JP2009533345A - リポキトオリゴ糖の化学合成法 - Google Patents

Abstract

リポキトオリゴ糖の合成法が開発された。完全にアシル化されたオリゴグルコサミン前駆体が製造され、アミン保護フタロイル基を有するグルコサミンモノマーと反応させられる。フタロイル基の除去で、脂肪酸が末端グルコサミン単位上に付加され、リポキトオリゴ糖が形成される。本方法は、商業規模で用いるためにアレンジすることができる。

Description

本発明は、リポキトオリゴ糖の化学合成法、および得られる化学合成リポキトオリゴ糖に関する。本明細書に開示される方法は、脂肪酸が非還元端に縮合している低分子量Ｎ−アシルグルコサミン・オリゴマーの坦懐的合成を可能にする。本方法は、商業規模で行うことができる。

リポキトオリゴ糖は根粒バクテリア中に天然に作られ、根粒形成因子として機能する。バクテリアから分泌される根粒形成因子は、根での共生根粒形成につながるマメ科植物の根細胞で応答を引き出す。これらの根粒で窒素は固定され、栄養物として植物に提供される。マメ科植物根根粒形成の程度は、植物成長および生産性に直接結び付いている。

根粒形成因子リポキトオリゴ糖は、４または５つのβ１，４−結合Ｎ−アシル化グルコサミン残基の主鎖、キチン（ポリ−［１−４］−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）中にもまた見いだされる構造を有する。この主鎖はＮ−アシル化されており、それが作られる根粒菌種に依存して、両端に様々な置換基を持つことができる。幾つかの根粒菌では末端単位のＮ−アシル化は、バクセン酸（Ｃ１８：１Δ１１Ｚ）などの一般脂質代謝の脂肪酸によるものであり、他の根粒菌ではＮ−アシル化はＣ２０：３およびＣ１８：２などの多不飽和脂肪酸によるものである。

バクテリアの任意の１つの種で作られる根粒形成因子リポキトオリゴ糖は、完全には分離することができない、異なる置換を有する化合物の混合物である。幾つかの根粒形成因子リポキトオリゴ糖は化学合成されてきた。例えば、ニコラオウ（Ｎｉｃｏｌａｏｕ）ら著、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４（１９９２）、８７０１−８７０２ページ；イケシタ（Ｉｋｅｓｈｉｔａ）ら著、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃ１−Ｃ６（１９９５）；およびワング（Ｗａｎｇ）ら著、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１（１９９４）、６２１−６２８ページに記載されているように、リポキトオリゴ糖の小サンプルを製造するための様々な報告された方法がある。

Ｎ−アシルグルコサミンオリゴマーのリポキトオリゴ糖クラスを大量にそして経済的に製造するための方法に対するニーズは依然としてある。本発明は、これらのおよび他の目的に関する。

本発明の一態様は、構造：

（式中、個々の基Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は独立して、ＨおよびＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、アラルキル、モノ、ジまたはポリアルケニル、モノ、ジまたはポリアルキニル基から選択され、Ｒ^４は単糖類、サルフェートおよびホスフェートから選択され、そしてｎは０〜約２０である）
を有するリポキトオリゴ糖化合物の合成法であって、

ａ）構造Ｃ

（式中、Ｒ^１はＨ、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、およびアラルキル基から選択される）
の化合物を非プロトン性溶媒中で構造Ｂ

（式中、個々の基Ｒ^１およびＲ^２は独立して、ＨおよびＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、およびアラルキル基から選択され、Ｒ^４は、好適に保護された形態での単糖類、サルフェートおよびホスフェートから選択され、そしてｎは０〜約１９である）
と組み合わせ、そして該溶液を約０℃〜約−７８℃の温度でかき混ぜて第１混合物を形成する工程と、
ｂ）ａ）の混合物に、Ｎ−ハロイミドから選択された第１活性化剤を加えて第２混合物を形成する工程と、
ｃ）該第２混合物に、パーフルオロアルキルスルホン酸から選択された第２活性化剤を加え、そして場合によりメチルパーフルオロアルキルスルホネートから選択された試薬を加えて第３混合物を形成する工程と、
ｄ）該第３混合物を約０℃〜約−７８℃の温度で反応させてエステル基およびＮ−フタルイミド基を含む生成物を形成する工程と、
ｅ）ｄ）の生成物を単離する工程と、
ｆ）該エスエル基および該Ｎ−フタルイミド基をｅ）の単離生成物から除去して脱エステル化および脱Ｎ−フタルイミド生成物を形成する工程と、
ｇ）ｆ）の生成物を単離する工程と、
ｈ）ｇ）の単離生成物の末端糖単位のアミノ基を式Ｒ^１ＣＯＸ（式中、それぞれ、酸および酸ハロゲン化物について、Ｘ＝ＯＨまたはハライドであり、そしてＲ^１は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、モノ、ジまたはポリアルケニル、モノ、ジまたはポリアルキニル基から選択される）の酸または酸ハロゲン化物と選択的に反応させてリポキトオリゴ糖を形成する工程と、
ｉ）該リポキトオリゴ糖を単離する工程と
を含む方法である。

本発明の別の態様は、構造：

（式中、個々の基Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は独立して、ＨおよびＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、アラルキル、モノ、ジまたはポリアルケニル、モノ、ジまたはポリアルキニル基から選択され、Ｒ^４は単糖類、サルフェートおよびホスフェートから選択され、そしてｎは０〜約２０である）
を有するリポキトオリゴ糖化合物の合成法であって、

ａ）構造Ｄ

（式中、Ｒ^１はＨ、およびＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、およびアラルキル基から選択される）
の化合物を提供する工程と、
ｂ）構造Ｄの化合物のエステル基および内部Ｎ−フタルイミド基を除去する工程と、
ｃ）構造Ｄの化合物の内部糖単位上のアミノ基をアシル化剤と選択的に反応させてＮ−アシル誘導体生成物を製造する工程と、
ｄ）ｃ）のＮ−アシル誘導体生成物の末端糖単位上のシリル基ならびにエスエルおよびＮ−フタルイミド基を、該Ｎ−アシル誘導体生成物をフッ化テトラ−Ｎ−アルキルアンモニウムと反応させ、引き続き還流条件下にアミンまたはジアミンと反応させることによって除去して脱シリル化および脱Ｎ−フタルイミド化生成物を製造する工程と、
ｅ）ｄ）の脱Ｎ−フタルイミド化生成物の末端アミノ基を、カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキルベンゾトリアゾールで活性化された脂肪酸で、または、塩基触媒の存在下に、式Ｒ^１ＣＯＸ（式中、Ｘはハライドであり、そしてＲ^１はＨおよびＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、アラルキル、モノ、ジまたはポリアルケニル、モノ、ジまたはポリアルキニ
ル基から選択される）の酸ハロゲン化物でアシル化してリポキトオリゴ糖を形成する工程と、
ｆ）該リポキトオリゴ糖を単離する工程と
を含む方法である。

本発明の別の態様は、構造：

（式中、個々の基Ｒ^１およびＲ^２は独立して、ＨおよびＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール基から選択され、Ｒ^４は単糖類、サルフェートおよびホスフェートから選択され、そしてｎは０〜約１９である）
を有する化合物である。

本発明のさらなる態様は、構造：

で表される化学合成リポキトオリゴ糖を含む組成物である。

本発明は、リポキトオリゴ糖と呼ばれる、脂肪酸が非還元端上に縮合しているマルチグラム〜キログラム量の低分子量Ｎ−アシルグルコサミンポリマー（オリゴＮ−アシルグルコサミン）の合成法であって、商業的利用のために拡大可能である方法を提供する。本方法は簡単な精製手順の使用を可能にし、コストのかかる手が出せないクロマトグラフィー分離手順を必要としない。リポキトオリゴ糖のオリゴＮ−アシルグルコサミン部分は、貯蔵に安定であるモノマーの効率的なカップリングによって製造される。本明細書で以下に記載される、成長するポリマー鎖への特定タイプのモノマーの段階的な付加は画定された鎖長のポリマーの合成をもたらし、それに脂肪酸が結び付けられる。グルコサミンモノマー単位は、一つずつ互いに付加され、オリゴマー中の各グルコサミン単位を選択する機会を与え、選り抜きのグルコサミン単位への脂肪酸の組み入れをはじめとする、所望のアシル基の組み入れを可能にし、こうして生物学的評価のための多数の類似体の合成を可能にする。

構造：

（式中、個々の基Ｒ^１およびＲ^２は独立して、ＨおよびＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリールおよびアラルキル基から選択され、Ｒ^４は、それぞれが好適に保護された形態にある、単糖類、好適に保護されたサルフェートおよびホスフェート基から選択され、そしてｎは０〜約１９である）
を有する中間体もまた提供される。各グルコサミン単位は、本明細書で以下に記載されるように、鎖に別々に付加されるので、各グルコサミン単位上の個々のＲ^１またはＲ^２基は異なってもよい。本中間体はリポキトオリゴ糖を合成するのに有用である。

量、濃度、または他の値もしくはパラメーターが範囲か、好ましい範囲か好ましい上方値と好ましい下方値とのリストかのどれかとして本明細書に列挙されるとき、列挙される量、濃度、または他の値もしくはパラメーターは、かかる範囲が別々に開示されているかどうかにかかわらず、任意の上方範囲限界または好ましい値と任意の下方範囲限界または好ましい値との任意のペアから形成される全ての範囲を含むことを意図される。数値の範囲が本明細書に列挙される場合、特に明記しない限り、該範囲はそれの終点、ならびに該範囲内の全ての整数および分数を含むことを意図される。本発明の範囲が範囲を画定するときに列挙される具体的な値に限定されることは意図されない。

特に明記しない限り、以下の用語は、本明細書で用いるところでは、以下の意味を有する。

用語「貯蔵安定な」は、本明細書で用いるところでは、化合物が室温での貯蔵で、そして実験室貯蔵条件の水分および空気に曝されたときに無傷のままであることを意味する。

用語「大規模」は物質の数十グラム〜キログラム量を意味する。

用語「低分子量ポリマー」は、長さが１単位より大きく約５０単位以下であるモノマー単位の鎖を意味する。オリゴマーは２〜約２２単位のポリマーである。それ故オリゴ−Ｎ−アシルグルコサミンは、例えば、低分子量ポリマーのタイプである。

用語「結合位置」は、グリコシル結合の一部である炭素の位置を意味する。１，４−結合では、結合位置は１グルコシド上の１および結合グリコシド上の４である。

用語「非結合位置」は、グリコシル結合の一部ではない炭素の位置を意味する。例えば、１，４−結合では、２，３および６位は非結合位置である。

用語「チオグリコシド供与体」は、Ｃ−１位でグリコシル結合に関与するグリコシル分子を意味する。

用語「グリコシル受容体」は、グリコシル結合に関与するであろう位置にヒドロキシル基を有する、かつ、その酸素を通して供与体からのＣ−１グリコシル残基に接続するグリコシル分子を意味する。β１，４−結合では、グリコシル受容体は４位にヒドロキシル基を有する。グリコシル受容体は、シングルユニット鎖または低分子量ポリマーであるマルチプルユニット鎖であってもよい。

用語「好適に保護されたチオグリコシド供与体」は、グリコシド結合の形成後に非結合位置になる位置に保護基を有するチオグリコシドを意味する。保護基は、それらのサイトでの反応を防ぐために用いられる。

用語「好適に保護されたグリコシド受容体」は、グリコシド結合の形成後に非結合位置になる位置に保護基を有するグリコシドを意味する。保護基は、それらのサイトでの反応を防ぐために用いられる。

本発明の一実施形態は、構造Ａ：

（式中、個々の基Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は独立して、ＨおよびＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、アラルキル、モノ、ジまたはポリアルケニル、モノ、ジまたはポリアルキニル基から選択され、Ｒ^４は単糖類、サルフェートおよびホスフェートから選択され、そしてｎは０〜約２０である）
の化合物の合成法を含む。各グルコサミン単位は、本明細書で以下に記載されるように、別々に鎖に付加されるので、各グルコサミン単位上の個々のＲ^１、Ｒ^２またはＲ^３基は異なってもよい。

好ましい実施形態では、構造Ａのものをはじめとする、本明細書に開示される化合物の合成は、本方法が商業規模で実施されることを可能にする十分に高い収率でおよび十分な効率で合成される。

構造Ａの化合物の一合成法では、オリゴＮ−アシルグルコサミン前駆体が合成され、それに脂肪酸が付加されて構造ＡでのＲ^３基を形成する。この合成は、構造Ｂの完全にアシル化されたオリゴＮ−アシルグルコサミンを製造し、次にチオグリコシド化合物Ｃでのグリコシル化によってＮ−フタロイル保護グルコサミンモノマーをβ１，４−結合で付加することによって可能にされる。エステルおよびＮ−フタロイル基はグリコシル化生成物から除去され、化合物Ａを得るために末端単位のアミノ基への脂肪酸の付加がそれに続く。

末端フタロイル−保護グルコサミンモノマーが付加される構造ＢのオリゴＮ−アシルグルコサミンは、β１，４−結合によって結び付けられている２〜約２１個のグルコサミン単位からなってもよい。

（式中、個々の基Ｒ^１およびＲ^２は独立して、ＨおよびＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、およびアラルキル基から選択され、Ｒ^４は、それぞれが好適に保護された形態にある、単糖類、サルフェート基およびホスフェート基から選択され、そしてｎは０〜約１９である）
各グルコサミン単位は、本明細書で以下に記載されるように、別々に鎖に付加されるので、各グルコサミン単位上の個々のＲ^１またはＲ^２基は異なってもよい。

オリゴＮ−アシルグルコサミンに結び付けられることになるＮ−フタロイル保護グルコサミンモノマーは構造Ｃとして示される。

（式中、Ｒ^１基は独立して、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、およびアラルキル基から選択される）

構造Ｂの合成のために必要とされるオリゴグルコサミンは、参照により本明細書に援用される、同時係属米国特許出願第１１／１５４４５７号明細書（代理人整理番号第ＣＬ２６９５）に記載されているヘキソース間のグリコシド結合の形成法を用いて製造される。オリゴグルコサミンは次の通り合成される。

構造（Ｉ）で表されるチオグリコシドモノマーは、Ｎ−ハロイミドから発生する活性化剤と、おおよそ等モル量の強プロトン酸とを使用することによって構造（ＩＩ）で表される位置４グリコシル受容体に非常に効率的に結合する。

式中、Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立して、ＨおよびＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、およびアラルキル基から選択され、
Ｒ^３およびＲ^４はそれぞれ独立して、一官能性アシル、二官能性アシル、フタロイル、トリクロロアセチル、およびテトラクロロフタロイル基から選択され、
そしてＲ^５、Ｒ^６、Ｒ^７およびＲ^８はそれぞれ独立して、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリ
ール、およびアラルキル基から選択される。
好ましくはＲ^１およびＲ^２はフェニル基である。
好ましくはＲ^３およびＲ^４はフタロイル単位に由来するアシル基である。
好ましくはＲ^５はｐ−トルイル基である。
好ましくはＲ^６およびＲ^７はメチル基である。
好ましくはＲ^８は第三ブチル基である。

位置４グリコシル受容体は構造（ＩＩ）：

（式中、Ｒ^１はアシル基および保護されたグリコシル単位から選択され、
Ｒ^２はＨおよびＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、およびアラルキル基から選択され、
Ｒ^３およびＲ^４はそれぞれ独立して、一官能性アシル、二官能性アシル、フタロイル、トリクロロアセチル、およびテトラクロロフタロイル基から選択され、そしてＲ^５はＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、およびアラルキル基から選択される。
好ましくはＲ^１およびＲ^２はフェニル基である。
好ましくはＲ^３およびＲ^４はフタロイル単位に由来するアシル基である。
好ましくはＲ^５はメチル基である）
で表される。

オリゴグルコサミン前駆体の合成に用いられるグリコシル化法は次の通り例示される。モノマー（ＩＩ）の単位、例えば分子、グリコシル受容体は、モノマー（Ｉ）の単位、チオグリコシド供与体が付加されてポリマー鎖を延ばす最初の単位を提供する。モノマー（Ｉ）および（ＩＩ）は、商業的に入手可能であるＤ−グルコサミン塩酸塩から製造することができる。１，４−結合グルコサミンの合成用のモノマー（Ｉ）を合成するため、Ｄ−グルコサミン塩酸塩は、アミノ基を保護するために無水フタル酸を使用してフタロイル基で誘導体化される（実施例１での生成物２）。ヒドロキシル基が次にアセチル化によって保護され（実施例２での生成物３）、生成物は結晶化によって精製される。次に、ベンゼンチオール基が１位に付加され（実施例２での生成物４）、生成物はプロトン性溶媒で洗浄することによって精製される。生じた生成物は脱アセチル化され（実施例２での生成物５）、ベンゾイル保護基が３および６ヒドロキシル位で付加され（実施例２での生成物６）、生成物は結晶化によって精製される。最後に、ｔ−ブチルジメチルシリル（ｔＢＤＭＳ）基と言われるケイ素保護基が、生成物６の４−ヒドロキシル基での一時的な保護基として付加され、下の反応１でモノマー（Ｉ）として示される化合物（Ｓ−（ｐ−トルイル）−４−Ｏ−（ジメチル−ｔ−ブチルシリル）−２−デオキシ−３，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２−フタルイミド−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド）を生み出す。この化合物は、好適に保護されたチオグリコシド供与体である、モノマー（Ｉ）の一例を表す。モノマー（Ｉ）の製造に用いられる個々の反応のそれぞれは当業者に公知である。反応と精製との組み合わせは、本発明の方法に使用されるモノマー（Ｉ）の大規模製造になじみやすい。生じたモノマー（Ｉ）は、オリゴグルコサミンの合成用の構成単位を提供する。

当業者は、他の保護基がグルコサミン−モノマー（Ｉ）の中間体の製造に使用され得ることを知るであろう。例えば、アミンは、一官能性アシル、二官能性アシル、トリクロロアセチルまたはテトラクロロフタロイル基で保護することができ、ヒドロキシル基は、エステル基の一部としてのＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、またはアラルキル基で保護することができる。同様に、シリル基は、例えば、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、およびアラルキル基で置換された、任意の三置換ケイ素であることができる。

１，４−結合グルコサミンの合成用のモノマー（ＩＩ）を合成するために、モノマー（Ｉ）について用いられるものと類似の一連の反応が用いられる。Ｄ−グルコサミン塩酸塩のフタロイル誘導体（実施例２での生成物３）がアセチル化され、１位ヒドロキシルでメチル化され（実施例３での生成物７）、次に他のヒドロキシルで脱アセチル化される（実施例３での生成物８）。ベンゾイル基が生成物８に３および６位で付加され、モノマー（ＩＩ）を生み出す。あるいはまた、ヒドロキシル保護単糖類が６位に付加されてもよい。これらの個々のステップのそれぞれは、当業者に周知の反応条件を用いて実施される。生じたモノマー（ＩＩ）は、モノマー（Ｉ）についての通りに製造された分子が低分子量グルコサミンの合成のために付加される最初の単位を提供する。下の反応１に示される化合物（メチル２−デオキシ−３，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシド）は、４位にヒドロキシル基を含有する好適に保護されたグリコシル受容体である、モノマー（ＩＩ）タイプ化合物の一例を表す。

当業者は、他の保護基がモノマー（ＩＩ）の中間体の製造に使用され得ることを知るであろう。例えば、アミンは、一官能性アシル、二官能性アシル、トリクロロアセチルまたはテトラクロロフタロイル基で保護されてもよく、ヒドロキシル基は、エステル基の一部としてのＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、またはアラルキル基で保護されてもよい。

反復グリコシル化および生成物多糖類からのケイ素保護基除去によって、グリコシル単位は所望の長さに付加することができる。オリゴグルコサミン鎖＋モノマー（Ｉ）のカップリングだけでなく、モノマー（Ｉ）と（ＩＩ）とのカップリングも、反応で基質濃度を飽和させるもとでチオグルコシド活性化剤を使用して実施される。チオグリコシド活性化剤は、Ｎ−ハロイミドと強プロトン酸とから発生する。例えば、Ｎ−ヨードコハク酸イミドおよびＮ−ブロモコハク酸イミドなどのＮ−ハロコハク酸イミドを、トリフリック酸（トリフルオロメタンスルホン酸）および他のパーフルオロアルキルスルホン酸などの強プロトン酸と組み合わせて活性化剤として使用することができる。トリフリック酸は単独でチオグリコシドを活性化させるのに十分であるが、トリフリック酸とメチルトリフレート（メチルトリフルオロメタンスルホネート）との組み合わせ使用は、グリコシル化反応に有害であるかもしれない副生物の排除を容易にする。このように、メチルトリフレートはモノマー（Ｉ）を活性化させるのに十分ではないが、トリフリック酸／メチルトリフレートの組み合わせは、反応および精製条件にとって最適な効率を与える。

モノマー（Ｉ）に対して１〜１．８モル当量でのＮ−ハロコハク酸イミドと、（モノマー（ＩＩ）に対して）モル当量のメチルトリフレートと一緒に、トリフリック酸がその一例である、（モノマー（ＩＩ）に対して）おおよそモル当量の量の任意のパーフルオロアルキルスルホン酸との使用は、効率的なグリコシル化を提供する。約０．２５〜約１．０モル当量の量でのトリフリック酸の使用を、効率的なグリコシル化のために用いることができる。カップリング効率は、出発原料からの所望の生成物の精製の容易さに直接関係する。このように、それぞれおおよそモル当量の量のトリフリック酸およびメチルトリフレートが、容易に精製できる生成物を形成するために特に役に立つ。かかる高濃度のトリフリック酸は、特に反応が低温で実施されるときに、糖分子を開裂させない。

上記の活性化剤を使用すると、カップリング反応は、反応１に示されるように、定量まで進行することができ、グリコシド結合を形成する。二量体低分子量ポリグルコサミンを形成するグルコサミンモノマー（Ｉ）とグルコサミンモノマー（ＩＩ）との実例反応が示される。グリコシル受容体（このケースではモノマー（ＩＩ））へのモノマー（Ｉ）のカップリングはステップＡである。

反応１
加えて、最小量の反応溶媒の使用は、反応体を飽和レベルにおよび高効率濃度に保ち、より効率的なグリコシル化をもたらす。活性化剤がグリコシドに加えられ、カップリング反応は低温で実施される。約０℃〜約−７８℃の温度が本反応に好適である。本反応のための温度は約−２０℃〜約−７０℃であることが好ましい。温度が約−５０℃〜約−６０℃であることがより好ましい。反応時間は約１５分〜約８時間である。反応は望ましくは、全ての潜在的なグリコシド結合が形成されるのに十分な時間行われる。約４〜約６時間の反応時間が好ましい。

モノマー（Ｉ）、好適に保護されたチオグリコシド供与体と、モノマー（ＩＩ）、位置４グリコシル受容体とのカップリング方法の一般的な説明は次の通りである。モノマー（ＩＩ）（約１．０当量）とモノマー（Ｉ）（約１〜２当量が好ましくて、少なくとも１当量〜約３当量以下）とは、塩化メチレン、ジエチルエーテル、アセトニトリル、およびベンゾトリフルオリドなどの、最小限の非プロトン性溶媒に溶解される。最も好ましい溶媒は塩化メチレンである。溶液を、かき混ぜながら窒素雰囲気下に約−５５℃〜−６０℃に冷却する。かき混ぜは、振盪または撹拌などの、溶液の成分を十分に混合するいかなる方法によってもよい。典型的には、激しい撹拌が用いられる。粉末化Ｎ−ヨードコハク酸イミド（ＮＩＳ）が冷溶液に加えられる。約１５分後に、最小限の非プロトン性溶媒、例えば、塩化メチレンに溶解された、トリフリック酸（約１．０当量）などのパーフルオロアルキルスルホン酸とメチルトリフルオロメタンスルホネート（約１．０当量）との溶液が、反応温度を約−６０℃より下に維持しながら滴加される。添加後に、反応混合物は、撹拌しながら同じ温度に約６時間維持され、次に飽和チオ硫酸ナトリウムと飽和炭酸水素ナトリウム溶液との１：１混合物上に直接注がれる。塩化メチレンなどの追加の溶媒が、反応混合物を希釈し、そして反応フラスコの洗浄を提供するために用いられる。溶液は十分に混合され、有機層が分離される。有機層は次に順次、１％〜６％の漂白剤溶液、好ましくは０．６％〜３％の漂白剤溶液、次に水、そして最後に飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄される。生成物は、減圧での溶液の濃縮によって回収される。不純物は、物質をジエチルエーテルまたは酢酸エチルに溶解させ、引き続くｎ−ヘキサンでの沈澱によって除去される。本発明の範囲から逸脱することなく、当業者に公知の変形が本方法に導入され得ることは理解されるべきである。

記載されるカップリング反応の効率は、カップリング後の反応混合物中の望ましくない副生物および出発原料のレベルを下げ、それによって選択的溶媒抽出法による存在するマイナー不純物の除去を容易にする。シリカゲルクロマトグラフィーの普通に用いられる、そして高くつく精製法が用いられてもよいが、これらの方法の必要性はない。有機溶媒での選択的洗浄は、大規模生産に有用である簡略化された精製法を提供する。精製中の洗浄に有用な溶媒には、ジエチルエーテルおよびヘキサン−酢酸エチル混合物が含まれる。生成物は不溶であるが、不純物および副生物は可溶である、溶媒の任意の組み合わせが使用されてもよい。所望の生成物が不溶である溶媒を使用する、過剰のモノマー（Ｉ）に由来する不純物のこの選択的抽出は、生成物の単離にとって非常に好ましい方法である。

カップリングおよび任意の精製後に、鎖延長が実施される。二糖類生成物の延長前に、ケイ素ブロッキング基が、下の反応２、ステップＢに示されるようにポリグルコサミン結合位置から除去される。ケイ素基は、例えば、最小限の無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解させ、次にＴＨＦ中の酢酸（２〜３当量）およびフッ化テトラｎ−ブチルアンモニウム溶液（１Ｍ、２〜３当量）と反応させることによって除去することができる。反応進行は、反応混合物のＴＬＣかＮＭＲかのいずれかによって監視されてもよい。ケイ素保護基の追加の除去方法は当業者に周知である。

完了すると直ぐに、反応混合物は濃縮乾固され、残留物は、塩化メチレンなどの溶媒に溶解され、水、１ＭのＨＣｌ水溶液、０．６〜３％漂白剤溶液（暗茶色を除去するための）、および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄される。残った有機層は無水硫酸マグネシウム上で乾燥され、濃縮乾固される。生成物の精製は典型的には、ケイ素不純物だけでなく前のステップからの残存モノマーの除去を確実にする、例えば、ジエチルエーテルまたはｎ−ヘキサン−酢酸エチル混合物での沈澱によって成し遂げられる。生成物は不溶であるが、不純物および副生物は可溶である溶媒の任意の組み合わせが、沈澱のために使用されてもよい。

追加のモノマー（Ｉ）、好適に保護されたチオグリコシド供与体が次に、上記のような活性化剤を使用してブロックされていない二糖類にグリコシル結合によって付加される。二糖類が、上記の一般カップリング手順に従って、反応２に示されるように、モノマー（ＩＩ）の代わりに使用される。ステップＢでのケイ素ブロッキング基の除去および三量体低分子量ポリグルコサミンを形成するグルコサミンモノマー（Ｉ）の付加のグルコサミン二量体の実例反応が示される。グリコシル受容体（実例反応では、グルコサミン二量体）へのモノマー（Ｉ）のカップリングはステップＡである。

反応２
有機溶媒洗浄による精製はまた上記の通りである。鎖延長のさらなるラウンドは、ケイ素ブロッキング基除去およびモノマー（Ｉ）の付加によって成し遂げられる。本方法は、チオグリコシドとポリグルコサミンとがｘ＋１（ここで、ｘは出発ポリグルコサミンの長さであり、１は１モノマー単位である）の長さを有するベータ結合ポリグルコサミンを形成するような段階的な方法で繰り返される。各ステップでの反応はほぼ定量的であるので、各ステップの完了は、単一鎖長を有する約８０％より多い分子を含有する生成物をもたらす。このように生成物はベータ結合オリゴグルコサミン分子の単一アノマーに富む。

本ステップは、リポキトオリゴ糖の合成に使用される前駆体オリゴグルコサミンを形成するのに適切な単位長さのものであるポリグルコサミン鎖が製造されるまで繰り返される。ポリグルコサミン鎖長は２〜約２１単位であってもよい。約３〜約７の単位の鎖長が本方法での使用に特に好適である。

前駆体オリゴグルコサミン上のベンゾイルおよびフタルイミド保護基は次に、それらのアセテートに変換される。保護基は、当業者に周知の方法によって除去される。２〜５の残基を含有するポリマーについては、これは２ステップ手順で実施される。先ず、脱Ｏ−ベンゾイル化は、メタノール中のナトリウムメトキシドを使用する、当業者に周知である、ゼムプレンス（Ｚｅｍｐｌｅｎｓ）の方法によって成し遂げることができる。フタロイル基は、当業者に周知のように、エチレンジアミン−誘導体化メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）樹脂（Ｐ．スタンギア（Ｐ．Ｓｔａｎｇｉｅｒ）、Ｏ．ヒンヅガウル（Ｏ．Ｈｉｎｄｓｇａｕｌ）著、Ｓｙｎｌｅｔｔ．２（１９９６）、１７９−１８１ページ）を使用することによって除去することができる。あるいはまた、ベンゾイルおよびフタルイミド基の除去は、保護された生成物を還流温度でヒドラジンまたはｎ−ブタノール中のヒドラジンで処理すること、引き続き生成物ポリヘキソサミンの水での選択的抽出によってシングルステップで成し遂げることができる。本シングルステップ方法は、ゼムプレンス条件下でのそれらの不完全な脱ベンゾイル化とメタノールおよびｎ−ブタノール中でのそれらの溶解度の欠如とのために４より大きい長さのポリマーにとって好ましい。シリル保護基は、鎖延長の終わりに末端４−ヒドロキシル基上に残っている。

生じた化合物のヒドロキシルおよびアミノ基は次に、当業者に周知の手順を用いてアシル化される。アセチル基などの簡単なアシル基については、アシル化は、当業者に周知であるように、少量の４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを添加して、ピリジンおよび無水酢酸の添加によって実施することができる。アセチルまたはプロピオニル基などの、簡単なアシル基の酸無水物は商業的に入手可能であり、容易に使用される。酸無水物が入手できない他のタイプのアシル基については、相当する酸塩化物が使用される。ヒドロキシル官能基でのアシル基は除去されるが、リポキトオリゴ糖分子で見られるように、アミノ基でのアシル基は永久にとどまることが望ましい。また必要ならば、当業者に周知の方法によって非常に反応性のアミノ基を先ずアシル化し、引き続くヒドロキシル基のアシル化によるアミノおよびヒドロキシル官能でのアシル基の差別導入があってもよい。

ケイ素ブロッキング基は次に、ポリグルコサミン鎖延長反応において前に記載されたように生じた化合物から除去される。生じたＮ−およびＯ−アシルオリゴグルコサミン化合物は、上の構造Ｂとして示される。構造Ｂの化合物は次に、構造Ｃ（保護フタロイル基を有する、上に示される構造）の化合物と反応させられる。構造Ｃの化合物は、モノマー（Ｉ）の合成における中間体であり、その製造は、構造Ｃに示されるものと同じ化合物である、実施例２での生成物４についての通りである。構造Ｂの化合物と構造Ｃの化合物との反応は、オリゴグルコサミン鎖＋モノマー（Ｉ）のカップリングだけでなく、モノマー（Ｉ）と（ＩＩ）とのカップリングについて上に記載されたように実施される。生じた結合した構造Ｂ＋Ｃ生成物は、結合したモノマー（Ｉ）＋（ＩＩ）生成物について上に記載されたように単離される。

結合した構造Ｂ＋Ｃ生成物の保護Ｎ−フタルイミド基およびエステル基は、当業者に周知の条件を用いる２ステップ反応で除去される。エステル基が先ず、アルコール中の金属アルコキシドでのエステル交換によって、具体的にはエステルをメタノール中のナトリウムメトキシドで処理することによって除去される。Ｎ−フタロイル基が次に、還流条件下にアミンまたはジアミンと反応させることによって、具体的には脱エステル化生成物をメタノールおよびエタノールなどのアルコール溶媒中でヒドラジンで処理することによって、または脱エステル化生成物をエチレンジアミン誘導体化メリフィールド樹脂で処理することによって除去される。フタルイミド基が除去された脱エステル化生成物は、水で抽出し、そして塩化メチレンなどの、不純物を抽出することができる溶媒で水性層を洗浄することにより不純物を除去することによって単離される。生じた化合物は末端糖単位上に遊離アミノ基を有するが、全ての他の窒素はアシル化されている。

全ての他の窒素はアシル化されているが、遊離アミノ基を末端糖単位上に有する化合物の別の製造方法は、構造Ｄ：

（式中、Ｒ^１はＨおよびＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、およびアラルキル基から選択される）
の化合物から出発して実施されてもよい。

構造Ｄで表される化合物は、生成物１３を合成するための本明細書での実施例に記載される方法に従って合成することができる。エステル基は、還流条件下にアルコール中の金属アルコキシドを使用するエステル交換条件下に除去される。内部Ｎ−フタルイミド基は、エチレンジアミン樹脂と反応させることによって除去される。内部アミノ基のアシル化は当業者に周知の方法によって実施され、フッ化テトラ−Ｎ−アルキルアンモニウムと反応させ、引き続き還流条件下でアミンまたはジアミンと反応させることによって末端糖単位上のシリル基ならびにエステルおよびＮ−フタルイミド基を除去して遊離アミノ基を末端糖単位上に含有する脱シリル化および脱Ｎ−フタルイミド化生成物を製造することがそれに続く。

遊離アミノ基は、式Ｒ^１ＣＯＸ
（式中、それぞれ、酸および酸ハロゲン化物について、Ｘ＝ＯＨまたはハライドであり、Ｒ^１はＨ、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、ジエニル、およびトリエニル基から選択される）
の酸または酸ハロゲン化物と選択的に反応させられる。

典型的には酸ハロゲン化物は塩化物試薬であるが、臭化物およびヨウ化物もまた使用されてもよい。

保護Ｎ−フタルイミド基およびエステル基が除去された、結合した構造Ｂ＋Ｃ生成物の末端糖上の遊離アミノ基とＲ^１ＣＯＸとの反応は、当業者により周知の方法（その幾つかは国際公開第２００５／０６３７８４ Ａ１号パンフレットに記載されている）によって行われてもよい。例えば、反応体はＤＭＦ−水混合物、または水とメタノールもしくはエタノールとの混合物に溶解されてもよい。酸ハロゲン化物が反応に使用されるとき、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素塩、トリエチルアミン、またはアルカリもしくはアルカリ土類金属の水酸化物などの塩基触媒が使用される。酸がアミド化反応に用いられるとき、それは、エチル−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩などのカルボジイミドの存在下に実施され、そしてＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールが反応を促進するために添加されてもよい。生成物は、酸性樹脂カラムを通しての濾過、引き続く乾燥によるなど当業者に公知の方法によって単離されてもよい。反応は、リポキトオリゴ糖と呼ばれる、構造Ａ（上に示される）を有する、脂肪酸縮合物が末端残基のアミノ基に結合しているＮ−アシルグルコサミン化合物をもたらす。本方法で製造される化合物は、１つもしくはそれ以上の脂肪酸基を内部残基上にもまた有するかもしれない。構造Ｂの化合物の合成中に、グルコサミンモノマー単位は、一つずつ互いに付加され、オリゴマー中の各グルコサミン単位を選択する機会を与え、そして選り抜きのグルコサミン単位への脂肪酸のそれをはじめとする、所望のアシル基の組み入れを可能にする。このように脂肪酸は、末端グルコサミン単位に脂肪酸を付加することに加えて、内部位置でグルコサミン単位と共に組み入れられてもよい。

リポキトオリゴ糖は、窒素固定バクテリアによるマメ科植物根の根粒形成に関与するシグナル伝達因子である天然の根粒形成因子を含む。根粒形成の増加、それによる植物への窒素供給の増加によって、リポキトオリゴ糖根粒形成因子は、植物成長および収量を高める。リポキトオリゴ糖は、植物の根、葉、または種子を処理するために使用されてもよい。本化合物は、土壌中に、植物枝葉に、または種子コーティングとして適用されてもよい。マメ科植物および非マメ科植物の両方とも、これらの処理から恩恵を受けるかもしれない。

本明細書に開示される方法を用いて製造された個々のリポキトオリゴ糖は、例えばデモント−カウレット（Ｄｅｍｏｎｔ−Ｃａｕｌｅｔ）ら（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １２０（１９９９）、８３−９２ページ）に記載されているように、当業者によってマメ科植物根根粒形成への影響について容易に試験されるかもしれない。また、マメ科植物および非マメ科植物の植物成長増進および収量向上における、本明細書に開示される方法を用いて製造された個々のリポキトオリゴ糖の有効性は、当業者に周知であるように、容易に試験されるかもしれない。このように公知の天然根粒形成因子には相当しないが、根粒形成刺激活性、植物成長増強活性、または収量増強活性を有する構造Ａの化合物は、本明細書に開示される方法を用いて製造され、そしてこれらの用途について試験することによって容易に同定されるかもしれない。

一般方法および原材料
明記しない限り、試薬は全てアルドリッチ・ケミカル社（ミズーリ州セントルイス）（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から購入した。薄層クロマトグラフィーは、シリカゲル（Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ）６０Ｆ_２５４のプレコートプレート（ＥＭサイエンス（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ））上で行い、スポットを、エタノール中５％硫酸を含有するスプレー、引き続く加熱で目に見えるようにした。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０（２３０〜４００メッシュ、ＥＭサイエンス）で行った。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは５００ＭＨｚで記録した。有機溶媒中の水素化学シフトは、５．３６ｐｐｍの基準化学シフトの、重水素化塩化メチレンに対して表す。重水または重メタノール中の化合物の溶液については、水素化学シフト値は、ＨＯＤシグナル（２９６°Ｋで４．７５ｐｐｍ）に対して表す。

実施例１
２−デオキシ−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−フタルイミド−Ｄ−グルコピラノースの合成

Ｄ−グルコサミン塩酸塩（化合物１、１．０Ｋｇ）をメタノール（５．０Ｌ）に懸濁させ、激しく撹拌した。ＮａＯＨ（１８４．８ｇ）を最小限の脱イオン水に溶解させ、Ｄ−グルコサミン／メタノール懸濁液に加えた。懸濁液を１５分間撹拌し、不溶性物質（塩化ナトリウム）を真空濾過によって濾別した。形成される理論量のＮａＣｌは約２７０ｇであるはずである。

濾液に無水フタル酸（３４２ｇ）を加え、溶液を、固体のほとんどが溶解するまで（約３０分）撹拌した。次にトリエチルアミン（４６８ｇ）の添加がこれに続き、１０〜１５分間撹拌した。生じた透明な溶液に、無水フタル酸の別の部分（３４２ｇ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌するに任せた。生成物は通常２時間後に沈澱し始めた。

沈澱生成物を濾過し、生成物から黄色を除去するために残渣を最小限の氷、冷メタノールで洗浄した。残渣を次に、固体を完全に浸すのに十分な溶媒をフィルターに加えて、アセトニトリルで３回洗浄し、高真空下に室温で乾燥させた。白色固体、生成物２の重量は９５４ｇであった。^１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）：７．７４−７．５６（フタルイミド水素），５．４２（Ｈ−１α），４．９４（Ｈ−１β），４．１７および４．０１（Ｈ−６），３．２７（Ｎ−エチル基のＣＨ_２），１．３５（Ｎ−エチル基のＣＨ_３）。

上記からの生成物２（１．０１Ｋｇ、２バッチから製造した）を、オーバーヘッド電気撹拌機、Ｎ_２入口および添加漏斗をセットした１０リットルの三口丸底フラスコに入れた。無水酢酸（３Ｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（１．０ｇ）をフラスコに加え、激しく撹拌した。ピリジン（２．８Ｌ）をゆっくり加え、反応混合物を室温で２日間撹拌した。反応混合物を氷水（４Ｌ）で反応停止し、生成物を塩化メチレンで抽出した。有機層を塩酸水溶液で、次に飽和炭酸水素ナトリウム溶液で繰り返し洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮乾固した。生成物を熱エタノールから再結晶した。再結晶生成物３の重量は７０１ｇであった。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_２Ｃｌ_２）δ：７．９１−７．８０（フタルイミド水素），６．６２（Ｈ−１），５．５９（Ｈ−３），５．２１（Ｈ−４），４．４７（Ｈ−２），４．３６および４．１６（Ｈ−６），４．０６（Ｈ−５），２．１２，２．０６，２．０２，１．８８（アセチルメチル基）。このように上記のＮＭＲ化学シフトデータは、実施例２で下に示される、生成物３、２−デオキシ−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−フタルイミド−Ｄ−グルコピラノースの構造を検証した。

実施例２
モノマー（Ｉ）の合成
中間生成物４の製造

生成物３（４６４ｇ）をトルエンに溶解させ、そして溶媒を蒸発させた。これを繰り返し、残った固体を高真空ラインに一晩置いた。

乾燥固体を最小限の塩化メチレン（約６００ｍＬ）の溶解させ、十分に撹拌した。これに、４−メチルベンゼンチオール（１８１ｇ、１．４５モル、１．５当量）を加え、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（ＢＦ_３−エーテラート、１６５ｇ、１．１６モル、１．２当量、１８０分にわたって）の滴加がそれに続いた。反応混合物を一晩撹拌した。白色結晶が朝に形成し、そのとき撹拌を停止した。結晶を濾過し、生成物４Ａを生じさせた。濾液を塩化メチレンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液、水、次に炭酸水素塩溶液で順次洗浄し、乾燥させて生成物４Ｂを生じさせた。４Ａおよび４Ｂ生成物の両方を無水メタノールで十分に洗浄し、真空下に乾燥させた。４Ａおよび４Ｂ生成物のＮＭＲスペクトルは同一であったので、これら２つを組み合わせた（生成物４、４２６．３ｇ）。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_２Ｃｌ_２）δ：７．９６−７．８０（フタルイミド水素），７．３６および７．１３（Ｓ−芳香族水素），５．７８（Ｈ−３），５．６９（Ｈ−１），５．１３（Ｈ−４），４．３３（Ｈ−２），４．３０および４．１２（Ｈ−６），３．９３（Ｈ−５），２．３６（Ｓ−Ｐｈ−Ｍｅ基），２．１３，２．０４，１．８５（アセチル基のメチル）。このようにＮＭＲスペクトルは、上に示されるような、生成物４の構造を検証した。

中間生成物５の製造

生成物４（３５０ｇ）をほぼ４Ｌの乾燥メタノールに懸濁させた。これに、３５ｍＬの０．５Ｍナトリウムメトキシド溶液を加え、溶液は直ちに塩基性になった。懸濁液を一晩室温で撹拌させたままにした。沈積した固体を濾過し、ジクロロメタンで洗浄し、純生成物５（２３２ｇ）を生じさせた。濾液をスルホン酸樹脂で中和し、濃縮乾固した。乾燥固体を塩化メチレンで洗浄し、乾燥させ、不純な化合物５（４３．８ｇ）を生じさせた。純５の^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）δ：７．８７−７．７６（フタルイミド水素），７．２２および６．９９（Ｓ−芳香族水素），５．４６（Ｈ−１），４．１８（Ｈ−２），４．０３（Ｈ−３），３．８９および３．７０（Ｈ−６），３．３９（Ｈ−５），３．３７（Ｈ−４），２．２２（Ｓ−Ｐｈ−Ｍｅ基）。このようにＮＭＲスペクトルは、上に示されるような、生成物５の構造を検証した。

中間生成物６の製造

生成物５（２９５ｇ、６３８ミリモル）を乾燥トルエン（１Ｌ）に懸濁させ、真空下に蒸発させた。この手順を、反応に有害であるメタノール汚染物質の除去を確実にするためにもう１回繰り返した。計２６５グラムを回収した。トルエン蒸発後の残留物を、オーバーヘッド撹拌機を備えた三口フラスコ中で塩化メチレン（３Ｌ）に懸濁させ、懸濁液を乾燥窒素雰囲気下に撹拌した。フラスコを氷浴で冷却し、次の試薬を加えた：ピリジン＝１２６ｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン＝５００ｍｇ、および塩化ベンゾイル：１７１ｇ（添加漏斗を用いて６０分にわたって滴々ゆっくり加えた）。反応混合物は乳白色であったが、全ての塩化ベンゾイルを加えたときに透明になり始めた。反応物を室温で１８時間撹拌するに任せた。反応物を塩化メチレンで希釈し、水（２×）、１Ｍ水性ＨＣｌ（２×）、次に飽和ＮａＨＣＯ_３で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させた。

粗生成物を８リットルの熱ＥｔＯＨで再結晶し、結晶を濾過し、ＥｔＯＨ中で洗浄し、クロップ６Ａ（２２５ｇ）を生じさせた。濾液を濃縮乾固し、クロップ６Ｂ（１３１ｇ）を生じさせた。クロップ６Ａの２回目の再結晶を行って純生成物６（１７２ｇ）を生じさせた。２回目の再結晶の濾液からの残留物（４０ｇ）は、ＮＭＲによって測定されるように、９５％より高い純度の生成物６を有した。クロップ６Ｂは、ＮＭＲ分析がかなりの量の望ましくない生成物をそれが有することを示したので、さらに処理せず、それ故化合物５にリサイクルバックした。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_２Ｃｌ_２）δ：８．１４，７．８８，７．６９，７．５７，７．４１（ベンゾエート水素），７．８０−７．７２（フタルイミド水素），７．３４および７．００（Ｓ−芳香族水素），５．９３（Ｈ−３），５．７９（Ｈ−１），４．７７および３．９９（Ｈ−６），４．４７（Ｈ−２），４．０３−３．９９（Ｈ−５），３．９１（Ｈ−４），３．２５（ＯＨ），２．３１（Ｓ−Ｐｈ−Ｍｅ基）。このようにＮＭＲスペクトルは、上に示されるような、生成物６の構造を検証した。

モノマー（Ｉ）の製造

生成物６（１７１．９ｇ、２７５．６ミリモル）を、コリジン（４１．７ｇ、３４４．５ミリモル、１．２５当量）を含有する最小限の塩化メチレン（３５０ｍＬ）に溶解させた。ｔ−ＢＤＭＳ−トリフレート（８０．０ｇ、３０３．１ミリモル、１．１当量）を添加漏斗によって滴加した（５０分にわたって）。反応混合物を一晩撹拌するに任せた。反応混合物を塩化メチレンで希釈し、氷冷水、０．５Ｍ水性ＨＣｌ（氷冷）、次に水性飽和ＮａＨＣＯ_３で順次洗浄した。それを次にＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮してモノマー（Ｉ）を白色固体（２０７ｇ）として生じさせた。生成物を乾燥トルエンに溶解させ、グリコシル化反応に使用する前に濃縮乾固した。回収された２０７ｇのモノマー（Ｉ）生成物は、２０３．４ｇであると計算される、理論収量と本質的に等しかった。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_２Ｃｌ_２）δ：８．１６−７．４１（ベンゾエート水素，フタルイミド水素），７．３０および６．９５（Ｓ−芳香族水素），５．９７（Ｈ−３），５．８２（Ｈ−１），４．８９および４．４９（Ｈ−６），４．４０（Ｈ−２），４．１４（Ｈ−４），４．０１（Ｈ−５），２．３０（Ｓ−Ｐｈ−Ｍｅ基），０．８０（ケイ素上のｔ−ブチル基），０．０９および−０．１６（ケイ素上のメチル基）。このようにＮＭＲスペクトルは、上に示されるような、モノマー（Ｉ）の構造を検証した。

実施例３
モノマー（ＩＩ）の合成
中間化合物７の製造

出発グリコシドが痕跡のＥｔＯＨを含まないことを確実にするために、化合物３（６０．０ｇ、１２６ミリモル）をトルエンに溶解させ、蒸発させた。それを次に、ＭｅＯＨ（６．５ｇ、２０２ミリモル、１．６当量）を含有する無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（５００ｍＬ）に溶解させた。四塩化スズ（ＳｎＣｌ_４、１８．４ｇ、７０．５ミリモル、０．５６当量）をＣＨ_２Ｃｌ_２（２５ｍＬ）で希釈し、滴加した。反応混合物を氷水上へ注ぎ、十分に振盪した。これをもう１回繰り返し、次に有機層を水性飽和ＮａＨＣＯ_３で２回洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物を熱ＥｔＯＨから再結晶し、生成物７の結晶（４３．１ｇ）を生じさせた。４９．８ｇの生成物７の粗収率は、５６．６ｇであると計算される、理論収量の８８％であったが、４３．１ｇの再結晶生成物７収率は７６％であった。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_２Ｃｌ_２）δ：７．８６−７．７４（フタルイミド水素），５．７８（Ｈ−３），５．３１（Ｈ−１），５．１８（Ｈ−４），４．３１（Ｈ−２），４．３４および４．２０（Ｈ−６），３．８８（Ｈ−５），２．２０，２．０３，１．８６（アセチル基のメチル）。このようにＮＭＲスペクトルは、上に示されるような、生成物７の構造を検証した。

中間生成物８の製造

生成物７（１４１．０ｇ、３１４ミリモル）をＭｅＯＨ（１０００ｍＬ）に懸濁させ、ＮａＯＭｅ（０．５Ｍ、１０ｍＬ）を加えた。メチルグリコシド生成物７はＭｅＯＨに容易には溶解しなかった。溶液を、塩基性を確実にするために試験した。反応物を一晩撹拌した。溶液は透明になった。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ−ヘキサン−ＥｔＯＨ＝１０：２０：１）による反応混合物の検査は、出発原料の消失および極性生成物（起源の近くに）の形成を示唆した。溶液をスルホン酸樹脂で中和し、濾過し、濃縮乾固した。生成物８と呼ばれる、残留物の重量は１０５．３ｇであったが、それは多分幾らかのメタノールを含む。

１０５．３ｇの生成物８の粗収量は、１０１．３ｇであると計算される、理論収量に本質的に等しかった。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）δ：７．８５−７．８０（フタルイミド水素），５．０７（Ｈ−１），４．２１（Ｈ−２），３．９４（Ｈ−３），３．９２および３．７４（Ｈ−６），３．４０（Ｈ−５），３．４０（ＯＣＨ_３），３．３８（Ｈ−４）。このようにＮＭＲスペクトルは、上に示されるような、生成物８の構造を検証した。

モノマー（ＩＩ）の製造

トルエン−ＤＭＦで蒸発させた後の、生成物８（粗、１０５．３ｇ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（５００ｍＬ）に懸濁させた。ピリジン（６１．８ｇ、７８２ミリモル、２．５当量）を先ず混合物に加え、塩化ベンゾイル（８８ｇ、６２６ミリモル、２．０当量）の滴加がこれに続いた。反応混合物を室温で２４時間撹拌するに任せた。それを次にＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、Ｈ_２Ｏ、１ＭのＨＣｌ（２×）、次に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で順次洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。生成物を、溶出液としてＥｔＯＡｃ−ヘキサン＝３：８を使用する、シリカゲル上のクロマトグラフィーによって精製した。精製生成物の重量は１１６．１ｇであった。生成物は、ＮＭＲによって測定されるように約９０％純度であった。この生成物の一部（２１．１ｇ）をジエチルエーテル−ヘキサンから結晶化させてモノマー（ＩＩ）の純結晶物質（１３．８ｇ）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_２Ｃｌ_２）δ：８．１５，７．９２，７．６７，７．５６，７．４２（ベンゾエート水素），７．８３−７．７４（フタルイミド水素），５．９３（Ｈ−３），５．４０（Ｈ−１），４．８２および４．７２（Ｈ−６），４．４３（Ｈ−２），４．０３−３．９２（Ｈ−５，Ｈ−４），３．５０（ＯＣＨ_３），３．３３（ＯＨ）。このようにＮＭＲスペクトルは、上に示されるような、モノマー（ＩＩ）の構造を検証した。

実施例４
誘導体化グルコサミン二糖類の合成
オリゴグルコサミン誘導体の構造キャラクタリゼーション
下に記載される結合した生成物の構造は、プロトンＮＭＲおよび質量分析法によって確認した。フタルイミドグルコサミン単位の水素Ｈ−３およびＨ−１の化学シフトは、プロトンＮＭＲスペクトルにおいて５〜６．５ｐｐｍの化学シフトで現れた。水素Ｈ−３は、約８〜１０Ｈｚの結合定数での二重線の二重線として現れた。これらの水素シグナルの数をカウントすることによって、オリゴグルコサミンの長さを、二糖類〜五糖類について、容易に測定することができる。６つおよびそれ以上のオリゴグルコサミン誘導体について、これらの水素についてのシグナルはオーバーラップし始めた。しかしながら、これらのシグナルの十分な数は、構造を確認するために同定することができよう。類似の観察は、約８〜８．５Ｈｚの結合定数での二重線として現れる、アノメリック水素について見られ、それによってβ−グリコシド立体構造を確認した。さらに、末端グルコサミン単位におけるＨ−４の化学シフトは、相当する炭素がヒドロキシル基を持っているとき、約３．５ｐｐｍに現れた。これは、このサイトでグリコシル化すると３．７ｐｐｍにシフトした。こうして、Ｈ−４は、グリコシル化反応の成功を立証するためのレポーター基として用いることができよう。構造のさらなる証拠は、各化合物について示される、生成物のＭＡＬＤＩ（マトリック支援レーザー脱離イオン化法）および電気スプレー質量スペクトルデータによって得られた。

二量体生成物９の合成

両方とも前もってトルエンで１回蒸発させた、モノマー（Ｉ）（８０．６ｇ、１０９．３ミリモル、１．２当量）およびモノマー（ＩＩ）（４８．４ｇ、９１．１ミリモル）を、三口５００ｍＬフラスコ中でＣＨ_２Ｃｌ_２（１５０ｍＬ）に溶解させた。４Ａモレキュラーシーブを加えた（５ｇ）。混合物を、激しく撹拌しながら窒素雰囲気下に−６０℃に冷却した。１０分後に、Ｎ−ヨードコハク酸イミド（ＮＩＳ、４４．３ｇ、１９６．７ミリモル、２．２当量）を乾燥粉末として加え、塩化メチレン中のトリフリック酸（ＴｆＯＨ、１３．７ｇ、９１．１ミリモル、１．０当量）およびメチルトリフレート（１４．９ｇ、５４．８ミリモル、１．０当量）の溶液の滴加がそれに続いた。反応混合物を追加の４時間−５５℃で放置した。追加の１００ｍＬのトリフリック酸／メチルトリフレート溶液を反応混合物に滴加して粘度を下げた。反応混合物を、濾過の間ずっと十分に撹拌される１：１飽和チオ硫酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム溶液を含有するフィルターフラスコ中へセライトパッド越しに冷時濾過した。フラスコおよびフィルター上の残渣を塩化メチレンでリンスし、組み合わせた濾液を次の通りワ−ク−アップした。濾液を分液漏斗へ注いだ。内容物を十分に混合し、水溶液を分離し、有機層を飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液でもう１回、引き続き水、および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。溶液を次に硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物の重量は１１１．１ｇであった。分析的に純粋なサンプルは、粗生成物を、溶出液として酢酸エチル−ヘキサンを使用する、シリカゲルクロマトグラフィーによる分離にかけることによって精製した。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_２Ｃｌ_２）δ：８．１７−７．１９（フタルイミドおよびベンゾエート水素），６．１１および５．７６（２×Ｈ−３），５．７４および５．３１（２×Ｈ−１），４．３６および４．３２（２×Ｈ−２），４．３２および３．９３（２×Ｈ−４），３．９０および３．５３（２×Ｈ−５），４．６５，４．３８，４．１２，および３．６３（４×Ｈ−６），３．３８（ＯＣＨ_３），０．６８（ｔ−ブチル），−０．１２，−０．４０（２×ＣＨ_３）。質量分析：分子量 計算値１１４４．３７；実測値Ｍ＋Ｎａ＝１１６７．５。このようにＮＭＲスペクトルは、上に示されるような、生成物９の構造を検証した。粗生成物をそのようなものとして次のステップに使用し、そこでｔＢＤＭＳの完全な除去を成し遂げた。

実施例５
鎖延長のための二糖類生成物９からのケイ素基の除去
中間生成物１０の製造

生成物９（１１１．１ｇ）をＴＨＦ（３５０ｍＬ）に溶解させた。この溶液に、酢酸の１Ｍ溶液（１１０ｍＬ）およびＴＨＦ中のフッ化ｎ−テトラブチルアンモニウムの１Ｍ溶液（１１０ｍＬ）を加え、反応混合物を室温で３日間撹拌した。反応の完了は、溶媒としてＥｔＯＡｃ：ヘキサン：ＥｔＯＨ＝４：８：１を使用するＴＬＣによって確認し、それは反応が完了したことを示唆した。反応の溶媒を高真空で（加熱なしで）蒸発させ、残留物をＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解させ、水、１Ｍ水性ＨＣｌ、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液で順次、そして最後に飽和水性ＮａＨＣＯ_３で洗浄した。溶液を次にＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。生じた固体をジエチルエーテルで処理し、それは膠質物質をもたらした。上澄液を濾過し、膠質物質をジエチルエーテルで繰り返し洗浄した。濾液にヘキサンを加えていかなるエーテル可溶性生成物も沈澱させ、そしてこれを濾過した（分画Ｂ、５．９ｇ）。エーテル−ヘキサンからの最後の濾液を濃縮乾固した（分画Ｃ）。

ＮＭＲスペクトルは、分画Ｂ生成物が主要な所望の二糖類と共に約５％のケイ素不純物（約０ｐｐｍのピーク）を有することを示唆した。分画Ａは、約１０％のｔＢＤＭＳ不純物およびテトラブチルアンモニウム誘導体で汚染されていた。それ故、分画Ａを６００ｍＬのエーテルに再懸濁させ、約１０分間混合し、濾過し、そして本プロセスをもう１回繰り返した（回収された固体の重量は７７．３ｇであった）。この固体を、生成物を酢酸エチルに溶解させ、ヘキサンの助けを借りて生成物を沈澱させることによってもう１回精製した（回収された生成物の重量は７１．７ｇであった）。濾液を組み合わせ、ヘキサンを加えて残った生成物を沈澱させ、追加の１０．８ｇの生成物を回収した。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_２Ｃｌ_２）δ：８．１２−７．１４（フタルイミドおよびベンゾエート水素），６．１４および５．７３（２×Ｈ−３），５．７２および５．３４（２×Ｈ−１），４．３７および４．３４（２×Ｈ−２），４．１０および３．６９（２×Ｈ−４），３．９７および３．４４（２×Ｈ−５），４．６６，４．１８，４．１２−４．０６（４×Ｈ−６），３．３８（ＯＣＨ_３），３．３５（ＯＨ）。質量分析：分子量 計算値１０３０．９８；実測値Ｍ＋Ｎａ＝１０５３．１。このようにＮＭＲスペクトルは、上に示されるような、生成物１０の構造を検証した。

実施例６
誘導体化グルコサミン三糖類の合成
三量体生成物１１の合成

モノマー（Ｉ）（８８．６ｇ、１２０ミリモル、１．５当量）および生成物１０（８２．５ｇ、８０．０ミリモル）をフラスコ中でＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）に溶解させた。モレキュラーシーブ（４Ａ、５．０ｇ）を加えた、フラスコを−５５℃浴に入れ、１５分間撹拌した。激しい撹拌を維持しながら、ＮＩＳ（４８．６ｇ、２１６ミリモル）を粉末として冷溶液に加えた。両方とも一緒にＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）に溶解させたメチルトリフレート（１３．１ｇ、８０ミリモル、１．０当量）およびＴｆＯＨ（１２ｇ、８０ミリモル、１．９当量）を、添加漏斗を用いて滴々冷溶液に加えた（６０分にわたって）。−６０℃〜−５０℃で６時間後に、反応混合物を、エルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコ中に含有される飽和炭酸水素ナトリウムおよび飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液（１：１、４００ｍＬ）上に注ぎ、十分に撹拌した。追加の塩化メチレン（２００ｍＬ）を加え、内容物を１０分間十分に混合し、水溶液を分離し、有機層を０．６％漂白剤水溶液、脱イオン水、および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。溶液を次にＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。

過剰のモノマー不純物を三糖類から除去するために、粗生成物をジエチルエーテル（６００ｍＬ）に懸濁させ、固体を十分に混合し、上澄液を濾過した。このプロセスを３回繰り返し、残渣を最終的に塩化メチレンに溶解させ、次に濃縮乾固して９３．５ｇの生成物１１を生じさせた。濾液に約４０容量％のヘキサンを加え、沈澱物質を濾過し、塩化メチレンに再溶解させ、真空下に濃縮乾固して追加量の化合物１１（２６．０ｇ）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_２Ｃｌ_２）δ（選択水素化学シフトのみが報告される）：８．１３−７．１２（フタルイミドおよびベンゾエート水素），６．０３，５．８８，および５．６２（３×Ｈ−３），５．６４，５．４８，および５．２９（３×Ｈ−１），３．７７（末端グルコサミン単位のＨ−４），３．９０（末端グルコサミン単位のＨ−５），４．６３（末端グルコサミン単位のＨ−６），３．３５（ＯＣＨ_３），０．６４（ｔ−ブチル），−０．１８，−０．３３（２×ケイ素単位のＣＨ_３）。質量分析：正確な分子量 計算値１６４３．４９；実測値Ｍ＋Ｎａ＝１６６６．３。このようにＮＭＲスペクトルは、上に示されるような、生成物１１の構造を検証した。

実施例７
さらなる鎖延長のための三糖類生成物１１からのケイ素基の除去
中間体１２の製造

生成物１１を最小限のＴＨＦ（５００ｍＬ）に溶解させた。この溶液に、酢酸の１Ｍ溶液（１５０ｍＬ）およびＴＨＦ中のフッ化ｎ−テトラブチルアンモニウムの１Ｍ溶液（１５０ｍＬ）を加え、反応混合物を室温で３日間撹拌した。反応混合物を蒸発乾固し、残留物を塩化メチレンに再溶解させ、脱イオン水、１ＭのＨＣｌ、１％漂白剤水溶液（暗茶色を除去するための）、および飽和炭酸水素ナトリウム溶液で順次洗浄し、次に濃縮乾固した。

非極性ケイ素および他の不純物を除去するために、固体を最小限の酢酸エチルに溶解させた。ヘキサンを滴々加えた（最終溶媒比ＥｔＯＡｃ−ヘキサンは１７：１４であった）。これは膠質物質をもたらした。液体を濾過し、膠質物質をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）に再溶解させ、上記のようにヘキサン（１００ｍＬ）で沈澱させた。最後に、ジエチルエーテルを加えて膠質物質を凝固させ、固体を濾過した。固体を塩化メチレンに再溶解させ、濃縮乾固して８１．４ｇの生成物１２を生じさせた。

濾液ＥｔＯＡｃ−ヘキサン−エーテルを濃縮乾固した。残留物をジエチルエーテルに懸濁させ、十分に振盪し、濾過した。このプロセスを２回繰り返した。最後に、沈澱を塩化メチレンに溶解させ、濃縮乾固して追加の生成物１２（１６．５ｇ）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_２Ｃｌ_２）δ（選択水素化学シフトのみが報告される）：８．０８−７．１６（フタルイミドおよびベンゾエート水素），６．０３，５．９２，および５．５９（３×Ｈ−３），５．６７，５．４８，および５．２９（３×Ｈ−１），３．５６（末端グルコサミン単位のＨ−４），３．９１（末端グルコサミン単位のＨ−５），４．６３（末端グルコサミン単位のＨ−６），３．３５（ＯＣＨ_３），３．０１（ＯＨ），０．６４。質量分析：正確な分子量 計算値１５２９．４１；実測値Ｍ＋Ｎａ＝１５５３．４。このようにＮＭＲスペクトルは、上に示されるような、生成物１２の構造を検証した。

実施例８
誘導体化グルコサミン四糖類の合成
四量体生成物１３の合成

チオグリコシドモノマー（Ｉ）（３７．４ｇ、５０．７ミリモル）および三糖類生成物１２（４５．６ｇ、２９．８ミリモル）を、フラスコ中でＣＨ_２Ｃｌ_２（１５０ｍＬ）に溶解させた。モレキュラーシーブ（４Ａ、１０．０ｇ）を加えた。フラスコを−５５℃浴に入れ、１５分間撹拌した。激しい撹拌を維持しながら、ＮＩＳ（２０．５ｇ、９１．２５ミリモル）を粉末として冷溶液に加えた。両方とも一緒にＣＨ_２Ｃｌ_２（２０ｍＬ）に溶解させた、メチルトリフレート（４．９ｇ、２９．８ミリモル）およびＴｆＯＨ（４．５ｇ、２９．８ミリモル）の溶液を、添加漏斗を用いて滴々冷溶液に加えた（６０分にわたって）。−６０℃で６時間後に、反応混合物を、エルレンマイヤーフラスコ中に含有される飽和炭酸水素ナトリウムおよび飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液（１：１、４００ｍＬ）上に注ぎ、十分に撹拌した。追加の塩化メチレン（２００ｍＬ）を加え、内容物を１０分間十分に混合し、水溶液を分離し、有機層を１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液、１％漂白剤水溶液、および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で順次洗浄した。溶液を次にＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した（７５．１ｇ）。

過剰のモノマー不純物を四糖類から除去するために、粗生成物をジエチルエーテル（６００ｍＬ）に懸濁させ、固体を十分に混合し、上澄液を濾過した。このプロセスを３回繰り返し、残渣を最終的に塩化メチレンに溶解させ、濃縮乾固した（１３Ａ、５４．２ｇ）。

濾液に約４０容量％のヘキサンを加え、沈澱物質を濾過し、塩化メチレンに再溶解させ、濃縮乾固し、５．８ｇの生成物１３Ｂを生じさせた。１３Ａおよび１３ＢのＮＭＲ分析は、これらがほぼ同じものであることを示唆し、それらを組み合わせた。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_２Ｃｌ_２）δ（選択水素化学シフトのみが報告される）：８．０９−７．０３（フタルイミドおよびベンゾエート水素），６．００，５．８３，５．７６，および５．６２（４×Ｈ−３），５．６２，５．４２，５．４１，および５．２７（４×Ｈ−１），３．７４（末端グルコサミン単位のＨ−４），３．８８（末端グルコサミン単位のＨ−５），４．６０（末端グルコサミン単位のＨ−６），３．３３（ＯＣＨ_３），０．６３（ｔ−ブチル），−０．１９，−０．３４（２×ケイ素単位のＣＨ_３）。質量分析：正確な分子量 計算値２１４２．６２；実測値Ｍ＋Ｎａ＝２１６６．４。このようにＮＭＲスペクトルは、上に示されるような、生成物１３の構造を検証した。

実施例９
ベンゾイルおよびフタルイミド保護基のそれらのアセテートへの変換
アセチル化生成物１５の１３からの合成

生成物１３をヒドラジンに溶解させ、１０５℃に加熱する。２０時間後に、反応混合物を濃縮乾固する。残留物を次に塩化メチレンで十分に洗浄して副生物を除去し、生成物１１を生じさせる。

生成物１４を、等容量の無水酢酸を含有する最小限量の無水ピリジンに溶解させる。少量の４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを加え、反応物を室温で２４時間撹拌する。それを次に氷水上に注ぎ、塩化メチレンで抽出する。塩化メチレン層を氷冷１Ｍ水性塩酸、次に飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄する。それを次に無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、減圧下に濃縮して生成物１５を得る。

実施例１０
脱シリル化および末端フタルイミド−グルコサミン単位の付加
脱シリル化生成物１６の合成

四糖類１５を最小限のＴＨＦに溶解させ、ＴＨＦ中の酢酸の１Ｍ溶液およびＴＨＦ中のフッ化テトラブチルアンモニウムの１Ｍ溶液の添加がそれに続き、室温で撹拌する。反応進行を、反応の完了についてＮＭＲによって１８時間後にチェックする。反応混合物を蒸発乾固し、塩化メチレンに再溶解させ、飽和チオ硫酸ナトリウム溶液、１ＭのＨＣｌ、および飽和炭酸水素ナトリウム溶液で順次洗浄し、次に濃縮乾固する。

非極性ケイ素不純物を除去するために、固体を酢酸エチル（４００ｍＬ）に溶解させる。沈澱物質を撹拌しながらヘキサン（４００ｍＬ）を滴々加える。沈殿を濾過し、本プロセスをもう１回繰り返し、１：１ＥｔＯＡｃ−ヘキサンでの固体の最終洗浄がそれに続き、次に乾燥させて生成物１６を得る。

四糖類のグリコシル化
四糖類生成物１７の合成

チオグリコシドモノマー（実施例２からの生成物４、生成物１６に対して２．２モル当量）および生成物１６を、４Ａモレキュラーシーブを含有する最小限のＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解させる。溶液を−６０℃に冷却し、十分に撹拌する。−６０℃で１０分後に、ＮＩＳ（五量体１６に対して３．５モル当量）を素早く加える。５分後に、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２０ｍＬ）に一緒に溶解されたトリフリック酸（１当量）およびメチルトリフレート（１当量）の溶液を滴々加える。反応混合物を−６０℃で追加の５時間放置する。反応混合物を、エルレンマイヤーフラスコ中に含有される飽和炭酸水素ナトリウムおよび飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液（１：１、５００ｍＬ）上に注ぎ、十分に撹拌する。追加の塩化メチレンを加え、内容物を１０分間十分に混合し、水溶液を分離し、有機層を１％漂白剤水溶液、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液、および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で順次洗浄する。溶液を次にＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮する。残った固体を最小限のＥｔＯＡｃに溶解させ、ヘキサンの滴加がそれに続く。液体部分を濾過し、不溶性物質をＥｔＯＡｃに再溶解させ、次にヘキサンで再び沈澱させる。最後に、ジエチルエーテルを加えて膠質物質を凝固させ、残渣をエーテルで洗浄し、乾燥させて生成物１７を得る。

実施例１１
Ｏ−アセチルおよびＮ−フタルイミド基の除去およびリポキトオリゴ糖への変換
生成物１８の合成

生成物１７をＭｅＯＨに懸濁させ、次にＮａＯＭｅ（０．５Ｍ）を加え、室温で２日間撹拌する。反応物を酸性樹脂で中和し、濃縮乾固する。生成物を次に、ＭＲ−エチレンジアミン樹脂を含有するｎ−ブタノールに懸濁させ、１００℃に２４時間加熱する。熱溶液をセライトパッド越しに濾過し、１：１メタノール−水で洗浄する。組み合わせた濾液を濃縮乾固して生成物１８を得る。

リポキトオリゴ糖１９の合成

生成物１８を、末端グルコサミン単位のアミノ基のアミド化のための２Ｅ，９Ｚ−ヘキサデカジエン酸を含有する最小限の水に溶解させる。エチル−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（１当量）およびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１当量）を加え、室温で一晩撹拌する。反応混合物を酸性樹脂のカラムに通し、濾液を濃縮乾固して生成物１９を得る。

実施例１２
リポキトオリゴ糖四量体の合成

実施例８の生成物四糖類１３（２５ｇ）を無水メタノール（９００ｍＬ）に懸濁させた。ナトリウムメトキシド溶液（０．５Ｍ、２０ｍＬ）を加え、反応混合物を室温で１日間撹拌し、濃い白色沈殿を形成した。反応混合物を次に還流に加熱し、固体の全てを溶解させた。還流で７２時間後に、多くの沈殿を反応フラスコ中で再び形成した。加熱を停止し、フラスコを冷却し、沈澱物質を濾過し、メタノールで洗浄した。沈澱生成物の重量は１１．２ｇであった。これは、プロトンＮＭＲによって生成物２０と同定された。

生成物２０（１１．２ｇ）を、エチレンジアミン・メリフィールド樹脂（１５２ｇ）を含有するメタノール（１Ｌ）中で５日間還流させた。暖かい反応混合物を次に濾過し、メタノールで洗浄した。未反応出発原料は固体としてとどまるが、メタノール濾液は生成物を含有した。これを濃縮乾固し、固体を、無水酢酸（６ｍＬ）およびトリエチルアミン（６ｍＬ）を含有するメタノール（１７５ｍＬ）に懸濁させ、室温で２時間撹拌した。白色沈殿がフラスコ中で形成し、それを濾過した。濾液をＨ^＋樹脂（１０ｇ）で処理し、濾過し、濃縮乾固して生成物２１（６．７ｇ）を得た。これはプロトンＮＭＲによって生成物２１と同定された。

生成物２１をテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）に懸濁させ、酢酸およびフッ化テトラブチルアンモニウムの１Ｍ溶液（それぞれ５ｍＬ）を加えた。室温での２４時間の撹拌後に混合物は曇ったままであった。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）を、生成物の溶解を助けるために加え、反応物を６５℃で３日間撹拌し、次に濃縮乾固した。生じた生成物を次にメタノール（１００ｍＬ）に懸濁させ、エチレンジアミン・メリフィールド樹脂（２５ｇ）を加えた。反応物を７５℃に加熱し、４４時間撹拌した。反応物を室温に放冷し、濾過した。生成物２２を含有する濾液を濃縮乾固した（２．２ｇ）。これは、プロトンＮＭＲによって生成物２２と同定された。

ＥＤＣ（０．２８ｇ）およびＨＯＢｔ−Ｈ_２Ｏ（０．２０ｇ）を含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中の脂肪酸Ｃ１８：１またはＣ１６：１（０．３７ｇ）の溶液を、ＤＭＦ中の生成物１６（１．０ｇ）の懸濁液に加えた。追加のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）を、オリゴマーを完全に溶解させるために加えた。反応混合物を室温で１８時間撹拌し、次に８０℃に２時間加熱し、濃いゲルの形成をもたらした。ゲルをメタノールで希釈し、生成物（Ｃ１８：１からの生成物２３およびＣ１６：１からの生成物２４）を含有するゲル状物質を濾過した。残渣をメタノールで繰り返し洗浄し、水での洗浄がそれに続いた。濾紙上の残渣を集め、乾燥させて生成物２３（５２０ｍｇ）または生成物２４（５５２ｍｇ）を得た。これはプロトンＮＭＲによって生成物２３および２４と同定された。

Claims (18)

1. 構造：
   

   

   （式中、個々の基Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は独立して、ＨおよびＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、アラルキル、モノ、ジまたはポリアルケニル、モノ、ジまたはポリアルキニル基から選択され、Ｒ^４は単糖類、サルフェートおよびホスフェートから選択され、そしてｎは０〜約２０である）
   を有するリポキトオリゴ糖化合物の合成法であって、
   ａ）構造Ｃ
   

   

   （式中、Ｒ^１はＨ、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、およびアラルキル基から選択される）
   の化合物を非プロトン性溶媒中で構造Ｂ
   

   

   （式中、個々の基Ｒ^１およびＲ^２は独立して、ＨならびにＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、およびアラルキル基から選択され、Ｒ^４は単糖類、サルフェートおよびホスフェートから選択され、そしてｎは０〜約１９である）
   の化合物と組み合わせ、そして該溶液を約０℃〜−７８℃の温度でかき混ぜて第１混合物を形成する工程と、
   ｂ）ａ）の混合物に、Ｎ−ハロイミドから選択された第１活性化剤を加えて第２混合物を形成する工程と、
   ｃ）該第２混合物に、パーフルオロアルキルスルホン酸から選択された第２活性化剤を加え、そして場合によりメチルパーフルオロアルキルスルホネートから選択された試薬を加えて第３混合物を形成する工程と、
   ｄ）該第３混合物を約０℃〜約−７８℃の温度で反応させてエステル基およびＮ−フタルイミド基を含む生成物を形成する工程と、
   ｅ）ｄ）の生成物を単離する工程と、
   ｆ）該エスエル基および該Ｎ−フタルイミド基をｅ）の単離生成物から除去して脱エステル化および脱Ｎ−フタルイミド生成物を形成する工程と、
   ｇ）ｆ）の生成物を単離する工程と、
   ｈ）ｇ）の単離生成物の末端糖単位のアミノ基を式Ｒ^１ＣＯＸ（式中、それぞれ、酸および酸ハロゲン化物について、Ｘ＝ＯＨまたはハライドであり、そしてＲ^１は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、アラルキル、モノ、ジまたはポリアルケニル、モノ、ジまたはポリアルキニル基から選択される）の酸または酸ハロゲン化物と選択的に反応させてリポキトオリゴ糖を形成する工程と、
   ｉ）該リポキトオリゴ糖を単離する工程と
   を含む方法。
2. 第１活性化剤がＮ−ハロコハク酸イミドである請求項１に記載の方法。
3. Ｎ−ハロコハク酸イミドがＮ−ヨードコハク酸イミドである請求項２に記載の方法。
4. パーフルオロアルキルスルホン酸が式Ｂの化合物に対して少なくとも約０．２５モル当量である請求項１に記載の方法。
5. パーフルオロアルキルスルホン酸が式Ｂの化合物に対しておよそ等モル当量である請求項４に記載の方法。
6. パーフルオロアルキルスルホン酸がトリフリック酸である請求項１に記載の方法。
7. メチルパーフルオロアルキルスルホネートがメチルトリフレートである請求項１に記載の方法。
8. ａ）およびｄ）の温度が約−２０℃〜約−７０℃である請求項１に記載の方法。
9. ａ）およびｄ）の温度が約−５０℃〜約−６０℃である請求項１に記載の方法。
10. ｅ）の生成物のエステル基がアルコール中で金属アルコキシドとのエステル交換によって除去され、そしてｅ）の生成物のＮ−フタルイミド基が還流条件下にアミンまたはジアミンと反応させることによって除去される請求項１に記載の方法。
11. ｈ）の反応が塩基触媒および酸ハロゲン化物を使用して、またはカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールで活性化された脂肪酸を使用して実施される請求項１に記載の方法。
12. 構造：
    

    

    （式中、個々の基Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は独立して、ＨおよびＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、アラルキル、モノ、ジまたはポリアルケニル、モノ、ジまたはポリアルキニル基から選択され、Ｒ^４は単糖類、サルフェートおよびホスフェートから選択され、そしてｎは０〜約２０である）
    を有するリポキトオリゴ糖化合物の合成法であって、
    ａ）構造Ｄ
    

    

    （式中、Ｒ^１はＨ、ならびにＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、およびアラルキル基から選択される）
    の化合物を提供する工程、
    ｂ）構造Ｄの化合物のエステル基および内部Ｎ−フタルイミド基を除去する工程と、
    ｃ）構造Ｄの化合物の内部糖単位上のアミノ基をアシル化剤と選択的に反応させてＮ−アシル誘導体生成物を製造する工程、
    ｄ）ｃ）のＮ−アシル誘導体生成物の末端糖単位上のシリル基ならびにエスエルおよびＮ−フタルイミド基を、該Ｎ−アシル誘導体生成物をフッ化テトラ−Ｎ−アルキルアンモニウムと反応させ、引き続き還流条件下にアミンまたはジアミンと反応させることによって除去して脱シリル化および脱Ｎ−フタルイミド化生成物を製造する工程、
    ｅ）ｄ）の脱Ｎ−フタルイミド化生成物の末端アミノ基を、カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシルベンゾトリアゾールで活性化された脂肪酸で、または、塩基触媒の存在下に、式Ｒ^１ＣＯＸ（式中、Ｘはハライドであり、そしてＲ^１はＨおよびＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、アラルキル、モノ、ジまたはポリアルケニル、モノ、ジまたはポリアルキニル基から選択される）の酸ハロゲン化物でアシル化してリポキトオリゴ糖を形成する工程、及び
    ｆ）該リポキトオリゴ糖を単離する工程
    を含む上記方法。
13. （ｃ）のアシル化剤が無水酢酸である請求項１２に記載の方法。
14. （ｄ）のフッ化テトラ−Ｎ−アルキルアンモニウムがフッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムであり、そしてジアミンがメリフィールド樹脂に結合したエチレンジアミンである請求項１２に記載の方法。
15. 構造：
    

    

    （式中、独立した基Ｒ^１およびＲ^２は独立して、ＨならびにＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、およびアラルキル基から選択され、Ｒ^４は単糖類、サルフェートおよびホスフェートから選択され、そしてｎは０〜約１９である）
    を有する化合物。
16. 構造：
    

    

    （式中、個々の基Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は独立して、ＨならびにＣ_１〜Ｃ_２０アルキル、アリール、アラルキル、モノ、ジまたはポリアルケニル、モノ、ジまたはポリアルキニル基から選択され、Ｒ^４は単糖類、サルフェートおよびホスフェートから選択され、そしてｎは０〜約２０である）
    で表される化学合成リポキトオリゴ糖を含む組成物。
17. 構造：
    

    

    で表される化学合成リポキトオリゴ糖を含む組成物。
18. 構造：
    

    

    で表される化学合成リポキトオリゴ糖を含む組成物。