CN109897078B - 一种糖苷键质谱碎裂型化学交联剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种以二糖为骨架结构的化学交联剂及其制备方法，本发明交联剂包括两类结构，一类是以海藻糖为骨架结构的不具有富集功能的化学交联剂，另一类是以麦芽糖、纤维二糖及乳糖为骨架结构的具有富集功能的化学交联剂。本发明交联剂具有以下特点：1)具有琥珀酰亚胺酯结构单元，能够高效温和地与蛋白质、多肽赖氨酸末端或N端氨基发生反应；2)具有糖苷键质谱碎裂位点，简化交联肽的数据处理；3)具有化学富集基团，实现交联肽高通量、高灵敏度分析。本发明二糖交联剂应用于蛋白质组学领域，为实现复杂样品中蛋白复合体的规模化分析、蛋白质的空间结构及蛋白质‑蛋白质相互作用提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及一种以二糖为骨架结构的化学交联剂及其制备方法。本发明交联剂具有明确的糖苷键质谱碎裂位点，具体包括两类结构：一类是以海藻糖为骨架结构的不具有富集功能的化学交联剂；另一类是以麦芽糖、纤维二糖及乳糖为骨架结构的具有富集功能的化学交联剂，其中富基集团包括炔基、叠氮及生物素单元。该发明属于有机合成技术领域。
背景技术
近年来，化学交联剂结合质谱技术兴起，成为一种研究蛋白质复合物结构以及蛋白质-蛋白质相互作用的有力工具。该方法相比酵母双杂交、免疫共沉淀、蛋白质结晶X射线衍射等传统方法(Trends Biotechnol,2016,34, 825-834.；Journal of CellularBiochemistry,2016,117,2109-2117.)具有分析迅速、灵敏度高、通量高及可处理复杂蛋白样品等优点，因而成为持续增长的新的研究热点(Current Opinion in ChemicalBiology,2005,9,509–516；Mass Spectrometry Reviews,2010,29,862-876；AnalyticalChemistry,2016,88, 7930-7937.)。
化学交联剂的设计与合成，为化学交联剂结合质谱技术提供重要的技术支撑。一般而言，化学交联剂包含两个反应活性基团以及合理的间隔臂长。目前反应活性基团最常采用的是琥珀酰亚胺酯结构，可以特异性地与蛋白质或多肽赖氨酸末端或N端氨基反应，反应条件温和、高效。交联反应后的蛋白质再经过酶解即可得到交联肽，但是交联肽在常规肽(未交联的多肽)中占有率小，丰度低。为实现交联肽的高通量分析，人们在交联剂的设计过程中引入富集基团。目前较为常见的富集基团包括炔基、叠氮以及生物素基团(Journal ofProteome Research,2009,8,3702-3711；Journal of the American Chemical Society,2003,9,241625)。其中炔基可以与含有叠氮的磁球发生点击化学反应，实现交联肽高效富集；同理，叠氮可以与含有炔基的磁球发生点击化学反应，实现交联肽高效富集；生物素单元可以采用含有链霉亲和素的磁球，实现交联肽高效富集。
最近，可碎裂的化学交联剂成为一种新的设计理念。在交联剂中引入碎裂位点可以有效地促进交联位点的鉴定。根据碎裂方法的不同，交联剂可分为化学碎裂交联剂和质谱碎裂交联剂。前者的碎裂发生在交联肽进入质谱仪之前，而后者的碎裂发生在质谱的二级碎裂中。化学碎裂方法通常采用化学试剂的氧化或还原方式碎裂，这种碎裂方式不仅增加了样品的处理步骤还引入了化学试剂的影响，而质谱碎裂方式步骤简单、碎裂可控并带有特定的碎裂标签，因而更具研究前景(Analytical Chemistry,2006,78, 8059-8068.)。
将碎裂位点插入交联剂两个反应基团之间，在质谱中交联肽可发生碎裂，成为两条单独的、被交联剂残片修饰的多肽，可以巧妙地将交联肽的数据处理问题由复杂的两条肽简化成为一条肽，使得常规的质谱数据搜索引擎即可完成交联位点的鉴定。例如，Kao等设计的DSSO是一种基于CID 碎裂的交联剂(Molecular&Cellular Proteomics,2011,10,2212)。在CID串联质谱中，相邻亚砜基团的C-S键可发生高效碎裂。DSSO交联剂被成功地应用在酵母20S蛋白酶复合物的结构解析中。
糖苷键是一种特殊类型的化学键，连接糖苷分子中的非糖部分与糖基，或者糖基与糖基，广泛存在于寡糖、多糖或者蛋白质糖基化修饰中。糖组学研究发现，糖苷键与多肽中的肽键的质谱碎裂模式明显不同，在较低的碰撞能量时即可发生碎裂，且碎裂效率比较高(Analytical Chemistry,2014,86, 453-463.)。因此在本发明中，分别采用海藻糖、麦芽糖、纤维二糖及乳糖为骨架结构设计化学交联剂，旨在引入糖苷键质谱碎裂位点；同时针对麦芽糖交联剂、纤维二糖交联剂及乳糖交联剂，作了进一步结构修饰，引入炔基、叠氮及生物素富集基团，实现交联肽高通量、高灵敏度分析。
发明内容
基于上述化学交联剂的研究现状及设计原则，本发明设计并合成了一种基于糖苷键质谱可碎裂型化学交联剂，具体包括两类结构，一类是以海藻糖为骨架结构的不具有富集功能的交联剂，另一类是以麦芽糖、纤维二糖及乳糖为骨架结构的具有富集功能的交联剂。本发明在二糖结构单元引入琥珀酰亚胺酯活性基团，能够高效温和地和蛋白、多肽赖氨酸末端或N 端氨基发生反应。二糖结构中的糖苷键能在质谱中以较低能量实现高效碎裂，巧妙地将交联肽段的质谱图和数据解析简化为普通肽段分析，降低了质谱图的复杂程度，避免了交联数据平方级规模的搜索困难。另外，针对交联肽在常规肽中占有率小、丰度低的问题，本发明在麦芽糖、纤维二糖及乳糖交联剂中引入富集基团，包括炔基、叠氮及生物素基团，能够实现交联肽的有效富集，提高其在质谱中的响应，实现交联肽的高通量、高灵敏度分析。
本发明提供的一种以海藻糖为骨架结构不含富集基团的化学交联剂，具体结构如下所示：
本发明提供了海藻糖交联剂的制备方法，具体步骤如下：
第一步，将海藻糖溶于异丙醇中，加入氢氧化钠固体，海藻糖与氢氧化钠摩尔比控制在1：(5-10)，温度控制在40-60℃搅拌0.5-1h；随后称取溴乙酸，海藻糖与溴乙酸摩尔比控制在1：2.0-3.0，分批次加入反应体系，继续反应5-10h，温度控制在40-60℃。停止反应，室温过滤并用少量甲醇淋洗滤饼，真空干燥12h，即制得海藻糖二羧酸。
第二步，将海藻糖二羧酸溶于二甲基亚砜中，依次加入EDCI、NHS，摩尔比控制在1：(3.0-4.0)：(3.0-4.0)，室温搅拌12-24h。反应完毕，以水、乙腈为流动相，检测波长为200nm，利用半制备反相色谱分离纯化，即制得海藻糖交联剂。
本发明提供的另一类具有富集功能的二糖交联剂，结构如下所示：
其中，二糖包括麦芽糖、纤维二糖及乳糖中的一种或二种以上；二糖两个伯羟基引入琥珀酰亚胺酯单元；R为富集基团，包括炔基、叠氮及生物素单元。
具体包含9种结构，如下所示：
本发明提供的具有富集功能的二糖交联剂，具体步骤如下：
第一步，二糖的全乙酰化。具体是将二糖加入无水吡啶中，升温至微回流，使二糖全部溶解。恢复室温，缓慢滴加乙酸酐，控制乙酸酐与二糖摩尔比大于10：1。滴毕，室温反应12-24h。反应完毕，除去溶剂及过量的乙酸酐，底物溶于二氯甲烷。有机相分别用饱和碳酸氢钠及饱和食盐水洗两次。有机相加入无水硫酸钠干燥，除去溶剂，粗品以二氯甲烷、石油醚混合液为流动相，通过柱色谱进一步纯化，即制得全乙酰二糖。。
第二步，全乙酰二糖引入富集基团，包括炔基、叠氮及生物素基团。该步骤利用二糖1号位乙酰氧基反应活性较高，在路易斯酸条件下优先脱去乙酰基，再与含有富集基团的伯醇脱去一分子水成醚。具体是将全乙酰二糖与含有羟基的富集试剂溶于二氯甲烷并降温至0℃，缓慢滴加三氟化硼乙醚溶液。全乙酰二糖、富集试剂与三氟化硼摩尔比控制在1:(3-10):(3-10)。滴毕，恢复室温反应过夜。反应液加入三乙胺中和过量的路易斯酸，有机相依次用饱和碳酸氢钠及饱和食盐水洗两遍，并用无水硫酸钠干燥。有机相除去溶剂，得到粗产物。以正己烷、二氯甲烷混合液为流动相，通过柱色谱进一步纯化，即制得修饰富集基团的乙酰二糖。
第三步，修饰富集基团的乙酰二糖脱乙酰基。具体是将修饰富集基团的乙酰二糖溶于四氢呋喃/甲醇中(体积比为1：1)。称取10-15当量的甲醇钠固体溶于甲醇中，室温条件缓慢加入反应液，继续反应2-5h。反应完毕，滴加稀盐酸调pH值至6-7。除去溶剂，粗品以氯仿、甲醇混合液为流动相，通过柱色谱进一步纯化，即制得修饰富集基团的二糖。
第四步，修饰富集基团的二糖在TEMPO/NaClO/NaBr氧化体系中将两个伯羟基氧化成二羧酸。具体是将修饰富集基团的二糖中间体溶于四氢呋喃/ 水中(体积比为1：1)，加入饱和碳酸钠溶液调pH＝9-11，降温至0℃。称取0.01-0.1当量的四甲基哌啶氮氧化物(TEMPO)、1-1.5当量的溴化钠固体依次加入反应液中，继续缓慢滴加5-10当量的次氯酸钠水溶液，并用稀盐酸调pH＝9-11。0℃继续反应1-3h。反应完毕，加入过量的甲醇终止反应，加入稀盐酸调pH＝4-5。除去溶剂，粗品以氯仿、甲醇混合液为流动相，通过柱色谱进一步纯化，即制得修饰富集基团的二糖二羧酸。。
第五步，修饰富集基团的二糖酸琥珀酰亚胺酯的合成。具体是将修饰富集基团的二糖二羧酸与NHS控制摩尔比1：(3-4)溶于二甲基亚砜中，加入3-4当量的EDCI，室温反应6-12h。反应完毕，以水、乙腈为流动相，利用半制备反相色谱分离纯化，即制得修饰富集基团的二糖交联剂。
本发明提供的海藻糖交联剂及修饰富集基团的二糖交联剂是一种基于糖苷键质谱碎裂模式、具有多功能的化学交联剂。本发明二糖交联剂应用领域在结构蛋白组学，为实现复杂样品中蛋白复合体的规模化分析、蛋白质的空间结构及蛋白质-蛋白质相互作用网络提供重要的技术支撑。
与现有化学交联剂相比，本发明交联剂具有如下优点：
1.以二糖为骨架结构，具有明确的糖苷键断裂位点，巧妙地将交联肽段的数据处理问题由复杂的两条肽简化成为一肽，使得常规的质谱数据搜索引擎即可完成交联位点的鉴定。
2.具有富集基团，包括炔基、叠氮及生物素基团，可以实现交联肽的有效富集，解决样品复杂、交联肽丰度低的问题，提高交联肽在质谱中的响应，实现高通量、高灵敏度分析。
3.交联剂以二糖为主体结构，水溶性好，满足水环境中交联剂与蛋白质的交联反应，有利于保持蛋白质的空间构型。
附图说明
图1为海藻糖交联剂结构式。
图2为海藻糖交联剂的合成路线。
图3为修饰富集基团的二糖交联剂结构式。
图4为修饰富集基团的二糖交联剂的合成路线。
图5为9种具有富集功能的二糖交联剂。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例公开了海藻糖交联剂的制备方法，包含两个步骤：
第一步，海藻糖二羧酸的制备，具体步骤如下：室温条件，将海藻糖 (3g,7.9mmol)溶于30ml异丙醇中，氢氧化钠(2.4g,60mmol)加入反应液，温度控制在40-60℃搅拌1h。取溴乙酸(2.75g,19.8mmol)少量多次加入反应液，升温40℃反应5h。恢复室温，不溶物过滤并用少量甲醇淋洗三次。将白色固体转移至1M稀盐酸中，震荡10min。减压蒸除液体，真空干燥12h，即得产品3.07g，收率85％。1H NMR(400MHz,D2O,ppm)δ 5.05(s,4H),4.02(d,2H,J＝6.8Hz),3.70(m,2H),3.78(m,2H),3.54(d,2H,J＝ 6.8Hz),3.41(m,2H).MALDI-MS(C16H26O15):理论值[M-H]:457.1272，测定值：457.0354.
第二步，海藻糖二琥珀酰亚胺酯的制备，具体步骤如下：室温条件，将海藻糖二羧酸(45.8mg,0.1mmol)、NHS(46mg,0.4mmol)、EDCI(76.8mg, 0.4mmol)加入15mL二甲基亚砜中，搅拌12h。反应完毕，利用半制备反相色谱分离纯化，以水、乙腈为流动相，以10um碳十八硅球为填料，检测波长为200nm。收集馏出液真空冻干，即得淡黄色产品42.4mg，收率 65％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ4.87(s,4H),4.23(d,2H,J＝6.8Hz), 3.66(m,2H),3.54(m,2H),3.32(d,2H,J＝6.8Hz),3.26(m,2H),2.83(s,8H). MALDI-MS(C24H32O19N2):理论值[M+Na]:675.1497，测定值：675.0322.
实施例2
本实施例公开了修饰富集基团的二糖交联剂的制备方法，包含五个步骤。以修饰炔基的乳糖交联剂为例，制备方法如下所示：
第一步，全乙酰乳糖的制备，参考文献(Chem.Eur.J.,2016,22,11180 –11185)，具体步骤如下：室温条件，将乳糖水合物(5.05g,15mmol)溶于40ml无水吡啶中。取乙酸酐(20ml,212mmol)缓慢滴加至反应液，继续搅拌15h。反应液降至0℃，取20ml甲醇缓慢滴加至反应液以消耗过量的乙酸酐。反应液恢复室温，减压蒸除溶剂。反应底物溶于二氯甲烷，依次用饱和的碳酸氢钠、食盐水洗两次。有机相用无水硫酸钠干燥除水，减压蒸除溶剂。粗品通过柱层析进一步纯化，流动相为二氯甲烷：石油醚＝1： 1，蒸干溶剂即得白色固体8.7g，收率88％。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm) δ6.29-6.28(d,1H,J＝4.0Hz),5.52-5.48(t,1H,J＝8.8.0Hz),5.39(d,1H,J＝4.0 Hz),5.15(d,1H,J＝4.4Hz),5.00(m,2H),4.52-4.45(m,2H),4.18-4.12(m,2H), 3.94-3.82(m,2H),2.20(s,3H),2.19(s,3H),2.18(s,3H),2.14(s,3H),2.10(s, 3H),2.09(s,3H),2.04(s,3H),2.00(s,3H)；13C NMR(400MHz,CDCl3,ppm) δ170.3-168.9(C＝O),101.0,88.1,75.4,70.5,69.2,68.9,68.5,66.1,61.2,60.5, 20.7-20.3；MALDI-MS(C28H38O19):理论值[M+Na]:701.1905,测定值： 701.1895.
第二步，炔丙基乙酰乳糖的制备，参考文献(Carbohydrate Research,2006, 341,35-40)，具体步骤如下：室温条件，将全乙酰乳糖(1.02g,1.5mmol) 和炔丙醇(0.42g,7.5mmol)溶于5ml干燥的二氯甲烷中并降温至0℃，取 1ml三氟化硼乙醚溶液缓慢滴加至反应液，继续搅拌40h。反应结束，反应液加入40ml乙酸乙酯稀释，有机相分别用饱和碳酸氢钠及食盐水洗两遍，有机相用无水硫酸钠干燥后，减压蒸除溶剂。粗品通过柱色谱进一步纯化，流动相为正己烷：乙酸乙酯＝1：1，蒸干溶剂即得白色固体0.81g，收率81％。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm)δ5.21(d,1H,J＝9.2Hz),5.14(d,1H, J＝9.1Hz,),5.06(s,1H),4.93(d,2H,J＝9.2Hz)4.73(d,1H,J＝8.0Hz),4.54(d, 1H,J＝8.4Hz),4.51(d,1H,J＝8.0Hz),4.37(d,1H,J＝4.5Hz,),4.33(d,2H,J＝ 2.4Hz),4.10(d,1H,J＝4.7Hz),4.14(d,1H,J＝2.0Hz),3.79(d,1H,J＝2.0Hz), 3.68-3.60(m,2H),2.45(t,1H,J＝2.0Hz),2.19-2.01(s,21H).MALDI-MS (C29H38O18):理论值[M+Na]:697.1956测定值：697.1954.
第三步，炔丙基乳糖的制备，具体步骤如下：将炔丙基乙酰乳糖(0.67 g,1mmol)溶于10ml四氢呋喃/甲醇混合液中(体积比为1：1)，搅拌10min。称取甲醇钠(0.54g,10mmol)分散在5ml甲醇中，室温条件下缓慢加入反应液，继续反应2h。反应完毕，将溶剂减压蒸除，粗品通过柱层析进一步纯化，流动相为氯仿：甲醇＝3：1，蒸干溶剂即得白色固体0.36g，收率95％。1H NMR(400MHz,D2O,ppm)δ5.03(d,1H,J＝9.2Hz),4.92(d,1H,J＝9.1 Hz,),4.76(s,1H),4.53(d,2H,J＝9.2Hz)4.34(d,1H,J＝8.0Hz),4.14(d,1H,J＝ 8.4Hz),4.04(d,1H,J＝8.0Hz),3.98(d,1H,J＝4.5Hz,),3.94(d,2H,J＝2.4Hz), 3.90(d,1H,J＝4.7Hz),3.84(d,1H,J＝2.0Hz),3.54(d,1H,J＝2.0Hz),3.20(m, 2H),2.45(d,1H,J＝2.0Hz).MALDI-MS(C15H24O11):理论值[M+Na]:403.1216, 测定值：403.0984.
第四步，炔丙基乳糖二羧酸的制备，具体步骤如下：将炔丙基乳糖(380 mg,1mmol)溶于20ml四氢呋喃/水中(体积比为1：1)，降温至0℃，滴加饱和碳酸钠溶液调pH＝10，搅拌10min。称取四甲基哌啶氮氧化物 (TEMPO,7.8mg,0.05mmol)、溴化钠(103mg,1mmol)依次加入反应液，搅拌10min。取次氯酸钠溶液(3.6ml,6mmol)逐滴加入反应液，用稀盐酸调pH＝10。0℃继续反应1h。反应完毕，加入3ml甲醇终止反应，滴加稀盐酸调pH＝3-5，恢复室温搅拌0.5h。减压蒸除溶剂，粗品通过柱层析进一步纯化，流动相为氯仿：甲醇＝1：1，蒸干溶剂即得油状液体0.26g，收率65％。1H NMR(400MHz,D2O,ppm)δ5.31(d,1H,J＝9.2Hz),4.81(d,1H,J ＝9.1Hz,),4.62(d,1H,J＝4.4Hz),4.53(d,2H,J＝9.2Hz)4.34(m,2H),4.14(d, 1H,J＝8.4Hz),4.07(d,1H,J＝8.0Hz),3.98(d,1H,J＝4.5Hz,),3.94(d,2H,J＝ 2.4Hz),3.90(d,1H,J＝4.7Hz),3.84(d,1H,J＝2.0Hz),3.54(d,1H,J＝2.0Hz), 3.20(m,2H),2.45(d,1H,J＝2.0Hz).MALDI-MS(C15H20O13):理论值[M+Na]: 431.0802,测定值：431.0693.
第五步，炔丙基乳糖二琥珀酰亚胺酯的制备，具体步骤如下：将炔丙基乳糖二羧酸(40.8mg,0.1mmol)、NHS(46mg,0.4mmol)、EDCI(76.8mg,0.4 mmol)加入15mL二甲基亚砜中，搅拌12h。反应完毕，半制备反相色谱纯化，填料10um碳十八硅球，流动相为水、乙腈，梯度洗脱(乙腈2％-30％)，收集流出液，真空冻干，即得淡黄色产品35mg，收率58％。1H NMR(400MHz, DMSO--d6,ppm)δ5.45(d,1H,J＝9.2Hz),4.97(d,1H,J＝9.1Hz,),4.78(d,1H,J＝4.4Hz),4.54(d,2H,J＝9.2Hz)4.33(m,2H),4.24(d,1H,J＝8.4Hz),4.02(d,1H, J＝8.0Hz),3.87(d,1H,J＝4.5Hz,),3.82(d,2H,J＝2.4Hz),3.76(d,1H,J＝4.7 Hz),3.70(d,1H,J＝2.0Hz),3.42(d,1H,J＝2.0Hz),3.20(m,2H),2.83(s,8H), 2.24(d,1H,J＝2.0Hz).MALDI-MS(C15H20O13N2):理论值[M+Na]:625.1129 测定值：625.0878.
实施例3
本实施例公开了修饰富集基团的二糖交联剂的制备方法，包含五个步骤。以修饰叠氮的乳糖交联剂为例，制备方法如下所示：
第一步，全乙酰乳糖的制备，参考实施例第一步。
第二步，叠氮乙酰乳糖的制备，具体步骤如下：室温条件，将全乙酰乳糖(1.02g,1.5mmol)和叠氮醇(0.66g,7.5mmol)溶于5ml干燥的二氯甲烷中并降温至0℃，取1ml三氟化硼乙醚溶液缓慢滴加至反应液，继续搅拌48h。反应结束，反应液加入60ml乙酸乙酯稀释，有机相分别用饱和碳酸氢钠及食盐水洗两遍，有机相用无水硫酸钠干燥后，减压蒸除溶剂。粗品通过柱色谱进一步纯化，流动相为正己烷：乙酸乙酯＝2：1，蒸干溶剂即得白色固体0.96g，收率75％。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm)δ5.45(d, 1H,J＝9.2Hz),5.25(d,1H,J＝9.1Hz,),5.12(s,1H),4.91(d,2H,J＝9.2Hz) 4.74(d,1H,J＝8.0Hz),4.55(d,1H,J＝8.4Hz),4.49(d,1H,J＝8.0Hz),4.41(d,1H, J＝4.5Hz,),4.32(d,2H,J＝2.4Hz),4.21(d,1H,J＝4.7Hz),4.18(d,1H,J＝2.0 Hz),3.70(d,1H,J＝2.0Hz),3.65-3.60(m,2H),2.42(t,1H,J＝2.0Hz),2.17-2.06 (s,21H).MALDI-MS(C30H43N3O16):理论值[M+Na]:697.1956测定值： 697.1954.
第三步，叠氮乳糖的制备，具体步骤如下：将叠氮乙酰乳糖(0.71g, 1mmol)溶于20ml四氢呋喃/甲醇混合液中(体积比为1：1)，搅拌10min。称取甲醇钠(0.54g,10mmol)分散在5ml甲醇中，室温条件下缓慢加入反应液，继续反应3h。反应完毕，将溶剂减压蒸除，粗品通过柱层析进一步纯化，流动相为氯仿：甲醇＝2：1，蒸干溶剂即得白色固体0.39g，收率97.6％。1H NMR(400MHz,D2O,ppm)δ5.03(d,1H,J＝9.2Hz),4.92(d,1H,J＝ 9.1Hz,),4.76(s,1H),4.53(d,2H,J＝9.2Hz)4.34(d,1H,J＝8.0Hz),4.14(d,1H,J ＝8.4Hz),4.04(d,1H,J＝8.0Hz),3.98(d,1H,J＝4.5Hz,),3.94(d,2H,J＝2.4Hz), 3.90(d,1H,J＝4.7Hz),3.84(d,1H,J＝2.0Hz),3.54(d,1H,J＝2.0Hz),3.20(m, 2H),2.45(d,1H,J＝2.0Hz).MALDI-MS(C16H29N3O9):理论值[M+H]: 408.1904,测定值：408.0974.
第四步，叠氮乳糖二羧酸的制备，具体步骤如下：将叠氮乳糖(407mg, 1mmol)溶于25ml四氢呋喃/水中(体积比为1：1)，降温至0℃，滴加饱和碳酸钠溶液调pH＝10，搅拌10min。称取四甲基哌啶氮氧化物(TEMPO, 7.8mg,0.05mmol)、溴化钠(103mg,1mmol)依次加入反应液，搅拌10min。取次氯酸钠溶液(3.6ml,6mmol)逐滴加入反应液，用稀盐酸调pH＝10。 0℃继续反应1h。反应完毕，加入3ml甲醇终止反应，滴加稀盐酸调pH＝ 3-5，恢复室温搅拌0.5h。减压蒸除溶剂，粗品通过柱层析进一步纯化，流动相为氯仿：甲醇＝1：1，蒸干溶剂即得油状液体0.22g，收率52％。1H NMR (400MHz,D2O,ppm)δ5.31(d,1H,J＝9.2Hz),4.81(d,1H,J＝9.1Hz,),4.62(d, 1H,J＝4.4Hz),4.53(d,2H,J＝9.2Hz)4.34(m,2H),4.14(d,1H,J＝8.4Hz),4.07 (d,1H,J＝8.0Hz),3.98(d,1H,J＝4.5Hz,),3.94(d,2H,J＝2.4Hz),3.90(d,1H,J ＝4.7Hz),3.84(d,1H,J＝2.0Hz),3.54(d,1H,J＝2.0Hz),3.20(m,2H),2.45(d, 1H,J＝2.0Hz).MALDI-MS(C16H25N3O11):理论值[M+H]:435.1489,测定值： 435.0693.
第五步，叠氮乳糖二琥珀酰亚胺酯的制备，具体步骤如下：将叠氮乳糖二羧酸(44mg,0.1mmol)、NHS(46mg,0.4mmol)、EDCI(76.8mg,0.4mmol) 加入20mL二甲基亚砜中，搅拌24h。反应完毕，半制备反相色谱纯化，填料10um碳十八硅球，流动相为水、乙腈，梯度洗脱(乙腈2％-30％)，收集流出液，真空冻干，即得淡黄色产品30mg，收率47％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ5.54(d,1H,J＝9.2Hz),5.21(d,1H,J＝9.1Hz,),5.05(d,1H,J ＝4.4Hz),4.74(d,2H,J＝9.2Hz)4.53(m,2H),4.34(d,1H,J＝8.4Hz),4.12(d,1H, J＝8.0Hz),3.77(d,1H,J＝4.5Hz,),3.71(d,2H,J＝2.4Hz),3.66(d,1H,J＝4.7 Hz),3.50(d,1H,J＝2.0Hz),3.34(d,1H,J＝2.0Hz),3.27(m,2H),2.83(s,8H), 2.17(d,1H,J＝2.0Hz).MALDI-MS(C24H31N5O15):理论值[M+Na]:652.1129 测定值：652.0878.
实施例4
本实施例公开了修饰富集基团的二糖交联剂的制备方法，包含五个步骤。修饰生物素的乳糖交联剂，制备方法如下所示：：
第一步，全乙酰乳糖的制备，参考实施例第一步。
第二步，生物素乙酰乳糖的制备，具体步骤如下：室温条件，将全乙酰乳糖(1.02g,1.5mmol)和生物素戊醇(1.8g,7.5mmol)溶于10ml干燥的二氯甲烷中并降温至0℃，取1ml三氟化硼乙醚溶液缓慢滴加至反应液，继续搅拌60h。反应结束，反应液加入80ml乙酸乙酯稀释，有机相分别用饱和碳酸氢钠及食盐水洗两遍，有机相用无水硫酸钠干燥后，减压蒸除溶剂。粗品通过柱色谱进一步纯化，流动相为正己烷：乙酸乙酯＝1：3，蒸干溶剂即得白色固体0.58g，收率67％。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm)δ5.21 (d,1H,J＝9.2Hz),5.14(d,1H,J＝9.1Hz,),5.06(s,1H),4.93(d,2H,J＝9.2Hz) 4.73(d,1H,J＝8.0Hz),4.54(d,1H,J＝8.4Hz),4.51(d,1H,J＝8.0Hz),4.37(d,1H, J＝4.5Hz,),4.33(d,2H,J＝2.4Hz),4.10(d,1H,J＝4.7Hz),4.14(d,1H,J＝2.0 Hz),3.79(d,1H,J＝2.0Hz),3.68-3.60(m,2H),2.45(t,1H,J＝2.0Hz),2.19-2.01 (s,21H).MALDI-MS(C37H57NO20S):理论值[M+Na]:884.2725测定值： 884.0654.
第三步，生物素乳糖的制备，具体步骤如下：将生物素乙酰乳糖(0.89 g,1mmol)溶于30ml四氢呋喃/甲醇混合液中(体积比为1：1)，搅拌30min。称取甲醇钠(0.54g,10mmol)分散在5ml甲醇中，室温条件下缓慢加入反应液，继续反应4h。反应完毕，将溶剂减压蒸除，粗品通过柱层析进一步纯化，流动相为氯仿：甲醇＝1：1，蒸干溶剂即得白色固体0.54g，收率96％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ5.03(d,1H,J＝9.2Hz),4.92(d,1H,J ＝9.1Hz,),4.76(s,1H),4.53(d,2H,J＝9.2Hz)4.34(d,1H,J＝8.0Hz),4.14(d,1H, J＝8.4Hz),4.04(d,1H,J＝8.0Hz),3.98(d,1H,J＝4.5Hz,),3.94(d,2H,J＝2.4 Hz),3.90(d,1H,J＝4.7Hz),3.84(d,1H,J＝2.0Hz),3.54(d,1H,J＝2.0Hz),3.20 (m,2H),2.45(d,1H,J＝2.0Hz).MALDI-MS(C23H37NO13S):理论值[M+H]: 568.1986,测定值：568.0984.
第四步，生物素乳糖二羧酸的制备，具体步骤如下：将生物素乳糖(567 mg,1mmol)溶于80ml四氢呋喃/水中(体积比为1：1)，降温至0℃，滴加饱和碳酸钠溶液调pH＝10，搅拌10min。称取四甲基哌啶氮氧化物 (TEMPO,7.8mg,0.05mmol)、溴化钠(103mg,1mmol)依次加入反应液，搅拌10min。取次氯酸钠溶液(3.6ml,6mmol)逐滴加入反应液，用稀盐酸调pH＝10。0℃继续反应1h。反应完毕，加入3ml甲醇终止反应，滴加稀盐酸调pH＝3-5，恢复室温搅拌0.5h。减压蒸除溶剂，粗品通过柱层析进一步纯化，流动相为氯仿：甲醇＝1：2，蒸干溶剂即得油状液体0.25g，收率43％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ5.31(d,1H,J＝9.2Hz),4.81(d, 1H,J＝9.1Hz,),4.62(d,1H,J＝4.4Hz),4.53(d,2H,J＝9.2Hz)4.34(m,2H),4.14(d,1H,J＝8.4Hz),4.07(d,1H,J＝8.0Hz),3.98(d,1H,J＝4.5Hz,),3.94(d,2H,J ＝2.4Hz),3.90(d,1H,J＝4.7Hz),3.84(d,1H,J＝2.0Hz),3.54(d,1H,J＝2.0Hz), 3.20(m,2H),2.45(d,1H,J＝2.0Hz).MALDI-MS(C23H33NO15S):理论值[M+H]: 596.1971,测定值：596.0832.
第五步，生物素乳糖二琥珀酰亚胺酯的制备，具体步骤如下：将生物素乳糖二羧酸(60mg,0.1mmol)、NHS(46mg,0.4mmol)、EDCI(76.8mg,0.4 mmol)加入15mL二甲基亚砜中，搅拌24h。反应完毕，半制备反相色谱纯化，填料10um碳十八硅球，流动相为水、乙腈，梯度洗脱(乙腈2％-30％)，收集流出液，真空冻干，即得淡黄色产品36mg，收率45％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ5.45(d,1H,J＝9.2Hz),4.97(d,1H,J＝9.1Hz,),4.78(d,1H,J ＝4.4Hz),4.54(d,2H,J＝9.2Hz)4.33(m,2H),4.24(d,1H,J＝8.4Hz),4.02(d,1H, J＝8.0Hz),3.87(d,1H,J＝4.5Hz,),3.82(d,2H,J＝2.4Hz),3.76(d,1H,J＝4.7 Hz),3.70(d,1H,J＝2.0Hz),3.42(d,1H,J＝2.0Hz),3.20(m,2H),2.83(s,8H), 2.24(d,1H,J＝2.0Hz).MALDI-MS(C31H39N3O19S):理论值[M+H]:790.1898 测定值：790.0078。
Claims (7)
1.一种糖苷键质谱碎裂型化学交联剂的制备方法，其特征在于：
步骤一，以海藻糖为起始原料，在碱性条件下，两个伯羟基与溴乙酸反应，制备海藻糖二羧酸；
步骤二，以海藻糖二羧酸为原料，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（简称EDCI）为缩合剂，与N-羟基琥珀酰亚胺（简称NHS）发生酯化反应，即制得海藻糖交联剂；
具体步骤如下：
2.一种糖苷键质谱碎裂型化学交联剂的制备方法，其特征在于：
步骤一，二糖的全乙酰化，在乙酸酐/吡啶体系中，制备全乙酰二糖；
步骤二，全乙酰二糖在路易斯酸作用下，与含羟基的富集试剂反应，在乙酰二糖1号位引入富集基团，制备修饰富集基团的乙酰二糖；
步骤三，修饰富集基团的乙酰二糖在碱性条件中去乙酰化，制备修饰富集基团的二糖；
步骤四，修饰富集基团的二糖在四甲基哌啶氮氧化物（简称TEMPO）/次氯酸钠氧化体系下，将二糖两个伯羟基氧化成二羧基，制备修饰富集基团的二糖二羧酸；
步骤五，修饰富集基团的二糖二羧酸为原料，以EDCI为缩合剂，与NHS发生酯化反应，即制得修饰富集基团的二糖交联剂；
具体步骤如下：
其中
二糖为麦芽糖、纤维二糖及乳糖中的一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，特征在于：
步骤一中将海藻糖溶于异丙醇中，加入氢氧化钠固体，海藻糖与氢氧化钠摩尔比控制在1：5-10，温度控制在40-60 ℃搅拌0.5-1 h；随后称取溴乙酸，海藻糖与溴乙酸摩尔比控制在1：2.0-3.0，分批次加入反应体系，继续反应5-10 h，温度控制在40-60 ℃，停止反应，室温过滤并用甲醇淋洗，真空干燥6-12 h，即制得海藻糖二羧酸；
步骤二中将海藻糖二羧酸溶于二甲基亚砜中，依次加入NHS、EDCI，三者摩尔比控制在1：(3.0-4.0)：(3.0-4.0)，室温搅拌12-24 h；反应完毕，利用半制备反相色谱分离纯化，即制得海藻糖交联剂。
4.根据权利要求2所述的制备方法，特征在于：
步骤一中将二糖加入无水吡啶中，升温至微回流，使二糖全部溶解；恢复室温，滴加乙酸酐，控制乙酸酐与二糖摩尔比大于10：1；滴毕，室温反应12-24 h；反应完毕，除去溶剂及过量的乙酸酐，底物溶于二氯甲烷；有机相分别用饱和碳酸氢钠及饱和食盐水洗二次；有机相加入无水硫酸钠干燥，除去溶剂，粗品以二氯甲烷、石油醚混合液为流动相，通过柱色谱进一步纯化，即制得全乙酰二糖；
步骤二中将全乙酰二糖与含有羟基的富集试剂溶于二氯甲烷并降温至0℃，缓慢滴加三氟化硼乙醚溶液；全乙酰二糖、富集试剂与三氟化硼摩尔比控制在1:(3-10): (3-10)；滴毕，恢复室温反应过夜；反应液加入三乙胺中和过量的路易斯酸，有机相依次用饱和碳酸氢钠及饱和食盐水洗两遍，并用无水硫酸钠干燥；有机相除去溶剂，得到粗产物；以正己烷、二氯甲烷混合液为流动相，通过柱色谱进一步纯化，即制得修饰富集基团的乙酰二糖。
5.根据权利要求2所述的制备方法，特征在于：步骤三中将修饰富集基团的乙酰二糖溶于体积比为1：1四氢呋喃/甲醇中；称取相对于乙酰二糖的10-15当量的甲醇钠固体溶于甲醇中，室温条件缓慢加入反应液，继续反应2-5 h；反应完毕，滴加稀盐酸调pH值至中性；除去溶剂，粗品以氯仿、甲醇混合液为流动相，通过柱色谱进一步纯化，即制得修饰富集基团的二糖。
6.根据权利要求2所述的制备方法，特征在于：步骤四中将修饰富集基团的二糖中间体溶于体积比为1：1的四氢呋喃/水中，加入饱和碳酸钠溶液调pH = 9-11，降温至0℃；称取相对于修饰富集基团的二糖中间体的0.01-0.1当量的四甲基哌啶氮氧化物（TEMPO）、相对于修饰富集基团的二糖中间体1-1.5当量的溴化钠固体依次加入反应液中，继续缓慢滴加相对于修饰富集基团的二糖中间体5-10当量的次氯酸钠水溶液，并用稀盐酸调pH = 9-11；0℃继续反应1-3 h；反应完毕，加入过量的甲醇终止反应，加入稀盐酸调pH = 3-5；除去溶剂，粗品以氯仿、甲醇混合液为流动相，通过柱色谱进一步纯化，即制得修饰富集基团的二糖二羧酸。
7.根据权利要求2所述的制备方法，特征在于：步骤五中将修饰富集基团的二糖二羧酸与NHS控制摩尔比1：(3-4)溶于二甲基亚砜中，加入相对于修饰富集基团的二糖二羧酸3-4当量的EDCI，室温反应6-12 h；反应完毕，以水、乙腈为流动相，利用半制备反相色谱分离纯化，即制得修饰富集基团的二糖交联剂。
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