されてしまい、薬効を示しにくくなるおそれがあることから、有効成分の細胞内への取込みは短時間で行われることが好ましい。
　しかしながら、短時間におけるペプチドの細胞膜透過性を向上させることができる技術として十分に満足のいくものは未だ開発されておらず、その速やかな開発が強く求められているのが現状である。
特開２００８－２７１９０３号公報 米国特許第７，８６２，８０７号明細書
　本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、短時間における細胞膜透過性に優れたペプチド複合体及びその製造方法、前記ペプチド複合体を含むペプチドライブラリ、及び前記ペプチドライブラリを用いた機能性ペプチドのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
　前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、４以上の枝を有する樹状構造を有し、前記４以上の枝のうち、少なくとも４つの枝の末端に塩基性官能基を有する細胞膜透過性付与基をペプチドに導入することにより、ペプチド複合体の短時間における細胞膜透過性を顕著に高めることができることを知見した。
　本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
　＜１＞　ペプチドと、前記ペプチドに導入された細胞膜透過性付与基とを含み、
　前記細胞膜透過性付与基が、４以上の枝を有する樹状構造を有し、
　前記４以上の枝のうち、少なくとも４つの枝の末端に塩基性官能基を有することを特徴とするペプチド複合体である。
　＜２＞　ペプチドに、細胞膜透過性分子を導入する工程を含み、
　前記細胞膜透過性分子が、４以上の枝を有する樹状構造を有し、前記４以上の枝のうち、少なくとも４つの枝の末端に塩基性官能基を有することを特徴とするペプチド複合体の製造方法である。
　＜３＞　前記＜１＞に記載のペプチド複合体を含むことを特徴とするペプチドライブラリである。
　＜４＞　前記＜３＞に記載のペプチドライブラリを用いて機能性ペプチドをスクリーニングする工程を含むことを特徴とする機能性ペプチドのスクリーニング方法である。
　本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、短時間における細胞膜透過性に優れたペプチド複合体及びその製造方法、前記ペプチド複合体を含むペプチドライブラリ、及び前記ペプチドライブラリを用いた機能性ペプチドのスクリーニング方法を提供することができる。
（ペプチド複合体）
　本発明のペプチド複合体は、ペプチドと、前記ペプチドに導入された細胞膜透過性付与基とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
＜ペプチド＞
　前記ペプチドとしては、前記細胞膜透過性付与基を導入することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記ペプチドにおけるアミノ酸の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、天然のアミノ酸であってもよいし、非天然のアミノ酸であってもよく、また、Ｄ体であってもよいし、Ｌ体であってもよい。
　前記ペプチドは、リポペプチドなどの修飾型ペプチドであってもよい。
　前記細胞膜透過性付与基の導入に利用するアミノ酸残基（以下、「反応性アミノ酸残基」と称することがある。）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、トリプトファン残基、チロシン残基、セリン残基、トレオニン残基などが挙げられる。また、アミノ酸残基におけるアルコール側鎖を利用してもよい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　前記反応性アミノ酸残基のペプチドにおける数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　例えば、前記ペプチドとして、環状のペプチドを用いる場合には、前記反応性アミノ酸残基のペプチドにおける数は、２以上が好ましい。前記反応性アミノ酸残基のペプチドにおける数の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、反応点が多くなるとペプチドに結合する前記細胞膜透過性付与基の数や位置が安定せず、アミノ酸配列に由来するペプチドの特性を比較し難くなる場合があるので、１０以下が好ましい。
　なお、例えば、ペプチド中のシステイン残基がジスルフィド結合により前記ペプチドの高次構造の安定化に関与しているような場合には、別途、上記反応性アミノ酸残基を前記ペプチドに導入することが好ましい。
　前記反応性アミノ酸残基の前記ペプチドにおける位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　例えば、前記ペプチドとして、ｍＲＮＡ分子、その翻訳物であるペプチド鎖（以下、「ポリペプチド鎖」と称することもある。）、及びリボソームを含むリボソームディスプレイ複合体（以下、「ＲＤ複合体」と称することがある。）を用いる場合には、例えば、リボソームの出口トンネル（ｅｘｉｔ　ｔｕｎｎｅｌ）から外に出ている部分であり、具体的にはＮ末端から２番目～Ｃ末端から３０番目の位置（Ｎ末端から２番目の位置及びＣ末端から３０番目の位置を含む）の間とすることが、前記リンカー分子による修飾反応がリボソームにより立体的に阻害され難くなり得る点で、好ましい。
　前記Ｃ末端からの位置としては、Ｃ末端から５０番目が好ましく、１００番目がより好ましい。
　また、前記反応性アミノ酸残基の位置をＮ末端側から数えた場合、その位置は、ペプチドの鎖長に応じて適宜設定できるが、例えば、Ｎ末端から２～１，０００番目の位置であり、Ｎ末端から２～１００番目の位置が好ましく、Ｎ末端から２～５０番目の位置がより好ましい。
　前記ＲＤ複合体の製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、国際公開第２０１７／２１３１５８号に記載の方法などが挙げられる。また、市販のキットを利用して製造することもできる。
　前記ペプチドのアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ペプチドライブラリとして有用であるように、特定の位置にランダム配列を含むものが好ましい。かかるランダム配列の中から、所定の目的に応じて有用なアミノ酸配列を特定し得る。
　前記ランダム配列の前記ペプチドにおける位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記反応性アミノ酸残基の位置と同様に、ＲＤ複合体を用いる場合には、Ｎ末端から２番目～Ｃ末端から３０番目の位置（Ｎ末端から２番目の位置及びＣ末端から３０番目の位置を含む）の間とすることが好ましい。即ち、反応性アミノ酸残基は、ランダム配列内に含まれることが好ましい。従ってランダム配列の好ましい位置は、反応性アミノ酸残基の好ましい位置と同じ範囲から設定できる。
　前記ランダム配列の前記ペプチドにおける数は、１つであってもよく、２つ以上であってもよい。前記ランダム配列の数の上限としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０以下が好ましい。
　前記ランダム配列１つあたりのアミノ酸残基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１以上、３０以下とすることができる。
　１つのランダム配列が長くなるほど、またランダム配列の数が多くなるほど、ペプチドライブラリの多様性を高めることができる。
　前記ペプチドは、更に、ＦＬＡＧ（登録商標）配列やポリＨｉｓ配列等のポリペプチド鎖の精製のための配列、プロテアーゼなどにより選択的に切断される配列、スペーサー配列などを含んでいてもよい。
　前記ペプチドのアミノ酸残基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１０以上、５，０００以下とすることができるが、その上限値としては、８００以下が好ましく、４００以下がより好ましく、２００以下が特に好ましい。
　前記ペプチドの合成方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
＜細胞膜透過性付与基＞
　前記細胞膜透過性付与基は、例えば、下記一般式（１）で表すことができる。
　Ａ－Ｂ－Ｃ　・・・　一般式（１）
　前記一般式（１）中、「Ａ」はペプチド連結用基、「Ｂ」は連結基又は単結合、「Ｃ」は樹状構造を有する基を表す。
－ペプチド連結用基－
　前記ペプチド連結用基は、前記ペプチドにおける反応性アミノ酸残基との反応により、細胞膜透過性付与基のペプチドへの導入に寄与する。
　前記反応性アミノ酸残基は、前記ペプチド連結用基と反応するアミノ酸残基であり、前記ペプチド連結用基と直接反応するアミノ酸残基であってもよいし、前記ペプチド連結用基と反応できるように修飾されたアミノ酸残基であってもよい。
　前記ペプチド連結用基としては、前記ペプチドと連結することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、システイン残基のチオール基、リジン残基の側鎖アミノ基（－ＮＨ２）、ヒスチジン残基又はトリプトファン残基の側鎖アミノ基（＞ＮＨ）と反応して結合を形成可能な基などが挙げられる。
　前記ペプチド連結用基の具体例としては、例えば、国際公開第２０１７／２１３１５８号の段落〔００６７〕～〔００７６〕に記載されているハロゲン化アルキル基、活性化カルボニル基、不飽和炭化水素基、エポキシ基、スルホニル含有基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、カルベン発生基、ジスルフィド結合含有基、チオール基などが挙げられる。
　また、例えば、オキシムライゲーション法により、前記ペプチドと前記細胞膜透過性付与基とを結合する場合には、下記構造式で表されるものを前記ペプチド連結用基として用いることもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
－連結基－
　前記連結基は、前記ペプチド連結用基と、前記樹状構造を有する基とを連結する基である。
　前記連結基の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
－樹状構造を有する基－
　前記細胞膜透過性付与基は、４以上の枝を有する樹状構造を有し、前記４以上の枝のうち、少なくとも４つの枝の末端に塩基性官能基を有する。
　前記樹状構造を有する基は、前記ペプチドに細胞膜透過能を付与する基である。
　前記細胞膜透過性付与基の樹状構造における枝の数としては、４以上であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、６以上、９以上などが挙げられる。
　なお、「４以上の枝を有する」とは、前記細胞膜透過性付与基内における樹状構造の枝の合計数をいう。即ち、前記細胞膜透過性付与基は、４以上の枝を有する１つの樹状構造単位を有していてもよいし、３以下の枝を有する１つの樹状構造単位を複数有し、前記複数の樹状構造単位における枝の合計数が４以上となるものであってもよい。
　前記細胞膜透過性付与基における樹状構造単位の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１つであってもよいし、２以上であってもよい。
　前記樹状構造単位１つあたりの枝の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３以上が好ましい。
　前記樹状構造の枝の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記樹状構造を有する基の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、米国特許第７，８６２，８０７号明細書などに記載の方法により製造することができる。
－－塩基性官能基－－
　前記塩基性官能基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グアニジノ基、アミノ基、イミダゾール基などが挙げられる。これらの中でも、グアニジノ基を有することが好ましい。前記塩基性官能基は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　前記塩基性官能基の数としては、４以上であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、６以上、９以上などが挙げられる。
　前記塩基性官能基は、４以上のグアニジノ基を有する態様が好ましい。
　前記塩基性官能基の前記細胞膜透過性付与基における位置としては、少なくとも樹状構造の４つの枝の末端に塩基性官能基が位置している限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記樹状構造を有する基の樹状構造単位の具体例としては、例えば、下記一般式（Ｃ）で表されるものなどが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 　前記一般式（Ｃ）は、枝の数が３である樹状構造単位を表し、式中「Ｙ」は塩基性官能基を表す。
　なお、前記塩基性官能基は、全ての枝の末端に形成されていてもよいし、一部の枝の末端に形成されていてもよい。
　前記細胞膜透過性付与基は、前記細胞膜透過性付与基における前記ペプチド連結用基と、前記ペプチドにおける反応性アミノ酸残基とが反応することにより前記ペプチドに導入される。前記反応の際に、前記ペプチド連結用基の構造は変化する。
　前記細胞膜透過性付与基の具体例としては、以下の構造式で表される化合物などが挙げられる。
　下記構造式で表される細胞膜透過性付与基は、ペプチド用連結基として、オキシムライゲーション法によりペプチドと結合可能な基を有し、樹状構造を有する基として、３つの枝のすべての末端に塩基性官能基としてグアニジノ基を有する樹状構造単位を２つ有し、前記ペプチド連結用基と前記樹状構造を有する基とが、連結基を介して連結している例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 　前記構造式中、「＊」はペプチドとの連結部位を表す。
　下記構造式で表される細胞膜透過性付与基は、ペプチド用連結基として、オキシムライゲーション法によりペプチドと結合可能な基を有し、樹状構造を有する基として、３つの枝のすべての末端に塩基性官能基としてグアニジノ基を有する樹状構造単位を３つ有し、前記ペプチド連結用基と前記樹状構造を有する基とが、連結基を介して連結している例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　前記構造式中、「＊」はペプチドとの連結部位を表す。
＜その他の構成＞
　前記ペプチド複合体におけるその他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光物質などの発光物質、色素、放射性物質、薬剤、毒素、核酸、アミノ酸、糖類、脂質、各種ポリマーなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　前記蛍光物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類などの蛍光色素が挙げられる。
　前記その他の構成は、例えば、上記したペプチドに、直接又は連結基などを介して結合させることができる。
　本発明のペプチド複合体は、短時間における細胞膜透過性に優れる。したがって、例えば、ランダム配列を含むペプチド複合体ライブラリとし、スクリーニングを行うことで、短時間における細胞膜透過性に優れ、かつ対象物質への親和性が高い等の有用なアミノ酸配列を特定し得る。
（ペプチド複合体の製造方法）
　本発明のペプチド複合体の製造方法は、ペプチドに、細胞膜透過性分子を導入する導入工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
＜導入工程＞
　前記導入工程は、ペプチドに、細胞膜透過性分子を導入する（以下、「結合させる」、「挿入する」、「連結する」と称することもある。）工程である。
　前記導入工程により、ペプチドに、上記した（ペプチド複合体）の項目における細胞膜透過性付与基を導入することができる。
　前記導入工程では、反応物中における少なくとも１つのペプチドに細胞膜透過性付与基が導入されればよいが、全てのペプチドに細胞膜透過性付与基が導入されることが好ましい。
－ペプチド－
　前記ペプチドは、上記した（ペプチド複合体）の＜ペプチド＞の項目に記載したものと同様である。なお、前記ペプチドは、ペプチドライブラリの態様であってもよい。
－細胞膜透過性分子－
　前記細胞膜透過性分子は、ペプチドに導入され、上記した（ペプチド複合体）の項目における細胞膜透過性付与基として存在する。そのため、前記細胞膜透過性分子は、上記した（ペプチド複合体）の＜細胞膜透過性付与基＞と同様とすることができる。
　前記細胞膜透過性分子の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞膜透過性付与基前駆体形成工程と、前記細胞膜透過性付与基前駆体にペプチド連結用基前駆体を有する連結基を導入する工程と、前記ペプチド連結用基前駆体からペプチド連結用基を形成する工程と、前記細胞膜透過性付与基前駆体から細胞膜透過性付与基を形成する工程と、を含む方法などが挙げられる。
　前記各工程は、公知の化学合成の技術を適宜選択して行うことができる。
－導入－
　前記導入の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細胞膜透過性分子におけるペプチド連結用基と、前記ペプチドにおける反応性アミノ酸残基とを反応させる方法などが挙げられる。
　前記反応の温度、時間等の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜その他の工程＞
　前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペプチド複合体精製工程などが挙げられる。
　得られたペプチド複合体が所望の構造を有するか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、公知の分析方法を適宜選択することができ、例えば、質量分析法、プロトン核磁気共鳴分光法、炭素１３核磁気共鳴分光法、紫外分光法、赤外分光法などの分析方法が挙げられる。
（ペプチドライブラリ）
　本発明のペプチドライブラリは、本発明のペプチド複合体を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
　前記ペプチドライブラリは、本発明のペプチド複合体のみからなるものであってもよいし、前記細胞膜透過性付与基が導入されていないペプチドが含まれていてもよい。
　前記ペプチドライブラリは、上記した（ペプチド複合体の製造方法）と同様にして、製造することができる。
（機能性ペプチドのスクリーニング方法）
　本発明の機能性ペプチドのスクリーニング方法は、本発明のペプチドライブラリを用いて機能性ペプチドをスクリーニングする工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
　前記スクリーニングの方法としては、本発明のペプチドライブラリを用いる限り、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。例えば、所望の対象物質と、前記ペプチドライブラリとを混合し、結合したペプチド複合体（例えば、ＲＤ複合体）を選択し、前記ＲＤ複合体からＲＮＡを解離させ、前記ＲＮＡからＤＮＡを調製し、増幅した後、ｍＲＮＡに転写し、再度ＲＤ複合体ライブラリを作製するという工程を繰り返し、前記対象物質に対する親和性を有する機能性ペプチドをスクリーニングする方法などが挙げられる。
　以下に実施例等を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例等に何ら限定されるものではない。
（比較例１：ペプチド複合体Ｇ３－Ｐの合成）
＜化合物Ｃ１の合成＞
　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０１３，１７－２４に記載の方法に従い、下記構造式で表される化合物Ｃ１を合成した。なお、化合物の構造式中の「Ｆｍｏｃ」は「９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基」を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
＜化合物Ｃ３の合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｃ３を合成した。
　具体的には、化合物Ｃ１（５０ｍｇ，０．１５９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。ここに、米国特許第７，８６２，８０７号明細書に記載の方法と同様の方法により合成した化合物Ｃ２（２８４ｍｇ，０．２３９ｍｍｏｌ）と１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ／ＨＣｌ）（４５．８ｍｇ，０．２３９ｍｍｏｌ）と１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（３２．２ｍｇ，０．２３９ｍｍｏｌ）を加え０℃で１２時間撹拌した。飽和食塩水（２０ｍＬ）を加え、塩化メチレンで抽出を行い（２０ｍＬで３回）、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、濃縮した。残渣を分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）で精製し（塩化メチレン／メタノール（ＭｅＯＨ）＝１０／１；Ｒｆ＝０．７）、化合物Ｃ３（２１０ｍｇ，０．１４１ｍｍｏｌ，収率８９％）を無色油状物として取得した。
　なお、化合物の構造式中の「Ｆｍｏｃ」は「９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基」、「Ｂｏｃ」は「ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基」を表す。
　前記化合物Ｃ３の１Ｈ　ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：　δ　８．５８（ｔ，　３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ，　３Ｈ），　７．７４（ｄ，　３ＪＨＨ＝８．０Ｈｚ，　２Ｈ），　７．５８－７．５７（ｍ，　４Ｈ），　７．３８（ｔ，　３ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ，　２Ｈ），　７．２８（ｔ，　３ＪＨＨ＝７．０Ｈｚ，　２Ｈ），　４．４７（ｄ，　３ＪＨＨ＝７．０Ｈｚ，　２Ｈ），　４．２６（ｓ，　６Ｈ），　３．６８（ｔ，　３ＪＨＨ＝５．５Ｈｚ，　６Ｈ），　３．４９－３．４６（ｍ，　６Ｈ），　３．３７－３．３３（ｍ，　６Ｈ），　２．４３（ｔ，　３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ，　６Ｈ），　１．４９（ｓ，　２７Ｈ），　１．４６（ｓ，　２７Ｈ）
＜化合物Ｃ４の合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｃ４を合成した。
　具体的には、化合物Ｃ３（２１０ｍｇ，０．１４１ｍｍｏｌ）と２０％ピペリジン／Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（１．０ｍＬ）を混合し、２５℃で１時間撹拌した。反応液に窒素ガスを吹き付けて溶媒を揮発させた。得られた残渣をＰＴＬＣで精製し（塩化メチレン／ＭｅＯＨ＝１０／１）、化合物Ｃ４（１６８ｍｇ，０．１３３ｍｍｏｌ，収率９４％）を無色透明油状物として取得した。
　前記化合物Ｃ４の１Ｈ　ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：　δ　１１．４（ｓ，　３Ｈ），　８．５９（ｔ，　３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ，　３Ｈ），　７．７１（ｔ，　３ＪＨＨ＝５．０Ｈｚ，　３Ｈ），　６．７９（ｓ，　１Ｈ），　４．０３（ｓ，　２Ｈ），　３．７１－３．６７（ｍ，　１２Ｈ），　３．５５－３．５２（ｍ，　６Ｈ），　３．４２－３．３９（ｍ，　６Ｈ），　２．４３（ｔ，　３ＪＨＨ＝５．５Ｈｚ，　６Ｈ），　１．４９（ｓ，　２７Ｈ），　１．４８（ｓ，　２７Ｈ）
＜細胞膜透過性分子Ｇ３の合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　上記反応式のようにして、上記構造式で表される細胞膜透過性分子Ｇ３を合成した。
　具体的には、化合物Ｃ４に塩酸ジオキサン溶液（４Ｎ；　１．０ｍＬ）を加えて溶液とし、２５℃で２時間撹拌した。析出した白色固体を遠心分離により取得し、さらにジエチルエーテルで洗浄することにより（３ｍＬで３回）、細胞膜透過性分子Ｇ３（９０ｍｇ，定量的収率）を取得した。
　前記化合物Ｇ３のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ）による同定データは、以下のとおりであった。
　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ　Ｃ２４Ｈ５０Ｎ１４Ｏ８　計算値（Ｍ＋Ｈ＋）６６３．４０１、測定値６６３．４０２
＜化合物Ｃ５の合成＞
　マイクロウェーブを用いた固相合成法により、リンクアミド（Ｒｉｎｋ　Ａｍｉｄｅ）樹脂（０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上で、以下の配列を有するペプチドを合成した。
　Ｆｍｏｃ－Ａｈｘ－Ｃｙｓ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－ＮＨ２
　［上記配列中、「Ｆｍｏｃ」は９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基を表し、「Ａｈｘ」は６－アミノヘキサン酸を表す。］
　前記ペプチドを形成した樹脂を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水／トリイソプロピルシラン／３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（９２．５／２．５／２．５／２．５（容量比））に３時間浸漬し、前記ペプチドを樹脂から切り出した。
　得られたペプチド（５５．０ｍｇ，３０．０μｍｏｌ）をＤＭＦ（２．５ｍＬ）に溶解し、１，３－ジブロモ－２－プロパノン（２０ｍＭ　ＤＭＦ溶液；１．５ｍＬ，３０μｍｏｌ）及びＮ－メチルモルホリン（１０ｍＭ　ＤＭＦ溶液；６．０ｍＬ，６０μｍｏｌ）を加えて２５℃で１時間撹拌した。ここにジエチルエーテル（１００ｍＬ）を加えて上清を除去し、残渣をジエチルエーテル（１００ｍＬ）で洗浄することにより化合物Ｃ５を白色固体として取得した（５４．６ｍｇ，２８．９μｍｏｌ，収率９７％）。
　なお、化合物Ｃ５の構造式中の「ＣＭＬＹＩＶＰＹＦＳＶＧＣ」は、ペプチドのアミノ酸配列を表す。
　前記化合物Ｃ５のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ）による同定データは、以下のとおりであった。
　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ　Ｃ９４Ｈ１２８Ｎ１５Ｏ２０Ｓ３ ＋　計算値（Ｍ＋Ｈ＋）１８８２．８６２、測定値１８８３．１４０
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
＜化合物Ｃ６の合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｃ６を合成した。
　具体的には、化合物Ｃ５（３０ｍｇ，０．０１５９ｍｍｏｌ）と細胞膜透過性分子Ｇ３（５２．７ｍｇ，０．０７９６ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（０．５ｍＬ）と水（０．０５ｍＬ）とを混合し、２５℃で２４時間撹拌した。ジエチルエーテル（５ｍＬ）を加えて遠心分離を行い、上澄を除去した。残渣をジエチルエーテルで洗浄（３ｍＬで３回）することにより化合物Ｃ６粗生成物を取得した。逆相ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により精製し凍結乾燥することにより、化合物Ｃ６（３．８ｍｇ，０．００１５０ｍｍｏｌ，収率９％）を取得した。
＜ペプチド複合体Ｇ３－Ｐの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　上記反応式のようにして、上記構造式で表されるペプチド複合体Ｇ３－Ｐを合成した。
　具体的には、化合物Ｃ６と２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１．０ｍＬ）を混合し、２５℃で２時間ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。窒素ガスを吹き付けて溶媒を揮発させた。この残渣をジエチルエーテルで洗浄した（１ｍＬで３回）。ここに、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（０．８ｍｇ，０．００２ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（ｉＰｒ２ＥｔＮ）（０．００２２ｍＬ，０．０１２４ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（０．５ｍＬ）を混合し、２５℃で２０時間撹拌した。ジエチルエーテル（１５ｍＬ）を加えて遠心分離を行い、上澄みを除去した。残渣をジエチルエーテルで洗浄し（５ｍＬで２回）、ペプチド複合体Ｇ３－Ｐ粗生成物を取得した。逆相ＨＰＬＣで精製し凍結乾燥することにより、ペプチド複合体Ｇ３－Ｐ（１．６ｍｇ，０．０００５９ｍｍｏｌ，収率４０％）を白色固体として取得した。
　前記ペプチド複合体Ｇ３－ＰのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳによる同定データは、以下のとおりであった。
　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ　Ｃ１２４Ｈ１７７Ｎ３０Ｏ３０Ｓ４ ＋　計算値（Ｍ＋Ｈ＋）２６９４．２１２、測定値２６９４．２０８
（実施例１：ペプチド複合体Ｇ６－Ｐの合成）
＜化合物Ｃ７の合成＞
　マイクロウェーブを用いた固相合成法により、Ｗａｎｇ樹脂（０．６６ｍｍｏｌ／ｇ）上で、以下の配列を有するペプチドを合成した。
　Ｆｍｏｃ－ＡＯＡＡ－Ａｈｘ－Ｇｌｕ
　［上記配列中、「ＡＯＡＡ」はアミノオキシ酢酸を表し、「Ａｈｘ」は６－アミノヘキサン酸を表す。］
　前記ペプチドを形成した樹脂を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水／トリイソプロピルシラン／３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（９２．５／２．５／２．５／２．５（容量比））に３時間浸漬し、前記ペプチドを樹脂から切り出した。窒素ガスを吹き付けて溶媒を留去し、残渣をジエチルエーテル（１０ｍＬ）で洗浄することにより下記構造式で表される化合物Ｃ７を白色固体として取得した（定量的収率）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
＜化合物Ｃ８の合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｃ８を合成した。
　具体的には、化合物Ｃ７（７２．６ｍｇ，０．１３０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。ここに、化合物Ｃ２（４６６ｍｇ，０．３９２ｍｍｏｌ）とＥＤＣ／ＨＣｌ（７５．１ｍｇ，０．３９２ｍｍｏｌ）とＨＯＢＴ（５２．９ｍｇ，０．３９２ｍｍｏｌ）を加え０℃で１２時間撹拌した。飽和食塩水（２０ｍＬ）を加え、塩化メチレンで抽出を行い（２０ｍＬで３回）、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、濃縮した。残渣をＰＴＬＣで精製し（塩化メチレン／ＭｅＯＨ＝１０／１；Ｒｆ＝０．７）、化合物Ｃ８（７４．０ｍｇ，０．０２５５ｍｍｏｌ，収率２０％）を無色油状物として取得した。
＜化合物Ｃ９の合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｃ９を合成した。
　具体的には、化合物Ｃ８（７４ｍｇ，２５．５ｍｍｏｌ）と２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１．０ｍＬ）を混合し、２５℃で１時間撹拌した。反応液に窒素ガスを吹き付けることで溶媒を揮発させて化合物Ｃ９粗生成物を無色透明油状物として取得した。
＜細胞膜透過性分子Ｇ６の合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　上記反応式のようにして、上記構造式で表される細胞膜透過性分子Ｇ６を合成した。
　具体的には、前記化合物Ｃ９粗生成物に塩酸ジオキサン溶液（４Ｎ；　１．０ｍＬ）を加えて溶液とし、２５℃で２時間撹拌した。析出した白色固体を遠心分離により取得し、さらにジエチルエーテルで洗浄することにより（１ｍＬで３回）、細胞膜透過性分子Ｇ６（１１７ｍｇ，定量的収率）を白色固体として取得した。
＜化合物Ｃ１０の合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｃ１０を合成した。
　具体的には、化合物Ｃ５（３０ｍｇ，０．０１５９ｍｍｏｌ）と細胞膜透過性分子Ｇ６（１１７ｍｇ，０．０７９６ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（０．５ｍＬ）と水（０．０５ｍＬ）とを混合し、２５℃で９２時間撹拌した。ジエチルエーテル（５ｍＬ）を加えて遠心分離を行い、上澄を除去した。残渣をジエチルエーテルで洗浄（３ｍＬで３回）することにより化合物Ｃ１０粗生成物を取得した。逆相ＨＰＬＣにより精製し凍結乾燥することにより、化合物Ｃ１０（４．７ｍｇ，０．００１４１ｍｍｏｌ，収率９％）を白色固体として取得した。
＜ペプチド複合体Ｇ６－Ｐの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　上記反応式のようにして、上記構造式で表されるペプチド複合体Ｇ６－Ｐを合成した。
　具体的には、化合物Ｃ１０と２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１．０ｍＬ）を混合し、２５℃で２時間ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。窒素ガスを吹き付けて溶媒を揮発させた。この残渣をジエチルエーテルで洗浄した（１ｍＬで３回）。ここに、ＦＩＴＣ（０．８ｍｇ，０．００２ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（０．００２２ｍＬ，０．０１２４ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（０．５ｍＬ）を混合し、２５℃で２４時間撹拌した。ジエチルエーテル（１５ｍＬ）を加えて遠心分離を行い、上澄みを除去した。残渣をジエチルエーテルで洗浄し（５ｍＬで２回）、ペプチド複合体Ｇ６－Ｐ粗生成物を取得した。逆相ＨＰＬＣで精製し凍結乾燥することにより、ペプチド複合体Ｇ６－Ｐ（１．１ｍｇ，０．０００３１ｍｍｏｌ，収率２２％）を黄色固体として取得した。
　前記ペプチド複合体Ｇ６－ＰのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳによる同定データは、以下のとおりであった。
　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ　Ｃ１５７Ｈ２４０Ｎ４５Ｏ３９Ｓ４ ＋　計算値（Ｍ＋Ｈ＋）３５０７．７０６、測定値３５０７．６９６
（実施例２：ペプチド複合体Ｇ９－Ｐの合成）
＜化合物Ｃ１１の合成＞
　マイクロウェーブを用いた固相合成法により、Ｗａｎｇ樹脂（０．６６ｍｍｏｌ／ｇ）上で、以下の配列を有するペプチドを合成した。
　Ｆｍｏｃ－ＡＯＡＡ－Ａｈｘ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ
　［上記配列中、「ＡＯＡＡ」はアミノオキシ酢酸を表し、「Ａｈｘ」は６－アミノヘキサン酸を表す。］
　前記ペプチドを形成した樹脂を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水／トリイソプロピルシラン／３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（９２．５／２．５／２．５／２．５（容量比））に３時間浸漬し、前記ペプチドを樹脂から切り出した。窒素ガスを吹き付けて溶媒を留去し、残渣をジエチルエーテル（１０ｍＬ）で洗浄することにより下記構造式で表される化合物Ｃ１１を白色固体として取得した（定量的収率）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
＜化合物Ｃ１２の合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｃ１２を合成した。
　具体的には、化合物Ｃ１１（５０ｍｇ，０．０７３ｍｍｏｌ）に塩化メチレン（１０ｍＬ）を加えて溶液とし、０℃に冷却した。ここに、化合物Ｃ２（３９１ｍｇ，０．３２９ｍｍｏｌ）とＥＤＣ／ＨＣｌ（６３．０ｍｇ，０．３２９ｍｍｏｌ）とＨＯＢＴ（４４．１ｍｇ，０．３２９ｍｍｏｌ）を順に加えて０℃で１４時間撹拌した。水（３０ｍＬ）を加え有機層を分離した。水層を更に塩化メチレンで抽出し（３０ｍＬで２回）、有機層を混合した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過及び濃縮を行うことにより化合物Ｃ１２粗生成物を取得した。粗生成物をＰＴＬＣで精製し（塩化メチレン／ＭｅＯＨ＝１０／１；Ｒｆ＝０．５）、化合物Ｃ１２（１６３ｍｇ，０．０３８ｍｍｏｌ，収率５３％）を白色固体として取得した。
＜化合物Ｃ１３の合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｃ１３を合成した。
　具体的には、化合物Ｃ１２（９３ｍｇ，２２．１ｍｍｏｌ）と２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１．０ｍＬ）を混合して溶液とし、２５℃で３０分間撹拌した。反応液に窒素ガスを吹き付けて溶媒を揮発させた。得られた残渣をヘキサンで洗浄し（５ｍＬで３回）、化合物Ｃ１３（１０１ｍｇ，定量的収率）を白色固体として取得した。
＜細胞膜透過性分子Ｇ９の合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　上記反応式のようにして、上記構造式で表される細胞膜透過性分子Ｇ９を合成した。
　具体的には、化合物Ｃ１３と塩酸ジオキサン溶液（４Ｎ；　１．０ｍＬ）を混合して溶液とし、２５℃で２時間撹拌した。析出した白色固体を遠心分離により取得し、さらにジエチルエーテルで洗浄することにより（５ｍＬで３回）、細胞膜透過性分子Ｇ９（１４８ｍｇ，定量的収率）を白色固体として取得した。
＜化合物Ｃ１４の合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｃ１４を合成した。
　具体的には、化合物Ｃ５（２８ｍｇ，０．０１４８ｍｍｏｌ）と細胞膜透過性分子Ｇ９（１６１ｍｇ，０．０７４ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（０．５ｍＬ）と水（０．０５ｍＬ）とを混合して溶液とした。ボルテックスミキサーを用い２５℃で１２時間撹拌後、窒素ガスを吹き付けて溶媒を揮発させた。残渣をジエチルエーテルで洗浄（５ｍＬで３回）することにより、化合物Ｃ１４粗生成物を取得した。逆相ＨＰＬＣにより精製し凍結乾燥することにより、化合物Ｃ１４（６．６ｍｇ，０．００１６３ｍｍｏｌ，収率１１％）を白色固体として取得した。
＜ペプチド複合体Ｇ９－Ｐの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　上記反応式のようにして、上記構造式で表されるペプチド複合体Ｇ９－Ｐを合成した。
　具体的には、化合物Ｃ１４と２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１ｍＬ）を混合し、２５℃で２時間ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。窒素ガスを吹き付けて溶媒を揮発させた。この残渣をジエチルエーテルで洗浄した（１ｍＬで３回）。ここに、ＦＩＴＣ（０．８ｍｇ，０．００２ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（０．００２２ｍＬ，０．０１２４ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（０．５ｍＬ）を混合し、２５℃で６０時間撹拌した。ジエチルエーテル（１５ｍＬ）を加えて遠心分離を行い、上澄みを除去した。残渣をジエチルエーテルで洗浄し（５ｍＬで２回）、ペプチド複合体Ｇ９－Ｐ粗生成物を取得した。逆相ＨＰＬＣで精製し凍結乾燥することにより、ペプチド複合体Ｇ９－Ｐ（２．０ｍｇ，０．０００４７５ｍｍｏｌ，収率２９％）を黄色固体として取得した。
　前記ペプチド複合体Ｇ９－ＰのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳによる同定データは、以下のとおりであった。
　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ　Ｃ１８４Ｈ２９１Ｎ５９Ｏ４７Ｓ４　計算値（Ｍ＋Ｈ＋）４２０８．１１５、測定値４２０８．１０７
（試験例１：細胞膜透過能評価）
　ＨｅＬａ細胞（Ｈｕｍａｎ　ｃｅｒｖｉｘ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ）を、実施例１～２又は比較例１で合成したペプチド複合体２μＭを含む細胞培養液中、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２、３７℃の条件下で１時間培養した。ＨｅＬａ細胞の培養には、ＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ　Ｄ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、１０％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）添加）を用いた。
　次いで、Ｄ－ＰＢＳ（－）（ヘパリン（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）添加）で細胞表面を洗浄後、細胞を回収し、Ｄ－ＰＢＳ（－）（０．５％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、２００ｍＭ　ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０．２％（ｖ／ｖ）ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）添加）に懸濁させ、フローサイトメーター（ＢＤ　ＦＡＣＳ　ＡｒｉａＩＩＩ）を用いて蛍光強度を測定した。フローサイトメトリー解析時には、ヨウ化プロピジウム陽性の死細胞を除いた生細胞集団に対し、蛍光強度最頻値を算出した。なお、対照として、ペプチド複合体を含まないジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）についても同様にして試験した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　表１に示されるとおり、培養１時間後において、実施例１～２で合成したペプチド複合体はいずれも比較例１で合成したペプチド複合体に比べて高い細胞膜透過量を示した。このことから、４以上の枝を有する樹状構造を有し、前記４以上の枝のうち、少なくとも４つの枝の末端に塩基性官能基を有するデンドリマー型の細胞膜透過性付与基を用いることで、短時間における高い膜透過性が得られることが実証された。
　本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
　＜１＞　ペプチドと、前記ペプチドに導入された細胞膜透過性付与基とを含み、
　前記細胞膜透過性付与基が、４以上の枝を有する樹状構造を有し、
　前記４以上の枝のうち、少なくとも４つの枝の末端に塩基性官能基を有することを特徴とするペプチド複合体である。
　＜２＞　前記塩基性官能基が、４以上のグアニジノ基を有する前記＜１＞に記載のペプチド複合体である。
　＜３＞　前記ペプチドのアミノ酸残基数が２００以下である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のペプチド複合体である。
　＜４＞　前記細胞膜透過性付与基が、下記一般式（Ｃ）で表される樹状構造単位を有する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のペプチド複合体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 　前記一般式（Ｃ）中、「Ｙ」は塩基性官能基を表す。
　＜５＞　前記細胞膜透過性付与基が、下記構造式で表される前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のペプチド複合体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 　前記構造式中、「＊」はペプチドとの連結部位を表す。
　＜６＞　前記細胞膜透過性付与基が、下記構造式で表される前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のペプチド複合体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 　前記構造式中、「＊」はペプチドとの連結部位を表す。
　＜７＞　ペプチドに、細胞膜透過性分子を導入する工程を含み、
　前記細胞膜透過性分子が、４以上の枝を有する樹状構造を有し、前記４以上の枝のうち、少なくとも４つの枝の末端に塩基性官能基を有することを特徴とするペプチド複合体の製造方法である。
　＜８＞　前記塩基性官能基が、４以上のグアニジノ基を有する前記＜７＞に記載のペプチド複合体の製造方法である。
　＜９＞　前記ペプチドのアミノ酸残基数が２００以下である前記＜７＞から＜８＞のいずれかに記載のペプチド複合体の製造方法である。
　＜１０＞　前記細胞膜透過性付与基が、下記一般式（Ｃ）で表される樹状構造単位を有する前記＜７＞から＜９＞のいずれかに記載のペプチド複合体の製造方法である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 　前記一般式（Ｃ）中、「Ｙ」は塩基性官能基を表す。
　＜１１＞　前記細胞膜透過性付与基が、下記構造式で表される前記＜７＞から＜１０＞のいずれかに記載のペプチド複合体の製造方法である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 　前記構造式中、「＊」はペプチドとの連結部位を表す。
　＜１２＞　前記細胞膜透過性付与基が、下記構造式で表される前記＜７＞から＜１０＞のいずれかに記載のペプチド複合体の製造方法である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 　前記構造式中、「＊」はペプチドとの連結部位を表す。
　＜１３＞　前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のペプチド複合体を含むことを特徴とするペプチドライブラリである。
　＜１４＞　前記＜１３＞に記載のペプチドライブラリを用いて機能性ペプチドをスクリーニングする工程を含むことを特徴とする機能性ペプチドのスクリーニング方法である。

Claims (8)

  1. 　ペプチドと、前記ペプチドに導入された細胞膜透過性付与基とを含み、
    　前記細胞膜透過性付与基が、４以上の枝を有する樹状構造を有し、
    　前記４以上の枝のうち、少なくとも４つの枝の末端に塩基性官能基を有することを特徴とするペプチド複合体。
  2. 　前記塩基性官能基が、４以上のグアニジノ基を有する請求項１に記載のペプチド複合体。
  3. 　前記ペプチドのアミノ酸残基数が２００以下である請求項１から２のいずれかに記載のペプチド複合体。
  4. 　ペプチドに、細胞膜透過性分子を導入する工程を含み、
    　前記細胞膜透過性分子が、４以上の枝を有する樹状構造を有し、前記４以上の枝のうち、少なくとも４つの枝の末端に塩基性官能基を有することを特徴とするペプチド複合体の製造方法。
  5. 　前記塩基性官能基が、４以上のグアニジノ基を有する請求項４に記載のペプチド複合体の製造方法。
  6. 　前記ペプチドのアミノ酸残基数が２００以下である請求項４から５のいずれかに記載のペプチド複合体の製造方法。
  7. 　請求項１から３のいずれかに記載のペプチド複合体を含むことを特徴とするペプチドライブラリ。
  8. 　請求項７に記載のペプチドライブラリを用いて機能性ペプチドをスクリーニングする工程を含むことを特徴とする機能性ペプチドのスクリーニング方法。
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PCT/JP2020/005762 WO2020195303A1 (ja) 2019-03-28 2020-02-14 ペプチド複合体及びその製造方法、並びに前記ペプチド複合体の利用

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