CN101421287A - 脂壳寡糖的化学合成方法 - Google Patents

脂壳寡糖的化学合成方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101421287A
CN101421287A CNA2007800114829A CN200780011482A CN101421287A CN 101421287 A CN101421287 A CN 101421287A CN A2007800114829 A CNA2007800114829 A CN A2007800114829A CN 200780011482 A CN200780011482 A CN 200780011482A CN 101421287 A CN101421287 A CN 101421287A
Authority
CN
China
Prior art keywords
product
compound
alkyl
aryl
aralkyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2007800114829A
Other languages
English (en)
Inventor
S·萨贝桑
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
EIDP Inc
Original Assignee
EI Du Pont de Nemours and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by EI Du Pont de Nemours and Co filed Critical EI Du Pont de Nemours and Co
Publication of CN101421287A publication Critical patent/CN101421287A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/12—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to a nitrogen atom of the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
    • C07H13/06—Fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/14—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to a sulfur, selenium or tellurium atom of a saccharide radical

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Cultivation Of Plants (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)

Abstract

研发了合成脂壳寡糖的方法。制备了完全酰化的低聚葡糖胺前体，并使之与具有胺保护邻苯二甲酰基的葡糖胺单体反应。除去邻苯二甲酰基后，脂肪酸可以加成到末端葡糖胺单元上，形成脂壳寡糖。本方法可以适用于工业规模应用。

Description

脂壳寡糖的化学合成方法
发明领域
本发明涉及脂壳寡糖的化学合成方法，和所得化学合成的脂壳寡糖。在这里公开的方法允许具有缩合在非还原性末端上的脂肪酸的低分子量N-酰基葡糖胺低聚物的分步合成法。该方法能够在工业规模上进行。
背景技术
脂壳寡糖在根瘤菌中天然形成并用作根瘤化因子。从细菌分泌的根瘤化因子在豆科植物的根细胞中引起响应，从而导致在根中的生物共生的根瘤形成。在这些根瘤中固定氮，并作为营养物提供给植物。豆科植物根根瘤化的程度直接与植物生长和产量有关。
该根瘤化因子脂壳寡糖具有四个或五个β 1，4-连接N-酰化葡糖胺残基的骨架，一种也在壳多糖(聚-[1-4]-β-N-乙酰基-D-葡糖胺)中发现的结构。这一骨架进行N-酰化并且可在两端上携带不同的取代基，这取决于根瘤菌种类(在其中形成该骨架)。在一些根瘤菌中末端单元的N-酰化采用一般的脂类代谢形成的脂肪酸如11-十八碳烯酸(C18:1Δ11Z)和在其它根瘤菌中N-酰化采用多不饱和脂肪酸如C20:3和C18:2。
在任何一种类型的细菌中形成的根瘤化因子脂壳寡糖是具有不同取代的化合物的混合物，这些化合物不可能完全地分离。一些根瘤化因子脂壳寡糖已经通过化学途径合成。对于制备脂壳寡糖的小样品现有各种已报道的方法，例如描述在Nicolaou等，J.Am.Chem.Soc.114：8701-8702(1992)；Ikeshita等，Carbohydrate Research C1-C6(1995)；和Wang等，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1：621-628(1994)。
仍然需要较大量和经济地制备脂壳寡糖类型的N-酰基葡糖胺低聚物的方法。本发明涉及这些和其它目的。
发明概述
本发明的一个方面是合成具有以下结构的脂壳寡糖化合物的方法：
Figure A200780011482D00081
结构A
其中各基团R1，R2和R3独立地选自H和C1-C20烷基、芳基、芳烷基，单、二或多烯基，单、二或多炔基；R4选自单糖、硫酸根和磷酸根；和n是0-约20；
该方法包括：
a)将结构C的化合物
Figure A200780011482D00082
结构C
其中R1选自H、C1-C20烷基、芳基和芳烷基，
与结构B的化合物
Figure A200780011482D00083
结构B
其中各基团R1和R2独立地选自H和C1-C20烷基、芳基和芳烷基；R4选自呈现适宜保护形式的单糖、硫酸根和磷酸根；和n是0-约19；
在非质子传递溶剂中掺混，并在约0℃至约-78℃之间的温度下搅拌所得溶液，以形成第一混合物；
b)在a)的混合物中添加选自N-卤酰亚胺的第一种活化剂以形成第二种混合物；
c)将选自全氟烷基磺酸的第二种活化剂，和任选地将选自全氟烷基磺酸甲基酯的试剂，添加到第二种混合物中以形成第三种混合物；
d)让第三种混合物在约0℃和约-78℃之间的温度下进行反应，以形成包括酯基和N-邻苯二甲酰亚胺基的产物；
e)分离出d)的产物；
f)从e)的分离产物中除去酯基和N-邻苯二甲酰亚胺基，形成去酯化的和去N-邻苯二甲酰亚胺基的产物；
g)分离出f)的产物；
h)让g)的分离产物的末端糖单元的氨基与式R1COX的酸或酰卤之间选择性地进行反应：
其中分别对于酸和酰卤而言X＝OH或卤素，和R1选自H、C1-C20烷基，芳基，单、二或多烯基，单、二或多炔基；以形成脂壳寡糖；和
i)分离出脂壳寡糖。
本发明的另一个方面是合成具有以下结构的脂壳寡糖化合物的方法：
结构A
其中各基团R1，R2和R3独立地选自H和C1-C20烷基、芳基、芳烷基，单、二或多烯基，单、二或多炔基；R4选自单糖、硫酸根和磷酸根；和n是0-约20；
该方法包括：
a)提供结构式D的化合物
Figure A200780011482D00101
结构D
其中R1选自H，以及C1-C20烷基、芳基和芳烷基；
b)除去结构式D的化合物的酯基和内部N-邻苯二甲酰亚胺基；
c)让结构式D的化合物的内部糖单元上的氨基与酰化试剂之间选择性地反应，以形成N-酰基衍生物产物；
d)通过让N-酰基衍生物产物与四-N-烷基铵氟化物反应，随后与胺或二胺在回流条件下反应产生去甲硅烷基化的和去-N-邻苯二甲酰亚胺基化产物，来除去在(c)的N-酰基衍生物产物的末端糖单元上的甲硅烷基团及酯和N-邻苯二甲酰亚胺基团；
e)在碱催化剂存在下，用已被碳化二亚胺和N-羟基苯并三唑活化的脂肪酸，或用式R1COX的酰卤将(d)的去N-邻苯二甲酰亚胺基化产物的末端氨基酰化，
其中X是卤素，和R1选自H和C1-C20烷基、芳基、芳烷基，单、二或多烯基，单、二或多炔基；以形成脂壳寡糖；和
f)分离出脂壳寡糖。
本发明的另一个方面是具有以下结构的化合物：
Figure A200780011482D00102
结构B
其中各基团R1和R2独立地选自H和C1-C20烷基、芳基；R4选自单糖、硫酸根和磷酸根；和n是0至约19。
本发明的再一个方面是包括由以下结构式表示的化学法合成的脂壳寡糖的组合物：
Figure A200780011482D00111
发明详述
本发明提供用于合成几克到千克量的具有缩合在非还原性末端上的脂肪酸的低分子量N-酰基葡糖胺聚合物(低聚N-酰基葡糖胺)(被称作脂壳寡糖)的方法，该方法可以放大规模到工业应用中。该方法允许简单的提纯程序的使用和不需要费用昂贵的色谱分离程序。脂壳寡糖的低聚N-酰基葡糖胺部分是由稳定贮存的单体的有效偶联形成的。以下描述的特定类型的单体在正在生长的聚合物链上的分阶段加成会导致所规定链长度的聚合物(在它之上连接了脂肪酸)的合成。这些葡糖胺单体单元一次一个地加成到彼此之上，使得有机会选择在低聚物中的各葡糖胺单元并且允许所需酰基(包括脂肪酸的酰基)引入到所选择的葡糖胺单元上，因此能够合成用于生物学评价的大系列的类似物。
还提供的是具有以下结构的中间体：
Figure A200780011482D00112
结构B
其中各基团R1和R2独立地选自H和C1-C20烷基、芳基和芳烷基；R4选自单糖，适宜保护的硫酸根和磷酸酯基团，它们中的每一个呈现适宜的保护形式；和n是0至约19。因为各葡糖胺单元单独加成到链上，如下面所述，在各葡糖胺单元上的各个R1或R2基团可以是不同的。中间体可用于合成脂壳寡糖。
当一种量、浓度或其它值或参数是作为范围，优选的范围或上优选值和下优选值的列表列举时，则所列举的量、浓度或其它值或参数拟包括从任何一对的任何范围上限或优选值和任何范围下限或优选值所形成的全部范围，不论这些范围是否单独地被公开。当数值的范围在这里列举时，除非另有说明，否则拟包括它的终点，以及在该范围内的全部整数和分数。当定义一个范围时，不希望本发明的范围限于所列举的具体值。
除非另有说明，否则在这里使用的下列术语具有以下意义。
在这里使用的术语“贮存稳定的”是指化合物在室温下贮存时以及当暴露于实验室贮存条件的湿气和空气中时保持完好无损。
术语“大规模的”指数十克到千克量的材料。
术语“低分子量聚合物”指长度大于一个单元和至多约50个单元的单体单元的链。低聚物是具有两个至约22个单元的聚合物。因此低聚N-酰基葡糖胺例如是一种类型的低分子量聚合物。
术语“连接位置”意指属于糖基键的一部分的碳的位置。在1，4-连接中，连接位置是在一个糖苷上的1位和在所连接的糖苷上的4位。
术语“非连接位置”意指不属于糖基键的一部分的碳的位置。例如，在1，4连接中，2、3和6位是非连接位置。
术语“硫糖苷给体”意指参与在糖基键的C-1位上的糖基分子。
术语“糖基受体”是指在参与到糖基键中的位置上有羟基的并经由它的氧连接到来自给体的C-1糖基残基之上的糖基分子。在β 1，4-连接键中该糖基受体在4位上有羟基。该糖基受体可以是单个单元或属于低分子量聚合物的多单元链。
术语“适宜地保护的硫糖苷给体”指在配糖键的形成之后变成非连接位置的那一位置之上有保护基团的硫糖苷。保护基团用来防止在这些部位发生反应。
术语“适宜地保护的糖苷受体”指在配糖键的形成之后变成非连接位置的那一位置之上有保护基团的糖苷。保护基团用来防止在这些部位发生反应。
本发明的一个实施方案包括合成结构A的化合物的方法：
结构A
其中各基团R1，R2和R3独立地选自H和C1-C20烷基、芳基、芳烷基，单、二或多烯基，单、二或多炔基；R4选自单糖、硫酸根和磷酸根；和n是0-约20。因为各葡糖胺单元单独加成到链上，如下面所述，在各葡糖胺单元上的各个R1、R2或R3基团可以是不同的。
在优选的实施方案中，在这里公开的的化合物(包括结构式A的那些)的合成能够以足够高的产率和以足够的效率合成，该效率允许该方法在工业规模上进行。
在合成结构式A的化合物的一种方法中，合成了低聚N-酰基葡糖胺前体，在它之上加成脂肪酸，形成在结构式A中的R3基团。通过制备结构式B的充分酰化的低聚N-酰基葡糖胺，然后用硫糖苷化合物C经由糖基化作用在β 1，4-连接键上加成N-邻苯二甲酰基保护的葡糖胺单体，使得这一合成成为可能。该酯和N-邻苯二甲酰基从该糖基化的产物中除去，然后脂肪酸加成到末端单元的氨基上而获得化合物A。
结构式B的低聚N-酰基葡糖胺(在它之上加成末端邻苯二甲酰基保护的葡糖胺单体)可以由被β 1，4-连接键所连接的2-约21个葡糖胺单元组成。
Figure A200780011482D00141
结构B
其中各基团R1和R2独立地选自H和C1-C20烷基、芳基和芳烷基；R4选自单糖、硫酸根和磷酸酯基团，这些基团中的每一个呈现适宜保护的形式；和n是0至约19。因为各葡糖胺单元单独加成到链上，如下面所述，在各葡糖胺单元上的各个R1或R2基团可以是不同的。
连接到低聚N-酰基葡糖胺上的N-邻苯二甲酰基保护的葡糖胺单体作为结构式C来显示。
Figure A200780011482D00142
结构式C
其中R1基团独立地选自H、C1-C20烷基、芳基和芳烷基。
结构式B的合成所需要的低聚葡糖胺是通过使用描述在共同未决的美国申请11/154457(代理案卷号CL2695)中的用于在己糖之间形成配糖键的方法来制备的，该文献以引用方式引入本文。低聚葡糖胺合成如下。
由结构式(I)表示的硫糖苷单体通过使用从N-卤代酰亚胺产生的活化剂和大约等摩尔量的强质子酸而非常高效地偶联到由结构式(II)表示的位置4糖基受体上。
Figure A200780011482D00151
其中R1和R2各自独立地选自H和C1-C20烷基、芳基和芳烷基；
R3和R4各自独立地选自单官能的酰基、双官能的酰基、邻苯二甲酰基、三氯乙酰基和四氯邻苯二甲酰基；
以及R5、R6、R7和R8各自独立地选自C1-C20烷基、芳基和芳烷基。
优选R1和R2是苯基。
优选R3和R4是从邻苯二甲酰基单元衍生的酰基。
优选R5是对-甲苯基。
优选R6和R7是甲基。
优选R8是叔丁基。
位置4糖基受体由结构式(II)表示：
Figure A200780011482D00152
其中R1选自酰基和保护的糖基单元；
R2选自H以及C1-C20烷基、芳基和芳烷基；
R3和R4各自独立地选自单官能的酰基、双官能的酰基、邻苯二甲酰基、三氯乙酰基和四氯邻苯二甲酰基；和R5选自C1-C20烷基、芳基和芳烷基。
优选R1和R2是苯基。
优选R3和R4是从邻苯二甲酰基单元衍生的酰基。
优选R5是甲基。
在低聚葡糖胺前体的合成中使用的糖基化方法说明如下。单体(II)即糖基受体的单元(例如分子)提供了初始单元，在该初始单元之上加成了单体(I)即硫糖苷给体的单元以使聚合物链延长。单体(I)和(II)能够从可以商购的D-葡糖胺盐酸盐制备。为了合成单体(I)，对于1，4-连接的葡糖胺的合成，该D-葡糖胺盐酸盐通过使用邻苯二甲酸酐而被邻苯二甲酰基团衍生化，以保护该胺(在实施例1中的产物2)。该羟基然后通过乙酰化加以保护(在实施例2中的产物3)，并且该产物由结晶提纯。接着，苯硫酚基团被加成到1位上(在实施例2中的产物4)和该产物通过用质子溶剂洗涤来提纯。所得产物进行脱乙酰(在实施例2中的产物5)，苯甲酰基保护基团在3和6羟基位上加成(在实施例2中的产物6)，并且该产物通过结晶提纯。最终，硅保护基团，称作叔丁基二甲基甲硅烷基(tBDMS)基团，作为临时保护基团在产物6的4-羟基上加成，产生在以下反应1中作为单体(I)所显示的化合物(S-(对-甲苯基)4-O-(二甲基-叔丁基甲硅烷基)-2-脱氧-3，6-二-O-苯甲酰基-2-邻苯二甲酰亚胺基-1-硫-β-D-吡喃葡糖苷)。这一化合物代表了单体(I)的一个例子，它是适宜地保护的硫糖苷给体。在单体(I)的制备中使用的各反应中的每一个是本领域中技术人员已知的。反应和提纯的结合是为了大规模制备单体(I)，该单体用于本发明的方法中。所得单体(I)提供用于低聚葡糖胺的合成中的构造单元。
本领域中技术人员将知道其它保护基团能够用于葡糖胺-单体(I)的中间体的制备中。例如，胺能够用单官能的酰基、双官能的酰基、三氯乙酰基或四氯邻苯二甲酰基加以保护和羟基能够用作为酯基的一部分的C1-C20烷基、芳基或芳烷基保护。类似地，甲硅烷基团能够是任何三取代的硅，例如被C1-C20烷基，芳基和芳烷基取代。
为了合成单体(II)，对于1，4-连接的葡糖胺的合成，使用与用于单体(I)时类似的反应顺序。D-葡糖胺盐酸盐的邻苯二甲酰基衍生物(在实施例2中的产物3)在1位羟基上乙酰化和甲基化(在实施例3中的产物7)，然后在其它羟基位上脱乙酰(在实施例3中的产物8)。苯甲酰基在3和6位上加成到产物8上，产生单体(II)。另外地，羟基保护的单糖可以加成到6位上。这些单个步骤中的每一个通过使用本领域中技术人员公知的反应条件来进行。所得单体(II)提供初始单元，在该初始单元上加成了对于单体(I)所制备的分子以便合成低分子量葡糖胺。在以下反应1中所示的化合物(甲基2-脱氧-3，6-二-O-苯甲酰基-2-邻苯二甲酰亚胺基-β-D-吡喃葡糖苷)代表单体(II)型化合物的一个例子，它是含有在4-位上的羟基的一种适宜地保护的糖基受体。
本领域中技术人员将知道其它保护基团能够用于单体(II)的中间体的制备中。例如，胺可以用单官能的酰基、双官能的酰基、三氯乙酰基或四氯邻苯二甲酰基加以保护和羟基可以用作为酯基的一部分的C1-C20烷基、芳基或芳烷基保护。
通过迭代糖基化和硅保护基团从产物多糖上的除去，糖基单元能够加成到所需的长度。单体(I)和(II)的偶联，以及低聚葡糖胺链+单体(I)的偶联，在反应中在饱和的底物浓度下通过使用硫糖苷活化剂来进行。硫糖苷活化剂是从N-卤酰亚胺和强质子酸产生的。例如N-卤代琥珀酰亚胺如N-碘琥珀酰亚胺和N-溴琥珀酰亚胺能够与强质子酸如三氟甲磺酸(triflic acid)和其它全氟烷基磺酸相结合用作活化剂。虽然三氟甲磺酸单独足以活化硫糖苷，但是三氟甲磺酸和三氟甲磺酸甲基酯的联用可有利于副产物的除去，该副产物可能对糖基化反应有害。因此，尽管三氟甲磺酸甲基酯不足以活化单体(I)，但是三氟甲磺酸/三氟甲磺酸甲基酯的结合为反应提供了最佳效率和提纯条件。
N-卤代琥珀酰亚胺以相对于单体(I)而言的1-1.8摩尔当量，和大约摩尔当量(相对于单体(II)而言)用量的任何全氟烷基磺酸(其中三氟甲磺酸是一个例子)，与摩尔当量(相对于单体(II)而言)的三氟甲磺酸甲基酯一起的使用提供了高效的糖基化作用。三氟甲磺酸以约0.25-约1.0摩尔当量用量使用能够用于有效的糖基化作用。偶联效率直接与所需产物从起始原料中的提纯的难易有关。因此，为了形成容易提纯的产物，特别使用大约摩尔当量用量的三氟甲磺酸和三氟甲磺酸甲基酯中的每一种。该高浓度的三氟甲磺酸不分裂糖分子，尤其当在低温下进行反应时。
使用以上所述的活化剂，偶联反应能够被驱动至定量，形成配糖键，如反应1中所示。所显示的是形成二聚体低分子量聚葡糖胺的葡糖胺-单体(I)和葡糖胺-单体(II)的示例反应。单体(I)在糖基受体(在这种情况下单体(II))上的偶联是步骤A。
Figure A200780011482D00181
反应1
另外，使用最低量的反应溶剂保持反应物在饱和水平和在高效浓度下，并且导致更有效的糖基化作用。活化剂被加成到糖苷上和偶联反应在低温下进行。从约0℃到约-78℃的温度适合于该反应。优选的是，反应温度是在约-20℃和约-70℃之间。更优选的是，温度是在约-50℃和约-60℃之间。反应时间是约15分钟至约8小时。该反应希望进行一段时间，足以让全部潜在的配糖键得以形成。优选的是在约4小时和约6小时之间的反应时间。
单体(I)，即适宜地保护的硫糖苷给体，和单体(II)，即位置4糖基受体，的偶联用的方法的一般描述如下所述。将单体(II)(约1.0当量)和单体(I)(至少1当量和至多约3当量，其中约1-2当量是优选的)溶于最低量的非质子传递溶剂中，如二氯甲烷、乙醚、乙腈和三氟甲苯。最优选的溶剂是二氯甲烷。该溶液在氮气氛下在搅拌下被冷却到约-55℃至-60℃。搅拌可通过彻底地混合溶液的各种组分的任何方法来进行，如振动或搅拌。典型地，使用强烈搅拌。将粉末状N-碘琥珀酰亚胺(NIS)添加到冷的溶液中。在约15分钟后，将由全氟烷基磺酸如三氟甲磺酸(约1.0当量)和三氟甲磺酸甲基酯(约1.0当量)溶于最低量的非质子传递溶剂例如二氯甲烷中所得到的溶液滴加进去，同时维持反应温度在约-60℃下。在添加之后，反应混合物在搅拌下在同一温度下维持约6小时，然后直接倾倒在饱和硫代硫酸钠和饱和碳酸氢钠溶液的1:1混合物上。另外的溶剂如二氯甲烷用于稀释反应混合物并为反应烧瓶提供洗涤作用。溶液彻底地被混合和分离有机层。有机层然后顺序地用1％-6％漂白剂溶液，优选0.6％-3％漂白剂溶液，然后水，和最终用饱和碳酸氢钠溶液进行洗涤。该产物在减压下通过溶液的浓缩来回收。通过将该物质溶于乙醚或乙酸乙酯中，然后用正己烷沉淀，来除去杂质。可以理解的是，在不脱离本发明的范围的情况下本领域中技术人员已知的各种变化能够引入该方法中。
所述的偶联反应的效率减少了在偶联之后的反应混合物中所存在的不希望有的副产物和起始原料的量，因此有利于通过选择性溶剂萃取法除去所存在的少量杂质。硅胶色谱分析法的通常使用和昂贵的提纯方法是不需要的，虽然这些方法可以使用。用有机溶剂的选择性洗涤提供了可用于大规模生产的简化提纯方法。在提纯过程中用于洗涤的溶剂包括乙醚和己烷-乙酸乙酯混合物。可以使用产物不溶于其中但杂质和副产物可溶于其中的溶剂的任何组合。通过使用所需产物不溶于其中的溶剂，来源于过量单体(I)的那些杂质的这一选择性萃取是产物分离用的高度优选的方法。
在偶联和任选的提纯之后，进行扩链。在二糖产物的扩链之前，硅封闭基团从聚葡糖胺连接位置上除去，如以下反应2，步骤B中所示。该硅基团能够被除去，例如通过溶于最低量的无水四氢呋喃(THF)中，然后与乙酸(2-3当量)和四正丁铵氟化物的THF溶液(1M，2-3当量)反应。反应进程可通过反应混合物的TLC或NMR来监测。除去硅保护基团的附加方法是本领域中技术人员公知的。
在完成之后，反应混合物被浓缩至干燥，将残留物溶于溶剂如二氯甲烷中，然后用水，1M HCl水溶液，0.6％-3％漂白剂溶液(除去深棕色)，和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。剩下的有机层在无水硫酸镁上干燥和浓缩至干燥。产物的提纯典型地通过用例如乙醚或正己烷-乙酸乙酯混合物沉淀来实现，这一操作确保来自前一步骤的残余单体以及硅杂质的除去。产物不溶于其中但杂质和副产物可溶于其中的溶剂的任何组合可用于沉淀。
通过使用如上所述的活化剂，附加的单体(I)，适宜地保护的硫糖苷给体，然后添加通过糖基键加成到未封闭的二糖上。使用二糖代替单体(II)，如反应2中所示，根据如上所述的一般偶联程序。所显示的是葡糖胺二聚体的示例反应，其中在步骤B中硅封闭基团被除去以及葡糖胺-单体(I)的加成形成三聚体低分子量聚葡糖胺。单体(I)偶联到糖基受体(在示例反应中，葡糖胺二聚体)上的过程是步骤A。
Figure A200780011482D00201
反应2
由有机溶剂洗涤所实现的提纯也如上所述。其它轮次的扩链是通过硅封闭基团除去以及单体(I)的加成来完成的。以分步骤的方式重复该过程，使得硫糖苷和聚葡糖胺形成具有x+1的长度的β连接的聚葡糖胺，其中x是起始聚葡糖胺的长度和1是一个单体单元。因为在各步骤中的反应是几乎定量的，各步骤的完成会得到含有高于约80％的具有单个链长度的分子的产物。因此，该产物富含β连接低聚葡糖胺分子的单种端基异构体。
重复这些步骤直至形成一种聚葡糖胺链，其单位长度适合于形成在脂壳寡糖的合成中使用的前体低聚葡糖胺。聚葡糖胺链长度可以在2和约21个单元之间。在约三个和约七个单元之间的链长度特别适合用于本发明的方法中。
在前体低聚葡糖胺上的苯甲酰基和邻苯二甲酰亚胺基保护基团然后转化成它们的乙酸酯。保护基团通过本领域中技术人员公知的方法被除去。对于含有2-5个残基的聚合物，它是在两步骤程序中进行的。首先，脱-O-苯甲酰化能够使用在甲醇中的甲醇钠由Zemplens方法来进行，该方法是本领域技术人员已知的。邻苯二甲酰基能够通过使用同样为本领域中技术人员公知的乙二胺衍生化的梅里菲尔德(Merrifield)树脂(P.Stangier，O.Hindsgaul，Synlett.1996，2：179-181)被除去。另外地，苯甲酰基和邻苯二甲酰亚胺基的除去能够在单个步骤中通过用肼或已溶于正丁醇中的肼在回流温度下处理被保护的产物，然后用水选择性萃取产物聚己糖胺来实现。单步骤方法对于长度大于4的聚合物是优选的，归因于在Zemplens条件下它们的不完全的脱苯甲酰化以及它们在甲醇和正丁醇中的低溶解度。在扩链结束时，甲硅烷基保护基团仍然保留在末端4-羟基上。
所得化合物的羟基和氨基然后使用本领域技术人员公知的程序进行酰化。对于简单的酰基如乙酰基，酰化能够通过添加吡啶和乙酸酐以及添加少量的本领域中技术人员已知的4-N，N-二甲基氨基吡啶来进行。具有简单酰基如乙酰基或丙酰基的酸酐是可商购的并且容易使用。对于无法获得酸酐的其它类型的酰基，使用相应的酰氯。希望在氨基上的酰基永久地保留，正如在脂壳寡糖分子中所看出的，而在羟基官能团上的酰基被除去。如果需要的话，还可以在氨基和羟基官能团上差别引入酰基，这通过首先酰化高度反应活性的氨基，随后由本领域中技术人员已知的方法酰化羟基来实现。
硅封闭基团然后从所得化合物上除去，正如前面在聚葡糖胺扩链反应中所述。所得N-和O-酰基低聚葡糖胺化合物作为以上结构式B被显示。结构式B的化合物然后与结构式C的化合物(它具有保护用的邻苯二甲酰基；以上所示的结构)反应。结构式C的化合物是在单体(I)的合成中的中间体，并且它的制备与实施例2中的产物4相同，它是在结构式C中所示的同一化合物。结构式B的化合物和结构式C的化合物的反应是按照以上对于单体(I)和(II)的偶联，以及低聚葡糖胺链+单体(I)的偶联所描述的那样来进行的。所得到的偶联的结构B+C产物按照以上对于偶联的单体(I)+(II)产物所述的那样被分离。
偶联结构B+C产物的保护用N-邻苯二甲酰亚胺基和酯基是在两步骤反应中被除去的，通过使用本领域中技术人员公知的条件。该酯基首先通过使用在醇中的金属醇盐进行酯交换而被除去，具体地说，通过用在甲醇中的甲醇钠处理该酯。该N-邻苯二甲酰基团然后通过在回流条件下与胺或二胺反应被除去，具体地说通过用在醇溶剂如甲醇和乙醇中的肼处理已脱酯的产物或通过用乙二胺衍生的梅里菲尔德树脂处理已脱酯的产物来实现。除去了邻苯二甲酰亚胺基的已脱酯产物通过用水萃取，和用能够萃取杂质的溶剂如二氯甲烷洗涤水层除去杂质来分离。所得化合物具有在末端糖单元上的游离氨基，而全部其它氮被酰化。
用于制备在末端糖单元上具有游离氨基而全部其它氮被酰化的化合物的另一种方法可以从结构式D的化合物开始来进行：
结构D
其中R1选自H，以及C1-C20烷基、芳基和芳烷基。
由结构式D表示的化合物能够根据在用于合成产物13的实施例中描述的方法来合成。酯基通过使用在醇中的金属醇盐在回流条件下在酯交换条件下被除去。内部N-邻苯二甲酰亚胺基通过与乙二胺树脂反应被除去。内部氨基的酰化是通过本领域中技术人员已知的方法来进行的，随后通过与四-N-烷基铵氟化物反应除去在末端糖单元上的甲硅烷基以及酯基团和N-邻苯二甲酰亚胺基，随后与胺或二胺在回流条件下反应产生在末端糖单元上含有游离氨基的脱甲硅烷基化的和脱N-邻苯二甲酰亚胺基化的产物。
游离氨基选择性地与式R1COX的酸或酰卤反应：
其中分别对于酸和酰卤而言，X＝OH或卤素，和
R1选自H、C1-C20烷基、芳基、芳烷基、烯基、二烯基和三烯基。
典型地，酰卤是酰氯试剂，但酰溴和酰碘也可以使用。
在已除去保护用的N-邻苯二甲酰亚胺基和酯基的偶联结构B+C产物的末端糖上的游离氨基与R1COX的反应可通过本领域中技术人员公知的方法来进行(其中的一些方法已描述在WO2005063784 A1中)。例如，反应物可以溶于DMF-水混合物，或者水和甲醇或乙醇混合物。当酰卤用于反应中时，使用碱催化剂如碳酸钠，碳酸钾，碳酸氢盐，三乙胺，或者碱金属或碱土金属的氢氧化物。当酸用于酰胺化反应时，它在碳化二亚胺如乙基-(N，N-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐存在下进行，并且可以添加N-羟基苯并三唑来促进反应。产物可以通过本领域技术人员已知的方法来分离，如通过酸性树脂柱过滤，随后干燥。该反应得到具有结构式A(以上所示)的在末端残基的氨基上连接有脂肪酸缩合物的N-酰基葡糖胺化合物，其被称作脂壳寡糖。在本发明方法中制备的化合物同样可以具有在内部残基上的一个或多个脂肪酸基团。在结构B的化合物合成期间，这些葡糖胺单体单元一次一个地加成到彼此之上，使得有机会选择在低聚物中的各葡糖胺单元并且允许所需酰基(包括脂肪酸的酰基)引入到所选择的葡糖胺单元上。因此，除了将脂肪酸加成到末端葡糖胺单元上，脂肪酸可以采用葡糖胺单元引入到内部位置上。
脂壳寡糖包括天然根瘤因子，其是在豆科植物根茎被固氮细菌的根瘤化中所牵涉的信号因子。通过增加根瘤化，由此增加对植物的氮供应，脂壳寡糖根瘤因子增强植物生长和产量。脂壳寡糖可用来处理植物的根茎，叶子或种子。化合物可以施加在土壤中，施加在植物叶片上，或作为种子包衣施加。豆科植物和非豆科植物都可从这些处理受益。
使用在这里公开的方法所制备的各脂壳寡糖可以容易地由本领域中技术人员测试对于豆科植物根茎根瘤化的影响，例如按照在Demont-Caulet等人(Plant Physiology 120：83-92(1999))中所述方法。同样，使用在这里公开的的方法所制备的各脂壳寡糖在促进豆科植物和非豆科植物的植物生长增强和产量改进上的有效性可以容易地测试，这是本领域中技术人员公知的。因此，不对应于已知的天然根瘤化因子但具有根瘤化刺激活性、植物生长增强活性或产量增强活性的结构式A的化合物可通过使用在这里公开的方法来制备并且容易地通过对于这些应用的测试来确认。
实施例
一般方法和原料
除非另有说明，全部试剂是从Aldrich Chemical Co(St.Louis，Mo.)商购的。在Silica Gel 60 F254(EM Science)的预涂覆的板上进行薄层色谱分析，斑点用在乙醇中含有5％硫酸的喷雾液来显现，然后加热。柱色谱法是在硅胶60(230-400目，EM Science)上进行的。1H NMR谱是在500MHz下记录的。在有机溶剂中的氢化学位移是相对于氘代二氯甲烷来表达的，后者具有5.36ppm的参比化学位移。对于化合物在重水或氘代甲醇中的溶液，氢化学位移数值是相对于HOD信号(在296°K处4.75ppm)表达的。
实施例1
2-脱氧-1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-邻苯二甲酰亚胺基-D-吡喃葡萄糖的合成
Figure A200780011482D00241
将D-葡糖胺盐酸盐(化合物1，1.0kg)悬浮于甲醇(5.0L)中，并剧烈搅拌。将NaOH(184.8g)溶于最低量的去离子水中，并添加到D-葡糖胺/甲醇悬浮液中。悬浮液搅拌15min，不溶性物质(氯化钠)通过真空过滤被滤出。所形成的NaCl的理论值应该是约270g。
向滤液中添加邻苯二甲酸酐(342g)，溶液被搅拌到绝大部分的固体溶解为止(约30min)。在此之后添加三乙胺(468g)并搅拌10-15min。向所形成的透明溶液中添加另一部分的邻苯二甲酸酐(342g)，混合物在室温下搅拌过夜。产物通常在两个小时后开始沉淀析出。
沉淀的产物被过滤出来，残留物用最低量的冰冷的甲醇洗涤，以便从产物中除去黄色物质。残留物然后用乙腈洗涤三次，用足够的溶剂添加到过滤器上以便完全浸没固体，然后在高真空下在室温下干燥。白色固体产物2的重量是954g。1H-NMR(D2O)：7.74-7.56(邻苯二甲酰亚胺基氢)，5.42(H-1α)，4.94(H-1β)，4.17和4.01(H-6)，3.27(N-乙基的CH2)，1.35(N-乙基的CH3)。
将来自以上的产物2(1.01Kg，从两个批次制得)加入到装有顶置电动搅拌器、N2入口和加料漏斗的10升三颈圆底烧瓶中。将乙酸酐(3L)和N，N-二甲基氨基吡啶(1.0g)加入到烧瓶中并剧烈地搅拌。缓慢地添加吡啶(2.8L)，反应混合物在室温下搅拌2天。反应混合物用冰-水(4L)骤冷，产物用二氯甲烷萃取。有机层反复地用盐酸水溶液洗涤，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机层在无水硫酸镁上干燥，过滤，和浓缩至干燥。产物从热的乙醇中重结晶。重结晶产物3的重量是701g。1H-NMR(CD2Cl2)δ：7.91-7.80(邻苯二甲酰亚胺基氢)，6.62(H-1)，5.59(H-3)，5.21(H-4)，4.47(H-2)，4.36和4.16(H-6)，4.06(H-5)，2，12，2.06，2.02，1.88(乙酰基的甲基)。因此以上NMR化学位移数据验证了产物3，即2-脱氧-1，3，4，6-四-O-乙酰基-2-邻苯二甲酰亚胺基-D-吡喃葡萄糖的结构，它在以下显示在实施例2中。
实施例2
单体(I)的合成
中间产物4的制备：
Figure A200780011482D00251
将产物3(464g)溶于甲苯中，然后蒸发溶剂。这一操作被重复，将残留固体置于高真空管线中过夜。
将干燥的固体溶于最低量的二氯甲烷(大约600ml)中，并且充分搅拌。在其中添加4-甲基苯硫酚(181g，1.45mol，1.5当量)，随后滴加三氟化硼二乙基醚合物(BF3-醚合物；165g，1.16mol，1.2当量，经过180min)。反应混合物搅拌过夜。当搅拌停止时，在早上形成白色晶体。晶体被滤出，得到产物4A。滤液用二氯甲烷稀释，顺序地用饱和NaHCO3溶液，水，然后碳酸氢盐溶液洗涤，干燥得到产物产物4B。4A和4B产物两者用无水甲醇彻底洗涤，并在真空下干燥。因为4A和4B产物的NMR谱是相同的，这两种产物被合并(产物4，426.3g)。
1H-NMR(CD2Cl2)δ：7.96-7.80(邻苯二甲酰亚胺基氢)，7.36和7.13(S-芳族氢)，5.78(H-3)，5.69(H-1)，5.13(H-4)，4.33(H-2)，4.30和4.12(H-6)，3.93(H-5)，2.36(S-Ph-Me基团)，2.13，2.04，1.85(乙酰基的甲基)。因此该NMR谱验证了产物4的结构，如上所述。
中间产物5的制备
将产物4(350g)悬浮于几乎4L的干燥甲醇中。在其中添加35ml的0.5M甲醇钠溶液，溶液立即变成碱性。悬浮液在室温下搅拌过夜。沉积的固体被滤出并用二氯甲烷洗涤，得到纯产物5(232g)。滤液用磺酸树脂中和并浓缩至干燥。干燥固体用二氯甲烷洗涤并干燥，得到不纯的化合物5(43.8g)。纯产物5的1H-NMR(CD3OD)δ：7.87-7.76(邻苯二甲酰亚胺基氢)，7.22和6.99(S-芳族氢)，5.46(H-1)，4.18(H-2)，4.03(H-3)，3.89和3.70(H-6)，3.39(H-5)，3.37(H-4)，2.22(S-Ph-Me基团)。因此该NMR谱验证了产物5的结构，如上所述。
中间产物6的制备
Figure A200780011482D00271
将产物5(295g；638mmol)悬浮于干燥甲苯(1L)中并在真空下蒸发。这一程序再一次重复以确保对反应有害的甲醇污染物的除去。总共回收265克。将在甲苯蒸发之后的残留物悬浮于装有顶置搅拌器的三颈烧瓶内的二氯甲烷(3L)中，悬浮液在干燥氮气氛下搅拌。该烧瓶在冰浴中冷却并添加以下试剂：吡啶＝126g，N，N-二甲基氨基吡啶＝500mg；和苯甲酰氯：171g(利用加料漏斗经过60min缓慢地滴加)。反应混合物是乳白色的，但是当添加全部苯甲酰氯时开始变透明。反应在室温下搅拌18小时。反应用二氯甲烷稀释，并用水(2次)，1M HCl水溶液(2次)，然后饱和NaHCO3溶液洗涤，并用MgSO4干燥。
粗产物在8升的热EtOH中重结晶，晶体被滤出，并且在EtOH中洗涤，得到产物6A(225g)。滤液浓缩至干燥，得到产物6B(131g)。进行产物6A的第二次重结晶，得到纯产物6(172g)。从第二次重结晶的滤液中得到的残留物(40g)具有大于95％的纯度的产物6，由NMR测定。产物6B没有进一步处理，因为NMR分析表明它具有大量的不希望有的产物并因此返回到化合物5。
1H-NMR(CD2Cl2)δ：8.14，7.88，7.69，7.57，7.41(苯甲酸酯的氢)，7.80-7.72(邻苯二甲酰亚胺基氢)，7.34和7.00(S-芳族氢)，5.93(H-3)，5.79(H-1)，4.77和3.99(H-6)，4.47(H-2)，4.03-3.99(H-5)，3.91(H-4)，3.25(OH)，2.31(S-Ph-Me基团)。因此该NMR谱验证了产物6的结构，如上所述。
单体(I)的制备
Figure A200780011482D00281
将产物6(171.9g；275.6mmol)溶于含有可力丁(41.7g；344.5mmol；1.25当量)的最低量二氯甲烷(350ml)中。由加料漏斗滴加t-BDMS-三氟甲磺酸盐(80.0g；303.1mmol；1.1当量)。反应混合物搅拌过夜。反应混合物用二氯甲烷稀释，然后顺序地用冰冷水，0.5M HCl水溶液(冰冷的)，然后饱和NaHCO3水溶液洗涤。它然后用MgSO4干燥，过滤和浓缩，得到单体(I)，为白色固体(207g)。在用于糖基化反应中之前，将产物溶于干燥甲苯中并浓缩至干燥。所回收的207g的单体(I)产物基本上等于理论收率，计算值是203.4g。
1H-NMR(CD2Cl2)δ：8.16-7.41(苯甲酸酯的氢，邻苯二甲酰亚胺基的氢)，7.30和6.95(S-芳族氢)，5.97(H-3)，5.82(H-1)，4.89和4.49(H-6)，4.40(H-2)，4.14(H-4)，4.01(H-5)，2.30(S-Ph-Me基团)，0.80(在硅上的叔丁基)，0.09和-0.16(硅上的甲基)。因此该NMR谱验证了单体(I)的结构，如上所述。
实施例3
单体(II)的合成
中间化合物7的制备
Figure A200780011482D00282
为了确保起始糖苷不含痕量EtOH，将化合物3(60.0g；126mmol)溶于甲苯中并蒸发。它然后溶于含有MeOH(6.5g；202mmol；1.6当量)的无水CH2Cl2(500ml)中。四氯化锡(SnCl4；18.4g；70.5mmol；0.56当量)用CH2Cl2(25ml)稀释，然后滴加进去。反应混合物被倾倒在冰水中，并充分振摇。这再一次重复，然后有机层用饱和NaHCO3水溶液洗涤两次，用MgSO4干燥，过滤，和浓缩。粗产物从热的EtOH中重结晶，得到产物7的晶体(43.1g)。49.8g的产物7的粗产率是理论产率的88％，计算值是56.6g，而43.1g的重结晶产物7的产率是76％。
1H-NMR(CD2Cl2)δ：7.86-7.74(邻苯二甲酰亚胺基氢)，5.78(H-3)，5.31(H-1)，5.18(H-4)，4.31(H-2)，4.34和4.20(H-6)，3.88(H-5)，2.20，2.03，1.86(乙酰基的甲基)。因此该NMR谱验证了产物7的结构，如上所述。
中间产物8的制备
Figure A200780011482D00291
将产物7(141.0g；314mmol)悬浮于MeOH(1000ml)中，并添加NaOMe(0.5M，10ml)。甲基糖苷产物7不容易溶于MeOH中。测试溶液以确保碱性。反应混合物搅拌过夜。溶液变成透明。反应混合物由TLC(EtOAc-己烷-EtOH＝10:20:1)的研究表明了起始原料的消失和极性产物(接近最初)的形成。溶液用磺酸树脂中和，过滤，和浓缩至干燥。残留物(称作产物8)的重量是105.3g，它可能包括一些甲醇。
105.3g的产物8的粗产量基本上等于理论产量，计算值是101.3g。1H-NMR(CD3OD)δ：7.85-7.80(邻苯二甲酰亚胺基氢)，5.07(H-1)，4.21(H-2)，3.94(H-3)，3.92和3.74(H-6)，3.40(H-5)，3.40(OCH3)，3.38(H-4)。因此该NMR谱验证了产物8的结构，如上所述。
单体(II)的制备
Figure A200780011482D00301
在与甲苯-DMF一起蒸发之后，将产物8(粗；105.3)悬浮于CH2Cl2(500ml)中。首先添加吡啶(61.8g；782mmol；2.5当量)，然后滴加苯甲酰氯(88g；626mmol；2.0当量)到混合物中。反应混合物是在室温下搅拌24小时。它然后用CH2Cl2稀释，并顺序地用H2O，1M HCl(2次)，然后饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，用MgSO4干燥，过滤，和浓缩。该产物通过硅胶色谱分析法提纯，使用EtOAc-己烷＝3:8作为洗脱剂。提纯产物的重量是116.1g。由NMR测得该产物约90％纯。这一产物的一部分(21.1g)从乙醚-己烷中重结晶，获得单体(II)的纯结晶材料(13.8g)。
1H-NMR(CD2Cl2)δ：8.15，7.92，7.67，7.56，7.42(苯甲酸酯的氢)，7.83-7.74(邻苯二甲酰亚胺基的氢)，5.93(H-3)，5.40(H-1)，4.82和4.72(H-6)，4.43(H-2)，4.03-3.92(H-5，H-4)，3.50(OCH3)，3.33(OH)。因此该NMR谱验证了单体(II)的结构，如上所述。
实施例4
衍生化葡糖胺二糖的合成
低聚葡糖胺衍生物的结构表征：
如下所述的偶联产物的结构通过以下的质子NMR和质谱分析法来证实。邻苯二甲酰亚胺基葡糖胺单元的氢H-3和H-1的化学位移是在5和6.5ppm之间的化学位移出现在质子NMR谱中。氢H-3作为具有约8-10Hz的耦合常数的双峰的双峰而出现。通过计数这些氢信号的数目，低聚葡糖胺的长度能够容易地测定，对于二糖到五糖。对于6和6以上的低聚葡糖胺衍生物，这些氢的信号开始重叠。然而，足够数量的这些信号能够被确定来证实所述结构。对于异头氢能够观察到类似的观察结果，这些氢作为具有约8-8.5Hz的耦合常数的双峰出现，因此证实该β-配糖构型。此外，当相应的碳携带羟基时，在末端葡糖胺单元中的H-4的化学位移在约3.5ppm出现。该化学位移通过在这一位置上的糖基化而转移到3.7ppm。因此，H-4能够用作信息基团来确定糖基化反应的成功。结构的其它证据是通过产物的MALDI和电喷雾质谱数据来获得的，这些数据对于各化合物都标明。
二聚体产物9的合成
Figure A200780011482D00311
将单体(II)(80.6g，109.3mmol，1.2当量)和单体(II)(48.4g，91.1mmol)，两者预先与甲苯一起蒸发一次，溶于在三颈500ml烧瓶内的CH2Cl2(150ml)中。添加4A分子筛(5g)。在氮气氛下在剧烈搅拌下将混合物冷却到-60℃。在10min后，将N-碘琥珀酰亚胺(NIS；44.3g；196.7mmol；2.2当量)作为干燥粉末添加，随后将三氟甲磺酸(TfOH；13.7g，91.1mmol，1.0当量)和三氟甲磺酸甲基酯(14.9g，54.8mmol，1.0当量)在二氯甲烷中的溶液滴加进去。反应混合物在-55℃下保持另外4小时。将另外100ml的三氟甲磺酸/三氟甲磺酸甲基酯溶液滴加到反应混合物中以降低粘度。将反应混合物在赛力特硅藻土过滤垫片上冷过滤到含有1:1饱和硫代硫酸钠-碳酸氢钠溶液的过滤烧瓶中，在过滤期间该溶液彻底地搅拌。烧瓶和在过滤器上的残留物用二氯甲烷漂洗，合并的滤液按以下进行后处理。将滤液倾倒在分液漏斗中。内容物彻底地混合，分离出水溶液，有机层再一次用饱和硫代硫酸钠水溶液，然后用水，和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。该溶液然后用硫酸镁干燥，过滤和浓缩。粗产物的重量是111.1g。通过使用乙酸乙酯-己烷作为洗脱剂，由硅胶色谱分析法对粗产物进行分离，以制备分析纯样品。1H-NMR(CD2Cl2)δ：8.17-7.19(邻苯二甲酰亚胺基和苯甲酸酯的氢)，6.11和5.76(2xH-3)，5.74和5.31(2xH-1)，4.36和4.32(2xH-2)，4.32和3.93(2xH-4)，3.90和3.53(2xH-5)，4.65，4.38，4.12，和3.63(4xH-6)，3.38(OCH3)，0.68(叔丁基)，-0.12，-0.40(2xCH3)。质谱：分子量计算值1144.37；实测值M+Na＝1167.5。因此该NMR谱验证了产物9的结构，如上所述。粗产物本身用于下一步，其中tBDMS的完全脱除得以实现。
实施例5
从用于扩链的二糖产物9中除去硅基团
中间产物10的制备
Figure A200780011482D00321
将产物9(111.1g)溶于THF(350ml)中。在该溶液中添加1M乙酸溶液(110ml)和1M的正四丁铵氟化物在THF中的溶液(110ml)，反应混合物在室温下搅拌3天。反应的完成通过使用EtOAC:Hex:EtOH＝4:8:1作为溶剂由TLC来确认，该分析表明反应已完成。在高真空(没有加热)下蒸发掉反应的溶剂，将残留物溶于CH2Cl2，顺序地依次用水，1M HCl水溶液，10％硫代硫酸钠水溶液和最终饱和NaHCO3水溶液洗涤。该溶液然后用MgSO4干燥，过滤和浓缩。所得固体用乙醚处理，它导致形成胶状物质。上层清液被过滤，胶状物质反复用乙醚洗涤。在滤液中添加己烷以沉淀任何溶于醚的产物，并过滤出沉淀物(级分B，5.9g)。来自醚-己烷的最终滤液被浓缩至干燥(级分C)。
该NMR谱表明该级分B产物具有与主要所需二糖一起的约5％硅杂质(在0ppm左右的峰)。级分A被tBDMS杂质和四丁基铵衍生物污染了约10％。因此，将级分A再悬浮在600ml的乙醚中，混合约10分钟，过滤，然后该过程再一次重复(回收固体的重量是77.3g)。这一固体通过将产物溶于乙酸乙酯中并借助于己烷沉淀出产物来再一次提纯(回收产物的重量是71.7g)。该滤液被合并，添加己烷以沉淀剩余产物，并回收另外10.8g的产物。1H-NMR(CD2Cl2)δ：8.12-7.14(邻苯二甲酰亚胺基和苯甲酸酯的氢)，6.14和5.73(2xH-3)，5.72和5.34(2xH-1)，4.37和4.34(2xH-2)，4.10和3.69(2xH-4)，3.97和3.44(2xH-5)，4.66，4.18，4.12-4.06(4xH-6)，3.38(OCH3)，3.35(OH)。质谱：分子量计算值1030.98；实测值M+Na＝1053.1。因此该NMR谱验证了产物10的结构，如上所述。
实施例6
衍生化葡糖胺三糖的合成
三聚体产物11的合成
Figure A200780011482D00331
将单体(I)(88.6g；120mmol；1.5当量)和产物10(82.5g；80.0mmol)溶于烧瓶内的CH2Cl2(100ml)中。添加分子筛(4A，5.0g)。将烧瓶置于-55℃水浴中并搅拌15min。将NIS(48.6g；216mmol)作为粉末添加到冷溶液中，同时保持强烈搅拌。利用加料漏斗(经过60min)将一起溶于CH2Cl2(5ml)中的三氟甲磺酸甲基酯(13.1g；80mmol；1.0当量)和TfOH(12g；80mmol；1.9当量)的溶液滴加到冷溶液中。在-60℃至-50℃下6小时后，将反应混合物倾倒在锥形烧瓶内的饱和碳酸氢钠和饱和硫代硫酸钠水溶液(1:1，400ml)上，彻底搅拌。添加另外二氯甲烷(200ml)并将内容物彻底地混合10min，分离出水溶液，并且有机层用0.6％漂白剂水溶液，去离子水，和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。该溶液然后用MgSO4干燥，过滤和浓缩。
为了从三糖中除去过量的单体杂质，将粗产物悬浮于乙醚(600ml)中，固体被彻底地混合并过滤上层清液。这一方法被重复三次，将残留物最终溶于二氯甲烷中，然后浓缩至干燥，得到93.5g的产物11。在滤液中添加约40％体积的己烷，沉淀的物质被过滤出来，再溶解在二氯甲烷中并在真空下浓缩至干燥而获得另外量的化合物11(26.0g)。1H-NMR(CD2Cl2)δ(仅仅选择氢化学位移报道)：8.13-7.12(邻苯二甲酰亚胺基和苯甲酸酯的氢)，6.03，5.88，和5.62(3xH-3)，5.64，5.48，和5.29(3xH-1)，3.77(末端葡糖胺单元的H-4)，3.90(末端葡糖胺单元的H-5)，4.63(末端葡糖胺单元的H-6)，3.35(OCH3)，0.64(叔丁基)，-0.18，-0.33(硅单元的2xCH3)。质谱：准确分子量计算值1643.49；实测值M+Na＝1666.3。因此该NMR谱验证了产物11的结构，如上所述。
实施例7
从用于进一步扩链的三糖产物11中除去硅基团
中间体12的制备
Figure A200780011482D00341
将产物11溶于最低量THF(500ml)中。在该溶液中添加1M乙酸溶液(150ml)和1M的正四丁铵氟化物在THF中的溶液(150ml)，反应混合物在室温下搅拌3天。反应混合物被蒸发至干燥，将残留物再溶解在二氯甲烷中，顺序地用去离子水，1M HCl，1％漂白剂水溶液(除去深棕色)，和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，然后浓缩至干燥。
为了除去非极性硅和其它杂质，将固体溶于最低量的乙酸乙酯。滴加己烷(最终溶剂比EtOAc-己烷是17:14)。这将得到胶状物质。液体被过滤出来，将胶状物质再溶解在EtOAc(200ml)中，并用己烷(100ml)沉淀，如上所述。最终，添加乙醚以使胶状物质凝固，过滤出固体。将固体再溶解在二氯甲烷中和浓缩至干燥，得到81.4g的产物12。
滤液EtOAc-己烷-乙醚被浓缩至干燥。将残留物悬浮于乙醚中，充分振荡，并过滤。这一过程重复两次。最终，将沉淀物溶于二氯甲烷中和浓缩至干燥而获得附加产物12(16.5g)。1H-NMR(CD2Cl2)δ(仅仅选择氢化学位移报道)：8.08-7.16(邻苯二甲酰亚胺基和苯甲酸酯的氢)，6.03，5.92，和5.59(3xH-3)，5.67，5.48，和5.29(3xH-1)，3.56(末端葡糖胺单元的H-4)，3.91(末端葡糖胺单元的H-5)，4.63(末端葡糖胺单元的H-6)，3.35(OCH3)，3.01(OH)，0.64。质谱：准确分子量计算值1529.41；实测值M+Na＝1553.4。因此该NMR谱验证了产物12的结构，如上所述。
实施例8
衍生化葡糖胺四糖的合成
四聚体产物13的合成
将硫糖苷单体(I)(37.4g；50.7mmol)和三糖产物12(45.6g；29.8mmol)溶于烧瓶内的CH2Cl2(150ml)中。添加分子筛(4A，10.0g)。将烧瓶置于-55℃水浴中并搅拌15min。将NIS(20.5g；91.25mmol)作为粉末添加到冷溶液中，同时保持强烈搅拌。利用加料漏斗(经过60min)将一起溶于CH2Cl2(20ml)中的三氟甲磺酸甲基酯(4.9g；29.8mmol)和TfOH(4.5g；29.8mmol)的溶液滴加到冷溶液中。在-60℃下6小时后，将反应混合物倾倒在锥形烧瓶内的饱和碳酸氢钠和饱和硫代硫酸钠水溶液(1:1，400ml)上，彻底搅拌。添加另外的二氯甲烷(200ml)并且内容物被彻底地混合10min，分离出水溶液，并将有机层顺序地用10％硫代硫酸钠水溶液，1％漂白剂水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。溶液然后用MgSO4干燥，过滤和浓缩(75.1g)。
为了从四糖中除去过量的单体杂质，将粗产物悬浮于乙醚(600ml)中，固体被彻底地混合并过滤掉上层清液。这一过程重复三次，最终将残留物溶于二氯甲烷中并浓缩至干燥(13A，54.2g)。
在该滤液中添加约40％体积的己烷，沉淀的物质被过滤出来，再溶解在二氯甲烷中和浓缩至干燥，得到5.8g的产物13B。13A和13B的NMR分析表明这些几乎相同，因此它们被合并。1H-NMR(CD2Cl2)δ(仅仅选择氢化学位移报道)：8.09-7.03(邻苯二甲酰亚胺基和苯甲酸酯的氢)，6.00，5.83，5.76，和5.62(4xH-3)，5.62，5.42，5.41，和5.27(4xH-1)，3.74(末端葡糖胺单元的H-4)，3.88(末端葡糖胺单元的H-5)，4.60(末端葡糖胺单元的H-6)，3.33(OCH3)，0.63(叔丁基)，-0.19，-0.34(硅单元的2xCH3)。质谱：准确分子量计算值2142.62；实测值M+Na＝2166.4。因此该NMR谱验证了产物13的结构，如上所述。
实施例9
苯甲酰基和邻苯二甲酰亚胺基保护基团转化成它们的乙酸酯
从13合成乙酰化产物15
Figure A200780011482D00371
将产物13溶于肼中并加热到105℃。在20小时后，反应混合物被浓缩至干燥。残留物然后用二氯甲烷彻底洗涤，以除去副产物，并得到产物14。
将产物14溶于最低量的无水吡啶(含有相等体积的乙酸酐)中。添加少量的4-N，N-二甲基氨基吡啶，反应在室温下搅拌24小时。它然后被倾倒在冰-水中，并用二氯甲烷萃取。二氯甲烷层用冰冷的1M盐酸水溶液洗涤，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。它然后在无水硫酸镁上干燥并在减压下浓缩而获得产物15。
实施例10
脱甲硅烷基化和末端邻苯二甲酰亚胺基-葡糖胺单元的加成
脱甲硅烷基化的产物16的合成
Figure A200780011482D00381
将四糖15溶于最低量的THF中，然后添加乙酸在THF中的1M溶液以及四丁基铵氟化物在THF中的1M溶液，并在室温下搅拌。在18小时后由NMR检查反应进程，以达到反应的完全。反应混合物被蒸发至干燥，再溶解在二氯甲烷中，顺序地用饱和硫代硫酸钠溶液，1M HCl，和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，然后浓缩至干燥。
为了除去非极性硅杂质，将固体溶于乙酸乙酯(400ml)中。滴加己烷(400ml)，搅拌所沉淀的物质。沉淀物被过滤出来，该过程再一次重复，随后用1:1 EtOAc-己烷最终洗涤固体，然后干燥得到产物16。
四糖的糖基化
四糖产物17的合成
Figure A200780011482D00391
将硫糖苷单体(来自实施例2的产物4；相对于产物16而言的2摩尔当量)和四糖产物16溶于含有4A分子筛的最低量CH2Cl2中。溶液被冷却到-60℃和充分搅拌。在-60℃下十分钟后，迅速地添加NIS(相对于五聚物16而言的3.5摩尔当量)。在五分钟后，将一起溶解在CH2Cl2(20ml)中的三氟甲磺酸(1当量)和三氟甲磺酸甲基酯(1当量)的溶液滴加进去。反应混合物在-60℃下保持另外5小时。将反应混合物倾倒在锥形烧瓶内的饱和碳酸氢钠和饱和硫代硫酸钠水溶液(1:1，500ml)上，并彻底地搅拌。添加另外的二氯甲烷并将内容物彻底地混合10min，分离出水溶液，和有机层顺序地用1％漂白剂水溶液，10％硫代硫酸钠水溶液，和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。该溶液然后用MgSO4干燥，过滤和浓缩。将残留固体溶于最低量EtOAc中，然后滴加己烷。液体部分被过滤出来，将不溶性物质再溶解在EtOAc中，然后再次在己烷中沉淀。最终，添加乙醚以凝固胶状材料，并用乙醚洗涤残留物，并干燥，得到产物17。
实施例11
O-乙酰基和N-邻苯二甲酰亚胺基的除去以及转化成脂壳寡糖
产物18的合成
Figure A200780011482D00401
将产物17悬浮于MeOH中，然后添加NaOMe(0.5M)并在室温下搅拌2天。反应用酸性树脂中和，并且浓缩至干燥。然后将产物悬浮在含有MR-乙二胺树脂的正丁醇中，并加热至100℃保持24小时。热的溶液在赛力特硅藻土垫片上过滤，然后用1:1甲醇-水洗涤。合并的滤液被浓缩至干燥而获得产物18。
脂壳寡糖19的合成：
Figure A200780011482D00402
将产物18溶于含有用于末端葡糖胺单元的胺基的酰胺化的2E，9Z-十六碳二烯酸的最低量水中。添加乙基-(N，N-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(1当量)和N-羟基苯并三唑(1当量)并在室温下搅拌过夜。反应混合物流过酸性树脂的柱，滤液被浓缩至干燥而获得产物19。
实施例12
脂壳寡糖四聚物的合成
Figure A200780011482D00411
将实施例8的产物四糖13(25g)悬浮于无水甲醇(900ml)中。添加甲醇钠溶液(0.5M，20ml)和反应混合物在室温下搅拌1天，形成稠厚的白色沉淀物。反应混合物然后被加热到回流状态，引起全部固体溶解。在回流下经过72小时后，再次在反应烧瓶中形成许多沉淀物。停止加热，冷却烧瓶，沉淀的物质被过滤出来，然后用甲醇洗涤。沉淀产物的重量是11.2g。这由质子NMR确认为产物20。
产物20(11.2g)在含有乙二胺梅里菲尔德树脂(152g)的甲醇(1L)中回流5天。温热的反应混合物然后进行过滤并用甲醇洗涤。未反应的起始原料保持为固体，而甲醇滤液含有产物。它被浓缩至干燥，将固体悬浮于含有乙酸酐(6ml)和三乙胺(6ml)的甲醇(175ml)中，并在室温下搅拌2小时。在烧瓶中形成白色沉淀物，它被过滤出来。该滤液用H+树脂(10g)处理，过滤，和浓缩至干燥而获得产物21(6.7g)。这由质子NMR确认为产物21。
将产物21悬浮于四氢呋喃(100ml)中，添加乙酸和四丁铵氟化物各自的1M溶液(各5ml)。在室温下搅拌24小时之后，混合物保持为浑浊。添加N，N-二甲基甲酰胺(10ml)来帮助溶解产物，反应在65℃下搅拌3天，然后浓缩至干燥。然后将所得产物悬浮在甲醇(100ml)中，添加乙二胺梅里菲尔德树脂(25g)。反应被加热至75℃并搅拌44小时。反应被冷却到室温和过滤。将含有产物22的滤液浓缩至干燥(2.2g)。这由质子NMR确认为产物22。
将脂肪酸C18:1或C16:1(.37g)在含有EDC(.28g)和HOBt-H2O(.20g)的N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中的溶液添加到产物16(1.0g)在DMF中的悬浮液之中。添加另外的N，N-二甲基甲酰胺(10ml)来完全地溶解低聚物。反应混合物在室温下搅拌18小时，然后加热至80℃保持2小时，导致稠厚凝胶的形成。凝胶用甲醇稀释，含有产物(来自C18:1的产物23和来自C16:1的产物24)的凝胶状物质被滤出。残留物用甲醇反复洗涤，随后用水洗涤。在滤纸上的残留物被收集，然后干燥而获得产物23(520mg)或产物24(552mg)。这由质子NMR确认为产物23和24。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.合成具有以下结构的脂壳寡糖化合物的方法：
Figure A200780011482Q00431
结构A
其中各基团R1，R2和R3独立地选自H和C1-C20烷基、芳基、芳烷基，单、二或多烯基，单、二或多炔基；R4选自单糖、硫酸根和磷酸根；和n是0-约20；
该方法包括：
a)将结构C的化合物
结构式C
其中R1选自H、C1-C20烷基、芳基和芳烷基，
与结构B的化合物
结构B
其中各基团R1和R2独立地选自H和C1-C20烷基、芳基和芳烷基；R4选自单糖、硫酸根和磷酸根；和n是0-约19；
在非质子传递溶剂中掺混，并在约0℃至约-78℃之间的温度下搅拌所得溶液，以形成第一种混合物；
b)在a)的混合物中添加选自N-卤酰亚胺的第一种活化剂以形成第二种混合物；
c)将选自全氟烷基磺酸的第二种活化剂，和任选地将选自全氟烷基磺酸甲基酯的试剂，添加到第二种混合物中以形成第三种混合物；
d)让第三种混合物在约0℃和约-78℃之间的温度下进行反应，以形成包括酯基和N-邻苯二甲酰亚胺基的产物；
e)分离出d)的产物；
f)从e)的分离产物中除去酯基和N-邻苯二甲酰亚胺基，形成去酯化的和去N-邻苯二甲酰亚胺基的产物；
g)分离出f)的产物；
h)让g)的分离产物的末端糖单元的氨基与式R1COX的酸或酰卤之间选择性地进行反应：
其中分别对于酸和酰卤而言X＝OH或卤素，和R1选自H、C1-C20烷基、芳基、芳烷基，单、二或多烯基，单、二或多炔基；以形成脂壳寡糖；和
i)分离出脂壳寡糖。
2.权利要求1的方法，其中第一种活化剂是N-卤代琥珀酰亚胺。
3.权利要求2的方法，其中N-卤代琥珀酰亚胺是N-碘琥珀酰亚胺。
4.权利要求1的方法，其中全氟烷基磺酸的量相对于式B的化合物为至少约0.25摩尔当量。
5.权利要求4的方法，其中全氟烷基磺酸的量相对于式B的化合物为大约等摩尔当量。
6.权利要求1的方法，其中全氟烷基磺酸是三氟甲磺酸。
7.权利要求1的方法，其中全氟烷基磺酸甲基酯是三氟甲磺酸甲基酯。
8.权利要求1的方法，其中a)和d)的温度是约-20℃至约-70℃。
9.权利要求1的方法，其中a)和d)的温度是约-50℃至约-60℃。
10.权利要求1的方法，其中e)的产物的酯基通过用在醇中的金属醇盐进行酯交换而被除去，和e)的产物的N-邻苯二甲酰亚胺基通过在回流条件下与胺或二胺反应而被除去。
11.权利要求1的方法，其中h)的反应通过使用碱催化剂和酰卤来进行，或通过使用被碳化二亚胺和N-羟基苯并三唑活化的脂肪酸来进行。
12.合成具有以下结构的脂壳寡糖化合物的方法：
Figure A200780011482Q00451
结构式A
其中各基团R1，R2和R3独立地选自H和C1-C20烷基、芳基、芳烷基，单、二或多烯基，单、二或多炔基；R4选自单糖、硫酸根和磷酸根；和n是0-约20；
该方法包括：
a)提供结构式D的化合物
结构D
其中R1选自H，以及C1-C20烷基、芳基和芳烷基；
b)除去结构式D的化合物的酯基和内部N-邻苯二甲酰亚胺基；
c)让结构式D的化合物的内部糖单元上的氨基与酰化试剂之间选择性地反应，以形成N-酰基衍生物产物；
d)通过让N-酰基衍生物产物与四-N-烷基铵氟化物反应，随后与胺或二胺在回流条件下反应产生去甲硅烷基化的和去-N-邻苯二甲酰亚胺基化产物，来除去在(c)的N-酰基衍生物产物的末端糖单元上的甲硅烷基团及酯和N-邻苯二甲酰亚胺基团；
e)在碱催化剂存在下，用已被碳化二亚胺和N-羟基苯并三唑活化的脂肪酸，或用式R1COX的酰卤将(d)的去N-邻苯二甲酰亚胺基化产物的末端氨基酰化，
其中X是卤素，和R1选自H和C1-C20烷基、芳基、芳烷基，单、二或多烯基，单、二或多炔基；以形成脂壳寡糖；和
f)分离出脂壳寡糖。
13.权利要求12的方法，其中(c)的酰化剂是乙酸酐。
14.权利要求12的方法，其中(d)的四-N-烷基铵氟化物是四-正丁基铵氟化物和二胺是连接于梅里菲尔德树脂上的乙二胺。
15.具有以下结构的化合物：
Figure A200780011482Q00471
结构B
其中各基团R1和R2独立地选自H和C1-C20烷基、芳基和芳烷基；R4选自单糖、硫酸根和磷酸根；和n是O-约19。
16.一种组合物，它包括由以下结构式表示的化学合成的脂壳寡糖：
Figure A200780011482Q00472
结构A
其中各基团R1和R2独立地选自H和C1-C20烷基、芳基、芳烷基，单、二或多烯基，单、二或多炔基；R3选自C12-C20烷基，单、二或多烯基，和单、二或多炔基；和R4选自单糖、硫酸根和磷酸根；和n是0-约20。
17.一种组合物，它包括由以下结构式表示的化学合成的脂壳寡糖：
Figure A200780011482Q00473
18.一种组合物，它包括由以下结构式表示的化学合成的脂壳寡糖：
Figure A200780011482Q00481

Claims (18)

1.合成具有以下结构的脂壳寡糖化合物的方法：
Figure A200780011482C00021
                      结构A
其中各基团R1，R2和R3独立地选自H和C1-C20烷基、芳基、芳烷基，单、二或多烯基，单、二或多炔基；R4选自单糖、硫酸根和磷酸根；和n是0-约20；
该方法包括：
b)将结构C的化合物
Figure A200780011482C00022
           结构式C
其中R1选自H、C1-C20烷基、芳基和芳烷基，
与结构B的化合物
Figure A200780011482C00031
                        结构B
其中各基团R1和R2独立地选自H和C1-C20烷基、芳基和芳烷基；R4选自单糖、硫酸根和磷酸根；和n是0-约19；
在非质子传递溶剂中掺混，并在约0℃至约-78℃之间的温度下搅拌所得溶液，以形成第一种混合物；
b)在a)的混合物中添加选自N-卤酰亚胺的第一种活化剂以形成第二种混合物；
c)将选自全氟烷基磺酸的第二种活化剂，和任选地将选自全氟烷基磺酸甲基酯的试剂，添加到第二种混合物中以形成第三种混合物；
d)让第三种混合物在约0℃和约-78℃之间的温度下进行反应，以形成包括酯基和N-邻苯二甲酰亚胺基的产物；
e)分离出d)的产物；
f)从e)的分离产物中除去酯基和N-邻苯二甲酰亚胺基，形成去酯化的和去N-邻苯二甲酰亚胺基的产物；
g)分离出f)的产物；
h)让g)的分离产物的末端糖单元的氨基与式R1COX的酸或酰卤之间选择性地进行反应：
其中分别对于酸和酰卤而言X＝OH或卤素，和R1选自H、C1-C20烷基、芳基、芳烷基，单、二或多烯基，单、二或多炔基；以形成脂壳寡糖；和
i)分离出脂壳寡糖。
2.权利要求1的方法，其中第一种活化剂是N-卤代琥珀酰亚胺。
3.权利要求2的方法，其中N-卤代琥珀酰亚胺是N-碘琥珀酰亚胺。
4.权利要求1的方法，其中全氟烷基磺酸的量相对于式B的化合物为至少约0.25摩尔当量。
5.权利要求4的方法，其中全氟烷基磺酸的量相对于式B的化合物为约等摩尔当量。
6.权利要求1的方法，其中全氟烷基磺酸是三氟甲磺酸。
7.权利要求1的方法，其中全氟烷基磺酸甲基酯是三氟甲磺酸甲基酯。
8.权利要求1的方法，其中a)和d)的温度是约-20℃至约-70℃。
9.权利要求1的方法，其中a)和d)的温度是约-50℃至约-60℃。
10.权利要求1的方法，其中e)的产物的酯基通过用在醇中的金属醇盐进行酯交换而被除去，和e)的产物的N-邻苯二甲酰亚胺基通过在回流条件下与胺或二胺反应而被除去。
11.权利要求1的方法，其中h)的反应通过使用碱催化剂和酰卤来进行，或通过使用被碳化二亚胺和N-羟基苯并三唑活化的脂肪酸来进行。
12.合成具有以下结构的脂壳寡糖化合物的方法：
Figure A200780011482C00041
                   结构式A
其中各基团R1，R2和R3独立地选自H和C1-C20烷基、芳基、芳烷基，单、二或多烯基，单、二或多炔基；R4选自单糖、硫酸根和磷酸根；和n是0-约20；
该方法包括：
a)提供结构式D的化合物
                     结构D
其中R1选自H，以及C1-C20烷基、芳基和芳烷基；
b)除去结构式D的化合物的酯基和内部N-邻苯二甲酰亚胺基；
c)让结构式D的化合物的内部糖单元上的氨基与酰化试剂之间选择性地反应，以形成N-酰基衍生物产物；
d)通过让N-酰基衍生物产物与四-N-烷基铵氟化物反应，随后与胺或二胺在回流条件下反应产生去甲硅烷基化的和去-N-邻苯二甲酰亚胺基化产物，来除去在(c)的N-酰基衍生物产物的末端糖单元上的甲硅烷基团及酯和N-邻苯二甲酰亚胺基团；
e)在碱催化剂存在下，用已被碳化二亚胺和N-羟基苯并三唑活化的脂肪酸，或用式R1COX的酰卤将(d)的去N-邻苯二甲酰亚胺基化产物的末端氨基酰化，
其中X是卤素，和R1选自H和C1-C20烷基、芳基、芳烷基，单、二或多烯基，单、二或多炔基；以形成脂壳寡糖；和
f)分离出脂壳寡糖。
13.权利要求12的方法，其中(c)的酰化剂是乙酸酐。
14.权利要求12的方法，其中(d)的四-N-烷基铵氟化物是四-正丁基铵氟化物和二胺是连接于梅里菲尔德树脂上的乙二胺。
15.具有以下结构的化合物：
Figure A200780011482C00052
                      结构B
其中各基团R1和R2独立地选自H和C1-C20烷基、芳基和芳烷基；R4选自单糖、硫酸根和磷酸根；和n是0-约19。
16.一种组合物，它包括由以下结构式表示的化学合成的脂壳寡糖：
                     结构A
其中各基团R1，R2和R3独立地选自H和C1-C20烷基、芳基、芳烷基，单、二或多烯基，单、二或多炔基；R4选自单糖、硫酸根和磷酸根；和n是0-约20。
17.一种组合物，它包括由以下结构式表示的化学合成的脂壳寡糖：
Figure A200780011482C00062
18.一种组合物，它包括由以下结构式表示的化学合成的脂壳寡糖：
Figure A200780011482C00063
CNA2007800114829A 2006-04-07 2007-04-05 脂壳寡糖的化学合成方法 Pending CN101421287A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US79042906P 2006-04-07 2006-04-07
US60/790,429 2006-04-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101421287A true CN101421287A (zh) 2009-04-29

Family

ID=38521085

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007800114829A Pending CN101421287A (zh) 2006-04-07 2007-04-05 脂壳寡糖的化学合成方法

Country Status (9)

Country Link
US (4) US20070238872A1 (zh)
EP (3) EP2010552B1 (zh)
JP (1) JP2009533345A (zh)
KR (1) KR20090023563A (zh)
CN (1) CN101421287A (zh)
AR (1) AR060392A1 (zh)
AU (1) AU2007235408A1 (zh)
CA (1) CA2644172A1 (zh)
WO (1) WO2007117500A2 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102532207A (zh) * 2010-12-24 2012-07-04 大连中科格莱克生物科技有限公司 一类n-不饱和脂肪酸酰化壳寡糖及其制备和应用
CN105101972A (zh) * 2013-01-31 2015-11-25 先锋国际良种公司 用于改善植物生长和产量的合成型脂质几丁寡糖
CN107081110A (zh) * 2017-04-06 2017-08-22 扬州大学 一种部分接枝的壳寡糖表面活性剂及制备方法
WO2023147789A1 (zh) * 2022-03-15 2023-08-10 山东京博农化科技股份有限公司 一种聚合度可控的壳寡糖化学合成方法

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9279022B1 (en) 2014-09-08 2016-03-08 Sirrus, Inc. Solution polymers including one or more 1,1-disubstituted alkene compounds, solution polymerization methods, and polymer compositions
US9828324B2 (en) 2010-10-20 2017-11-28 Sirrus, Inc. Methylene beta-diketone monomers, methods for making methylene beta-diketone monomers, polymerizable compositions and products formed therefrom
US9249265B1 (en) 2014-09-08 2016-02-02 Sirrus, Inc. Emulsion polymers including one or more 1,1-disubstituted alkene compounds, emulsion methods, and polymer compositions
US10414839B2 (en) 2010-10-20 2019-09-17 Sirrus, Inc. Polymers including a methylene beta-ketoester and products formed therefrom
EP3058826A1 (en) 2011-09-08 2016-08-24 Novozymes BioAG A/S Seed treatment methods and compositions
RU2658362C1 (ru) 2011-09-14 2018-06-21 Новозимс Биоаг А/С Применение липохитоолигосахаридов и/или хитоолигосахаридов в комбинации с микроорганизмами, придающими растворимость фосфатам, для усиления роста растений
US9055747B2 (en) 2011-09-23 2015-06-16 Novozymes Bioag A/S Chitooligosaccharides and methods for use in enhancing corn growth
BR112014006919B1 (pt) 2011-09-23 2019-05-21 Novozymes Bioag A/S Método para intensificar o crescimento e/ou rendimento de plantas
CN104066328B (zh) 2011-09-23 2016-03-23 诺维信生物农业公司 用于增强大豆生长的壳寡糖和方法
RU2612428C2 (ru) 2011-09-23 2017-03-09 Новозимс Биоаг А/С Комбинации липохитоолигосахаридов и способы их применения для усиления роста растений
US9512058B2 (en) 2011-10-19 2016-12-06 Sirrus Inc. Multifunctional monomers, methods for making multifunctional monomers, polymerizable compostions and products formed thereform
US20150305333A1 (en) * 2012-10-29 2015-10-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Use of glucosamine amides as plant growth and yield enhancers
US20160007600A1 (en) 2013-03-06 2016-01-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company Synthetic lipochitooligosaccharide analogs for enhancing plant performance
ES2951883T3 (es) 2014-07-23 2023-10-25 Novozymes Bioag As Composiciones que contienen lipo-quito-oligosacáridos y microorganismo para potenciar el crecimiento de las plantas
US9315597B2 (en) 2014-09-08 2016-04-19 Sirrus, Inc. Compositions containing 1,1-disubstituted alkene compounds for preparing polymers having enhanced glass transition temperatures
US9416091B1 (en) 2015-02-04 2016-08-16 Sirrus, Inc. Catalytic transesterification of ester compounds with groups reactive under transesterification conditions
US10501400B2 (en) 2015-02-04 2019-12-10 Sirrus, Inc. Heterogeneous catalytic transesterification of ester compounds with groups reactive under transesterification conditions
AR105480A1 (es) * 2015-04-22 2017-10-11 Monsanto Technology Llc Beneficios de rendimiento de plantas por microbianos
US10617704B2 (en) 2015-07-30 2020-04-14 Microbial Chemistry Research Foundation Effective aminoglycoside antibiotic for multidrug-resistant bacteria
EP3346842A1 (en) 2015-09-11 2018-07-18 Novozymes BioAG A/S Stable inoculant compositions and methods for producing same
KR20180119560A (ko) 2015-12-28 2018-11-02 노보자임스 바이오아게 에이/에스 안정한 접종제 조성물 및 그의 생성 방법
JP2019503714A (ja) 2015-12-28 2019-02-14 ノボザイムス バイオアーゲー アクティーゼルスカブ 安定した接種組成物およびその製造方法
CA3025912A1 (en) 2016-05-31 2017-12-07 Novozymes Bioag A/S Stable liquid inoculant compositions and coated plant propagation materials comprising same
EP3462881A1 (en) 2016-05-31 2019-04-10 Novozymes BioAG A/S Stable inoculant compositions and methods for producing same
US9567475B1 (en) 2016-06-03 2017-02-14 Sirrus, Inc. Coatings containing polyester macromers containing 1,1-dicarbonyl-substituted 1 alkenes
US10196481B2 (en) 2016-06-03 2019-02-05 Sirrus, Inc. Polymer and other compounds functionalized with terminal 1,1-disubstituted alkene monomer(s) and methods thereof
US10428177B2 (en) 2016-06-03 2019-10-01 Sirrus, Inc. Water absorbing or water soluble polymers, intermediate compounds, and methods thereof
US9617377B1 (en) 2016-06-03 2017-04-11 Sirrus, Inc. Polyester macromers containing 1,1-dicarbonyl-substituted 1 alkenes
WO2018118740A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 Novozymes Bioag A/S Stable inoculant compositions and methods for producing same
BR112019013761A2 (pt) 2017-01-03 2020-01-21 Monsanto Technology Llc composições microbianas e métodos
CA3048997A1 (en) 2017-01-03 2018-07-12 Monsanto Technology Llc Microbial compositions and methods
CN110637082B (zh) 2017-01-04 2024-04-05 诺维信生物农业公司 芽孢杆菌属分离株及其用途
UY37564A (es) 2017-01-05 2018-07-31 Novozymes Bioag As Aislados de lysinibacillus y usos de los mismos
US11089776B2 (en) 2017-02-28 2021-08-17 Monsanto Technology Llc Containerized liquid formulations
CA3056903A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 Novozymes Bioag A/S Combinations of yersinia entomophaga and pesticides or other substances
CA3065297A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 Novozymes Bioag A/S Stable inoculant compositions comprising methylated plant oils
PL3631019T3 (pl) 2017-05-26 2024-03-11 Novozymes Bioag A/S Stabilne kompozycje inokulacyjne zawierające oleje/woski parafinowe
WO2018218008A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 Novozymes Bioag A/S Stable liquid inoculant compositions comprising dodecane
US20200288627A1 (en) 2017-06-29 2020-09-17 Monsanto Technology Llc Seed treatment process for large liquid volumes
WO2019136198A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Novozymes Bioag A/S Aqueous compositions comprising solubilzed lipo-chitooligosaccharides
WO2019147660A1 (en) 2018-01-23 2019-08-01 Novozymes Bioag A/S Method of enhancing seed germination under abiotic stress with chitin oligosaccharides
AU2019266155A1 (en) 2018-05-07 2020-11-05 Novozymes Bioag A/S Microbacterium isolates and uses thereof
CN114302953B (zh) 2019-06-24 2024-06-11 奥本大学 一种芽孢杆菌属菌株及其用于促进植物生长的方法
WO2020263734A1 (en) 2019-06-24 2020-12-30 Novozymes Bioag A/S Erwinia isolates and uses thereof
EP3818829A3 (en) 2019-10-16 2021-07-21 Monsanto Technology LLC Granular nematicide compositions
WO2021086695A1 (en) 2019-10-29 2021-05-06 Novozymes Bioag A/S Microbacterium isolates and uses thereof
WO2021101937A1 (en) 2019-11-20 2021-05-27 Novozymes Bioag A/S Pseudomonas isolates and uses thereof
CN115151632A (zh) 2019-11-22 2022-10-04 诺维信生物农业公司 类芽孢杆菌属分离株及其用途
WO2022125639A1 (en) 2020-12-08 2022-06-16 Monsanto Technology Llc Modified plant-associated bacteria and methods of their use

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2660658A1 (fr) * 1990-04-06 1991-10-11 Centre Nat Rech Scient Substances de structure oligosaccharidique propres a jouer le role de signaux symbiotiques plantes-specifiques, leurs procedes de production et leurs applications.
DE19633502A1 (de) * 1996-08-20 1998-02-26 Bayer Ag Verwendung von Lipo-Chitooligosacchariden zur Verbesserung der Wirksamkeit von Fungiziden
CA2243669A1 (en) 1998-07-21 2000-01-21 Bios Agriculture Inc. Composition for accelerating plant seed germination, plant growth and methods using same
FR2864538B1 (fr) 2003-12-30 2006-03-03 Bayer Cropscience Sa Composes synthetiques utiles comme facteurs de nodulation des plantes legumineuses et procedes de preparation de tels composes
CN101203230A (zh) * 2005-04-01 2008-06-18 克里斯托弗·理查德·帕里什 用nod因子例如葡糖胺寡糖调节血管发生
US7485718B2 (en) 2005-06-16 2009-02-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Chemical synthesis of low molecular weight polyglucosamines and polygalactosamines
WO2007001283A2 (en) * 2005-06-16 2007-01-04 E.I. Dupont De Nemours And Company Chemical synthesis of low molecular weight polyglucosamines and polygalactosamines
WO2010049751A1 (en) * 2008-10-29 2010-05-06 Institut National De La Recherche Agronomique Lipochitooligosaccharides stimulating arbuscular mycorrhizal symbiosis

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102532207A (zh) * 2010-12-24 2012-07-04 大连中科格莱克生物科技有限公司 一类n-不饱和脂肪酸酰化壳寡糖及其制备和应用
CN102532207B (zh) * 2010-12-24 2014-11-26 大连中科格莱克生物科技有限公司 一类n-不饱和脂肪酸酰化壳寡糖及其制备和应用
CN105101972A (zh) * 2013-01-31 2015-11-25 先锋国际良种公司 用于改善植物生长和产量的合成型脂质几丁寡糖
CN107081110A (zh) * 2017-04-06 2017-08-22 扬州大学 一种部分接枝的壳寡糖表面活性剂及制备方法
CN107081110B (zh) * 2017-04-06 2019-01-11 扬州大学 一种部分接枝的壳寡糖表面活性剂及制备方法
WO2023147789A1 (zh) * 2022-03-15 2023-08-10 山东京博农化科技股份有限公司 一种聚合度可控的壳寡糖化学合成方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2348027B1 (en) 2013-10-23
KR20090023563A (ko) 2009-03-05
WO2007117500A2 (en) 2007-10-18
US20120004401A1 (en) 2012-01-05
AU2007235408A1 (en) 2007-10-18
JP2009533345A (ja) 2009-09-17
EP2010552B1 (en) 2011-07-06
EP2348028B1 (en) 2012-08-22
US8049002B2 (en) 2011-11-01
US20140303361A1 (en) 2014-10-09
US20090292115A1 (en) 2009-11-26
CA2644172A1 (en) 2007-10-18
AR060392A1 (es) 2008-06-11
US9090644B2 (en) 2015-07-28
US20070238872A1 (en) 2007-10-11
EP2348027A1 (en) 2011-07-27
WO2007117500A3 (en) 2008-04-03
EP2010552A2 (en) 2009-01-07
EP2348028A1 (en) 2011-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101421287A (zh) 脂壳寡糖的化学合成方法
Helm et al. Regioselective protection strategies for D-xylopyranosides
CN108558961B (zh) 类志贺邻单胞菌o51血清型o抗原寡糖化学合成方法
JPH09151187A (ja) ４′−デメチルエピポドフィロトキシン誘導体
JP3231765B2 (ja) デメチルエピポドフィロトキシンの製造方法
CN113527388A (zh) 一种β-2-脱氧糖、2-脱氧-2-叠氮糖和葡萄糖苷键立体选择性合成的方法
CN1012366B (zh) 胞嘧啶核苷的制备
CN110590872A (zh) 一种玫瑰红景天活性成分络塞维或洛塞啉的合成方法
KR101529061B1 (ko) 당류 구조물, 그리고 이러한 구조물의 제조 및 사용 방법
WO2007091040A2 (en) The preparation of thiosugars and their use
CN110642906B (zh) 一种天然产物香豆素酪胺糖苷化合物的全合成方法
Van Straten et al. Synthesis of a trisaccharide fragment corresponding to the lipopolysaccharide region of Vibrio parahaemolyticus
CN1331880C (zh) 一种喷脑皂甙的化学合成方法
BOCK et al. Synthesis of Tetrasaccharides Related to the 0-Specific Determinants of Salmonella Serogroups А, В and Dt
JPH0689041B2 (ja) オリゴガラクチュロン酸の製造法
Adinolfi et al. Reactivity of glycopyranosyl trichloroacetimidates with air-oxidised samarium diiodide in tetrahydrofuran
CN114591384A (zh) 区域选择性保护乳糖的合成及其在寡糖制备中的应用
Zeng et al. Synthesis of a hexasaccharide fragment of group E streptococci polysaccharide and the tetrasaccharide repeating unit of E. coli O7: K98: H6
GB2036007A (en) A Method for the Preparation of 2-chloro-2-deoxy Saccharides
CN111187312A (zh) 烷基麦芽糖苷表面活性剂的简便制备方法
Bobek Synthesis of C-aryl glycosides by coupling of higher order cuprates with sugar halides
JP2004099575A (ja) 新規ｄ−ガラクトサミン誘導体，およびそれを用いるムチンコア２クラスの合成法
JPH01316394A (ja) ハイグロマイシンの合成中間体
JPS63215688A (ja) フェノ−ル配糖体の製造法
JPH10195094A (ja) 新規な硫酸化及び燐酸化ガラクトース誘導体及びその製法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20090429