JP2023165042A - Method for improving cell membrane permeability of cell membrane-permeable molecule - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法に関する。 The present invention relates to a method for improving cell membrane permeability of cell membrane permeable molecules.
分子量が５００程度までの低分子医薬品は、製造コストが安く免疫原性が低いため、これまで多くの医薬品として開発されてきた。しかし、この低分子医薬品は、特異性が低く、オフターゲットによる副作用の問題から近年は次第に開発が難しくなってきている。これに対し、分子量が１０，０００を超えるような抗体やタンパク質由来の高分子医薬品は、特異性が高く副作用も少ないことから売り上げが伸びている。しかし、高価であること、その大きな分子量から免疫原性を起こす可能性があること、一般に細胞内へ移行しないためその標的となりうる分子が限られることが課題となっている。
そこで近年、ペプチドや核酸などをはじめとする分子量が５００～５，０００程度の分子、いわゆる中分子医薬品が、安価で免疫原性が低いという低分子医薬品の利点と、標的分子への特異性が高く、副作用が少ないというという高分子医薬品の利点を併せ持つ医薬品として期待されている。
Many low-molecular drugs with a molecular weight of up to about 500 have been developed as drugs due to their low manufacturing cost and low immunogenicity. However, it has become increasingly difficult to develop small-molecule drugs in recent years due to low specificity and side effects caused by off-targets. In contrast, sales of polymeric drugs derived from antibodies and proteins with molecular weights exceeding 10,000 are increasing because they are highly specific and have fewer side effects. However, problems include that they are expensive, that their large molecular weight may cause immunogenicity, and that molecules that can be targeted are limited because they generally do not move into cells.
Therefore, in recent years, so-called middle-molecule drugs, molecules with a molecular weight of about 500 to 5,000, such as peptides and nucleic acids, have been developed. It is expected to be a drug that has the advantages of polymer drugs, such as being expensive and having fewer side effects.
ペプチドや核酸などの中分子医薬品は細胞内の分子を標的とする場合、細胞膜を透過させて所望の細胞内標的分子に到達させる手段が必要となる。細胞内には、細胞骨格関連タンパク質やキナーゼ関連因子など種々の疾病治療に際して標的となりうるものが多い。このため、有用な細胞内導入法の確立は、中分子医薬品の適用範囲を大幅に拡大することに繋がる。
有効成分を細胞内に取り込む技術としては、例えば、塩基性アミノ酸を多く含む細胞膜透過ペプチドのアミノ酸配列を融合する方法や、中心から規則的に分枝した構造を有する樹状高分子であるデンドリマーを用いる方法（例えば、特許文献１参照）などが知られている。
When medium-molecule drugs such as peptides and nucleic acids target intracellular molecules, a means to penetrate the cell membrane and reach the desired intracellular target molecules is required. There are many substances within cells that can be targeted in the treatment of various diseases, such as cytoskeleton-related proteins and kinase-related factors. Therefore, the establishment of a useful intracellular introduction method will lead to a significant expansion of the scope of application of middle molecule drugs.
Techniques for introducing active ingredients into cells include, for example, methods that fuse amino acid sequences of cell membrane-penetrating peptides containing many basic amino acids, and methods that incorporate dendrimers, which are dendritic polymers that have a structure that regularly branches from the center. There are known methods (for example, see Patent Document 1).
上記したように、有効成分を細胞内に取り込む技術として、特許文献１に記載した方法などが検討されている。有効成分を細胞内により効率良く取り込むためには、細胞膜透過性分子において、細胞膜透過に寄与する構造の数を増やすことが考えられる。しかしながら、細胞膜透過性分子の分子量が大きくなると免疫原性を引き起こす可能性があるため、より小さい分子量の細胞膜透過性分子を用いて有効成分を細胞内により効率良く取り込む方法の開発が強く求められている。
したがって、本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、分子量が小さな細胞膜透過性分子であっても、有効成分を細胞内に効率良く取り込むことができる、細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法を提供することを目的とする。
As described above, the method described in Patent Document 1 and the like are being studied as techniques for taking active ingredients into cells. In order to more efficiently take active ingredients into cells, it is conceivable to increase the number of structures that contribute to cell membrane permeation in cell membrane permeable molecules. However, as the molecular weight of cell membrane-permeable molecules increases, it may cause immunogenicity, so there is a strong need to develop a method for more efficiently taking active ingredients into cells using cell membrane-permeable molecules with smaller molecular weights. There is.
Therefore, an object of the present invention is to solve the above-mentioned conventional problems and achieve the following objects. That is, an object of the present invention is to provide a method for improving the cell membrane permeability of a cell membrane permeable molecule, which can efficiently incorporate an active ingredient into cells even if the cell membrane permeable molecule has a small molecular weight. .
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、下記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子を、ｐＫａの値が－８．０超の酸との塩とすることで、細胞膜透過に寄与する構造の数が多い細胞膜透過性分子と同等以上にまで細胞膜透過性を向上させることができることを知見した。
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 下記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子を、ｐＫａの値が－８．０超の酸との塩とすることを含むことを特徴とする細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。
<1> Cell membrane permeability, which comprises converting a cell membrane permeable molecule having a structure represented by the following general formula (i) into a salt with an acid having a pK a value of more than -8.0. This is a method of improving cell membrane permeability of molecules.
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、分子量が小さな細胞膜透過性分子であっても、有効成分を細胞内に効率良く取り込むことができる、細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法を提供することができる。 According to the present invention, the above-mentioned problems in the conventional art can be solved and the above-mentioned objects can be achieved, and even if the molecular weight is a cell membrane-permeable molecule with a small molecular weight, an active ingredient can be efficiently taken into the cell membrane. A method for improving cell membrane permeability of permeable molecules can be provided.
（細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法）
本発明の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法（以下、「膜透過性向上方法」と称することがある。）は、塩形成工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
(Method for improving cell membrane permeability of cell membrane permeable molecules)
The method for improving cell membrane permeability of a cell membrane permeable molecule of the present invention (hereinafter sometimes referred to as "method for improving membrane permeability") includes at least a salt forming step, and further includes other steps as necessary. .
＜塩形成工程＞
前記塩形成工程は、下記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子を、ｐＫａの値が－８．０超の酸との塩とする工程である。
The salt forming step is a step of converting a cell membrane permeable molecule having a structure represented by the following general formula (i) into a salt with an acid having a pK a value of more than −8.0.
＜＜一般式（ｉ）で表される構造＞＞
前記一般式（ｉ）で表される構造における前記Ｘ以外の部分は、細胞膜透過性に寄与する部分である。
前記細胞膜透過性分子における一般式（ｉ）で表される構造のＸ以外の部分の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１つであることが好ましい。即ち、本発明の細胞膜透過性分子は、前記一般式（ｉ）で表される樹状構造を１つ有する態様が好ましい。
<<Structure represented by general formula (i)>>
The portion other than the X in the structure represented by the general formula (i) is a portion that contributes to cell membrane permeability.
The number of moieties other than X in the structure represented by general formula (i) in the cell membrane permeable molecule is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but is preferably one. . That is, the cell membrane permeable molecule of the present invention preferably has one dendritic structure represented by the general formula (i).
前記一般式（ｉ）で表される構造の前記Ｘの部分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ヘテロ原子含有基と結合していることが好ましい。 The part X in the structure represented by the general formula (i) is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but it is preferably bonded to a heteroatom-containing group.
－ヘテロ原子含有基－
前記ヘテロ原子含有基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（Ａ）ペプチドと連結するペプチド連結用基と、前記ペプチド連結用基と前記一般式（ｉ）で表す構造とを連結する連結基とからなる態様、（Ｂ）ペプチドと連結するペプチド連結用基からなる態様などが挙げられる。また、前記ヘテロ原子含有基は、ペプチドや核酸の骨格を有してもよい。
-Heteroatom-containing group-
The hetero atom-containing group is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. ), and (B) an embodiment consisting of a peptide linking group that connects to the peptide. Furthermore, the heteroatom-containing group may have a peptide or nucleic acid skeleton.
前記ヘテロ原子含有基の長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば直鎖上に結合している原子数の下限値としては１原子以上が好ましく、上限値としては５０原子以下が好ましく、２５原子以下がより好ましい。前記直鎖上に結合している原子数が２５原子以下の例としては、後述する細胞膜透過性分子Ｇ３－ＤＣＸにおけるヘテロ原子含有基などが挙げられる。 The length of the heteroatom-containing group is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but for example, the lower limit of the number of atoms bonded in a straight chain is preferably 1 atom or more, The upper limit is preferably 50 atoms or less, more preferably 25 atoms or less. Examples of the linear chain having 25 or less atoms include a heteroatom-containing group in the cell membrane permeable molecule G3-DCX described below.
前記ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子及びリン原子からなる群から選択される少なくとも１種などが挙げられる。前記ヘテロ原子は、１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。 The heteroatom in the heteroatom-containing group is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, for example, at least one selected from the group consisting of oxygen atom, nitrogen atom, sulfur atom, and phosphorus atom. Examples include. The number of the heteroatoms may be one, or two or more.
前記ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子の含有割合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、細胞膜透過性分子の水溶性が高まる点で、１０％以上であることが好ましい。前記ヘテロ原子の含有割合の上限としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、６０％以下が好ましく、５０％以下がより好ましい。前記ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子の含有割合の範囲としては、１０％以上６０％以下が好ましく、１０％以上５０％以下がより好ましい。
前記ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子の含有割合は、下記のようにして算出することができる。なお、全原子には、水素原子も含まれる。
ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子の含有割合（％）＝｛（ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子の数）／（ヘテロ原子含有基の全原子数）｝×１００
The content ratio of heteroatoms in the heteroatom-containing group is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose, but from the viewpoint of increasing the water solubility of the cell membrane permeable molecule, it is preferably 10% or more. preferable. The upper limit of the content of the heteroatoms is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but is preferably 60% or less, more preferably 50% or less. The content ratio of heteroatoms in the heteroatom-containing group is preferably 10% or more and 60% or less, more preferably 10% or more and 50% or less.
The content ratio of heteroatoms in the heteroatom-containing group can be calculated as follows. Note that all atoms also include hydrogen atoms.
Content ratio of heteroatoms in heteroatom-containing group (%) = {(number of heteroatoms in heteroatom-containing group)/(total number of atoms in heteroatom-containing group)}×100
前記ヘテロ原子含有基は、繰返し単位を含むことが好ましい。
前記繰返し単位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アルキレンオキサイド、アルキレンイミン、アルキレンスルフィドなどが挙げられる。前記繰返し単位は、１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。また、前記繰返し単位は、置換基を有していてもよい。前記繰り返し単位としては、入手容易性、安定性の観点からアルキレンオキサイドが好ましい。
Preferably, the heteroatom-containing group includes a repeating unit.
The repeating unit is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and includes, for example, alkylene oxide, alkylene imine, alkylene sulfide, and the like. The number of the repeating units may be one, or two or more. Further, the repeating unit may have a substituent. As the repeating unit, alkylene oxide is preferable from the viewpoint of availability and stability.
前記アルキレンオキサイドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メチレンオキサイド、エチレンオキサイド及びプロピレンオキサイドからなる群から選択される少なくとも１種などが挙げられる。 The alkylene oxide is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and includes, for example, at least one selected from the group consisting of methylene oxide, ethylene oxide, and propylene oxide.
前記繰返し単位の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記繰り返し単位の下限としては１以上が好ましく、上限としては１０以下が好ましい。 The number of the repeating units is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, the lower limit of the repeating units is preferably 1 or more, and the upper limit is preferably 10 or less.
前記繰り返し単位が有する置換基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記置換基としては、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、カルボニル、アミド、チオアミド、ウレア、スルホンアミド、カルボキシ、ニトリルが好ましい。 The substituent that the repeating unit has is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but examples of the substituent include alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, cycloalkyl, heterocyclyl, Hydroxy, mercapto, amino, carbonyl, amide, thioamide, urea, sulfonamide, carboxy, nitrile are preferred.
－－ペプチド連結用基－－
前記ペプチド連結用基は、前記ペプチドにおける反応性アミノ酸残基との反応により、細胞膜透過性分子のペプチドへの導入に寄与する。
前記反応性アミノ酸残基は、前記ペプチド連結用基と反応するアミノ酸残基であり、前記ペプチド連結用基と直接反応するアミノ酸残基であってもよいし、前記ペプチド連結用基と反応できるように修飾されたアミノ酸残基であってもよい。
--Peptide linking group--
The peptide linking group contributes to the introduction of a cell membrane permeable molecule into the peptide by reacting with a reactive amino acid residue in the peptide.
The reactive amino acid residue is an amino acid residue that reacts with the peptide linking group, and may be an amino acid residue that reacts directly with the peptide linking group, or may be an amino acid residue that reacts with the peptide linking group, or may be an amino acid residue that reacts with the peptide linking group. It may also be an amino acid residue modified to
前記ペプチド連結用基としては、前記ペプチドと連結することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、システイン残基のチオール基、リジン残基の側鎖アミノ基（－ＮＨ２）、ヒスチジン残基又はトリプトファン残基の側鎖アミノ基（＞ＮＨ）、トリプトファン残基のインドール環２位及び３位炭素、チロシン残基又はセリン残基又はスレオニン残基の側鎖水酸基（－ＯＨ）、チロシン残基のオルト位炭素、メチオニン残基の側鎖スルフィド基（－ＳＭｅ）と反応して結合を形成可能な基などが挙げられる。
前記ペプチド連結用基の具体例としては、例えば、国際公開第２０１７／２１３１５８号の段落〔００６７〕～〔００７６〕に記載されているハロゲン化アルキル基、活性化カルボニル基、不飽和炭化水素基、エポキシ基、スルホニル含有基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、カルベン発生基、ジスルフィド結合含有基、チオール基などが挙げられる。
The peptide linking group is not particularly limited as long as it can be linked to the peptide, and can be appropriately selected depending on the purpose.For example, a thiol group of a cysteine residue, a side chain amino group of a lysine residue, etc. group (-NH 2 ), the side chain amino group (>NH) of histidine residue or tryptophan residue, the 2nd and 3rd carbon positions of the indole ring of tryptophan residue, the side of tyrosine residue, serine residue, or threonine residue Examples include a group capable of forming a bond by reacting with a chain hydroxyl group (-OH), the ortho-position carbon of a tyrosine residue, and a side chain sulfide group (-SMe) of a methionine residue.
Specific examples of the peptide linking group include, for example, halogenated alkyl groups, activated carbonyl groups, unsaturated hydrocarbon groups described in paragraphs [0067] to [0076] of International Publication No. 2017/213158, Examples include epoxy groups, sulfonyl-containing groups, isocyanate groups, thioisocyanate groups, carbene-generating groups, disulfide bond-containing groups, and thiol groups.
また、前記ペプチド連結用基は、ペプチドにおける反応性アミノ酸残基との反応により、前記ペプチドの環状化に寄与するもの（以下、「環状化基」と称することがある。）であることが好ましい。
前記環状化基と反応する反応性アミノ酸残基は、前記環状化基と直接反応するアミノ酸残基であってもよいし、前記環状化基と反応できるように修飾されたアミノ酸残基であってもよい。
前記環状化基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、電子吸引基が好ましい。
Further, the peptide linking group is preferably one that contributes to cyclization of the peptide by reaction with a reactive amino acid residue in the peptide (hereinafter sometimes referred to as a "cyclization group"). .
The reactive amino acid residue that reacts with the cyclization group may be an amino acid residue that directly reacts with the cyclization group, or an amino acid residue that has been modified so that it can react with the cyclization group. Good too.
The cyclization group is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but an electron-withdrawing group is preferable.
前記電子吸引基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ハロゲンを有することが好ましい。前記ハロゲンの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が好ましい。前記ハロゲンの数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ハロゲン数の下限としては２以上が好ましく、上限としては、５以下、４以下が好ましい。
前記電子吸引基は、置換基を有していてもよい。前記電子吸引基は、その構造中に不飽和構造を含むとペプチドを環状化させやすい。前記不飽和構造としては、特に制限はないが、例えば芳香環構造、複素環構造、脂環式炭化水素構造、アルケニル構造、アルキニル構造、カルボニル構造、チオカルボニル構造、オキシム構造、シアノ構造、イソシアネート構造を挙げることができる。中でも前記電子吸引基としては、ベンジルハライドがより好ましく、３，５－ビス（ハロメチル）ベンジル基が特に好ましい。前記ハロゲンの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が好ましく、塩素原子がより好ましい。
The electron-withdrawing group is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but preferably contains a halogen. The type of halogen is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but chlorine, bromine, and iodine atoms are preferred, for example. The number of halogens is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but the lower limit of the number of halogens is preferably 2 or more, and the upper limit is preferably 5 or less and 4 or less.
The electron-withdrawing group may have a substituent. When the electron-withdrawing group contains an unsaturated structure in its structure, it tends to cyclize the peptide. The unsaturated structure is not particularly limited, but includes, for example, an aromatic ring structure, a heterocyclic structure, an alicyclic hydrocarbon structure, an alkenyl structure, an alkynyl structure, a carbonyl structure, a thiocarbonyl structure, an oxime structure, a cyano structure, and an isocyanate structure. can be mentioned. Among these, as the electron-withdrawing group, benzyl halide is more preferable, and 3,5-bis(halomethyl)benzyl group is particularly preferable. The type of halogen is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but, for example, chlorine atom, bromine atom, and iodine atom are preferable, and chlorine atom is more preferable.
前記環状化基によるペプチドの環状化は、前記環状化基と、ペプチドに含まれるチオール基、アミノ基、及びヒドロキシ基からなる群から選択される少なくとも１種の基との反応により行われることが好ましい。 Cyclization of the peptide with the cyclization group may be carried out by reaction between the cyclization group and at least one group selected from the group consisting of a thiol group, an amino group, and a hydroxy group contained in the peptide. preferable.
また、例えば、オキシムライゲーション法により、前記ペプチドと前記細胞膜透過性分子とを結合する場合には、下記構造式で表されるものを前記ペプチド連結用基として用いることもできる。
－－連結基－－
前記連結基は、前記ペプチド連結用基と前記一般式（ｉ）で表す構造とを連結する基である。
前記連結基の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した繰返し単位を含む構造などが挙げられる。
--Linking group--
The linking group is a group that connects the peptide linking group and the structure represented by the general formula (i).
The structure of the connecting group is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and includes, for example, a structure containing the above-described repeating unit.
前記細胞膜透過性分子は、ペプチドに導入される際に、前記ペプチドにおける反応性アミノ酸残基と反応する部位の構造が変化してもよい。 When the cell membrane permeable molecule is introduced into a peptide, the structure of a site that reacts with a reactive amino acid residue in the peptide may be changed.
前記細胞膜透過性分子の具体例としては、例えば、以下の構造式で表される化合物などが挙げられる。なお、前記細胞膜透過性分子は、塩の形態とする際に、その構造の一部が変化してもよい。 Specific examples of the cell membrane permeable molecules include compounds represented by the following structural formula. In addition, when the cell membrane permeable molecule is made into a salt form, a part of its structure may be changed.
下記構造式で表される細胞膜透過性分子Ｇ３－ＤＣＸは、一般式（ｉ）において、Ｘの部分にヘテロ原子含有基として、３，５－ビス（クロロメチル）ベンジル基である環状化基（ペプチド連結用基）と、連結基とを有している例である。前記細胞膜透過性分子Ｇ３－ＤＣＸは環状化基を有しているので、ペプチドの環状化と、ペプチドへの細胞膜透過性の付与とを１工程で行うことができる。
下記構造式で表される細胞膜透過性分子Ｇ３は、一般式（ｉ）において、Ｘの部分にヘテロ原子含有基として、オキシムライゲーション法によりペプチドと結合可能なペプチド連結用基と、連結基とを有している例である。
－一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子の製造方法－
前記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子の製造方法としては、特に制限はなく、公知の化学合成の技術を適宜選択して行うことができる。例えば、米国特許第７，８６２，８０７号明細書などに記載の方法を参考にして、公知の化学合成の技術を適宜選択することにより製造することができる。
- Method for producing a cell membrane permeable molecule having the structure represented by general formula (i) -
There are no particular limitations on the method for producing the cell membrane permeable molecule having the structure represented by the general formula (i), and known chemical synthesis techniques can be appropriately selected. For example, it can be produced by appropriately selecting known chemical synthesis techniques with reference to the method described in US Pat. No. 7,862,807.
＜＜塩の形成＞＞
前記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子を、ｐＫａの値が－８．０超の酸との塩とする方法としては、特に制限はなく、公知の化学合成の技術を適宜選択して行うことができる。例えば、塩の形態ではない細胞膜透過性分子の粗生成物を、目的の塩の種類に応じた移動相を用いたＨＰＬＣにより精製し、目的とする塩の形態の細胞膜透過性分子とする方法、塩の形態である細胞膜透過性分子を、対イオンを目的の塩のイオンへと置換した陰イオン交換樹脂に通じ、溶出することで目的とする塩の形態の細胞膜透過性分子とする方法などが挙げられる。
<<Salt Formation>>
There is no particular restriction on the method for converting the cell membrane permeable molecule having the structure represented by the general formula (i) into a salt with an acid having a pK a value of more than -8.0, and known chemical synthesis methods can be used. This can be done by selecting appropriate techniques. For example, a method of purifying a crude product of a cell membrane-permeable molecule that is not in a salt form by HPLC using a mobile phase depending on the type of salt to obtain a cell membrane-permeable molecule in the desired salt form; There are methods such as passing a cell membrane permeable molecule in the form of a salt through an anion exchange resin in which the counter ions are replaced with ions of the desired salt, and eluting it into the desired cell membrane permeable molecule in the form of a salt. Can be mentioned.
本発明の細胞膜透過性分子は、ｐＫａ（酸解離定数）の値が－８．０超（－８．０よりも大きい）の酸との塩である。
本発明において、酸が複数のｐＫａの値を有している場合には、１段階目の解離におけるｐＫａの値であるｐＫａ１の値をｐＫａの値とする。
前記ｐＫａの値が－８．０超の酸の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トリフルオロ酢酸、硫酸、硝酸、リン酸、メシル酸、トシル酸、酒石酸、クエン酸、酢酸、各種アミノ酸などが挙げられる。これらの中でも、酸性アミノ酸以外の酸が好ましく、ｐＫａの値が－８．０超４．７以下の酸がより好ましい。
前記ｐＫａの値が－８．０超４．７以下の酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トリフルオロ酢酸（－０．３）、硫酸（－３．０）、硝酸（－１．３）、リン酸（２．１（ｐＫａ１））、メシル酸（－２．６）、トシル酸（－２．８）、酒石酸（３．２（ｐＫａ１））、クエン酸（３．１（ｐＫａ１））、酢酸（４．７）などが挙げられる。前記酸の名称の後のかっこ内の数値はｐＫａの値を表す。なお、ｐＫａ１の値の場合は、数値の後にｐＫａ１と記載した。
The cell membrane permeable molecule of the present invention is a salt with an acid having a pK a (acid dissociation constant) value of more than -8.0 (greater than -8.0).
In the present invention, when the acid has a plurality of pK a values, the pK a1 value, which is the pK a value in the first stage of dissociation, is taken as the pK a value.
The type of acid having a pK a value of more than -8.0 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, such as trifluoroacetic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, mesylic acid, Examples include tosylic acid, tartaric acid, citric acid, acetic acid, and various amino acids. Among these, acids other than acidic amino acids are preferred, and acids with a pK a value of more than -8.0 and 4.7 or less are more preferred.
The acid having a pK a value of more than -8.0 and less than 4.7 is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose. For example, trifluoroacetic acid (-0.3), sulfuric acid ( -3.0), nitric acid (-1.3), phosphoric acid (2.1 (pK a1 )), mesylic acid (-2.6), tosylic acid (-2.8), tartaric acid (3.2 ( pK a1 )), citric acid (3.1 (pK a1 )), acetic acid (4.7), and the like. The number in parentheses after the name of the acid represents the pK a value. In addition, in the case of the value of pK a1 , pK a1 was written after the numerical value.
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
<Other processes>
The other steps mentioned above are not particularly limited as long as they do not impair the effects of the present invention, and can be appropriately selected depending on the purpose.
前記細胞膜透過性分子は、上記した一般式（ｉ）で表される構造を有し、ｐＫａの値が－８．０超の酸との塩であって、本発明の効果を損なわない限りにおいて、その他の構成を有していてもよい。 The cell membrane permeable molecule has a structure represented by the above general formula (i) and is a salt with an acid having a pKa value of more than -8.0, as long as it does not impair the effects of the present invention. may have other configurations.
前記細胞膜透過性分子が所望の構造を有するか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、公知の分析方法を適宜選択することができ、例えば、質量分析法、プロトン核磁気共鳴分光法、炭素１３核磁気共鳴分光法、紫外分光法、赤外分光法などの分析方法が挙げられる。 The method for confirming whether the cell membrane permeable molecule has a desired structure is not particularly limited, and any known analysis method can be selected as appropriate, such as mass spectrometry, proton nuclear magnetic resonance spectroscopy, etc. , carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy, ultraviolet spectroscopy, and infrared spectroscopy.
本発明の膜透過性向上方法によれば、分子量が小さな細胞膜透過性分子の細胞膜透過性を向上することができる。そのため、前記細胞膜透過性分子をペプチド、核酸、タンパク質などの有効成分に導入することで、これらの細胞内への取込み効率を向上することができる。これらの中でも前記細胞膜透過性分子は、ペプチドに導入されたものであることが好ましい。 According to the method for improving membrane permeability of the present invention, it is possible to improve the cell membrane permeability of cell membrane permeable molecules having small molecular weights. Therefore, by introducing the cell membrane permeable molecules into active ingredients such as peptides, nucleic acids, proteins, etc., the efficiency of their uptake into cells can be improved. Among these, it is preferable that the cell membrane permeable molecule be introduced into a peptide.
したがって、本発明は、前記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子が導入されたペプチド複合体を、ｐＫａの値が－８．０超の酸との塩とすることを含むことを特徴とするペプチド複合体の細胞膜透過性の向上方法にも関する。 Therefore, the present invention provides a method for converting a peptide complex into which a cell membrane-permeable molecule having a structure represented by the general formula (i) is salted with an acid having a pK a value of more than -8.0. The present invention also relates to a method for improving cell membrane permeability of a peptide complex comprising the following.
［ペプチド複合体の細胞膜透過性の向上方法］
前記ペプチド複合体の細胞膜透過性の向上方法は、塩形成工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
[Method for improving cell membrane permeability of peptide complex]
The method for improving cell membrane permeability of the peptide complex includes at least a salt forming step, and further includes other steps as necessary.
＜塩形成工程＞
前記塩形成工程は、前記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子が導入されたペプチド複合体を、ｐＫａの値が－８．０超の酸との塩とする工程であり、前記細胞膜透過性分子がペプチドに導入されたものである点以外は、上記した細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法における塩形成工程と同様にして行うことができる。
<Salt formation process>
The salt forming step is a step in which the peptide complex into which the cell membrane permeable molecule having the structure represented by the general formula (i) is introduced is made into a salt with an acid having a pK a value of more than −8.0. This can be carried out in the same manner as the salt formation step in the method for improving cell membrane permeability of a cell membrane permeable molecule described above, except that the cell membrane permeable molecule is introduced into a peptide.
＜＜ペプチド複合体＞＞
前記ペプチド複合体は、ペプチドと、前記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
<<Peptide complex>>
The peptide complex includes at least a peptide and a cell membrane permeable molecule having the structure represented by the general formula (i), and further includes other components as necessary.
－ペプチド－
前記ペプチドとしては、前記細胞膜透過性分子を導入することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記細胞膜透過性分子を導入することにより環状化されるペプチドが好ましい。
前記ペプチドにおけるアミノ酸の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、天然のアミノ酸であってもよいし、非天然のアミノ酸であってもよく、また、Ｄ体であってもよいし、Ｌ体であってもよい。
前記ペプチドは、リポペプチドなどの修飾型ペプチドであってもよい。
-peptide-
The peptide is not particularly limited as long as it can introduce the cell membrane permeable molecule, and can be appropriately selected depending on the purpose; however, peptides that can be cyclized by introducing the cell membrane permeable molecule is preferred.
The type of amino acid in the peptide is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and may be a natural amino acid or a non-natural amino acid. It may be present, or it may be an L-form.
The peptide may be a modified peptide such as a lipopeptide.
前記細胞膜透過性分子の導入に利用するアミノ酸残基（以下、「反応性アミノ酸残基」と称することがある。）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基、トリプトファン残基、チロシン残基、セリン残基、スレオニン残基などが挙げられる。
前記ペプチドとして、細胞膜透過性分子を導入することにより環状化されるペプチドを用いる場合には、前記反応性アミノ酸残基としては、例えば、システイン残基、リジン残基、セリン残基、スレオニン残基などが挙げられる。
また、アミノ酸残基におけるアルコール側鎖を利用してもよい。
前記反応性アミノ酸残基は、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
The amino acid residues (hereinafter sometimes referred to as "reactive amino acid residues") used for the introduction of the cell membrane permeable molecule are not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose, such as , cysteine residue, lysine residue, histidine residue, tryptophan residue, tyrosine residue, serine residue, threonine residue, etc.
When using a peptide that can be cyclized by introducing a cell membrane permeable molecule as the peptide, examples of the reactive amino acid residue include cysteine residue, lysine residue, serine residue, and threonine residue. Examples include.
Alternatively, alcohol side chains in amino acid residues may be utilized.
The reactive amino acid residues may be used alone or in combination of two or more.
前記反応性アミノ酸残基のペプチドにおける数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
例えば、前記ペプチドとして、細胞膜透過性分子を導入することにより環状化されるペプチドを用いる場合には、前記反応性アミノ酸残基のペプチドにおける数は、２以上が好ましい。前記反応性アミノ酸残基のペプチドにおける数の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、反応点が多くなるとペプチドに結合する前記細胞膜透過性分子の数や位置が安定せず、アミノ酸配列に由来するペプチドの特性を比較し難くなる場合があるので、１０以下が好ましい。
なお、例えば、ペプチド中のシステイン残基がジスルフィド結合により前記ペプチドの高次構造の安定化に関与しているような場合には、別途、上記反応性アミノ酸残基を前記ペプチドに導入することが好ましい。
The number of the reactive amino acid residues in the peptide is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
For example, when a peptide that is cyclized by introducing a cell membrane permeable molecule is used as the peptide, the number of the reactive amino acid residues in the peptide is preferably 2 or more. The upper limit of the number of reactive amino acid residues in a peptide is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose, but as the number of reactive points increases, the number of cell membrane permeable molecules that bind to the peptide and The number is preferably 10 or less because the position may not be stable and it may be difficult to compare the properties of peptides derived from amino acid sequences.
Note that, for example, in cases where cysteine residues in the peptide are involved in stabilizing the higher-order structure of the peptide through disulfide bonds, it is possible to separately introduce the above-mentioned reactive amino acid residue into the peptide. preferable.
前記反応性アミノ酸残基の前記ペプチドにおける位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 The position of the reactive amino acid residue in the peptide is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
例えば、前記ペプチドとして、ｍＲＮＡ分子、その翻訳物であるペプチド鎖（以下、「ポリペプチド鎖」と称することもある。）、及びリボソームを含むリボソームディスプレイ複合体（以下、「ＲＤ複合体」と称することがある。）を用いる場合には、例えば、リボソームの出口トンネル（ｅｘｉｔ ｔｕｎｎｅｌ）から外に出ている部分であり、具体的にはＮ末端から２番目～Ｃ末端から３０番目の位置（Ｎ末端から２番目の位置及びＣ末端から３０番目の位置を含む）の間とすることが、前記リンカー分子による修飾反応がリボソームにより立体的に阻害され難くなり得る点で、好ましい。
前記Ｃ末端からの位置としては、Ｃ末端から５０番目が好ましく、１００番目がより好ましい。
また、前記反応性アミノ酸残基の位置をＮ末端側から数えた場合、その位置は、ペプチドの鎖長に応じて適宜設定できるが、例えば、Ｎ末端から２～１，０００番目の位置であり、Ｎ末端から２～１００番目の位置が好ましく、Ｎ末端から２～５０番目の位置がより好ましい。
For example, the peptide may include an mRNA molecule, a peptide chain (hereinafter sometimes referred to as a "polypeptide chain") that is a translation product thereof, and a ribosome display complex containing ribosomes (hereinafter referred to as an "RD complex"). ), for example, the part that exits from the exit tunnel of the ribosome, specifically the 2nd position from the N-terminus to the 30th position from the C-terminus (N (including the second position from the end and the 30th position from the C-terminus) is preferable in that the modification reaction by the linker molecule is less likely to be sterically inhibited by ribosomes.
The position from the C-terminus is preferably the 50th position, more preferably the 100th position from the C-terminus.
Furthermore, when counting the position of the reactive amino acid residue from the N-terminus side, the position can be set as appropriate depending on the chain length of the peptide, but for example, it is the 2nd to 1,000th position from the N-terminus. , the 2nd to 100th positions from the N-terminus are preferred, and the 2nd to 50th positions from the N-terminus are more preferred.
前記ＲＤ複合体の製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、国際公開第２０１７／２１３１５８号に記載の方法などが挙げられる。また、市販のキットを利用して製造することもできる。 The method for producing the RD complex is not particularly limited, and any known method can be selected as appropriate, such as the method described in International Publication No. 2017/213158. It can also be manufactured using a commercially available kit.
前記ペプチドのアミノ酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ペプチドライブラリとして有用であるように、特定の位置にランダム配列を含むものが好ましい。かかるランダム配列の中から、所定の目的に応じて有用なアミノ酸配列を特定し得る。 The amino acid sequence of the peptide is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but it is preferable that the peptide contains a random sequence at a specific position so that it is useful as a peptide library. Among such random sequences, useful amino acid sequences can be identified depending on a given purpose.
前記ランダム配列の前記ペプチドにおける位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記反応性アミノ酸残基の位置と同様に、ＲＤ複合体を用いる場合には、Ｎ末端から２番目～Ｃ末端から３０番目の位置（Ｎ末端から２番目の位置及びＣ末端から３０番目の位置を含む）の間とすることが好ましい。即ち、反応性アミノ酸残基は、ランダム配列内に含まれることが好ましい。従ってランダム配列の好ましい位置は、反応性アミノ酸残基の好ましい位置と同じ範囲から設定できる。 The position of the random sequence in the peptide is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, similarly to the position of the reactive amino acid residue, when using an RD complex, It is preferably between the 2nd position from the N-terminus to the 30th position from the C-terminus (including the 2nd position from the N-terminus and the 30th position from the C-terminus). That is, the reactive amino acid residues are preferably contained within a random sequence. Therefore, the preferred positions of the random sequence can be set from the same range as the preferred positions of the reactive amino acid residues.
前記ランダム配列の前記ペプチドにおける数は、１つであってもよく、２つ以上であってもよい。前記ランダム配列の数の上限としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０以下が好ましい。
前記ランダム配列１つあたりのアミノ酸残基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１以上、３０以下とすることができる。
１つのランダム配列が長くなるほど、またランダム配列の数が多くなるほど、ペプチドライブラリの多様性を高めることができる。
The number of the random sequences in the peptide may be one, or two or more. The upper limit of the number of random arrays is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but is preferably 10 or less.
The number of amino acid residues per random sequence is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, for example, from 1 to 30.
The longer one random sequence and the greater the number of random sequences, the more diverse the peptide library can be.
前記ペプチドは、更に、ＦＬＡＧ（登録商標）配列やポリＨｉｓ配列等のポリペプチド鎖の精製のための配列、プロテアーゼなどにより選択的に切断される配列、スペーサー配列などを含んでいてもよい。 The peptide may further include a sequence for purifying a polypeptide chain such as a FLAG (registered trademark) sequence or a poly-His sequence, a sequence that can be selectively cleaved by protease, a spacer sequence, and the like.
前記ペプチドのアミノ酸残基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１０以上、５，０００以下とすることができる。
前記ペプチドのアミノ酸残基数の下限値としては、１５０以上が好ましく、２００以上がより好ましい。また、ペプチドのアミノ酸残基数の上限値としては、８００以下が好ましく、６００以下がより好ましく、５００以下が特に好ましい。前記下限値と上限値とは、適宜組み合わせて選択することができる。
The number of amino acid residues in the peptide is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, for example, 10 or more and 5,000 or less.
The lower limit of the number of amino acid residues in the peptide is preferably 150 or more, more preferably 200 or more. Furthermore, the upper limit of the number of amino acid residues in the peptide is preferably 800 or less, more preferably 600 or less, and particularly preferably 500 or less. The lower limit value and upper limit value can be selected in combination as appropriate.
前記ペプチドの合成方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。 The method for synthesizing the peptide is not particularly limited, and any known method can be selected as appropriate.
－細胞膜透過性分子－
前記細胞膜透過性分子は、上記した一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子である。
前記細胞膜透過性分子は、ペプチドに導入される際に、前記ペプチドにおける反応性アミノ酸残基と反応する部位の構造が変化してもよい。
-Cell membrane permeable molecules-
The cell membrane permeable molecule is a cell membrane permeable molecule having a structure represented by the above general formula (i).
When the cell membrane permeable molecule is introduced into a peptide, the structure of a site that reacts with a reactive amino acid residue in the peptide may be changed.
－その他の構成－
前記ペプチド複合体におけるその他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光物質などの発光物質、色素、放射性物質、薬剤、毒素、核酸、アミノ酸、糖類、脂質、各種ポリマーなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記蛍光物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類などの蛍光色素が挙げられる。
前記その他の構成は、例えば、上記したペプチドに、直接又は連結基などを介して結合させることができる。
-Other configurations-
Other components of the peptide complex are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose as long as they do not impair the effects of the present invention. For example, luminescent substances such as fluorescent substances, dyes, radioactive substances, Examples include drugs, toxins, nucleic acids, amino acids, saccharides, lipids, and various polymers. These may be used alone or in combination of two or more.
The fluorescent substance is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and includes, for example, fluorescent dyes such as fluoresceins, rhodamines, coumarins, pyrenes, and cyanines.
The other configurations described above can be bonded to the above-mentioned peptide, for example, directly or via a linking group.
前記ペプチドに、前記細胞膜透過性分子を導入する（以下、「結合する」、「挿入する」、「連結する」と称することもある。）方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細胞膜透過性分子におけるペプチド連結用基と、前記ペプチドにおける反応性アミノ酸残基とを反応させる方法などが挙げられる。例えば、還元剤の存在下で、前記細胞膜透過性分子と、前記ペプチドとを反応させる方法などが挙げられる。前記還元剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩などが挙げられる。
前記反応の温度、時間等の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記細胞膜透過性分子の導入により、ペプチドへ細胞膜透過性を付与することができる。また、上記した環状化基を有する細胞膜透過性分子を導入する場合には、ペプチドの環状化と、ペプチドへの細胞膜透過性の付与とを同時に行うことができる。
前記細胞膜透過性分子の導入では、反応物中における少なくとも１つのペプチドに細胞膜透過性分子が導入されればよいが、全てのペプチドに細胞膜透過性分子が導入されることが好ましい。
The method of introducing the cell membrane permeable molecule into the peptide (hereinafter sometimes referred to as "binding", "inserting", "linking") is not particularly limited, and may be used as appropriate depending on the purpose. Examples of the method include a method of reacting a peptide linking group in the cell membrane permeable molecule with a reactive amino acid residue in the peptide. For example, a method may be used in which the cell membrane permeable molecule and the peptide are reacted in the presence of a reducing agent. The reducing agent is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, such as tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride.
Conditions such as temperature and time for the reaction are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
By introducing the cell membrane permeable molecule, cell membrane permeability can be imparted to the peptide. Furthermore, when introducing a cell membrane permeable molecule having the above-described cyclization group, cyclization of the peptide and imparting cell membrane permeability to the peptide can be performed simultaneously.
In the introduction of the cell membrane permeable molecule, it is sufficient that the cell membrane permeable molecule is introduced into at least one peptide in the reaction product, but it is preferable that the cell membrane permeable molecule is introduced into all peptides.
前記ペプチド複合体に用いるペプチドは、ペプチドライブラリの態様であってもよい。即ち、上記した細胞膜透過性分子が導入される前のペプチドは、ペプチドライブラリの態様のものを用いることもできる。 The peptide used in the peptide complex may be in the form of a peptide library. That is, the peptides in the form of a peptide library can also be used before the above-mentioned cell membrane permeable molecules are introduced.
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
<Other processes>
The other steps mentioned above are not particularly limited as long as they do not impair the effects of the present invention, and can be appropriately selected depending on the purpose.
以下に実施例等を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例等に何ら限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail below with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
（実施例１：細胞膜透過性分子Ｇ３－ＤＣＸトリフルオロ酢酸塩の合成）
＜化合物Ｇ３－ＤＣＸの合成＞
－化合物Ｃ１の合成－
米国特許第７，８６２，８０７号明細書に記載の方法と同様の方法により、下記構造式で表される化合物Ｃ１を合成した。
なお、構造式中の「Ｂｏｃ」は、「ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基」を表す。
<Synthesis of compound G3-DCX>
-Synthesis of compound C1-
Compound C1 represented by the following structural formula was synthesized by a method similar to that described in US Pat. No. 7,862,807.
Note that "Boc" in the structural formula represents a "tert-butoxycarbonyl group."
－化合物Ｃ３の合成－
上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｃ３を合成した。
具体的には、化合物Ｃ１（５００ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（１５ｍＬ）を０℃に冷却し、化合物Ｃ２（東京化成工業株式会社製、製品番号Ａ２２９３）（１１７．５ｍｇ，０．５０４ｍｍｏｌ）と１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（８５．１ｍｇ，０．６３０ｍｍｏｌ）と１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ／ＨＣｌ）（１２０ｍｇ，０．６３０ｍｍｏｌ）を加えて２５℃で１７時間撹拌した。ここにＨ２Ｏ（２０ｍＬ）を加え、塩化メチレンで抽出を行い（３０ｍＬで３回）、有機層は１Ｎ塩酸（２０ｍＬで２回）と飽和重曹水（２０ｍＬで２回）と水（２０ｍＬで２回）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥しろ過と濃縮を行い、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー精製（メタノール（ＭｅＯＨ）／ＣＨ２Ｃｌ２＝１／１０）することにより、化合物Ｃ３を白色固体として取得した（５３３ｍｇ，０．３７９ｍｍｏｌ，収率９０％）。
前記化合物Ｃ３の１Ｈ ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ １１．４（ｓ， ３Ｈ）， ８．５８（ｔ， ３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．６９（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ６．８４（ｓ， １Ｈ）， ３．８９（ｓ， ２Ｈ）， ３．７１－３．６５（ｍ， ２２Ｈ）， ３．５６－３．５３（ｍ， ６Ｈ）， ３．４２－３．３８（ｍ， ８Ｈ）， ２．４３（ｔ， ３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ， ６Ｈ）， １．４９（ｓ， ２７Ｈ）， １．４８（ｓ， ２７Ｈ）
Compound C3 represented by the above structural formula was synthesized according to the above reaction formula.
Specifically, a methylene chloride solution (15 mL) of compound C1 (500 mg, 0.42 mmol) was cooled to 0°C, and compound C2 (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd., product number A2293) (117.5 mg, 0.504 mmol) was cooled to 0°C. ), 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) (85.1 mg, 0.630 mmol), and 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC/HCl) (120 mg, 0.630 mmol) were added. The mixture was stirred at 25°C for 17 hours. H 2 O (20 mL) was added thereto, and extraction was performed with methylene chloride (3 times with 30 mL), and the organic layer was extracted with 1N hydrochloric acid (2 times with 20 mL), saturated aqueous sodium bicarbonate (2 times with 20 mL), and water (2 times with 20 mL). Washed twice). After drying with Na 2 SO 4 , filtration and concentration, the resulting residue was purified by silica gel chromatography (methanol (MeOH)/CH 2 Cl 2 = 1/10) to obtain compound C3 as a white solid ( 533 mg, 0.379 mmol, yield 90%).
Identification data of the compound C3 by 1H NMR were as follows.
1H NMR ( CDCl3 ): δ 11.4 (s, 3H), 8.58 (t, 3 J HH =6.0Hz, 3H), 7.69 (t, 3 J HH =5.0Hz, 3H) , 6.84 (s, 1H), 3.89 (s, 2H), 3.71-3.65 (m, 22H), 3.56-3.53 (m, 6H), 3.42-3 .38 (m, 8H), 2.43 (t, 3 J HH =6.0Hz, 6H), 1.49 (s, 27H), 1.48 (s, 27H)
－化合物ＤＢＸＡの合成－
水素化ナトリウム（１３２ｍｇ，３．０２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（６ｍＬ）に懸濁させ０℃に冷却した。ここに２－プロピン－１－オール（０．１６５ｍＬ，２．８０ｍｍｏｌ）を加え０℃で３０分間撹拌した。１，３，５－トリス（ブロモメチル）ベンゼン（１．００ｇ，２．８０ｍｍｏｌ）を加え２５℃で２０時間撹拌した。酢酸エチル（１００ｍＬ）を加えてから水（１００ｍＬ）と飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムで洗浄した。ろ過と濃縮を行い得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）で精製し（塩化メチレン／ヘキサン＝１／２）、下記構造式で表される化合物ＤＢＸＡ（４１６．６ｍｇ，１．２５ｍｍｏｌ，収率４５％）を淡黄色油状物として取得した。
前記化合物ＤＢＸＡの１Ｈ ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ ７．２９（ｓ， １Ｈ）， ７．２６（ｓ， ２Ｈ）， ４．５３（ｓ， ２Ｈ）， ４．４０（ｓ， ４Ｈ）， ４．１５（４ＪＨＨ＝２．５Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４３（４ＪＨＨ＝２．０Ｈｚ， １Ｈ）
Sodium hydride (132 mg, 3.02 mmol) was suspended in tetrahydrofuran (THF) (6 mL) and cooled to 0°C. 2-Propyn-1-ol (0.165 mL, 2.80 mmol) was added thereto and stirred at 0° C. for 30 minutes. 1,3,5-tris(bromomethyl)benzene (1.00 g, 2.80 mmol) was added and stirred at 25° C. for 20 hours. After adding ethyl acetate (100 mL), the mixture was washed with water (100 mL) and saturated brine (100 mL), and the organic layer was washed with magnesium sulfate. The residue obtained by filtration and concentration was purified by preparative thin layer chromatography (PTLC) (methylene chloride/hexane = 1/2) to obtain a compound DBXA (416.6 mg, 1.25 mmol) represented by the following structural formula. , yield 45%) was obtained as a pale yellow oil.
Identification data of the compound DBXA by 1H NMR were as follows.
1H NMR ( CDCl3 ): δ 7.29 (s, 1H), 7.26 (s, 2H), 4.53 (s, 2H), 4.40 (s, 4H), 4.15 ( 4 J HH = 2.5Hz, 2H), 2.43 ( 4 J HH = 2.0Hz, 1H)
－化合物Ｃ４の合成－
上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｃ４を合成した。
具体的には、化合物Ｃ３（５３３ｍｇ， ０．３７９ｍｍｏｌ）と化合物ＤＢＸＡ（１８８ｍｇ， ０．５６８ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（４０ｍＬ）からなる溶液に窒素ガスバブリングを行い、窒素雰囲気下とした。ここに、硫酸銅水溶液（２００ｍＭ； １．８９ｍＬ，０．３７９ｍｍｏｌ）とアスコルビン酸ナトリウム水溶液（１００ｍＭ； ７．５８ｍＬ，０．７５８ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３時間撹拌した。反応液に水を加え塩化メチレンで抽出を行い（２０ｍＬで３回）、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥しろ過と濃縮を行い、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー精製（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２＝１／２０）することにより、化合物Ｃ４を白色固体として取得した（４９７ｍｇ，０．２８６ｍｍｏｌ，収率７６％）。
前記化合物Ｃ４の１Ｈ ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ ８．５８（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．５Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．７７（ｓ， １Ｈ）， ７．７４（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．３４（ｓ， １Ｈ）， ７．３２（ｓ， ２Ｈ）， ６．８２（ｓ， １Ｈ）， ４．６９（ｓ， ２Ｈ）， ４．５８（ｓ， ２Ｈ）， ４．５６（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．４７（ｓ， ４Ｈ）， ３．８９（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８７（ｓ， ２Ｈ）， ３．６９（ｔ， ３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ， ６Ｈ）， ３．６６（ｓ， ６Ｈ）， ３．６１（ｓ， ８Ｈ）， ３．５６－３．５２（ｍ， ６Ｈ）， ３．４１－３．３８（ｍ， ６Ｈ）， ２．４２（ｔ， ３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ， ６Ｈ）， １．４９（ｓ， ２７Ｈ）， １．４８（ｓ， ２７Ｈ）
Compound C4 represented by the above structural formula was synthesized according to the above reaction formula.
Specifically, nitrogen gas was bubbled into a solution consisting of compound C3 (533 mg, 0.379 mmol), compound DBXA (188 mg, 0.568 mmol), and THF (40 mL) to create a nitrogen atmosphere. A copper sulfate aqueous solution (200mM; 1.89mL, 0.379mmol) and a sodium ascorbate aqueous solution (100mM; 7.58mL, 0.758mmol) were added thereto, and the mixture was stirred at 25°C for 3 hours. Water was added to the reaction solution and extracted with methylene chloride (20 mL x 3), the organic layer was dried over Na 2 SO 4 , filtered and concentrated, and the resulting residue was purified by silica gel chromatography (MeOH/CH 2 Cl). 2 = 1/20), compound C4 was obtained as a white solid (497 mg, 0.286 mmol, yield 76%).
Identification data of the compound C4 by 1H NMR were as follows.
1H NMR ( CDCl3 ): δ 8.58 (t, 3 J HH =5.5Hz, 3H), 7.77 (s, 1H), 7.74 (t, 3 J HH =5.0Hz, 3H) , 7.34 (s, 1H), 7.32 (s, 2H), 6.82 (s, 1H), 4.69 (s, 2H), 4.58 (s, 2H), 4.56 ( t, 3 J HH =5.0Hz, 2H), 4.47 (s, 4H), 3.89 (t, 3 J HH =5.0Hz, 2H), 3.87 (s, 2H), 3. 69 (t, 3 J HH =6.0Hz, 6H), 3.66 (s, 6H), 3.61 (s, 8H), 3.56-3.52 (m, 6H), 3.41- 3.38 (m, 6H), 2.42 (t, 3 J HH =6.0Hz, 6H), 1.49 (s, 27H), 1.48 (s, 27H)
－化合物Ｇ３－ＤＣＸの合成－
上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｇ３－ＤＣＸを合成した。
具体的には、化合物Ｃ４（４９７ｍｇ，０．２８６ｍｍｏｌ）と４Ｎ塩酸ジオキサン溶液（３０ｍＬ）を混合し、２５℃で４６時間撹拌した。反応後、白色固体が析出した。上清を除去し、化合物Ｇ３－ＤＣＸの粗生成物を取得した。
Compound G3-DCX represented by the above structural formula was synthesized according to the above reaction formula.
Specifically, compound C4 (497 mg, 0.286 mmol) and 4N hydrochloric acid dioxane solution (30 mL) were mixed and stirred at 25° C. for 46 hours. After the reaction, a white solid precipitated. The supernatant was removed to obtain a crude product of compound G3-DCX.
＜細胞膜透過性分子Ｇ３－ＤＣＸトリフルオロ酢酸塩の合成＞
上述の方法により得られたＧ３－ＤＣＸの粗生成物（１１６ｍｇ）を水に溶解し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む移動相を用いたＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により精製し、下記構造式で表される細胞膜透過性分子Ｇ３－ＤＣＸトリフルオロ酢酸塩（５３．１ｍｇ， ３８．２μｍｏｌ）を取得した。
The crude product (116 mg) of G3-DCX obtained by the above method was dissolved in water, purified by HPLC (high performance liquid chromatography) using a mobile phase containing trifluoroacetic acid (TFA), and obtained with the following structural formula. A cell membrane permeable molecule G3-DCX trifluoroacetate (53.1 mg, 38.2 μmol) was obtained.
（実施例２：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩の合成）
＜ペプチドの合成＞
マイクロウェーブを用いた固相合成法により、リンクアミド（Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ）樹脂（０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上で、以下の配列を有するペプチドを合成した。
ＦＩＴＣ－Ａｈｘ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－ＮＨ２
（上記配列中、「ＦＩＴＣ」はフルオレセインイソチオシアネートを表し、「Ａｈｘ」は６－アミノヘキサン酸を表す。）
(Example 2: Synthesis of peptide complex G3-DCX-P trifluoroacetate)
<Synthesis of peptide>
A peptide having the following sequence was synthesized on Rink Amide resin (0.2 mmol/g) by solid phase synthesis using microwaves.
FITC-Ahx-Cys-Gly-Ser-Gly-Leu-Ala-Ser-Pro-Asn-Gly-Tyr-Cys- NH2
(In the above sequence, "FITC" represents fluorescein isothiocyanate, and "Ahx" represents 6-aminohexanoic acid.)
前記ペプチドを形成した樹脂を、ＴＦＡ／水／トリイソプロピルシラン／３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（９２．５／２．５／２．５／２．５（容量比））に３時間浸漬し、前記ペプチドを樹脂から切り出した。得られたペプチドをＨＰＬＣで精製し凍結乾燥することにより、上記配列を有するペプチド（以下、「Ｐ」と表すことがある。下記構造式参照。）を取得した。前記ペプチドＰのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）による同定データは、以下のとおりであった。
ＥＳＩ－ＭＳ Ｃ７２Ｈ９２Ｎ１６Ｏ２２Ｏ３ 計算値（[Ｍ＋２Ｈ]２＋）８１５．２９５、測定値８１４．６７
ESI-MS C 72 H 92 N 16 O 22 O 3 Calculated value ([M+2H] 2+ ) 815.295, Measured value 814.67
＜ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩の合成＞
上記反応式のようにして、上記構造式で表されるペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩を合成した。
具体的には、上記で合成したペプチドＰ（１１．０ｍｇ，６．７５μｍｏｌ）を２０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液（１１．８ｍＬ）とアセトニトリル（ＭｅＣＮ）（１．７ｍＬ）の混合溶液に溶解させた。この溶液に、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（５００ｍＭ ｉｎ Ｈ２Ｏ；１４．８μＬ，７．４μｍｏｌ）を添加し、２５℃下で１５分間撹拌した。続いて、上記で合成したＧ３－ＤＣＸ（１０．６ｍｇ，１０．１μｍｏｌ）と２５℃下で２４時間撹拌した。その後、反応液を、ＴＦＡを含む移動相を用いたＨＰＬＣで精製することにより、環状ペプチド（ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩）（３．２５ｍｇ，１．１０μｍｏｌ，収率１６％）を取得した。
前記ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによる同定データは、次のとおりであった。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ Ｃ１１４Ｈ１６３Ｎ３２Ｏ３３Ｓ３ 計算値（[Ｍ＋Ｈ]＋）２６０４．９２、測定値２６０４．３３０
A peptide complex G3-DCX-P trifluoroacetate represented by the above structural formula was synthesized according to the above reaction formula.
Specifically, peptide P (11.0 mg, 6.75 μmol) synthesized above was dissolved in a mixed solution of 20 mM ammonium bicarbonate buffer (11.8 mL) and acetonitrile (MeCN) (1.7 mL). Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) (500 mM in H 2 O; 14.8 μL, 7.4 μmol) was added to this solution, and the mixture was stirred at 25° C. for 15 minutes. Subsequently, the mixture was stirred with G3-DCX (10.6 mg, 10.1 μmol) synthesized above at 25° C. for 24 hours. Thereafter, the reaction solution was purified by HPLC using a mobile phase containing TFA to obtain a cyclic peptide (peptide complex G3-DCX-P trifluoroacetate) (3.25 mg, 1.10 μmol, yield 16%). ) was obtained.
The identification data of the peptide complex G3-DCX-P trifluoroacetate by MALDI-TOF MS was as follows.
MALDI-TOF MS C 114 H 163 N 32 O 33 S 3 Calculated value ([M+H] + ) 2604.92, Measured value 2604.330
（実施例３：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ酢酸塩の調製）
実施例２と同様にして合成したペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩（１．０ｍｇ）を、超純水に溶解し（０．５ｍｇ／ｍＬ）、対イオンを酢酸イオンへと置換した陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン ＰＡ３０６Ｓ）を添加した。１時間振とうしたのち、陰イオン交換樹脂を濾別し、超純水で溶出した。得られた溶液を凍結乾燥して、白色乃至オフホワイト色粉末としてＧ３－ＤＣＸ－Ｐ酢酸塩（０．９ｍｇ）を得た。
(Example 3: Preparation of peptide complex G3-DCX-P acetate)
Peptide complex G3-DCX-P trifluoroacetate (1.0 mg) synthesized in the same manner as in Example 2 was dissolved in ultrapure water (0.5 mg/mL), and the counter ion was replaced with acetate ion. An anion exchange resin (Diaion PA306S) was added. After shaking for 1 hour, the anion exchange resin was filtered off and eluted with ultrapure water. The resulting solution was lyophilized to give G3-DCX-P acetate (0.9 mg) as a white to off-white powder.
（実施例４：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ硝酸塩の調製）
実施例２と同様にして合成したペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩を、超純水に溶解し、対イオンを硝酸イオンへと置換した陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン ＰＡ３０６Ｓ）に通じた。溶出には超純水を用いた。得られた溶液を凍結乾燥して、白色乃至オフホワイト色粉末としてペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ硝酸塩を得た。
(Example 4: Preparation of peptide complex G3-DCX-P nitrate)
The peptide complex G3-DCX-P trifluoroacetate synthesized in the same manner as in Example 2 was dissolved in ultrapure water and passed through an anion exchange resin (Diaion PA306S) in which the counter ions were replaced with nitrate ions. Ta. Ultrapure water was used for elution. The resulting solution was freeze-dried to obtain the peptide conjugate G3-DCX-P nitrate as a white to off-white powder.
（実施例５：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ硫酸塩の調製）
実施例２と同様にして合成したペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩を、超純水に溶解し、対イオンを硫酸イオンへと置換した陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン ＰＡ３０６Ｓ）に通じた。溶出には超純水を用いた。得られた溶液を凍結乾燥して、白色乃至オフホワイト色粉末としてペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ硫酸塩を得た。
(Example 5: Preparation of peptide complex G3-DCX-P sulfate)
The peptide complex G3-DCX-P trifluoroacetate synthesized in the same manner as in Example 2 was dissolved in ultrapure water and passed through an anion exchange resin (Diaion PA306S) in which the counter ions were replaced with sulfate ions. Ta. Ultrapure water was used for elution. The resulting solution was lyophilized to obtain peptide conjugate G3-DCX-P sulfate as a white to off-white powder.
（実施例６：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐリン酸塩の調製）
実施例２と同様にして合成したペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩を、超純水に溶解し、対イオンをリン酸イオンへと置換した陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン ＰＡ３０６Ｓ）に通じた。溶出には超純水を用いた。得られた溶液を凍結乾燥して、白色乃至オフホワイト色粉末としてペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐリン酸塩を得た。
(Example 6: Preparation of peptide complex G3-DCX-P phosphate)
The peptide complex G3-DCX-P trifluoroacetate synthesized in the same manner as in Example 2 was dissolved in ultrapure water and added to an anion exchange resin (Diaion PA306S) in which the counter ions were replaced with phosphate ions. got through. Ultrapure water was used for elution. The resulting solution was freeze-dried to obtain the peptide complex G3-DCX-P phosphate as a white to off-white powder.
（実施例７：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐメシル酸塩の調製）
実施例２と同様にして合成したペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩を、超純水に溶解し、対イオンをメシル酸イオンへと置換した陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン ＰＡ３０６Ｓ）に通じた。溶出には超純水を用いた。得られた溶液を凍結乾燥して、無色液体としてペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐメシル酸塩を得た。
(Example 7: Preparation of peptide complex G3-DCX-P mesylate)
The peptide complex G3-DCX-P trifluoroacetate synthesized in the same manner as in Example 2 was dissolved in ultrapure water and added to an anion exchange resin (Diaion PA306S) in which the counter ion was replaced with mesylate ion. got through. Ultrapure water was used for elution. The resulting solution was freeze-dried to obtain the peptide complex G3-DCX-P mesylate as a colorless liquid.
（実施例８：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトシル酸塩の調製）
実施例２と同様にして合成したペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩を、超純水に溶解し、対イオンをトシル酸イオンへと置換した陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン ＰＡ３０６Ｓ）に通じた。溶出には超純水を用いた。得られた溶液を凍結乾燥して、白色粉末としてペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトシル酸塩を得た。
(Example 8: Preparation of peptide complex G3-DCX-P tosylate)
The peptide complex G3-DCX-P trifluoroacetate synthesized in the same manner as in Example 2 was dissolved in ultrapure water and added to an anion exchange resin (Diaion PA306S) in which the counter ion was replaced with tosylate ion. got through. Ultrapure water was used for elution. The resulting solution was freeze-dried to obtain the peptide complex G3-DCX-P tosylate as a white powder.
（実施例９：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ酒石酸塩の調製）
実施例２と同様にして合成したペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩を、超純水に溶解し、対イオンを酒石酸イオンへと置換した陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン ＰＡ３０６Ｓ）に通じた。溶出には超純水を用いた。得られた溶液を凍結乾燥して、淡黄色粉末としてペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐ酒石酸塩を得た。
(Example 9: Preparation of peptide complex G3-DCX-P tartrate)
The peptide complex G3-DCX-P trifluoroacetate synthesized in the same manner as in Example 2 was dissolved in ultrapure water and passed through an anion exchange resin (Diaion PA306S) in which the counter ion was replaced with tartrate ion. Ta. Ultrapure water was used for elution. The resulting solution was freeze-dried to obtain the peptide complex G3-DCX-P tartrate as a pale yellow powder.
（実施例１０：ペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐクエン酸塩の調製）
実施例２と同様にして合成したペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐトリフルオロ酢酸塩を、超純水に溶解し、対イオンをクエン酸イオンへと置換した陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン ＰＡ３０６Ｓ）に通じた。溶出には超純水を用いた。得られた溶液を凍結乾燥して、淡黄色粉末としてペプチド複合体Ｇ３－ＤＣＸ－Ｐクエン酸塩を得た。
(Example 10: Preparation of peptide complex G3-DCX-P citrate)
The peptide complex G3-DCX-P trifluoroacetate synthesized in the same manner as in Example 2 was dissolved in ultrapure water and added to an anion exchange resin (Diaion PA306S) in which the counter ions were replaced with citrate ions. got through. Ultrapure water was used for elution. The resulting solution was freeze-dried to obtain the peptide complex G3-DCX-P citrate as a pale yellow powder.
（実施例１１：ペプチド複合体Ｇ３－Ｐトリフルオロ酢酸塩の合成）
＜化合物Ｆｍｏｃ－Ｇ３－Ｐの合成＞
－化合物Ｋ１の合成－
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３，１７－２４に記載の方法に従い、下記構造式で表される化合物Ｋ１を合成した。なお、化合物の構造式中の「Ｆｍｏｃ」は「９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基」を表す。
<Synthesis of compound Fmoc-G3-P>
-Synthesis of compound K1-
Compound K1 represented by the following structural formula was synthesized according to the method described in The Journal of Organometallic Chemistry 2013, 17-24. Note that "Fmoc" in the structural formula of the compound represents a "9-fluorenylmethyloxycarbonyl group."
－化合物Ｋ３の合成－
上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｋ３を合成した。
具体的には、化合物Ｋ１（５０ｍｇ，０．１５９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。ここに、米国特許第７，８６２，８０７号明細書に記載の方法と同様の方法により合成した化合物Ｋ２（２８４ｍｇ，０．２３９ｍｍｏｌ）と１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ／ＨＣｌ）（４５．８ｍｇ，０．２３９ｍｍｏｌ）と１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（３２．２ｍｇ，０．２３９ｍｍｏｌ）を加え０℃で１２時間撹拌した。飽和食塩水（２０ｍＬ）を加え、塩化メチレンで抽出を行い（２０ｍＬで３回）、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、濃縮した。残渣を分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ）で精製し（塩化メチレン／メタノール（ＭｅＯＨ）＝１０／１；Ｒｆ＝０．７）、化合物Ｋ３（２１０ｍｇ，０．１４１ｍｍｏｌ，収率８９％）を無色油状物として取得した。
なお、化合物の構造式中の「Ｆｍｏｃ」は「９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基」、「Ｂｏｃ」は「ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基」を表す。
前記化合物Ｋ３の１Ｈ ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ ８．５８（ｔ， ３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．７４（ｄ， ３ＪＨＨ＝８．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．５８－７．５７（ｍ， ４Ｈ）， ７．３８（ｔ， ３ＪＨＨ＝７．５Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．２８（ｔ， ３ＪＨＨ＝７．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．４７（ｄ， ３ＪＨＨ＝７．０Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．２６（ｓ， ６Ｈ）， ３．６８（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．５Ｈｚ， ６Ｈ）， ３．４９－３．４６（ｍ， ６Ｈ）， ３．３７－３．３３（ｍ， ６Ｈ）， ２．４３（ｔ， ３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ， ６Ｈ）， １．４９（ｓ， ２７Ｈ）， １．４６（ｓ， ２７Ｈ）
Compound K3 represented by the above structural formula was synthesized according to the above reaction formula.
Specifically, compound K1 (50 mg, 0.159 mmol) was dissolved in methylene chloride (5 mL) and cooled to 0°C. Here, compound K2 (284 mg, 0.239 mmol) synthesized by a method similar to that described in US Patent No. 7,862,807 and 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride Salt (EDC/HCl) (45.8 mg, 0.239 mmol) and 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) (32.2 mg, 0.239 mmol) were added and stirred at 0° C. for 12 hours. Saturated brine (20 mL) was added, extraction was performed with methylene chloride (3 times with 20 mL), and the organic phase was dried over magnesium sulfate, filtered, and concentrated. The residue was purified by preparative thin layer chromatography (PTLC) (methylene chloride/methanol (MeOH) = 10/1; Rf = 0.7) to obtain colorless compound K3 (210 mg, 0.141 mmol, yield 89%). Obtained as an oil.
In the structural formula of the compound, "Fmoc" represents a "9-fluorenylmethyloxycarbonyl group" and "Boc" represents a "tert-butoxycarbonyl group."
Identification data of the compound K3 by 1H NMR were as follows.
1H NMR ( CDCl3 ): δ 8.58 (t, 3 J HH = 6.0 Hz, 3H), 7.74 (d, 3 J HH = 8.0 Hz, 2H), 7.58-7.57 ( m, 4H), 7.38 (t, 3 J HH =7.5Hz, 2H), 7.28 (t, 3 J HH =7.0Hz, 2H), 4.47 (d, 3 J HH =7 .0Hz, 2H), 4.26 (s, 6H), 3.68 (t, 3 J HH =5.5Hz, 6H), 3.49-3.46 (m, 6H), 3.37-3 .33 (m, 6H), 2.43 (t, 3 J HH =6.0Hz, 6H), 1.49 (s, 27H), 1.46 (s, 27H)
－化合物Ｋ４の合成－
上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｋ４を合成した。
具体的には、化合物Ｋ３（２１０ｍｇ，０．１４１ｍｍｏｌ）と２０％ピペリジン／Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（１．０ｍＬ）を混合し、２５℃で１時間撹拌した。反応液に窒素ガスを吹き付けて溶媒を揮発させた。得られた残渣をＰＴＬＣで精製し（塩化メチレン／ＭｅＯＨ＝１０／１）、化合物Ｋ４（１６８ｍｇ，０．１３３ｍｍｏｌ，収率９４％）を無色透明油状物として取得した。
前記化合物Ｋ４の１Ｈ ＮＭＲによる同定データは、以下のとおりであった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ １１．４（ｓ， ３Ｈ）， ８．５９（ｔ， ３ＪＨＨ＝６．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．７１（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．０Ｈｚ， ３Ｈ）， ６．７９（ｓ， １Ｈ）， ４．０３（ｓ， ２Ｈ）， ３．７１－３．６７（ｍ， １２Ｈ）， ３．５５－３．５２（ｍ， ６Ｈ）， ３．４２－３．３９（ｍ， ６Ｈ）， ２．４３（ｔ， ３ＪＨＨ＝５．５Ｈｚ， ６Ｈ）， １．４９（ｓ， ２７Ｈ）， １．４８（ｓ， ２７Ｈ）
Compound K4 represented by the above structural formula was synthesized according to the above reaction formula.
Specifically, compound K3 (210 mg, 0.141 mmol) and 20% piperidine/N,N-dimethylformamide (DMF) solution (1.0 mL) were mixed and stirred at 25° C. for 1 hour. Nitrogen gas was blown onto the reaction solution to evaporate the solvent. The obtained residue was purified by PTLC (methylene chloride/MeOH=10/1) to obtain compound K4 (168 mg, 0.133 mmol, yield 94%) as a colorless transparent oil.
Identification data of the compound K4 by 1H NMR were as follows.
1H NMR ( CDCl3 ): δ 11.4 (s, 3H), 8.59 (t, 3 J HH = 6.0 Hz, 3H), 7.71 (t, 3 J HH = 5.0 Hz, 3H) , 6.79 (s, 1H), 4.03 (s, 2H), 3.71-3.67 (m, 12H), 3.55-3.52 (m, 6H), 3.42-3 .39 (m, 6H), 2.43 (t, 3 J HH =5.5Hz, 6H), 1.49 (s, 27H), 1.48 (s, 27H)
－細胞膜透過性分子Ｇ３の合成－
上記反応式のようにして、上記構造式で表される細胞膜透過性分子Ｇ３を合成した。
具体的には、化合物Ｋ４に塩酸ジオキサン溶液（４Ｎ； １．０ｍＬ）を加えて溶液とし、２５℃で２時間撹拌した。析出した白色固体を遠心分離により取得し、さらにジエチルエーテルで洗浄することにより（３ｍＬで３回）、細胞膜透過性分子Ｇ３（９０ｍｇ，定量的収率）を取得した。
前記細胞膜透過性分子Ｇ３のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）による同定データは、以下のとおりであった。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ Ｃ２４Ｈ５０Ｎ１４Ｏ８ 計算値（［Ｍ＋Ｈ］＋）６６３．４０１、測定値６６３．４０２
Cell membrane permeable molecule G3 represented by the above structural formula was synthesized according to the above reaction formula.
Specifically, a dioxane hydrochloric acid solution (4N; 1.0 mL) was added to Compound K4 to form a solution, and the mixture was stirred at 25° C. for 2 hours. The precipitated white solid was obtained by centrifugation and further washed with diethyl ether (3 times with 3 mL) to obtain cell membrane permeable molecule G3 (90 mg, quantitative yield).
Identification data of the cell membrane permeable molecule G3 by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) were as follows.
MALDI-TOF MS C 24 H 50 N 14 O 8 Calculated value ([M+H] + ) 663.401, Measured value 663.402
－化合物Ｋ５の合成－
マイクロウェーブを用いた固相合成法により、リンクアミド（Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ）樹脂（０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上で、以下の配列を有するペプチドを合成した。
Ｆｍｏｃ－Ａｈｘ－Ｃｙｓ－Ｍｅｔ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－ＮＨ２
［上記配列中、「Ｆｍｏｃ」は９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基を表し、「Ａｈｘ」は６－アミノヘキサン酸を表す。］
前記ペプチドを形成した樹脂を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水／トリイソプロピルシラン／３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（９２．５／２．５／２．５／２．５（容量比））に３時間浸漬し、前記ペプチドを樹脂から切り出した。
得られたペプチド（５５．０ｍｇ，３０．０μｍｏｌ）をＤＭＦ（２．５ｍＬ）に溶解し、１，３－ジブロモ－２－プロパノン（２０ｍＭ ＤＭＦ溶液；１．５ｍＬ，３０μｍｏｌ）及びＮ－メチルモルホリン（１０ｍＭ ＤＭＦ溶液；６．０ｍＬ，６０μｍｏｌ）を加えて２５℃で１時間撹拌した。ここにジエチルエーテル（１００ｍＬ）を加えて上清を除去し、残渣をジエチルエーテル（１００ｍＬ）で洗浄することにより化合物Ｋ５を白色固体として取得した（５４．６ｍｇ，２８．９μｍｏｌ，収率９７％）。
なお、化合物Ｋ５の構造式中の「ＣＭＬＹＩＶＰＹＦＳＶＧＣ」は、ペプチドのアミノ酸配列を表す。
前記化合物Ｋ５のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）による同定データは、以下のとおりであった。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ Ｃ９４Ｈ１２８Ｎ１５Ｏ２０Ｓ３
＋ 計算値（［Ｍ＋Ｈ］＋）１８８２．８６２、測定値１８８３．１４０
A peptide having the following sequence was synthesized on Rink Amide resin (0.2 mmol/g) by solid phase synthesis using microwaves.
Fmoc-Ahx-Cys-Met-Leu-Tyr-Ile-Val-Pro-Tyr-Phe-Ser-Val-Gly-Cys- NH2
[In the above sequence, "Fmoc" represents a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, and "Ahx" represents 6-aminohexanoic acid. ]
The resin on which the peptide was formed was mixed with trifluoroacetic acid (TFA)/water/triisopropylsilane/3,6-dioxa-1,8-octanedithiol (92.5/2.5/2.5/2.5). (volume ratio)) for 3 hours, and the peptide was cut out from the resin.
The obtained peptide (55.0 mg, 30.0 μmol) was dissolved in DMF (2.5 mL), and 1,3-dibromo-2-propanone (20 mM DMF solution; 1.5 mL, 30 μmol) and N-methylmorpholine ( 10mM DMF solution; 6.0mL, 60μmol) was added and stirred at 25°C for 1 hour. Diethyl ether (100 mL) was added thereto, the supernatant was removed, and the residue was washed with diethyl ether (100 mL) to obtain compound K5 as a white solid (54.6 mg, 28.9 μmol, yield 97%). .
Note that "CMLYIVPYFSVGC" in the structural formula of compound K5 represents the amino acid sequence of the peptide.
Identification data of the compound K5 by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) were as follows.
MALDI-TOF MS C 94 H 128 N 15 O 20 S 3 + calculated value ([M+H] + ) 1882.862, measured value 1883.140
－化合物Ｆｍｏｃ－Ｇ３－Ｐの合成－
上記反応式のようにして、上記構造式で表される化合物Ｆｍｏｃ－Ｇ３－Ｐを合成した。
具体的には、化合物Ｋ５（３０ｍｇ，０．０１５９ｍｍｏｌ）と細胞膜透過性分子Ｇ３（５２．７ｍｇ，０．０７９６ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（０．５ｍＬ）と水（０．０５ｍＬ）とを混合し、２５℃で２４時間撹拌した。ジエチルエーテル（５ｍＬ）を加えて遠心分離を行い、上澄を除去した。残渣をジエチルエーテルで洗浄（３ｍＬで３回）することにより化合物Ｆｍｏｃ－Ｇ３－Ｐの粗生成物を取得した。逆相ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により精製し凍結乾燥することにより、化合物Ｆｍｏｃ－Ｇ３－Ｐ（３．８ｍｇ，０．００１５０ｍｍｏｌ，収率９％）を取得した。
A compound Fmoc-G3-P represented by the above structural formula was synthesized according to the above reaction formula.
Specifically, compound K5 (30 mg, 0.0159 mmol), cell membrane permeable molecule G3 (52.7 mg, 0.0796 mmol), DMF (0.5 mL), and water (0.05 mL) were mixed, and the mixture was heated at 25°C. The mixture was stirred for 24 hours. Diethyl ether (5 mL) was added, centrifuged, and the supernatant was removed. The crude product of compound Fmoc-G3-P was obtained by washing the residue with diethyl ether (3 times with 3 mL). Compound Fmoc-G3-P (3.8 mg, 0.00150 mmol, yield 9%) was obtained by purifying by reverse phase HPLC (high performance liquid chromatography) and freeze-drying.
＜ペプチド複合体Ｇ３－Ｐトリフルオロ酢酸塩の合成＞
上記反応式のようにして、上記構造式で表されるペプチド複合体Ｇ３－Ｐトリフルオロ酢酸塩を合成した。
具体的には、上記で合成した化合物Ｆｍｏｃ－Ｇ３－Ｐと２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１．０ｍＬ）を混合し、２５℃で２時間ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。窒素ガスを吹き付けて溶媒を揮発させた。この残渣をジエチルエーテルで洗浄した（１ｍＬで３回）。ここに、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（０．８ｍｇ，０．００２ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０２２ｍＬ，０．０１２４ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（０．５ｍＬ）を混合し、２５℃で２０時間撹拌した。ジエチルエーテル（１５ｍＬ）を加えて遠心分離を行い、上澄みを除去した。残渣をジエチルエーテルで洗浄し（５ｍＬで２回）、ペプチド複合体Ｇ３－Ｐ粗生成物を取得した。ＴＦＡを含む移動相を用いたＨＰＬＣで精製し凍結乾燥することにより、ペプチド複合体Ｇ３－Ｐトリフルオロ酢酸塩（１．６ｍｇ，０．０００５９ｍｍｏｌ，収率４０％）を白色固体として取得した。
前記ペプチド複合体Ｇ３－Ｐトリフルオロ酢酸塩のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによる同定データは、次のとおりであった。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ Ｃ１２４Ｈ１７７Ｎ３０Ｏ３０Ｓ４ 計算値（[Ｍ＋Ｈ]＋）２６９４．２１２、測定値２６９４．２０８
A peptide complex G3-P trifluoroacetate represented by the above structural formula was synthesized according to the above reaction formula.
Specifically, the compound Fmoc-G3-P synthesized above and a 20% piperidine/DMF solution (1.0 mL) were mixed and stirred at 25° C. for 2 hours using a vortex mixer. The solvent was evaporated by blowing nitrogen gas. The residue was washed with diethyl ether (3 x 1 mL). Fluorescein isothiocyanate (FITC) (0.8 mg, 0.002 mmol), diisopropylethylamine (DIPEA) (0.022 mL, 0.0124 mmol) and DMF (0.5 mL) were mixed here, and the mixture was stirred at 25°C for 20 hours. did. Diethyl ether (15 mL) was added, centrifuged, and the supernatant was removed. The residue was washed with diethyl ether (5 mL twice) to obtain a crude peptide complex G3-P. Peptide complex G3-P trifluoroacetate (1.6 mg, 0.00059 mmol, yield 40%) was obtained as a white solid by purifying by HPLC using a mobile phase containing TFA and freeze-drying.
The identification data of the peptide complex G3-P trifluoroacetate by MALDI-TOF MS was as follows.
MALDI-TOF MS C 124 H 177 N 30 O 30 S 4 Calculated value ([M+H] + ) 2694.212, Measured value 2694.208
（比較例１：ペプチド複合体Ｇ６－Ｐの合成）
国際出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ２０２０／００５７６２に記載の実施例１の方法により、下記構造式で表されるペプチド複合体Ｇ６－Ｐを合成した。なお、下記構造式中の「ＣＭＬＹＩＶＰＹＦＳＶＧＣ」は、ペプチドのアミノ酸配列を表す。
A peptide complex G6-P represented by the following structural formula was synthesized by the method of Example 1 described in International Application Number: PCT/JP2020/005762. Note that "CMLYIVPYFSVGC" in the structural formula below represents the amino acid sequence of the peptide.
（比較例２：ペプチド複合体Ｇ９－Ｐの合成）
国際出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ２０２０／００５７６２に記載の実施例２の方法により、下記構造式で表されるペプチド複合体Ｇ９－Ｐを合成した。なお、下記構造式中の「ＣＭＬＹＩＶＰＹＦＳＶＧＣ」は、ペプチドのアミノ酸配列を表す。
Peptide complex G9-P represented by the following structural formula was synthesized by the method of Example 2 described in International Application Number: PCT/JP2020/005762. Note that "CMLYIVPYFSVGC" in the structural formula below represents the amino acid sequence of the peptide.
（試験例１：ペプチド複合体の細胞膜透過能評価）
実施例１１で合成したペプチド複合体Ｇ３－Ｐトリフルオロ酢酸塩、比較例１で合成したペプチド複合体Ｇ６－Ｐ、及び比較例２で合成したペプチド複合体Ｇ９－Ｐのいずれかを２μＭ含む細胞培養液中、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２、３７℃の条件下で、ＨｅＬａ細胞（Ｈｕｍａｎ ｃｅｒｖｉｘ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ）を２時間培養した。ＨｅＬａ細胞の培養には、ＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ Ｄ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、１０％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）添加）を用いた。
次いで、Ｄ－ＰＢＳ（－）（ヘパリン（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）添加）で細胞表面を洗浄後、細胞を回収し、Ｄ－ＰＢＳ（－）（０．５％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、２００ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０．２％（ｖ／ｖ）ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）添加）に懸濁させ、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩ）を用いて蛍光強度を測定した。フローサイトメトリー解析時には、ヨウ化プロピジウム陽性の死細胞を除いた生細胞集団に対し、蛍光強度最頻値を算出した。結果を表１に示す。
(Test Example 1: Evaluation of cell membrane permeability of peptide complex)
Cells containing 2 μM of any of the peptide complex G3-P trifluoroacetate synthesized in Example 11, the peptide complex G6-P synthesized in Comparative Example 1, and the peptide complex G9-P synthesized in Comparative Example 2. HeLa cells (Human cervix adenocarcinoma cells) were cultured for 2 hours in a culture medium under conditions of 5% (v/v) CO 2 and 37°C. For culturing HeLa cells, FluoroBrite D-MEM (manufactured by ThermoFisher) (supplemented with 10% (v/v) FCS (fetal calf serum) and 10% (v/v) GlutaMax (manufactured by ThermoFisher)) was used.
Next, after washing the cell surface with D-PBS(-) (added with heparin (20 units/mL)), the cells were collected, and D-PBS(-) (0.5% (v/v) BSA (bovine serum albumin) was added). ), 200mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.2% (v/v) propidium iodide (Sigma-Aldrich)), and the fluorescence intensity was measured using a flow cytometer (BD FACS AriaIII). It was measured. At the time of flow cytometry analysis, the mode of fluorescence intensity was calculated for the live cell population excluding propidium iodide-positive dead cells. The results are shown in Table 1.
国際出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ２０２０／００５７６２においては、ペプチド複合体の細胞膜透過能は、Ｇ３－Ｐ、Ｇ６－Ｐ及びＧ９－Ｐの順に高くなり、グアニジル基を有する樹状骨格の数が多いほど膜透過性が大きかった。一方、表１に示すように、培養４時間後におけるＧ３－Ｐトリフルオロ酢酸塩の細胞膜透過能は、Ｇ６－ＰやＧ９－Ｐと比較して顕著に高かった。このことから、ｐＫａの値が－８．０超の酸との塩の形態をとることでＧ３－Ｐは、Ｇ６－Ｐ及びＧ９－Ｐと同等以上の細胞膜透過性を示すことが明らかとなった。
分子量４，０００Ｄａを超える分子は免疫原性を引き起こす可能性があり、分子量が１，０００を超えるペプチドと結合させて用いる細胞膜透過性分子は、分子量はより小さいものが望ましい。そのため、医薬品製造においては、Ｇ６－ＰやＧ９－Ｐよりも分子量の小さいＧ３－Ｐを使用するのが好ましい。また、上述したように、Ｇ３－ＰをｐＫａの値が－８．０超の酸との塩の形態にすることで、膜透過能を顕著に向上させることが可能となり、Ｇ３－Ｐが課題としていた細胞膜透過能の不足についても克服できたといえる。つまり本発明の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法は、医薬品としてのペプチドを含むペプチド複合体の細胞膜透過性能を向上することができる有用な方法であるといえる。
In International Application Number: PCT/JP2020/005762, the cell membrane permeability of peptide complexes increases in the order of G3-P, G6-P, and G9-P, and the greater the number of dendritic skeletons having guanidyl groups, the higher the cell membrane permeability of peptide complexes. It had great transparency. On the other hand, as shown in Table 1, the cell membrane permeability of G3-P trifluoroacetate after 4 hours of culture was significantly higher than that of G6-P and G9-P. From this, it is clear that in the form of a salt with an acid with a pK a value of over -8.0, G3-P exhibits cell membrane permeability equivalent to or higher than that of G6-P and G9-P. became.
Molecules with a molecular weight of more than 4,000 Da may cause immunogenicity, and cell membrane permeable molecules used in combination with peptides with a molecular weight of more than 1,000 desirably have a smaller molecular weight. Therefore, in pharmaceutical production, it is preferable to use G3-P, which has a smaller molecular weight than G6-P and G9-P. In addition, as mentioned above, by forming G3-P in the form of a salt with an acid with a pK a value of over -8.0, it is possible to significantly improve membrane permeability, and G3-P It can be said that the lack of cell membrane permeability, which had been an issue, was overcome. In other words, the method of improving the cell membrane permeability of a cell membrane permeable molecule of the present invention can be said to be a useful method for improving the cell membrane permeability of a peptide complex containing a peptide as a drug.
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ 下記一般式（ｉ）で表される構造を有する細胞膜透過性分子を、ｐＫａの値が－８．０超の酸との塩とすることを含むことを特徴とする細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。
＜２＞ 前記一般式（ｉ）で表される構造の前記Ｘの部分が、ヘテロ原子含有基と結合している前記＜１＞に記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。
＜３＞ 前記ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子の含有割合が、１０％以上である前記＜２＞に記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。
＜４＞ 前記ヘテロ原子含有基におけるヘテロ原子が、酸素原子、窒素原子、硫黄原子及びリン原子からなる群から選択される少なくとも１種である前記＜２＞から＜３＞のいずれかに記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。
＜５＞ 前記ヘテロ原子含有基が、繰返し単位を含む前記＜２＞から＜４＞のいずれかに記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。
＜６＞ 前記繰返し単位が、アルキレンオキサイドである前記＜５＞に記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。
＜７＞ 前記アルキレンオキサイドが、メチレンオキサイド、エチレンオキサイド及びプロピレンオキサイドからなる群から選択される少なくとも１種である前記＜６＞に記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。
＜８＞ 前記細胞膜透過性分子がペプチドに導入されたものである前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の細胞膜透過性分子の細胞膜透過性の向上方法である。
Examples of aspects of the present invention include the following.
<1> Cell membrane permeability, which comprises converting a cell membrane permeable molecule having a structure represented by the following general formula (i) into a salt with an acid having a pK a value of more than -8.0. This is a method of improving cell membrane permeability of molecules.
<2> The method for improving the cell membrane permeability of the cell membrane permeable molecule according to <1> above, wherein the X part of the structure represented by the general formula (i) is bonded to a heteroatom-containing group. .
<3> The method for improving cell membrane permeability of the cell membrane permeable molecule according to <2> above, wherein the heteroatom content in the heteroatom-containing group is 10% or more.
<4> The heteroatom according to any one of <2> to <3> above, wherein the heteroatom in the heteroatom-containing group is at least one selected from the group consisting of an oxygen atom, a nitrogen atom, a sulfur atom, and a phosphorus atom. This is a method for improving cell membrane permeability of cell membrane permeable molecules.
<5> The method for improving cell membrane permeability of the cell membrane permeable molecule according to any one of <2> to <4>, wherein the heteroatom-containing group includes a repeating unit.
<6> The method for improving cell membrane permeability of a cell membrane permeable molecule according to <5> above, wherein the repeating unit is an alkylene oxide.
<7> The method for improving cell membrane permeability of a cell membrane permeable molecule according to <6> above, wherein the alkylene oxide is at least one selected from the group consisting of methylene oxide, ethylene oxide, and propylene oxide.
<8> The method for improving cell membrane permeability of the cell membrane permeable molecule according to any one of <1> to <7> above, wherein the cell membrane permeable molecule is introduced into a peptide.
Claims (8)
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