JP2023165042A - 細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法 - Google Patents

Abstract

【課題】分子量が小さな細胞膜透過性分子であっても、有効成分を細胞内に効率良く取り込むことができる、細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法を提供する。【解決手段】一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子を、ｐＫａの値が－８．０超の酸との塩とすることを含むことを特徴とする細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。【選択図】なし

Description

本発明は、細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法に関する。

分子量が５００程度までの低分子医薬品は、製造コストが安く免疫原性が低いため、これまで多くの医薬品として開発されてきた。しかし、この低分子医薬品は、特異性が低く、オフターゲットによる副作用の問題から近年は次第に開発が難しくなってきている。これに対し、分子量が１０，０００を超えるような抗体やタンパク質由来の高分子医薬品は、特異性が高く副作用も少ないことから売り上げが伸びている。しかし、高価であること、その大きな分子量から免疫原性を起こす可能性があること、一般に細胞内へ移行しないためその標的となりうる分子が限られることが課題となっている。
そこで近年、ペプチドや核酸などをはじめとする分子量が５００～５，０００程度の分子、いわゆる中分子医薬品が、安価で免疫原性が低いという低分子医薬品の利点と、標的分子への特異性が高く、副作用が少ないというという高分子医薬品の利点を併せ持つ医薬品として期待されている。

ペプチドや核酸などの中分子医薬品は細胞内の分子を標的とする場合、細胞膜を透過させて所望の細胞内標的分子に到達させる手段が必要となる。細胞内には、細胞骨格関連タンパク質やキナーゼ関連因子など種々の疾病治療に際して標的となりうるものが多い。このため、有用な細胞内導入法の確立は、中分子医薬品の適用範囲を大幅に拡大することに繋がる。
有効成分を細胞内に取り込む技術としては、例えば、塩基性アミノ酸を多く含む細胞膜透過ペプチドのアミノ酸配列を融合する方法や、中心から規則的に分枝した構造を有する樹状高分子であるデンドリマーを用いる方法（例えば、特許文献１参照）などが知られている。

米国特許第７，８６２，８０７号明細書

上記したように、有効成分を細胞内に取り込む技術として、特許文献１に記載した方法などが検討されている。有効成分を細胞内により効率良く取り込むためには、細胞膜透過性分子において、細胞膜透過に寄与する構造の数を増やすことが考えられる。しかしながら、細胞膜透過性分子の分子量が大きくなると免疫原性を引き起こす可能性があるため、より小さい分子量の細胞膜透過性分子を用いて有効成分を細胞内により効率良く取り込む方法の開発が強く求められている。
したがって、本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、分子量が小さな細胞膜透過性分子であっても、有効成分を細胞内に効率良く取り込むことができる、細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法を提供することを目的とする。

前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、下記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子を、ｐＫ_ａの値が－８．０超の酸との塩とすることで、細胞膜透過に寄与する構造の数が多い細胞膜透過性分子と同等以上にまで細胞膜透過性を向上させることができることを知見した。
（前記一般式（ｉ）中、Ｘは結合手を表す。）。

本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 下記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子を、ｐＫ_ａの値が－８．０超の酸との塩とすることを含むことを特徴とする細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。
（前記一般式（ｉ）中、Ｘは結合手を表す。）。

本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、分子量が小さな細胞膜透過性分子であっても、有効成分を細胞内に効率良く取り込むことができる、細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法を提供することができる。

（細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法）
本発明の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法（以下、「膜透過性向上方法」と称することがある。）は、塩形成工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。

＜塩形成工程＞
前記塩形成工程は、下記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子を、ｐＫ_ａの値が－８．０超の酸との塩とする工程である。
（前記一般式（ｉ）中、Ｘは結合手を表す。）。

＜＜一般式（ｉ）で表される構造＞＞
前記一般式（ｉ）で表される構造における前記Ｘ以外の部分は、細胞膜透過性に寄与する部分である。
前記細胞膜透過性分子における一般式（ｉ）で表される構造のＸ以外の部分の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１つであることが好ましい。即ち、本発明の細胞膜透過性分子は、前記一般式（ｉ）で表される樹状構造を１つ有する態様が好ましい。

前記一般式（ｉ）で表される構造の前記Ｘの部分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ヘテロ原子含有基と結合していることが好ましい。

－ヘテロ原子含有基－
前記ヘテロ原子含有基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（Ａ）ペプチドと連結するペプチド連結用基と、前記ペプチド連結用基と前記一般式（ｉ）で表す構造とを連結する連結基とからなる態様、（Ｂ）ペプチドと連結するペプチド連結用基からなる態様などが挙げられる。また、前記ヘテロ原子含有基は、ペプチドや核酸の骨格を有してもよい。

前記ヘテロ原子含有基の長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば直鎖上に結合している原子数の下限値としては１原子以上が好ましく、上限値としては５０原子以下が好ましく、２５原子以下がより好ましい。前記直鎖上に結合している原子数が２５原子以下の例としては、後述する細胞膜透過性分子Ｇ３－ＤＣＸにおけるヘテロ原子含有基などが挙げられる。

前記ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子及びリン原子からなる群から選択される少なくとも１種などが挙げられる。前記ヘテロ原子は、１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。

前記ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子の含有割合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、細胞膜透過性分子の水溶性が高まる点で、１０％以上であることが好ましい。前記ヘテロ原子の含有割合の上限としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、６０％以下が好ましく、５０％以下がより好ましい。前記ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子の含有割合の範囲としては、１０％以上６０％以下が好ましく、１０％以上５０％以下がより好ましい。
前記ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子の含有割合は、下記のようにして算出することができる。なお、全原子には、水素原子も含まれる。
ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子の含有割合（％）＝｛（ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子の数）／（ヘテロ原子含有基の全原子数）｝×１００

前記ヘテロ原子含有基は、繰返し単位を含むことが好ましい。
前記繰返し単位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アルキレンオキサイド、アルキレンイミン、アルキレンスルフィドなどが挙げられる。前記繰返し単位は、１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。また、前記繰返し単位は、置換基を有していてもよい。前記繰り返し単位としては、入手容易性、安定性の観点からアルキレンオキサイドが好ましい。

前記アルキレンオキサイドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メチレンオキサイド、エチレンオキサイド及びプロピレンオキサイドからなる群から選択される少なくとも１種などが挙げられる。

前記繰返し単位の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記繰り返し単位の下限としては１以上が好ましく、上限としては１０以下が好ましい。

前記繰り返し単位が有する置換基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記置換基としては、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、カルボニル、アミド、チオアミド、ウレア、スルホンアミド、カルボキシ、ニトリルが好ましい。

－－ペプチド連結用基－－
前記ペプチド連結用基は、前記ペプチドにおける反応性アミノ酸残基との反応により、細胞膜透過性分子のペプチドへの導入に寄与する。
前記反応性アミノ酸残基は、前記ペプチド連結用基と反応するアミノ酸残基であり、前記ペプチド連結用基と直接反応するアミノ酸残基であってもよいし、前記ペプチド連結用基と反応できるように修飾されたアミノ酸残基であってもよい。

前記ペプチド連結用基としては、前記ペプチドと連結することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、システイン残基のチオール基、リジン残基の側鎖アミノ基（－ＮＨ_２）、ヒスチジン残基又はトリプトファン残基の側鎖アミノ基（＞ＮＨ）、トリプトファン残基のインドール環２位及び３位炭素、チロシン残基又はセリン残基又はスレオニン残基の側鎖水酸基（－ＯＨ）、チロシン残基のオルト位炭素、メチオニン残基の側鎖スルフィド基（－ＳＭｅ）と反応して結合を形成可能な基などが挙げられる。
前記ペプチド連結用基の具体例としては、例えば、国際公開第２０１７／２１３１５８号の段落〔００６７〕～〔００７６〕に記載されているハロゲン化アルキル基、活性化カルボニル基、不飽和炭化水素基、エポキシ基、スルホニル含有基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、カルベン発生基、ジスルフィド結合含有基、チオール基などが挙げられる。

また、前記ペプチド連結用基は、ペプチドにおける反応性アミノ酸残基との反応により、前記ペプチドの環状化に寄与するもの（以下、「環状化基」と称することがある。）であることが好ましい。
前記環状化基と反応する反応性アミノ酸残基は、前記環状化基と直接反応するアミノ酸残基であってもよいし、前記環状化基と反応できるように修飾されたアミノ酸残基であってもよい。
前記環状化基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、電子吸引基が好ましい。

前記電子吸引基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ハロゲンを有することが好ましい。前記ハロゲンの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が好ましい。前記ハロゲンの数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ハロゲン数の下限としては２以上が好ましく、上限としては、５以下、４以下が好ましい。
前記電子吸引基は、置換基を有していてもよい。前記電子吸引基は、その構造中に不飽和構造を含むとペプチドを環状化させやすい。前記不飽和構造としては、特に制限はないが、例えば芳香環構造、複素環構造、脂環式炭化水素構造、アルケニル構造、アルキニル構造、カルボニル構造、チオカルボニル構造、オキシム構造、シアノ構造、イソシアネート構造を挙げることができる。中でも前記電子吸引基としては、ベンジルハライドがより好ましく、３，５－ビス（ハロメチル）ベンジル基が特に好ましい。前記ハロゲンの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が好ましく、塩素原子がより好ましい。

前記環状化基によるペプチドの環状化は、前記環状化基と、ペプチドに含まれるチオール基、アミノ基、及びヒドロキシ基からなる群から選択される少なくとも１種の基との反応により行われることが好ましい。

また、例えば、オキシムライゲーション法により、前記ペプチドと前記細胞膜透過性分子とを結合する場合には、下記構造式で表されるものを前記ペプチド連結用基として用いることもできる。

－－連結基－－
前記連結基は、前記ペプチド連結用基と前記一般式（ｉ）で表す構造とを連結する基である。
前記連結基の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した繰返し単位を含む構造などが挙げられる。

前記細胞膜透過性分子は、ペプチドに導入される際に、前記ペプチドにおける反応性アミノ酸残基と反応する部位の構造が変化してもよい。

前記細胞膜透過性分子の具体例としては、例えば、以下の構造式で表される化合物などが挙げられる。なお、前記細胞膜透過性分子は、塩の形態とする際に、その構造の一部が変化してもよい。

下記構造式で表される細胞膜透過性分子Ｇ３－ＤＣＸは、一般式（ｉ）において、Ｘの部分にヘテロ原子含有基として、３，５－ビス（クロロメチル）ベンジル基である環状化基（ペプチド連結用基）と、連結基とを有している例である。前記細胞膜透過性分子Ｇ３－ＤＣＸは環状化基を有しているので、ペプチドの環状化と、ペプチドへの細胞膜透過性の付与とを１工程で行うことができる。

下記構造式で表される細胞膜透過性分子Ｇ３は、一般式（ｉ）において、Ｘの部分にヘテロ原子含有基として、オキシムライゲーション法によりペプチドと結合可能なペプチド連結用基と、連結基とを有している例である。

－一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子の製造方法－
前記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子の製造方法としては、特に制限はなく、公知の化学合成の技術を適宜選択して行うことができる。例えば、米国特許第７，８６２，８０７号明細書などに記載の方法を参考にして、公知の化学合成の技術を適宜選択することにより製造することができる。

＜＜塩の形成＞＞
前記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子を、ｐＫ_ａの値が－８．０超の酸との塩とする方法としては、特に制限はなく、公知の化学合成の技術を適宜選択して行うことができる。例えば、塩の形態ではない細胞膜透過性分子の粗生成物を、目的の塩の種類に応じた移動相を用いたＨＰＬＣにより精製し、目的とする塩の形態の細胞膜透過性分子とする方法、塩の形態である細胞膜透過性分子を、対イオンを目的の塩のイオンへと置換した陰イオン交換樹脂に通じ、溶出することで目的とする塩の形態の細胞膜透過性分子とする方法などが挙げられる。

本発明の細胞膜透過性分子は、ｐＫ_ａ（酸解離定数）の値が－８．０超（－８．０よりも大きい）の酸との塩である。
本発明において、酸が複数のｐＫ_ａの値を有している場合には、１段階目の解離におけるｐＫ_ａの値であるｐＫ_ａ１の値をｐＫ_ａの値とする。
前記ｐＫ_ａの値が－８．０超の酸の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トリフルオロ酢酸、硫酸、硝酸、リン酸、メシル酸、トシル酸、酒石酸、クエン酸、酢酸、各種アミノ酸などが挙げられる。これらの中でも、酸性アミノ酸以外の酸が好ましく、ｐＫ_ａの値が－８．０超４．７以下の酸がより好ましい。
前記ｐＫ_ａの値が－８．０超４．７以下の酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トリフルオロ酢酸（－０．３）、硫酸（－３．０）、硝酸（－１．３）、リン酸（２．１（ｐＫ_ａ１））、メシル酸（－２．６）、トシル酸（－２．８）、酒石酸（３．２（ｐＫ_ａ１））、クエン酸（３．１（ｐＫ_ａ１））、酢酸（４．７）などが挙げられる。前記酸の名称の後のかっこ内の数値はｐＫ_ａの値を表す。なお、ｐＫ_ａ１の値の場合は、数値の後にｐＫ_ａ１と記載した。

＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

前記細胞膜透過性分子は、上記した一般式（ｉ）で表される構造を有し、ｐＫ_ａの値が－８．０超の酸との塩であって、本発明の効果を損なわない限りにおいて、その他の構成を有していてもよい。

前記細胞膜透過性分子が所望の構造を有するか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、公知の分析方法を適宜選択することができ、例えば、質量分析法、プロトン核磁気共鳴分光法、炭素１３核磁気共鳴分光法、紫外分光法、赤外分光法などの分析方法が挙げられる。

本発明の膜透過性向上方法によれば、分子量が小さな細胞膜透過性分子の細胞膜透過性を向上することができる。そのため、前記細胞膜透過性分子をペプチド、核酸、タンパク質などの有効成分に導入することで、これらの細胞内への取込み効率を向上することができる。これらの中でも前記細胞膜透過性分子は、ペプチドに導入されたものであることが好ましい。

したがって、本発明は、前記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子が導入されたペプチド複合体を、ｐＫ_ａの値が－８．０超の酸との塩とすることを含むことを特徴とするペプチド複合体の細胞膜透過性の向上方法にも関する。

［ペプチド複合体の細胞膜透過性の向上方法］
前記ペプチド複合体の細胞膜透過性の向上方法は、塩形成工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。

＜塩形成工程＞
前記塩形成工程は、前記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子が導入されたペプチド複合体を、ｐＫ_ａの値が－８．０超の酸との塩とする工程であり、前記細胞膜透過性分子がペプチドに導入されたものである点以外は、上記した細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法における塩形成工程と同様にして行うことができる。

＜＜ペプチド複合体＞＞
前記ペプチド複合体は、ペプチドと、前記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。

－ペプチド－
前記ペプチドとしては、前記細胞膜透過性分子を導入することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記細胞膜透過性分子を導入することにより環状化されるペプチドが好ましい。
前記ペプチドにおけるアミノ酸の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、天然のアミノ酸であってもよいし、非天然のアミノ酸であってもよく、また、Ｄ体であってもよいし、Ｌ体であってもよい。
前記ペプチドは、リポペプチドなどの修飾型ペプチドであってもよい。

前記細胞膜透過性分子の導入に利用するアミノ酸残基（以下、「反応性アミノ酸残基」と称することがある。）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、トリプトファン残基、チロシン残基、セリン残基、スレオニン残基などが挙げられる。
前記ペプチドとして、細胞膜透過性分子を導入することにより環状化されるペプチドを用いる場合には、前記反応性アミノ酸残基としては、例えば、システイン残基、リジン残基、セリン残基、スレオニン残基などが挙げられる。
また、アミノ酸残基におけるアルコール側鎖を利用してもよい。
前記反応性アミノ酸残基は、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。

前記反応性アミノ酸残基のペプチドにおける数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
例えば、前記ペプチドとして、細胞膜透過性分子を導入することにより環状化されるペプチドを用いる場合には、前記反応性アミノ酸残基のペプチドにおける数は、２以上が好ましい。前記反応性アミノ酸残基のペプチドにおける数の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、反応点が多くなるとペプチドに結合する前記細胞膜透過性分子の数や位置が安定せず、アミノ酸配列に由来するペプチドの特性を比較し難くなる場合があるので、１０以下が好ましい。
なお、例えば、ペプチド中のシステイン残基がジスルフィド結合により前記ペプチドの高次構造の安定化に関与しているような場合には、別途、上記反応性アミノ酸残基を前記ペプチドに導入することが好ましい。

前記反応性アミノ酸残基の前記ペプチドにおける位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

例えば、前記ペプチドとして、ｍＲＮＡ分子、その翻訳物であるペプチド鎖（以下、「ポリペプチド鎖」と称することもある。）、及びリボソームを含むリボソームディスプレイ複合体（以下、「ＲＤ複合体」と称することがある。）を用いる場合には、例えば、リボソームの出口トンネル（ｅｘｉｔ ｔｕｎｎｅｌ）から外に出ている部分であり、具体的にはＮ末端から２番目～Ｃ末端から３０番目の位置（Ｎ末端から２番目の位置及びＣ末端から３０番目の位置を含む）の間とすることが、前記リンカー分子による修飾反応がリボソームにより立体的に阻害され難くなり得る点で、好ましい。
前記Ｃ末端からの位置としては、Ｃ末端から５０番目が好ましく、１００番目がより好ましい。
また、前記反応性アミノ酸残基の位置をＮ末端側から数えた場合、その位置は、ペプチドの鎖長に応じて適宜設定できるが、例えば、Ｎ末端から２～１，０００番目の位置であり、Ｎ末端から２～１００番目の位置が好ましく、Ｎ末端から２～５０番目の位置がより好ましい。

前記ＲＤ複合体の製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、国際公開第２０１７／２１３１５８号に記載の方法などが挙げられる。また、市販のキットを利用して製造することもできる。

前記ペプチドのアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ペプチドライブラリとして有用であるように、特定の位置にランダム配列を含むものが好ましい。かかるランダム配列の中から、所定の目的に応じて有用なアミノ酸配列を特定し得る。

前記ランダム配列の前記ペプチドにおける位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記反応性アミノ酸残基の位置と同様に、ＲＤ複合体を用いる場合には、Ｎ末端から２番目～Ｃ末端から３０番目の位置（Ｎ末端から２番目の位置及びＣ末端から３０番目の位置を含む）の間とすることが好ましい。即ち、反応性アミノ酸残基は、ランダム配列内に含まれることが好ましい。従ってランダム配列の好ましい位置は、反応性アミノ酸残基の好ましい位置と同じ範囲から設定できる。

前記ランダム配列の前記ペプチドにおける数は、１つであってもよく、２つ以上であってもよい。前記ランダム配列の数の上限としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０以下が好ましい。
前記ランダム配列１つあたりのアミノ酸残基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１以上、３０以下とすることができる。
１つのランダム配列が長くなるほど、またランダム配列の数が多くなるほど、ペプチドライブラリの多様性を高めることができる。

前記ペプチドは、更に、ＦＬＡＧ（登録商標）配列やポリＨｉｓ配列等のポリペプチド鎖の精製のための配列、プロテアーゼなどにより選択的に切断される配列、スペーサー配列などを含んでいてもよい。

前記ペプチドのアミノ酸残基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１０以上、５，０００以下とすることができる。
前記ペプチドのアミノ酸残基数の下限値としては、１５０以上が好ましく、２００以上がより好ましい。また、ペプチドのアミノ酸残基数の上限値としては、８００以下が好ましく、６００以下がより好ましく、５００以下が特に好ましい。前記下限値と上限値とは、適宜組み合わせて選択することができる。

前記ペプチドの合成方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。

－細胞膜透過性分子－
前記細胞膜透過性分子は、上記した一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子である。
前記細胞膜透過性分子は、ペプチドに導入される際に、前記ペプチドにおける反応性アミノ酸残基と反応する部位の構造が変化してもよい。

－その他の構成－
前記ペプチド複合体におけるその他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光物質などの発光物質、色素、放射性物質、薬剤、毒素、核酸、アミノ酸、糖類、脂質、各種ポリマーなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記蛍光物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類などの蛍光色素が挙げられる。
前記その他の構成は、例えば、上記したペプチドに、直接又は連結基などを介して結合させることができる。

前記ペプチドに、前記細胞膜透過性分子を導入する（以下、「結合する」、「挿入する」、「連結する」と称することもある。）方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細胞膜透過性分子におけるペプチド連結用基と、前記ペプチドにおける反応性アミノ酸残基とを反応させる方法などが挙げられる。例えば、還元剤の存在下で、前記細胞膜透過性分子と、前記ペプチドとを反応させる方法などが挙げられる。前記還元剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩などが挙げられる。
前記反応の温度、時間等の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記細胞膜透過性分子の導入により、ペプチドへ細胞膜透過性を付与することができる。また、上記した環状化基を有する細胞膜透過性分子を導入する場合には、ペプチドの環状化と、ペプチドへの細胞膜透過性の付与とを同時に行うことができる。
前記細胞膜透過性分子の導入では、反応物中における少なくとも１つのペプチドに細胞膜透過性分子が導入されればよいが、全てのペプチドに細胞膜透過性分子が導入されることが好ましい。

前記ペプチド複合体に用いるペプチドは、ペプチドライブラリの態様であってもよい。即ち、上記した細胞膜透過性分子が導入される前のペプチドは、ペプチドライブラリの態様のものを用いることもできる。

＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

以下に実施例等を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例等に何ら限定されるものではない。

（実施例１：細胞膜透過性分子Ｇ３－ＤＣＸトリフルオロ酢酸塩の合成）
＜化合物Ｇ３－ＤＣＸの合成＞
－化合物Ｃ１の合成－
米国特許第７，８６２，８０７号明細書に記載の方法と同様の方法により、下記構造式で表される化合物Ｃ１を合成した。
なお、構造式中の「Ｂｏｃ」は、「ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基」を表す。

－化合物Ｃ３の合成－

上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｃ３を合成した。
具体的には、化合物Ｃ１（５００ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（１５ｍＬ）を０℃に冷却し、化合物Ｃ２（東京化成工業株式会社製、製品番号Ａ２２９３）（１１７．５ｍｇ，０．５０４ｍｍｏｌ）と１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（８５．１ｍｇ，０．６３０ｍｍｏｌ）と１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ／ＨＣｌ）（１２０ｍｇ，０．６３０ｍｍｏｌ）を加えて２５℃で１７時間撹拌した。ここにＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）を加え、塩化メチレンで抽出を行い（３０ｍＬで３回）、有機層は１Ｎ塩酸（２０ｍＬで２回）と飽和重曹水（２０ｍＬで２回）と水（２０ｍＬで２回）で洗浄した。Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥しろ過と濃縮を行い、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー精製（メタノール（ＭｅＯＨ）／ＣＨ_２Ｃｌ_２＝１／１０）することにより、化合物Ｃ３を白色固体として取得した（５３３ｍｇ，０．３７９ｍｍｏｌ，収率９０％）。
前記化合物Ｃ３の１Ｈ ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）： δ １１．４（ｓ， ３Ｈ）， ８．５８（ｔ， ^３Ｊ_ＨＨ＝６．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．６９（ｔ， ^３Ｊ_ＨＨ＝５．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ６．８４（ｓ， １Ｈ）， ３．８９（ｓ， ２Ｈ）， ３．７１－３．６５（ｍ， ２２Ｈ）， ３．５６－３．５３（ｍ， ６Ｈ）， ３．４２－３．３８（ｍ， ８Ｈ）， ２．４３（ｔ， ^３Ｊ_ＨＨ＝６．０Ｈｚ， ６Ｈ）， １．４９（ｓ， ２７Ｈ）， １．４８（ｓ， ２７Ｈ）

－化合物ＤＢＸＡの合成－
水素化ナトリウム（１３２ｍｇ，３．０２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（６ｍＬ）に懸濁させ０℃に冷却した。ここに２－プロピン－１－オール（０．１６５ｍＬ，２．８０ｍｍｏｌ）を加え０℃で３０分間撹拌した。１，３，５－トリス（ブロモメチル）ベンゼン（１．００ｇ，２．８０ｍｍｏｌ）を加え２５℃で２０時間撹拌した。酢酸エチル（１００ｍＬ）を加えてから水（１００ｍＬ）と飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで洗浄した。ろ過と濃縮を行い得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）で精製し（塩化メチレン／ヘキサン＝１／２）、下記構造式で表される化合物ＤＢＸＡ（４１６．６ｍｇ，１．２５ｍｍｏｌ，収率４５％）を淡黄色油状物として取得した。
前記化合物ＤＢＸＡの１Ｈ ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）： δ ７．２９（ｓ， １Ｈ）， ７．２６（ｓ， ２Ｈ）， ４．５３（ｓ， ２Ｈ）， ４．４０（ｓ， ４Ｈ）， ４．１５（^４Ｊ_ＨＨ＝２．５Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４３（^４Ｊ_ＨＨ＝２．０Ｈｚ， １Ｈ）

－化合物Ｃ４の合成－

上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｃ４を合成した。
具体的には、化合物Ｃ３（５３３ｍｇ， ０．３７９ｍｍｏｌ）と化合物ＤＢＸＡ（１８８ｍｇ， ０．５６８ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（４０ｍＬ）からなる溶液に窒素ガスバブリングを行い、窒素雰囲気下とした。ここに、硫酸銅水溶液（２００ｍＭ； １．８９ｍＬ，０．３７９ｍｍｏｌ）とアスコルビン酸ナトリウム水溶液（１００ｍＭ； ７．５８ｍＬ，０．７５８ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３時間撹拌した。反応液に水を加え塩化メチレンで抽出を行い（２０ｍＬで３回）、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥しろ過と濃縮を行い、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー精製（ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２＝１／２０）することにより、化合物Ｃ４を白色固体として取得した（４９７ｍｇ，０．２８６ｍｍｏｌ，収率７６％）。
前記化合物Ｃ４の１Ｈ ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）： δ ８．５８（ｔ， ^３Ｊ_ＨＨ＝５．５Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．７７（ｓ， １Ｈ）， ７．７４（ｔ， ^３Ｊ_ＨＨ＝５．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．３４（ｓ， １Ｈ）， ７．３２（ｓ， ２Ｈ）， ６．８２（ｓ， １Ｈ）， ４．６９（ｓ， ２Ｈ）， ４．５８（ｓ， ２Ｈ）， ４．５６（ｔ， ^３Ｊ_ＨＨ＝５．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．４７（ｓ， ４Ｈ）， ３．８９（ｔ， ^３Ｊ_ＨＨ＝５．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８７（ｓ， ２Ｈ）， ３．６９（ｔ， ^３Ｊ_ＨＨ＝６．０Ｈｚ， ６Ｈ）， ３．６６（ｓ， ６Ｈ）， ３．６１（ｓ， ８Ｈ）， ３．５６－３．５２（ｍ， ６Ｈ）， ３．４１－３．３８（ｍ， ６Ｈ）， ２．４２（ｔ， ^３Ｊ_ＨＨ＝６．０Ｈｚ， ６Ｈ）， １．４９（ｓ， ２７Ｈ）， １．４８（ｓ， ２７Ｈ）

－化合物Ｇ３－ＤＣＸの合成－

上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｇ３－ＤＣＸを合成した。
具体的には、化合物Ｃ４（４９７ｍｇ，０．２８６ｍｍｏｌ）と４Ｎ塩酸ジオキサン溶液（３０ｍＬ）を混合し、２５℃で４６時間撹拌した。反応後、白色固体が析出した。上清を除去し、化合物Ｇ３－ＤＣＸの粗生成物を取得した。

＜細胞膜透過性分子Ｇ３－ＤＣＸトリフルオロ酢酸塩の合成＞
上述の方法により得られたＧ３－ＤＣＸの粗生成物（１１６ｍｇ）を水に溶解し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む移動相を用いたＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により精製し、下記構造式で表される細胞膜透過性分子Ｇ３－ＤＣＸトリフルオロ酢酸塩（５３．１ｍｇ， ３８．２μｍｏｌ）を取得した。

（実施例２：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩の合成）
＜ペプチドの合成＞
マイクロウェーブを用いた固相合成法により、リンクアミド（Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ）樹脂（０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上で、以下の配列を有するペプチドを合成した。
ＦＩＴＣ－Ａｈｘ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－ＮＨ_２
（上記配列中、「ＦＩＴＣ」はフルオレセインイソチオシアネートを表し、「Ａｈｘ」は６－アミノヘキサン酸を表す。）

前記ペプチドを形成した樹脂を、ＴＦＡ／水／トリイソプロピルシラン／３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（９２．５／２．５／２．５／２．５（容量比））に３時間浸漬し、前記ペプチドを樹脂から切り出した。得られたペプチドをＨＰＬＣで精製し凍結乾燥することにより、上記配列を有するペプチド（以下、「Ｐ」と表すことがある。下記構造式参照。）を取得した。前記ペプチドＰのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）による同定データは、以下のとおりであった。
ＥＳＩ－ＭＳ Ｃ_７２Ｈ_９２Ｎ_１６Ｏ_２２Ｏ_３ 計算値（[Ｍ＋２Ｈ]^２＋）８１５．２９５、測定値８１４．６７

＜ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩の合成＞

上記反応式のようにして、上記構造式で表されるペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩を合成した。
具体的には、上記で合成したペプチドＰ（１１．０ｍｇ，６．７５μｍｏｌ）を２０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液（１１．８ｍＬ）とアセトニトリル（ＭｅＣＮ）（１．７ｍＬ）の混合溶液に溶解させた。この溶液に、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（５００ｍＭ ｉｎ Ｈ_２Ｏ；１４．８μＬ，７．４μｍｏｌ）を添加し、２５℃下で１５分間撹拌した。続いて、上記で合成したＧ３－ＤＣＸ（１０．６ｍｇ，１０．１μｍｏｌ）と２５℃下で２４時間撹拌した。その後、反応液を、ＴＦＡを含む移動相を用いたＨＰＬＣで精製することにより、環状ペプチド（ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩）（３．２５ｍｇ，１．１０μｍｏｌ，収率１６％）を取得した。
前記ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによる同定データは、次のとおりであった。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ Ｃ_１１４Ｈ_１６３Ｎ_３２Ｏ_３３Ｓ_３ 計算値（[Ｍ＋Ｈ]^＋）２６０４．９２、測定値２６０４．３３０

（実施例３：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ酢酸塩の調製）
実施例２と同様にして合成したペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩（１．０ｍｇ）を、超純水に溶解し（０．５ｍｇ／ｍＬ）、対イオンを酢酸イオンへと置換した陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン ＰＡ３０６Ｓ）を添加した。１時間振とうしたのち、陰イオン交換樹脂を濾別し、超純水で溶出した。得られた溶液を凍結乾燥して、白色乃至オフホワイト色粉末としてＧ３－ＤＣＸ－Ｐ酢酸塩（０．９ｍｇ）を得た。

（実施例４：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ硝酸塩の調製）
実施例２と同様にして合成したペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩を、超純水に溶解し、対イオンを硝酸イオンへと置換した陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン ＰＡ３０６Ｓ）に通じた。溶出には超純水を用いた。得られた溶液を凍結乾燥して、白色乃至オフホワイト色粉末としてペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ硝酸塩を得た。

（実施例５：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ硫酸塩の調製）
実施例２と同様にして合成したペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩を、超純水に溶解し、対イオンを硫酸イオンへと置換した陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン ＰＡ３０６Ｓ）に通じた。溶出には超純水を用いた。得られた溶液を凍結乾燥して、白色乃至オフホワイト色粉末としてペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ硫酸塩を得た。

（実施例６：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐリン酸塩の調製）
実施例２と同様にして合成したペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩を、超純水に溶解し、対イオンをリン酸イオンへと置換した陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン ＰＡ３０６Ｓ）に通じた。溶出には超純水を用いた。得られた溶液を凍結乾燥して、白色乃至オフホワイト色粉末としてペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐリン酸塩を得た。

（実施例７：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐメシル酸塩の調製）
実施例２と同様にして合成したペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩を、超純水に溶解し、対イオンをメシル酸イオンへと置換した陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン ＰＡ３０６Ｓ）に通じた。溶出には超純水を用いた。得られた溶液を凍結乾燥して、無色液体としてペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐメシル酸塩を得た。

（実施例８：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトシル酸塩の調製）
実施例２と同様にして合成したペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩を、超純水に溶解し、対イオンをトシル酸イオンへと置換した陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン ＰＡ３０６Ｓ）に通じた。溶出には超純水を用いた。得られた溶液を凍結乾燥して、白色粉末としてペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトシル酸塩を得た。

（実施例９：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ酒石酸塩の調製）
実施例２と同様にして合成したペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩を、超純水に溶解し、対イオンを酒石酸イオンへと置換した陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン ＰＡ３０６Ｓ）に通じた。溶出には超純水を用いた。得られた溶液を凍結乾燥して、淡黄色粉末としてペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ酒石酸塩を得た。

（実施例１０：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐクエン酸塩の調製）
実施例２と同様にして合成したペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩を、超純水に溶解し、対イオンをクエン酸イオンへと置換した陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン ＰＡ３０６Ｓ）に通じた。溶出には超純水を用いた。得られた溶液を凍結乾燥して、淡黄色粉末としてペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐクエン酸塩を得た。

（実施例１１：ペプチド複合体Ｇ３－Ｐトリフルオロ酢酸塩の合成）
＜化合物Ｆｍｏｃ－Ｇ３－Ｐの合成＞
－化合物Ｋ１の合成－
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３，１７－２４に記載の方法に従い、下記構造式で表される化合物Ｋ１を合成した。なお、化合物の構造式中の「Ｆｍｏｃ」は「９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基」を表す。

－化合物Ｋ３の合成－

上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｋ３を合成した。
具体的には、化合物Ｋ１（５０ｍｇ，０．１５９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。ここに、米国特許第７，８６２，８０７号明細書に記載の方法と同様の方法により合成した化合物Ｋ２（２８４ｍｇ，０．２３９ｍｍｏｌ）と１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ／ＨＣｌ）（４５．８ｍｇ，０．２３９ｍｍｏｌ）と１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（３２．２ｍｇ，０．２３９ｍｍｏｌ）を加え０℃で１２時間撹拌した。飽和食塩水（２０ｍＬ）を加え、塩化メチレンで抽出を行い（２０ｍＬで３回）、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、濃縮した。残渣を分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）で精製し（塩化メチレン／メタノール（ＭｅＯＨ）＝１０／１；Ｒｆ＝０．７）、化合物Ｋ３（２１０ｍｇ，０．１４１ｍｍｏｌ，収率８９％）を無色油状物として取得した。
なお、化合物の構造式中の「Ｆｍｏｃ」は「９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基」、「Ｂｏｃ」は「ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基」を表す。
前記化合物Ｋ３の１Ｈ ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）： δ ８．５８（ｔ， ^３Ｊ_ＨＨ＝６．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．７４（ｄ， ^３Ｊ_ＨＨ＝８．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．５８－７．５７（ｍ， ４Ｈ）， ７．３８（ｔ， ^３Ｊ_ＨＨ＝７．５Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．２８（ｔ， ^３Ｊ_ＨＨ＝７．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．４７（ｄ， ^３Ｊ_ＨＨ＝７．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．２６（ｓ， ６Ｈ）， ３．６８（ｔ， ^３Ｊ_ＨＨ＝５．５Ｈｚ， ６Ｈ）， ３．４９－３．４６（ｍ， ６Ｈ）， ３．３７－３．３３（ｍ， ６Ｈ）， ２．４３（ｔ， ^３Ｊ_ＨＨ＝６．０Ｈｚ， ６Ｈ）， １．４９（ｓ， ２７Ｈ）， １．４６（ｓ， ２７Ｈ）

－化合物Ｋ４の合成－

上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｋ４を合成した。
具体的には、化合物Ｋ３（２１０ｍｇ，０．１４１ｍｍｏｌ）と２０％ピペリジン／Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（１．０ｍＬ）を混合し、２５℃で１時間撹拌した。反応液に窒素ガスを吹き付けて溶媒を揮発させた。得られた残渣をＰＴＬＣで精製し（塩化メチレン／ＭｅＯＨ＝１０／１）、化合物Ｋ４（１６８ｍｇ，０．１３３ｍｍｏｌ，収率９４％）を無色透明油状物として取得した。
前記化合物Ｋ４の１Ｈ ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）： δ １１．４（ｓ， ３Ｈ）， ８．５９（ｔ， ^３Ｊ_ＨＨ＝６．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．７１（ｔ， ^３Ｊ_ＨＨ＝５．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ６．７９（ｓ， １Ｈ）， ４．０３（ｓ， ２Ｈ）， ３．７１－３．６７（ｍ， １２Ｈ）， ３．５５－３．５２（ｍ， ６Ｈ）， ３．４２－３．３９（ｍ， ６Ｈ）， ２．４３（ｔ， ^３Ｊ_ＨＨ＝５．５Ｈｚ， ６Ｈ）， １．４９（ｓ， ２７Ｈ）， １．４８（ｓ， ２７Ｈ）

－細胞膜透過性分子Ｇ３の合成－

上記反応式のようにして、上記構造式で表される細胞膜透過性分子Ｇ３を合成した。
具体的には、化合物Ｋ４に塩酸ジオキサン溶液（４Ｎ； １．０ｍＬ）を加えて溶液とし、２５℃で２時間撹拌した。析出した白色固体を遠心分離により取得し、さらにジエチルエーテルで洗浄することにより（３ｍＬで３回）、細胞膜透過性分子Ｇ３（９０ｍｇ，定量的収率）を取得した。
前記細胞膜透過性分子Ｇ３のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）による同定データは、以下のとおりであった。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ Ｃ_２４Ｈ_５０Ｎ_１４Ｏ_８ 計算値（［Ｍ＋Ｈ］^＋）６６３．４０１、測定値６６３．４０２

－化合物Ｋ５の合成－
マイクロウェーブを用いた固相合成法により、リンクアミド（Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ）樹脂（０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上で、以下の配列を有するペプチドを合成した。
Ｆｍｏｃ－Ａｈｘ－Ｃｙｓ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－ＮＨ_２
［上記配列中、「Ｆｍｏｃ」は９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基を表し、「Ａｈｘ」は６－アミノヘキサン酸を表す。］
前記ペプチドを形成した樹脂を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水／トリイソプロピルシラン／３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（９２．５／２．５／２．５／２．５（容量比））に３時間浸漬し、前記ペプチドを樹脂から切り出した。
得られたペプチド（５５．０ｍｇ，３０．０μｍｏｌ）をＤＭＦ（２．５ｍＬ）に溶解し、１，３－ジブロモ－２－プロパノン（２０ｍＭ ＤＭＦ溶液；１．５ｍＬ，３０μｍｏｌ）及びＮ－メチルモルホリン（１０ｍＭ ＤＭＦ溶液；６．０ｍＬ，６０μｍｏｌ）を加えて２５℃で１時間撹拌した。ここにジエチルエーテル（１００ｍＬ）を加えて上清を除去し、残渣をジエチルエーテル（１００ｍＬ）で洗浄することにより化合物Ｋ５を白色固体として取得した（５４．６ｍｇ，２８．９μｍｏｌ，収率９７％）。
なお、化合物Ｋ５の構造式中の「ＣＭＬＹＩＶＰＹＦＳＶＧＣ」は、ペプチドのアミノ酸配列を表す。
前記化合物Ｋ５のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）による同定データは、以下のとおりであった。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ Ｃ_９４Ｈ_１２８Ｎ_１５Ｏ_２０Ｓ_３ ^＋ 計算値（［Ｍ＋Ｈ］^＋）１８８２．８６２、測定値１８８３．１４０

－化合物Ｆｍｏｃ－Ｇ３－Ｐの合成－

上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｆｍｏｃ－Ｇ３－Ｐを合成した。
具体的には、化合物Ｋ５（３０ｍｇ，０．０１５９ｍｍｏｌ）と細胞膜透過性分子Ｇ３（５２．７ｍｇ，０．０７９６ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（０．５ｍＬ）と水（０．０５ｍＬ）とを混合し、２５℃で２４時間撹拌した。ジエチルエーテル（５ｍＬ）を加えて遠心分離を行い、上澄を除去した。残渣をジエチルエーテルで洗浄（３ｍＬで３回）することにより化合物Ｆｍｏｃ－Ｇ３－Ｐの粗生成物を取得した。逆相ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により精製し凍結乾燥することにより、化合物Ｆｍｏｃ－Ｇ３－Ｐ（３．８ｍｇ，０．００１５０ｍｍｏｌ，収率９％）を取得した。

＜ペプチド複合体Ｇ３－Ｐトリフルオロ酢酸塩の合成＞

上記反応式のようにして、上記構造式で表されるペプチド複合体Ｇ３－Ｐトリフルオロ酢酸塩を合成した。
具体的には、上記で合成した化合物Ｆｍｏｃ－Ｇ３－Ｐと２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１．０ｍＬ）を混合し、２５℃で２時間ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。窒素ガスを吹き付けて溶媒を揮発させた。この残渣をジエチルエーテルで洗浄した（１ｍＬで３回）。ここに、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（０．８ｍｇ，０．００２ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０２２ｍＬ，０．０１２４ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（０．５ｍＬ）を混合し、２５℃で２０時間撹拌した。ジエチルエーテル（１５ｍＬ）を加えて遠心分離を行い、上澄みを除去した。残渣をジエチルエーテルで洗浄し（５ｍＬで２回）、ペプチド複合体Ｇ３－Ｐ粗生成物を取得した。ＴＦＡを含む移動相を用いたＨＰＬＣで精製し凍結乾燥することにより、ペプチド複合体Ｇ３－Ｐトリフルオロ酢酸塩（１．６ｍｇ，０．０００５９ｍｍｏｌ，収率４０％）を白色固体として取得した。
前記ペプチド複合体Ｇ３－Ｐトリフルオロ酢酸塩のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによる同定データは、次のとおりであった。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ Ｃ_１２４Ｈ_１７７Ｎ_３０Ｏ_３０Ｓ_４ 計算値（[Ｍ＋Ｈ]^＋）２６９４．２１２、測定値２６９４．２０８

（比較例１：ペプチド複合体Ｇ６－Ｐの合成）
国際出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ２０２０／００５７６２に記載の実施例１の方法により、下記構造式で表されるペプチド複合体Ｇ６－Ｐを合成した。なお、下記構造式中の「ＣＭＬＹＩＶＰＹＦＳＶＧＣ」は、ペプチドのアミノ酸配列を表す。

（比較例２：ペプチド複合体Ｇ９－Ｐの合成）
国際出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ２０２０／００５７６２に記載の実施例２の方法により、下記構造式で表されるペプチド複合体Ｇ９－Ｐを合成した。なお、下記構造式中の「ＣＭＬＹＩＶＰＹＦＳＶＧＣ」は、ペプチドのアミノ酸配列を表す。

（試験例１：ペプチド複合体の細胞膜透過能評価）
実施例１１で合成したペプチド複合体Ｇ３－Ｐトリフルオロ酢酸塩、比較例１で合成したペプチド複合体Ｇ６－Ｐ、及び比較例２で合成したペプチド複合体Ｇ９－Ｐのいずれかを２μＭ含む細胞培養液中、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２、３７℃の条件下で、ＨｅＬａ細胞（Ｈｕｍａｎ ｃｅｒｖｉｘ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ）を２時間培養した。ＨｅＬａ細胞の培養には、ＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ Ｄ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、１０％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）添加）を用いた。
次いで、Ｄ－ＰＢＳ（－）（ヘパリン（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）添加）で細胞表面を洗浄後、細胞を回収し、Ｄ－ＰＢＳ（－）（０．５％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、２００ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０．２％（ｖ／ｖ）ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）添加）に懸濁させ、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩ）を用いて蛍光強度を測定した。フローサイトメトリー解析時には、ヨウ化プロピジウム陽性の死細胞を除いた生細胞集団に対し、蛍光強度最頻値を算出した。結果を表１に示す。

国際出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ２０２０／００５７６２においては、ペプチド複合体の細胞膜透過能は、Ｇ３－Ｐ、Ｇ６－Ｐ及びＧ９－Ｐの順に高くなり、グアニジル基を有する樹状骨格の数が多いほど膜透過性が大きかった。一方、表１に示すように、培養４時間後におけるＧ３－Ｐトリフルオロ酢酸塩の細胞膜透過能は、Ｇ６－ＰやＧ９－Ｐと比較して顕著に高かった。このことから、ｐＫ_ａの値が－８．０超の酸との塩の形態をとることでＧ３－Ｐは、Ｇ６－Ｐ及びＧ９－Ｐと同等以上の細胞膜透過性を示すことが明らかとなった。
分子量４，０００Ｄａを超える分子は免疫原性を引き起こす可能性があり、分子量が１，０００を超えるペプチドと結合させて用いる細胞膜透過性分子は、分子量はより小さいものが望ましい。そのため、医薬品製造においては、Ｇ６－ＰやＧ９－Ｐよりも分子量の小さいＧ３－Ｐを使用するのが好ましい。また、上述したように、Ｇ３－ＰをｐＫ_ａの値が－８．０超の酸との塩の形態にすることで、膜透過能を顕著に向上させることが可能となり、Ｇ３－Ｐが課題としていた細胞膜透過能の不足についても克服できたといえる。つまり本発明の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法は、医薬品としてのペプチドを含むペプチド複合体の細胞膜透過性能を向上することができる有用な方法であるといえる。

本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ 下記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子を、ｐＫ_ａの値が－８．０超の酸との塩とすることを含むことを特徴とする細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。
（前記一般式（ｉ）中、Ｘは結合手を表す。）。
＜２＞ 前記一般式（ｉ）で表される構造の前記Ｘの部分が、ヘテロ原子含有基と結合している前記＜１＞に記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。
＜３＞ 前記ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子の含有割合が、１０％以上である前記＜２＞に記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。
＜４＞ 前記ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子が、酸素原子、窒素原子、硫黄原子及びリン原子からなる群から選択される少なくとも１種である前記＜２＞から＜３＞のいずれかに記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。
＜５＞ 前記ヘテロ原子含有基が、繰返し単位を含む前記＜２＞から＜４＞のいずれかに記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。
＜６＞ 前記繰返し単位が、アルキレンオキサイドである前記＜５＞に記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。
＜７＞ 前記アルキレンオキサイドが、メチレンオキサイド、エチレンオキサイド及びプロピレンオキサイドからなる群から選択される少なくとも１種である前記＜６＞に記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。
＜８＞ 前記細胞膜透過性分子がペプチドに導入されたものである前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。

Claims (8)

1. 下記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子を、ｐＫ_ａの値が－８．０超の酸との塩とすることを含むことを特徴とする細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法：
   （前記一般式（ｉ）中、Ｘは結合手を表す。）。
2. 前記一般式（ｉ）で表される構造の前記Ｘの部分が、ヘテロ原子含有基と結合している請求項１に記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法。
3. 前記ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子の含有割合が、１０％以上である請求項２に記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法。
4. 前記ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子が、酸素原子、窒素原子、硫黄原子及びリン原子からなる群から選択される少なくとも１種である請求項２から３のいずれかに記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法。
5. 前記ヘテロ原子含有基が、繰返し単位を含む請求項２から４のいずれかに記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法。
6. 前記繰返し単位が、アルキレンオキサイドである請求項５に記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法。
7. 前記アルキレンオキサイドが、メチレンオキサイド、エチレンオキサイド及びプロピレンオキサイドからなる群から選択される少なくとも１種である請求項６に記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法。
8. 前記細胞膜透過性分子がペプチドに導入されたものである請求項１から７のいずれかに記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法。