KR20090023563A

KR20090023563A - 지질키토올리고당의 화학적 합성 방법

Info

Publication number: KR20090023563A
Application number: KR1020087027225A
Authority: KR
Inventors: 서브라마니암 사베산
Original assignee: 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니
Priority date: 2006-04-07
Filing date: 2007-04-05
Publication date: 2009-03-05
Also published as: WO2007117500A2; CA2644172A1; US20090292115A1; EP2348028A1; EP2010552B1; EP2348027B1; AR060392A1; EP2348028B1; US20070238872A1; US20120004401A1; EP2348027A1; EP2010552A2; JP2009533345A; CN101421287A; US8049002B2; AU2007235408A1; WO2007117500A3; US9090644B2; US20140303361A1

Abstract

지질키토올리고당의 합성 방법이 개발되었다. 완전히 아실화된 올리고글루코사민 전구체를 제조하고, 아민 보호 프탈로일 기를 가지는 글루코사민 단량체와 반응시킨다. 프탈로일 기가 제거되고 나면, 지방산이 말단 글루코사민 단위체 상에 첨가됨으로써, 지질키토올리고당을 형성시킬 수 있다. 본 방법은 상업적인 규모의 용도로 개조될 수 있다.

지질키토올리고당, 합성, 콩류, 근립착생, 프탈이미도

Description

지질키토올리고당의 화학적 합성 방법{PROCESSES FOR CHEMICAL SYNTHESIS OF LIPOCHITOOLIGOSACCHARIDES}

본 발명은 지질키토올리고당의 화학적 합성 방법, 및 생성되는 화학적 합성 지질키토올리고당에 관한 것이다. 여기에서 개시되는 방법은 비-환원성 말단에 축합된 지방산을 가지는 저분자량 N-아실글루코사민 올리고머의 단계적 합성을 가능케 한다. 본 방법은 상업적인 규모로 수행될 수 있다.

지질키토올리고당은 리조비아(rhizobia) 균에서 천연적으로 제조되며, 근립착생(nodulation) 인자로서 기능한다. 세균으로부터 분비되는 근립착생 인자는 뿌리에서의 공생 근립 형성을 초래하는 콩류 뿌리 세포에서의 반응을 유도한다. 이와 같은 근립에서는 질소가 고정되어 영양소로서 식물에 제공된다. 콩류 뿌리 근립착생의 정도는 식물의 생장 및 생산성과 직접적으로 연결된다.

근립착생 인자인 지질키토올리고당은 키틴 (폴리-[1-4]-β-N-아세틸-D-글루코사민)에서도 발견되는 구조인 4 또는 5개의 β1,4-결합된 N-아실화 글루코사민 잔기의 골격을 가진다. 이러한 골격은 N-아실화되어 있어서, 그것이 제조되는 리조비아 종에 따라 양 말단에 다양한 치환체를 보유할 수 있다. 어떤 리조비아에서는 말단 단위체의 N-아실화가 바센산 (C18:1Δ11Z)과 같은 일반적 지질 대사의 지 방산과의 것이며, 다른 리조비아에서는 N-아실화가 C20:3 및 C18:2와 같은 다중불포화 지방산과의 것이다.

일종의 소정 세균 종에서 제조되는 근립착생 인자인 지질키토올리고당은 완전하게 분리할 수 없는 상이한 치환체를 가지는 화합물들의 혼합물이다. 일부 근립착생 인자 지질키토올리고당은 화학적으로 합성된 바 있다. 예컨대 문헌 [Nicolaou et al., J. Am. Chem. Soc. 114: 8701-8702 (1992)]; [Ikeshita et al., Carbohydrate Research C1-C6 (1995)]; 및 [Wang et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1: 621-628 (1994)]에 기술되어 있는 바와 같이, 지질키토올리고당의 소량 샘플을 제조하는 것에 대한 여러 보고된 방법들이 있다.

지질키토올리고당 류의 N-아실글루코사민 올리고머를 대량으로 그리고 경제적으로 제조하는 방법에 대한 필요성이 남아 있다. 본 발명은 이러한 목적 및 기타 목적에 관한 것이다.

<발명의 개요>

본 발명의 일 양태는

a) 비양성자성 용매 중에서 구조 C의 화합물을 구조 B의 화합물과 혼합하고, 약 0 ℃ 내지 약 -78 ℃ 사이의 온도에서 용액을 교반하여 제1 혼합물을 형성시키는 것;

b) a)의 혼합물에 N-할로이미드에서 선택되는 제1 활성화제를 첨가하여 제2 혼합물을 형성시키는 것;

c) 제2 혼합물에 퍼플루오로알킬 술폰산에서 선택되는 제2 활성화제를 첨가 하고, 임의로 메틸 퍼플루오로알킬 술포네이트에서 선택되는 반응물을 첨가하여 제3 혼합물을 형성시키는 것;

d) 약 0 ℃ 내지 약 -78 ℃ 사이의 온도에서 제3 혼합물을 반응시켜 에스테르 기 및 N-프탈이미도 기를 포함하는 생성물을 형성시키는 것;

e) d)의 생성물을 단리하는 것;

f) 단리된 e)의 생성물로부터 에스테르 기 및 N-프탈이미도 기를 제거함으로써 탈-에스테르화 및 탈-N-프탈이미도 생성물을 형성시키는 것;

g) f)의 생성물을 단리하는 것;

h) 단리된 g)의 생성물의 말단 당 단위체의 아미노 기를 화학식 R¹COX (여기서, 산 및 산 할로겐화물에 대하여 각각 X = OH 또는 할로겐화물이며, R¹은 H, C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 모노, 디 또는 폴리알케닐, 모노, 디 또는 폴리알키닐 기에서 선택됨)의 산 또는 산 할로겐화물과 선택적으로 반응시켜 지질키토올리고당을 형성시키는 것; 및

i) 지질키토올리고당을 단리하는 것

을 포함하는, 구조 A를 가지는 지질키토올리고당 화합물의 합성 방법이다:

(여기서, 개별적인 기 R¹, R² 및 R³는 독립적으로 H 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 아르알킬, 모노, 디 또는 폴리알케닐, 모노, 디 또는 폴리알키닐 기에서 선택되며; R⁴는 단당류, 술페이트 및 포스페이트에서 선택되고; n은 0 내지 약 20임),

(여기서, R¹은 H, C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 및 아르알킬 기에서 선택됨),

(여기서, 개별적인 기 R¹ 및 R²는 독립적으로 H 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 및 아르알킬 기에서 선택되며; R⁴는 적절하게 보호된 형태의 단당류, 술페이트 및 포스페이트에서 선택되고; n은 0 내지 약 19임).

본 발명의 다른 양태는

a) 구조 D의 화합물을 제공하는 것;

b) 구조 D 화합물의 에스테르 기 및 내부 N-프탈이미도 기를 제거하는 것;

c) 구조 D 화합물의 내부 당 단위체 상의 아미노 기를 아실화 반응물과 선택적으로 반응시켜 N-아실 유도체 생성물을 제조하는 것;

d) N-아실 유도체 생성물을 테트라-N-알킬 암모늄 플루오라이드와 반응시키고 이어서 환류 조건 하에서 아민 또는 디아민과 반응시켜, (c)의 N-아실 유도체 생성물의 말단 당 단위체 상의 실릴 기와 에스테르 및 N-프탈이미도 기를 제거함으로써, 탈-실릴화 및 탈-N-프탈이미드화 생성물을 생성시키는 것;

e) 염기 촉매의 존재 하에, 카르보디이미드 및 N-하이드록시벤즈트리아졸로 활성화된 지방산, 또는 화학식 R¹COX (여기서, X는 할로겐화물이며, R¹은 H 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 아르알킬, 모노, 디 또는 폴리알케닐, 모노, 디 또는 폴리알키닐 기에서 선택됨)의 산 할로겐화물을 사용하여 (d)의 탈-N-프탈이미드화된 생성물의 말단 아미노 기를 아실화함으로써, 지질키토올리고당을 형성시키는 것; 및

f) 지질키토올리고당을 단리하는 것

(여기서, R¹은 H, 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 및 아르알킬 기에서 선택됨).

본 발명의 또 다른 양태는 구조 B를 가지는 화합물이다:

(여기서, 개별적인 기 R¹ 및 R²는 독립적으로 H 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴 기에서 선택되며; R⁴는 단당류, 술페이트 및 포스페이트에서 선택되고; n은 0 내지 약 19임).

본 발명의 추가적인 양태는 하기의 구조로 표시되는 화학적 합성 지질키토올리고당을 포함하는 조성물이다:

본 발명은, 상업적인 용도로 확장할 수 있는, 지질키토올리고당으로 지칭되며 비-환원성 말단에 축합된 지방산을 가지는 저분자량의 N-아실글루코사민 중합체 (올리고 N-아실글루코사민)를 수그램 내지 킬로그램의 양으로 합성하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 간단한 정제 절차의 사용을 가능케 하며, 비용이 비싼 크로마토그래피 분리 절차를 필요로 하지 않는다. 지질키토올리고당의 올리고 N-아실글루코사민 부분은 저장하기에 안정한 단량체의 효율적인 결합에 의해 제조된다. 여기에서 하기되는 특정 유형 단량체의 성장하는 중합체 사슬에 대한 단계적인 첨가는 지방산이 결합될 규정된 사슬 길이의 중합체 합성으로 귀결된다. 글루코사민 단량체 단위체는 한번에 하나씩 서로에게 첨가되어, 올리고머 중 각 글루코사민 단위체를 선택할 기회를 제공하고 지방산의 것을 포함하여 원하는 아실 기가 선택된 글루코사민 단위체에 도입되도록 함으로써, 생물학적으로 가치있는 대규모 배열의 유사체 합성을 가능케 한다.

구조 B를 가지는 중간체 역시 제공된다:

(여기서, 개별적인 기 R¹ 및 R²는 독립적으로 H 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 및 아르알킬 기에서 선택되며; R⁴는 단당류, 적절하게 보호된 술페이트 및 포스페이트 기에서 선택되고, 이들 각각은 적절하게 보호된 형태이며; n은 0 내지 약 19임). 각 글루코사민 단위체가 별도로 사슬에 첨가되기 때문에, 여기에서 하기하는 바와 같이, 각 글루코사민 단위체 상의 개별적인 R¹ 또는 R² 기는 서로 다를 수 있다. 상기 중간체는 지질키토올리고당을 합성하는 데에 유용하다.

여기에서 범위, 바람직한 범위 또는 상위의 바람직한 값과 하위의 바람직한 값의 목록 중 어느 것으로 양, 농도, 또는 다른 값이나 파라미터가 언급되는 경우, 언급된 양, 농도, 또는 다른 값이나 파라미터는, 그러한 범위가 별도로 개시되어 있는지에 관계없이, 모든 상위의 범위 한계 또는 바람직한 값과 모든 하위의 범위 한계 또는 바람직한 값의 모든 쌍으로 형성되는 모든 범위를 포함하고자 하는 것이다. 여기에서 숫자 값의 범위가 언급되는 경우, 다르게 설명되지 않는 한, 그 범위는 그의 말단점, 및 범위 내의 모든 정수 및 분수를 포함하고자 하는 것이다. 본 발명의 영역을 범위 규정시 언급한 특정 값으로 제한하고자 하는 것은 아니다.

다르게 설명되지 않는 한, 하기의 용어들은 여기에서 사용될 때 하기의 의미를 가진다.

여기에서 사용될 때, "보관상 안정한"이라는 용어는 실온에서 저장할 때, 그리고 실험실 저장 조건의 습기 및 공기에 노출되었을 때 화합물이 그대로 유지된다는 것을 의미한다.

"대규모"라는 용어는 수십 그램 내지 킬로그램 양의 물질을 지칭한다.

"저분자량 중합체"라는 용어는 길이가 1개의 단위체보다 크고 약 50 단위체 이하인 단량체 단위체의 사슬을 지칭한다. 올리고머는 2 내지 약 22개의 단위체를 가지는 중합체이다. 따라서, 예컨대 올리고-N-아실글루코사민은 일종의 저분자량 중합체이다.

"결합 위치"라는 용어는 글리코실 결합의 일부인 탄소의 위치를 의미한다. 1,4-결합에서, 결합 위치는 하나의 글리코시드 상의 1 및 결합된 글리코시드 상의 4이다.

"비-결합 위치"라는 용어는 글리코실 결합의 일부가 아닌 탄소의 위치를 의미한다. 예를 들어, 1,4 결합에서, 2, 3 및 6 위치는 비-결합 위치이다.

"티오글리코시드 공여체"라는 용어는 글리코실 결합의 C-1 위치에 참여하는 글리코실 분자를 의미한다.

"글리코실 수용체"라는 용어는 글리코실 결합에 참여하게 될 위치에 하이드록실 기를 가지며 그의 산소를 통하여 공여체로부터의 C-1 글리코실 잔기에 연결되는 글리코실 분자를 의미한다. β1,4-결합에서, 글리코실 수용체는 4 위치에 하이드록실 기를 가진다. 글리코실 수용체는 단일의 단위체이거나, 또는 저분자량 중합체인 다중 단위체 사슬일 수 있다.

"적절하게 보호된 티오글리코시드 공여체"라는 용어는 글리코시드 결합 형성 후 비-결합 위치가 되는 위치에 보호 기를 가지는 티오글리코시드를 의미한다. 보호 기는 그 위치에서의 반응을 방지하는 데에 사용된다.

"적절하게 보호된 글리코시드 수용체"라는 용어는 글리코시드 결합 형성 후 비-결합 위치가 되는 위치에 보호 기를 가지는 글리코시드를 의미한다. 보호 기는 그 위치에서의 반응을 방지하는 데에 사용된다.

본 발명의 일 구현예에는 구조 A의 화합물을 합성하는 방법이 포함된다:

(여기서, 개별적인 기 R¹, R² 및 R³는 독립적으로 H 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 아르알킬, 모노, 디 또는 폴리알케닐, 모노, 디 또는 폴리알키닐 기에서 선택되며; R⁴는 단당류, 술페이트 및 포스페이트에서 선택되고; n은 0 내지 약 20임). 각 글루코사민 단위체가 별도로 사슬에 첨가되기 때문에, 여기에서 하기하는 바와 같이, 각 글루코사민 단위체 상의 개별적인 R¹, R² 또는 R³ 기는 서로 다를 수 있다.

바람직한 구현예에서, 구조 A의 것을 포함하여 여기에서 개시되는 화합물의 합성은 상업적인 규모로 공정이 수행되는 것을 가능케 하는 충분히 높은 수율로 그리고 적절한 효율로 합성된다.

구조 A 화합물의 합성을 위한 일 방법에서는, 올리고 N-아실글루코사민 전구체가 합성되고, 거기에 지방산이 첨가되어 구조 A의 R³ 기가 형성된다. 이와 같은 합성은 구조 B의 완전히 아실화된 올리고 N-아실글루코사민을 제조한 다음, 티오글리코시드 화합물 C를 사용한 글리코실화를 통하여 β1,4-결합으로 N-프탈로일 보호된 글루코사민 단량체를 첨가하는 것에 의해 가능해진다. 에스테르 및 N-프탈로일 기는 글리코실화 생성물로부터 제거되며, 말단 단위체의 아미노 기에 대한 지방산의 첨가로 이어져 화합물 A를 수득하게 된다.

말단의 프탈로일-보호된 글루코사민 단량체가 첨가되는 구조 B의 올리고 N-아실글루코사민은 β1,4-결합으로 연결된 2 내지 약 21개의 글루코사민 단위체로 구성될 수 있다:

(여기서, 개별적인 기 R¹ 및 R²는 독립적으로 H 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 및 아르알킬 기에서 선택되며; R⁴는 단당류, 술페이트 기 및 포스페이트 기에서 선택되고, 이들 각각은 적절하게 보호된 형태이며; n은 0 내지 약 19임). 각 글루코사민 단위체가 별도로 사슬에 첨가되기 때문에, 여기에서 하기하는 바와 같이, 각 글루코사민 단위체 상의 개별적인 R¹ 또는 R² 기는 서로 다를 수 있다.

올리고 N-아실글루코사민에 연결될 N-프탈로일 보호된 글루코사민 단량체는 구조 C로 나타내어진다:

(여기서, R¹ 기는 독립적으로 H, C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 및 아르알킬 기에서 선택됨).

구조 B의 합성을 위하여 요구되는 올리고글루코사민은 여기에 참조로써 개재되는 동시계류 중인 US 출원 11/154457호 (대리인 서류 번호 CL2695)에 기술되어 있는 6탄당들 사이의 글리코시드 결합 형성 방법을 사용하여 제조된다. 올리고글루코사민은 하기와 같이 합성된다.

구조 (I)로 표시되는 티오글리코시드 단량체는 N-할로이미드 및 대략 등몰량의 강한 양성자성 산으로부터 생성되는 활성화제를 사용하는 것에 의해 구조 (II)로 표시되는 위치 4 글리코실 수용체에 매우 효율적으로 결합된다:

(여기서, R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 H 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 및 아르알킬 기에서 선택되며; R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 일관능성 아실, 이관능성 아실, 프탈로일, 트리클로로아세틸, 및 테트라클로로프탈로일 기에서 선택되고; R⁵, R⁶, R⁷ 및 R⁸은 각각 독립적으로 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 및 아르알킬 기에서 선택됨).

바람직하게는 R¹ 및 R²는 페닐 기이다.

바람직하게는 R³ 및 R⁴는 프탈로일 단위로부터 유래하는 아실 기이다.

바람직하게는 R⁵는 p-톨루일 기이다.

바람직하게는 R⁶ 및 R⁷은 메틸 기이다.

바람직하게는 R⁸은 3차 부틸 기이다.

위치 4 글리코실 수용체는 구조 (II)로 표시된다:

(여기서, R¹은 아실 기 및 보호된 글리코실 단위에서 선택되며; R²는 H 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 및 아르알킬 기에서 선택되고; R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 일관능성 아실, 이관능성 아실, 프탈로일, 트리클로로아세틸, 및 테트라클로로프탈로일 기에서 선택되며; R⁵는 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 및 아르알킬 기에서 선택됨).

바람직하게는 R¹ 및 R²는 페닐 기이다.

바람직하게는 R⁵는 메틸 기이다.

올리고글루코사민 전구체의 합성에 사용되는 글리코실화 방법은 하기와 같이 설명된다. 글리코실 수용체인 단량체 (II)의 단위체, 예컨대 분자가 티오글리코시드 공여체인 단량체 (I)의 단위체가 첨가되어 중합체 사슬이 연장되는 개시 단위체를 제공한다. 단량체 (I) 및 (II)는 시중에서 구입가능한 D-글루코사민 하이드로클로라이드로부터 제조될 수 있다. 단량체 (I)을 합성함에 있어서, 1,4-결합된 글루코사민의 합성을 위하여, D-글루코사민 하이드로클로라이드는 프탈산 무수물을 사용하여 프탈로일 기로 유도체화됨으로써 아민이 보호화된다 (실시예 1의 생성물 2). 다음에, 아세틸화에 의해 하이드록실 기가 보호화되며 (실시예 2의 생성물 3), 생성물은 결정화에 의해 정제된다. 다음에, 1 위치에 벤젠티올 기가 첨가되고 (실시예 2의 생성물 4), 생성물은 양성자성 용매를 사용한 세척에 의해 정제된다. 결과 생성물은 탈아세틸화되고 (실시예 2의 생성물 5), 3 및 6의 하이드록실 위치에 벤조일 보호 기가 첨가되며 (실시예 2의 생성물 6), 그 생성물은 결정화에 의해 정제된다. 최종적으로, 생성물 6의 4-하이드록실 기에 일시적인 보호 기로서 t-부틸디메틸실릴 (tBDMS) 기로 지칭되는 규소 보호 기가 첨가됨으로써 하기 반응 1에 단량체 (I)로 나타낸 화합물 (S-(p-톨루일) 4-O-(디메틸-t-부틸실릴)-2-데옥시-3,6-디-O-벤조일-2-프탈이미도-1-티오-β-D-글루코피라오시드)을 생성시킨다. 이 화합물은 적절하게 보호된 티오글리코시드 공여체인 단량체 (I)의 일례를 나타낸다. 단량체 (I)의 제조에 사용되는 각각의 개별 반응은 업계 숙련자에게 알려져 있다. 상기 반응 및 정제의 조합은 본 발명의 방법에 사용되는 단량체 (I)의 대규모 제조에 적합하다. 생성되는 단량체 (I)은 올리고글루코사민의 합성을 위한 빌딩 블록(building block)을 제공한다.

업계 숙련자라면, 다른 보호 기가 글루코사민-단량체 (I)의 중간체 제조에 사용될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어, 아민은 일관능성 아실, 이관능성 아실, 트리클로로아세틸 또는 테트라클로로프탈로일 기로 보호될 수 있으며, 하이드록실 기는 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 또는 아르알킬 기에 의해 에스테르 기의 일부로서 보호될 수 있다. 마찬가지로, 실릴 기는 예컨대 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 및 아르알킬 기로 치환된 소정의 삼치환 규소일 수 있다.

단량체 (II)를 합성함에 있어서, 1,4-결합된 글루코사민의 합성을 위해서는, 단량체 (I)에 사용된 것과 유사한 순서의 반응들이 사용된다. D-글루코사민 하이드로클로라이드의 프탈로일 유도체 (실시예 2의 생성물 3)가 아세틸화되고, 1 위치 하이드록실에서 메틸화된 (실시예 3의 생성물 7) 다음, 다른 하이드록실에서 탈아세틸화된다 (실시예 3의 생성물 8). 생성물 8의 3 및 6 위치에 벤조일 기가 첨가됨으로써, 단량체 (II)를 생성시킨다. 다르게는, 하이드록실-보호된 단당류가 6 위치에 첨가될 수 있다. 이들 개별적인 단계 각각은 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 반응 조건을 사용하여 수행된다. 생성되는 단량체 (II)는 저분자량 글루코사민의 합성을 위하여 단량체 (I)에 대해서 제조된 분자가 첨가되는 개시 단위체를 제공한다. 하기 반응 1에 나타낸 화합물 (메틸 2-데옥시-3,6-디-O-벤조일-2-프탈이미도-β-D-글루코피라오시드)은 4-위치에 하이드록실 기를 함유하는 적절하게 보호된 글리코실 수용체인 단량체 (II) 유형 화합물의 일례를 나타낸다.

업계 숙련자라면, 다른 보호 기가 단량체 (II)의 중간체 제조에 사용될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어, 아민은 일관능성 아실, 이관능성 아실, 트리클로로아세틸 또는 테트라클로로프탈로일 기로 보호될 수 있으며, 하이드록실 기는 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 또는 아르알킬 기에 의해 에스테르 기의 일부로서 보호될 수 있다.

반복적인 글리코실화 및 생성물 다당류로부터의 규소 보호 기 제거를 통하여, 글리코실 단위체는 원하는 길이까지 첨가될 수 있다. 단량체 (I)과 (II)의 결합은 물론 올리고글루코사민 사슬 + 단량체 (I)의 결합도 포화된 반응 중 기질 농도 하에서 티오글리코시드 활성화제를 사용하여 수행된다. 티오글리코시드 활성화제는 N-할로이미드 및 강한 양성자성 산으로부터 생성된다. 예를 들어, N-요오도숙신이미드 및 N-브로모숙신이미드와 같은 N-할로숙신이미드가 트리플산 (트리플루오로메탄술폰산) 및 기타 퍼플루오로알킬술폰산과 같은 강한 양성자성 산과의 조합으로 활성화제로서 사용될 수 있다. 트리플산 단독으로도 티오글리코시드를 활성화하는 데에 충분하지만, 트리플산과 메틸트리플레이트 (메틸트리플루오로메탄술포네이트)의 조합 사용이 글리코실화 반응에 해로울 수 있는 부산물의 제거를 촉진한다. 따라서, 메틸트리플레이트가 단량체 (I)을 활성화하는 데에는 충분하지 않다 할지라도, 트리플산/메틸트리플레이트의 조합은 반응 및 정제 조건을 위한 적정한 효율을 제공한다.

몰당량 (단량체 (II)에 대한)의 메틸트리플레이트와 함께, 단량체 (I)에 대한 1 내지 1.8 몰당량의 N-할로숙신이미드 및 대략 몰당량 (단량체 (II)에 대한) 양의 소정 퍼플루오로알킬 술폰산 (트리플산이 그 예)의 사용은 효율적인 글리코실화를 제공한다. 효과적인 글리코실화를 위해서는, 약 0.25 내지 약 1.0 몰당량 양의 트리플산 사용이 이용될 수 있다. 결합 효율은 출발 물질로부터의 원하는 생성물 정제의 용이성과 직접적으로 관련된다. 따라서, 쉽게 정제가능한 생성물을 형성시키기 위해서는, 각각 대략 몰당량 양의 트리플산 및 메틸트리플레이트가 구체적으로 사용된다. 이와 같은 고농도의 트리플산이, 특히 반응이 저온에서 수행되는 경우, 당 분자를 분열시키지는 않는다.

상기 활성화제를 사용함으로써, 반응 1에 나타낸 바와 같이 결합 반응은 정량적으로 진행되어 글리코시드 결합을 형성시킬 수 있다. 나타낸 것은 2분자체의 저분자량 폴리글루코사민을 형성시키는 글루코사민-단량체 (I)과 글루코사민-단량체 (II)의 반응의 예이다. 글리코실 수용체 (이 경우 단량체 (II))에 대한 단량체 (I)의 결합은 단계 A이다.

또한, 최소량의 반응 용매를 사용하는 것은 반응물을 포화 농도로 그리고 높은 유효 농도로 유지함으로써, 더욱 효율적인 글리코실화가 이루어지게 한다. 활성화제가 글리코시드에 첨가되고, 저온에서 결합 반응이 수행된다. 약 0 ℃ 내지 약 -78 ℃의 온도가 반응에 적합하다. 반응을 위한 온도는 약 -20 ℃ 내지 약 -70 ℃ 사이인 것이 바람직하다. 더욱 바람직한 것은 온도가 약 -50 ℃ 내지 약 -60 ℃ 사이인 것이다. 반응 시간은 약 15 분 내지 약 8시간이다. 반응은 바람직하게는 모든 잠재적인 글리코시드 결합이 형성되기에 충분한 시간 동안 진행되도록 허용된다. 바람직한 것은 약 4 내지 약 6시간 사이의 반응 시간이다.

적절하게 보호된 티오글리코시드 공여체인 단량체 (I)과 위치 4 글리코실 수용체인 단량체 (II)의 결합을 위한 방법의 일반적인 설명은 하기와 같다. 단량체 (II) (약 1.0 당량) 및 단량체 (I) (1 이상 내지 약 3 당량 이하, 약 1-2 당량이 바람직함)을 최소한의 메틸렌클로라이드, 디에틸에테르, 아세토니트릴, 및 벤조트리플루오라이드와 같은 비양성자성 용매에 용해시킨다. 가장 바람직한 용매는 메틸렌클로라이드이다. 용액을 질소 대기 하에서 휘저으면서 약 -55 ℃ 내지 -60 ℃로 냉각시킨다. 휘저음은 진탕 또는 교반과 같이 용액의 성분들을 철저하게 혼합하는 어떠한 방법에 의해서도 가능하다. 통상적으로, 강력한 교반이 사용된다. 냉각된 용액에 분말화된 N-요오도숙신이미드 (NIS)를 첨가한다. 약 15분 후, 반응 온도를 약 -60 ℃ 미만으로 유지하면서 최소한의 비양성자성 용매, 예컨대 메틸렌클로라이드에 용해된 트리플산 (약 1.0 당량) 및 메틸트리플루오로메탄술포네이트 (약 1.0 당량)과 같은 퍼플루오로알킬 술폰산의 용액을 적가한다. 첨가 후, 반응 혼합물을 동일한 온도에서 교반하면서 약 6시간 동안 유지한 다음, 포화 티오황산 나트륨과 포화 중탄산 나트륨 용액의 1:1 혼합물 상에 직접 붓는다. 메틸렌클로라이드와 같은 추가적인 용매를 사용하여, 반응 혼합물을 희석하고 반응 플라스크의 세척을 제공한다. 용액을 철저하게 혼합하고, 유기 층을 분리한다. 다음에, 1 % 내지 6 % 표백 용액, 바람직하게는 0.6 % 내지 3 % 표백 용액, 다음에는 물을 사용하여, 그리고 최종적으로는 포화 중탄산 나트륨 용액을 사용하여, 유기 층을 순차적으로 세척한다. 감압에서의 용액의 농축에 의해 생성물을 회수한다. 디에틸에테르 또는 에틸아세테이트에 물질을 용해시키고 이어서 n-헥산으로 침전시킴으로써, 불순물을 제거한다. 본 발명의 영역을 벗어나지 않고도, 업계 숙련자에게 알려져 있는 변형들이 방법으로 도입될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

기술된 결합 반응의 효율성은 원치않는 부산물 및 결합 후 반응 혼합물 중 출발 물질의 농도를 감소시킴으로써, 선택적인 용매 추출법을 통한 잔존 미량 불순물의 제거를 용이하게 한다. 그러한 방법이 사용될 수도 있기는 하나, 통상적으로 사용되는 고비용의 실리카 겔 크로마토그래피의 정제법에 대한 필요성이 없다. 유기 용매를 사용한 선택적인 세척은 대규모 생산에 유용한 단순화된 정제 방법을 제공한다. 정제시의 세척에 유용한 용매에는 디에틸에테르 및 헥산-에틸아세테이트 혼합물이 포함된다. 생성물은 불용성이나 불순물 및 부산물은 가용성인 어떠한 조합의 용매도 사용될 수 있다. 원하는 생성물이 불용성인 용매를 사용하는 과량의 단량체 (I)에서 유래하는 불순물의 이와 같은 선택적 추출은 생성물의 단리를 위한 매우 바람직한 방법이다.

결합 및 임의의 정제 후에는, 사슬 연장이 수행된다. 이당체 생성물의 연장에 앞서, 하기 반응 2의 단계 B에 나타낸 바와 같이 폴리글루코사민 결합 위치로부터 규소 차단 기가 제거된다. 규소 기는 예컨대 최소한의 무수 테트라하이드로퓨란 (THF)에 용해시킨 다음, 아세트산 (2-3 당량) 및 THF 중 n-테트라부틸암모늄 플루오라이드 용액 (1 M, 2-3 당량)과 반응시키는 것에 의해 제거될 수 있다. 반응의 진행은 반응 혼합물의 TLC 또는 NMR 중 어느 것에 의해 모니터링될 수 있다. 규소 보호 기를 제거하기 위한 추가적인 방법들은 업계 숙련자에게 잘 알려져 있다.

완료시에는, 반응 혼합물을 농축하여 건조하고, 잔류물을 메틸렌클로라이드와 같은 용매에 용해시킨 후, 물, 1 M HCl 수용액, 0.6 %-3 % 표백 용액 (암갈색 색상을 제거하기 위한 것), 및 포화 중탄산 나트륨 수용액으로 세척한다. 잔류하는 유기 층을 무수 황산 마그네슘 상에서 건조하여 농축하여 건조시킨다. 생성물의 정제는 통상적으로 이전 단계로부터의 잔류 단량체는 물론 규소 불순물의 제거를 보장하는 예컨대 디에틸에테르 또는 n-헥산-에틸 아세테이트 혼합물을 사용한 침전에 의해 이루어진다. 생성물은 불용성이나 불순물 및 부산물은 가용성인 어떠한 조합의 용매도 침전에 사용될 수 있다.

다음에, 적절하게 보호된 티오글리코시드 공여체인 추가적인 단량체 (I)이 상기한 바와 같은 활성화제를 사용하여 글리코실 결합을 통해 비차단된 이당체에 첨가된다. 반응 2에 나타낸 바와 같이, 상기한 일반적 결합 절차에 따라 이당체가 단량체 (II) 대신 사용된다. 나타낸 것은 단계 B에서의 규소 차단 기의 제거 및 글루코사민-단량체 (I)의 첨가에 의해 3분자체의 저분자량 폴리글루코사민을 형성시키는 글루코사민 2분자체의 반응의 예이다. 글리코실 수용체 (예의 반응에서는 글루코사민 2분자체)에 대한 단량체 (I)의 결합은 단계 A이다.

유기 용매 세척에 의한 정제 역시 상기한 바와 같다. 추가적인 사슬 연장 과정은 규소 차단 기 제거 및 단량체 (I)의 첨가에 의해 수행된다. 티오글리코시드와 폴리글루코사민이 x + 1의 길이를 가지며 여기서 x는 개시 폴리글루코사민의 길이이고 1은 하나의 단량체 단위체인 베타 결합 폴리글루코사민을 형성하도록, 단계적인 방식으로 공정이 반복된다. 각 단계에서의 반응이 거의 정량적이기 때문에, 각 단계를 완료하면 동일한 사슬 길이를 가지는 약 80 %를 초과하는 분자를 포함하는 생성물이 형성된다. 따라서, 생성물에는 베타 결합 올리고글루코사민 분자의 단일 아노머가 풍부하게 된다.

상기 단계들은 지질키토올리고당의 합성에 사용되는 전구체 올리고글루코사민을 형성하기에 적당한 단위체 길이를 가지는 폴리글루코사민 사슬이 제조될 때까지 반복된다. 상기 폴리글루코사민 사슬 길이는 2 내지 약 21 단위체 사이일 수 있다. 약 3 내지 약 7 단위체 사이의 사슬 길이가 본 방법에 사용하기에 특히 적합하다.

다음에, 전구체 올리고글루코사민 상의 벤조일 및 프탈이미도 보호 기가 그의 아세테이트로 전환된다. 보호 기는 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 제거된다. 2-5 잔기를 포함하는 중합체에서, 이것은 2단계 절차로 수행된다. 먼저, 탈-O-벤조일화는 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 젬플렌법(Zemplens' method)에 의해 메탄올 중 나트륨 메톡사이드를 사용하여 수행될 수 있다. 프탈로일 기는 역시 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 에틸렌디아민-유도체화 메리필드 수지(Merrifield resin) (문헌 [P. Stangier, O. Hindsgaul, Synlett. 1996, 2: 179-181])를 사용하는 것에 의해 제거될 수 있다. 다르게는, 벤조일 및 프탈이미도 기의 제거는 환류 온도에서 하이드라진 또는 n-부탄올 중 하이드라진으로 보호된 생성물을 처리하고, 이어서 물을 사용하여 생성물인 폴리헥소스아민을 선택적으로 추출하는 것에 의해 단일의 단계로 수행될 수 있다. 상기 단일 단계법은 4를 초과하는 길이의 중합체에 바람직한데, 젬플렌 조건 하에서의 그의 불완전한 탈-벤조일화 및 메탄올과 n-부탄올에서의 그의 용해도의 결핍 때문이다. 실릴 보호 기는 사슬 연장 단부의 말단 4-하이드록실 기 상에 남아 있다.

다음에, 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 절차를 사용하여 생성된 화합물의 하이드록실 및 아미노 기가 아실화된다. 아세틸 기와 같은 단순한 아실 기에 있어서, 아실화는 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 바와 같이 소량의 4-N,N-디메틸아미노 피리딘의 첨가를 이용한 피리딘 및 아세트산 무수물의 첨가에 의해 수행될 수 있다. 아세틸 또는 프로피오닐 기와 같은 단순한 아실 기의 무수물은 시중에서 구입가능해서, 용이하게 사용된다. 무수물이 구입가능하지 않은 다른 유형의 아실 기에 있어서는, 상응하는 산 염화물이 사용된다. 지질키토올리고당 분자에서 볼 수 있는 바와 같이, 아미노 기의 아실 기는 영구적으로 유지되는 것이 바람직한 반면, 하이드록실 관능기의 아실 기는 제거된다. 경우에 따라, 고도로 반응성인 아미노 기를 먼저 아실화하고, 이어서 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 하이드록실 기를 아실화하는 것에 의해, 아미노 및 하이드록실 관능기에 아실 기가 시차적으로 도입될 수도 있다.

다음에, 폴리글루코사민 사슬 연장 반응에서 전기한 바와 같이, 생성된 화합물로부터 규소 차단 기가 제거된다. 생성되는 N- 및 O-아실 올리고글루코사민 화합물을 상기에 구조 B로서 나타내었다. 다음에, 구조 B의 화합물은 구조 C의 화합물 (보호 프탈로일 기를 가짐; 상기에 나타낸 구조)과 반응된다. 구조 C의 화합물은 단량체 (I) 합성에서의 중간체로서, 그 제조는 구조 C에 나타낸 것과 동일한 화합물인 실시예 2의 생성물 4에 대한 것과 같다. 구조 B 화합물과 구조 C 화합물의 반응은 단량체 (I)과 (II)의 결합은 물론, 올리고글루코사민 사슬 + 단량체 (I)의 결합에 대하여 상기한 바와 같이 수행된다. 생성되는 결합된 구조 B + C 생성물은 결합된 단량체 (I) + (II) 생성물에 대하여 상기한 바와 같이 단리된다.

결합된 구조 B + C 생성물의 보호 N-프탈이미도 기 및 에스테르 기는 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 조건을 사용하여 2-단계 반응으로 제거된다. 알콜 중 금속 알콕사이드와의 트랜스에스테르화에 의해, 특히 메탄올 중 나트륨 메톡사이드로 에스테르를 처리함으로써, 에스테르 기가 먼저 제거된다. 다음에, N-프탈로일 기는 환류 조건 하에서의 아민 또는 디아민과의 반응에 의해, 특히 탈-에스테르화된 생성물을 메탄올 및 에탄올과 같은 알콜성 용매 중 하이드라진으로 처리함으로써, 또는 탈-에스테르화된 생성물을 에틸렌디아민 유도체화 메리필드 수지로 처리함으로써 제거된다. 프탈이미도 기가 제거된 탈-에스테르화 생성물은 물을 사용하여 추출하고, 메틸렌 클로라이드와 같이 불순물을 추출할 수 있는 용매로 수성 층을 세척하여 불순물을 제거함으로써 단리된다. 생성되는 화합물은 말단 당 단위체 상에 자유 아미노 기를 가지는 반면, 다른 모든 질소는 아실화되어 있다.

말단 당 단위체 상에 자유 아미노 기를 가지는 반면 다른 모든 질소는 아실화되어 있는 화합물을 제조하기 위한 또 다른 방법은 구조 D의 화합물로부터 시작하여 수행될 수 있다:

(여기서, R¹은 H 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 및 아르알킬 기에서 선택됨).

구조 D로 표시되는 화합물은 생성물 13의 합성에 대하여 여기의 실시예에 기술되어 있는 방법에 따라 합성될 수 있다. 에스테르 기는 환류 조건 하에서 알콜 중 금속 알콕사이드를 사용하는 트랜스에스테르화 조건 하에서 제거된다. 내부 N-프탈이미도 기는 에틸렌디아민 수지와 반응시킴으로써 제거된다. 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 내부 아미노 기의 아실화가 수행되고, 이어서 테트라-N-알킬 암모늄 플루오라이드와 반응시키는 것에 의해 말단 당 단위체 상의 실릴 기와 에스테르 및 N-프탈이미도 기가 제거되며, 이어서 환류 조건 하에서 아민 또는 디아민과 반응시킴으로써, 말단 당 단위체 상에 자유 아미노 기를 포함하는 탈-실릴화 및 탈-N-프탈이미드화 생성물이 생성된다.

자유 아미노 기는 화학식 R¹COX (여기서, 산 및 산 할로겐화물에 대하여 각각 X = OH 또는 할로겐화물이며, R¹은 H, C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 아르알킬, 알케닐, 디에닐, 및 트리에닐 기에서 선택됨)의 산 또는 산 할로겐화물과 선택적으로 반응된다.

통상적으로, 산 할로겐화물은 염화물 반응물이나, 브롬화물 및 요오드화물 역시 사용될 수 있다.

보호 N-프탈이미도 기 및 에스테르 기가 제거된 결합된 구조 B + C 생성물의 말단 당 상 자유 아미노 기와 R¹COX의 반응은 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 방법 (그 일부가 WO2005063784A1호에 기술되어 있음)에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 반응물들은 DMF-물 혼합물, 또는 물과 메탄올 또는 에탄올 혼합물에 용해될 수 있다. 산 할로겐화물이 반응에 사용되는 경우에는, 탄산 나트륨, 탄산 칼륨, 중탄산염, 트리에틸아민, 또는 알칼리 또는 알칼리토 금속의 수산화물과 같은 염기 촉매가 사용된다. 산이 아미드화 반응에 사용되는 경우, 그것은 에틸-(N,N-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드와 같은 카르보디이미드의 존재 하에 수행되며, 반응을 촉진하기 위하여 N-하이드록시벤즈트리아졸이 첨가될 수 있다. 생성물은 산 수지 컬럼을 통한 여과 후 건조하는 것에 의한 것과 같이 업계 숙련자에게 알려져 있는 방법에 의해 단리될 수 있다. 반응 결과 구조 A (상기에 나타냄)를 가지며 지질키토올리고당으로 지칭되는, 말단 잔기의 아미노 기에 결합된 지방산 축합물을 가지는 N-아실글루코사민 화합물이 형성된다. 본 방법에서 제조된 화합물은 내부 잔기 상에도 하나 이상의 지방산 기를 가질 수 있다. 구조 B 화합물의 합성시, 글루코사민 단량체 단위체는 한번에 하나씩 서로에게 첨가됨으로써, 올리고머 중 각 글루코사민 단위체를 선택할 기회를 제공하고, 지방산의 것을 포함하여 원하는 아실 기가 선택된 글루코사민 단위체에 도입되는 것을 가능케 한다. 따라서, 말단 글루코사민 단위체에 지방산을 첨가하는 것 이외에도, 글루코사민 단위체와 함께 내부 위치에 지방산이 도입될 수 있다.

지질키토올리고당에는 질소 고정 세균에 의한 콩류 뿌리의 근립착생과 관련된 신호전달 인자인 천연 근립 인자가 포함된다. 근립착생의 증가를 통하여 식물에 대한 질소 공급을 증가시킴으로써, 지질키토올리고당 근립 인자는 식물의 생장 및 수율을 향상시킨다. 지질키토올리고당은 식물의 뿌리, 잎 또는 종자를 처리하는 데에 사용될 수 있다. 본 화합물은 토양에, 식물 엽면으로, 또는 종자 코팅으로서 적용될 수 있다. 콩류 및 비-콩류 식물 모두가 이러한 처리에 의해 혜택을 볼 수 있다.

여기에서 개시되는 방법을 사용하여 제조되는 개별적인 지질키토올리고당은 예컨대 데몬트-카울렛(Demont-Caulet) 등의 문헌 [Plant Physiology 120:83-92 (1999)]에 기술되어 있는 바와 같이 업계 숙련자에 의해 콩류 뿌리 근립착생에 대한 효과와 관련하여 용이하게 시험될 수 있다. 여기에서 개시되는 방법을 사용하여 제조되는 개별적인 지질키토올리고당의 콩류 및 비-콩류 식물의 식물 생장 제고 및 수율 향상 촉진에서의 효과 또한, 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 바와 같이 용이하게 시험될 수 있다. 따라서, 공지의 천연 근립착생 인자에 해당하지 않으나, 근립착생 자극 활성, 식물 생장 향상 활성, 또는 수율 향상 활성을 가지는 구조 A의 화합물이 여기에서 개시되는 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 이러한 적용분야에 대한 시험에 의해 용이하게 식별될 수 있다.

일반적 방법 및 재료

특정되지 않는 한, 모든 반응물은 알드리치 케미칼 코(Aldrich Chemical Co) (미주리, 세인트루이스 소재) 사로부터 구입한 것이다. 박층 크로마토그래피는 실리카 겔 60 F₂₅₄ (EM 사이언스(Science) 사)의 사전-코팅된 플레이트 상에서 수행되었으며, 에탄올 중 5 % 황산을 함유하는 분무액으로 스폿(spot)을 가시화하고, 이 어서 가열하였다. 컬럼 크로마토그래피는 실리카 겔 60 (230-400 메쉬, EM 사이언스 사) 상에서 수행되었다. ¹H NMR 스펙트럼은 500 MHz에서 기록되었다. 유기 용매 중에서의 수소 화학적 이동은 5.36 ppm의 기준 화학적 이동으로 중수소화 메틸렌클로라이드에 대하여 나타낸다. 산화 중수소 또는 중수소화 메탄올 중 화합물의 용액에 있어서, 수소 화학적 이동 값은 HOD 신호 (296 °K에서 4.75 ppm)에 대하여 나타낸다.

실시예 1

2-데옥시-1,3,4,6-테트라-O-아세틸-2-프탈이미도-D-글루코피라노스의 합성

D-글루코사민 하이드로클로라이드 (화합물 1, 1.0 Kg)을 메탄올 (5.0 L)에 현탁시키고, 강력하게 교반하였다. NaOH (184.8 g)을 최소한의 탈이온수에 용해시켜, D-글루코사민/메탄올 현탁액에 첨가하였다. 현탁액을 15분 동안 교반하고, 진공 여과에 의해 불용성 물질 (염화 나트륨)을 여과 제거하였다. 형성된 NaCl의 이론적 양은 약 270 g일 것이다.

여과액에, 프탈산 무수물 (342 g)을 첨가하고, 대부분의 고체가 용해될 때까지 (약 30분) 용액을 교반하였다. 다음에, 이에 이어 트리에틸아민 (468 g)을 첨가하고 10 내지 15분 동안 교반하였다. 생성되는 투명 용액에, 추가분의 프탈산 무수물 (342 g)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 생성물은 보통 2시간 후부터 침전 분리되기 시작하였다.

침전된 생성물을 여과하고, 생성물로부터 황색 색상이 제거되도록 최소한의 빙냉 메탄올로 잔류물을 세척하였다. 다음에, 고체가 완전히 잠기도록 충분한 용매를 필터에 첨가하면서 잔류물을 아세토니트릴로 3회 세척하고, 고진공 하 실온에서 건조하였다. 생성물 2인 백색 고체의 중량은 954 g이었다. ¹H-NMR (D₂O): 7.74-7.56 (프탈이미도 수소), 5.42 (H-1α), 4.94 (H-1β), 4.17 및 4.01 (H-6), 3.27 (N-에틸 기의 CH₂), 1.35 (N-에틸 기의 CH₃).

상기로부터의 생성물 2 (1.01 Kg, 2개의 배치로부터 제조된 것)를 오버헤드 전기 교반기, N₂ 주입구 및 첨가 깔대기가 구비된 10 리터 3구 원형저 플라스크에 넣었다. 아세트산 무수물 (3 L) 및 N,N-디메틸아미노피리딘 (1.0 g)을 플라스크에 첨가하고, 강력하게 교반하였다. 피리딘 (2.8 L)을 천천히 첨가하고, 반응 혼합물 을 실온에서 2일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수 (4 L)로 급랭하고, 생성물을 메틸렌클로라이드로 추출하였다. 염산 수용액으로, 이어서 포화 중탄산 나트륨 용액으로 유기 층을 반복하여 세척하였다. 유기 층을 무수 황산 마그네슘 상에서 건조하고, 여과한 후, 농축하여 건조하였다. 고온 에탄올로부터 생성물을 재결정화하였다. 재결정화된 생성물 3의 중량은 701 g이었다. ¹H-NMR (CD₂Cl₂) δ: 7.91-7.80 (프탈이미도 수소), 6.62 (H-1), 5.59 (H-3), 5.21 (H-4), 4.47 (H-2), 4.36 및 4.16 (H-6), 4.06 (H-5), 2,12, 2.06, 2.02, 1.88 (아세틸 메틸 기). 이에 따라, 상기 NMR 화학적 이동 데이터는 하기 실시예 2에 나타낸 2-데옥시-1,3,4,6-테트라-O-아세틸-2-프탈이미도-D-글루코피라노스인 생성물 3의 구조를 입증하였다.

실시예 2

단량체 (I)의 합성

중간 생성물 4의 제조:

생성물 3 (464 g)을 톨루엔에 용해시키고, 용매를 증발시켰다. 이것을 반복하고, 남아 있는 고체를 밤새 고진공 라인 상에 위치시켰다.

건조된 고체를 최소한의 메틸렌클로라이드 (약 600 ml)에 용해시키고, 잘 교반하였다. 여기에, 4-메틸벤젠티올 (181 g, 1.45 몰, 1.5 당량)을 첨가하고, 이어서 붕소 트리플루오라이드 디에틸 에테레이트를 적가하였다 (BF₃-에테레이트: 165 g, 1.16 몰, 1.2 당량, 180분 이상). 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 아침에 교반을 중지하였을 때 백색의 결정이 형성되었다. 결정을 여과하여 생성물 4A를 산출하였다. 여과액을 메틸렌클로라이드로 희석하고, 포화 NaHCO₃ 용액, 물, 이어서 중탄산염 용액을 사용하여 순차적으로 세척한 후, 건조하여 생성물 4B를 산출하였다. 무수 메탄올을 사용하여 4A 및 4B 생성물 모두를 광범위하게 세척하고, 진공 하에서 건조하였다. 4A 및 4B 생성물의 NMR 스펙트럼이 동일하였으므로, 이들 둘을 합쳤다 (생성물 4, 426.3 g).

¹H-NMR (CD₂Cl₂) δ: 7.96-7.80 (프탈이미도 수소), 7.36 및 7.13 (S-방향족 수소), 5.78 (H-3), 5.69 (H-1), 5.13 (H-4), 4.33 (H-2), 4.30 및 4.12 (H-6), 3.93 (H-5), 2.36 (S-Ph-Me 기), 2.13, 2.04, 1.85 (아세틸 기의 메틸). 이에 따라, NMR 스펙트럼은 상기에 나타낸 바와 같은 생성물 4의 구조를 입증하였다.

중간 생성물 5의 제조

생성물 4 (350 g)을 거의 4 L의 무수(dry) 메탄올에 현탁시켰다. 여기에, 35 ml의 0.5 M 나트륨 메톡사이드 용액을 첨가하자, 용액은 즉시 염기성으로 전환되었다. 현탁액을 교반하면서 실온에서 밤새 방치하였다. 침전된 고체를 여과하고, 디클로로메탄으로 세척하여 순수한 생성물 5 (232 g)을 산출하였다. 여과액을 술폰산 수지로 중화하고, 농축하여 건조하였다. 건조 고체를 메틸렌클로라이드로 세척하고, 건조하여 순수하지 않은 화합물 5 (43.8 g)을 산출하였다. 순수한 5의 ¹H-NMR (CD₃OD) δ: 7.87-7.76 (프탈이미도 수소), 7.22 및 6.99 (S-방향족 수소), 5.46 (H-1), 4.18 (H-2), 4.03 (H-3), 3.89 및 3.70 (H-6), 3.39 (H-5), 3.37 (H-4), 2.22 (S-Ph-Me 기). 이에 따라, NMR 스펙트럼은 상기에 나타낸 바와 같은 생성물 5의 구조를 입증하였다.

중간 생성물 6의 제조

생성물 5 (295 g; 638 mmol)을 무수 톨루엔 (1 L)에 현탁시키고, 진공 하에서 증발시켰다. 이 절차를 한번 더 반복하여 반응에 유해한 메탄올 오염물을 확실하게 제거하였다. 총 265 g을 회수하였다. 톨루엔 증발 후의 잔류물을 오버헤드 교반기가 구비된 3-구 플라스크에서 메틸렌클로라이드 (3 L)에 현탁시키고, 현탁액을 건조 질소 대기 하에서 교반하였다. 플라스크를 얼음 배스에서 냉각시키고, 하기의 반응물들을 첨가하였다: 피리딘 = 126 g, N,N-디메틸아미노피리딘 = 500 mg; 및 벤조일 클로라이드: 171 g (첨가 깔대기를 사용하여 60분에 걸쳐 액적으로 천천히 첨가). 반응 혼합물은 유백색이었으나, 모든 벤조일 클로라이드가 첨가되자 투명해지기 시작하였다. 반응액을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 반응액을 메틸렌클로라이드로 희석하고, 물 (2 ×), 1 M 수성 HCl (2 ×), 이어서 포화 NaHCO₃로 세척한 후, MgSO₄로 건조하였다.

조생성물을 8 리터의 고온 EtOH에서 재결정화하고, 결정을 여과한 후, EtOH에서 세척하여 수확물 6A (225 g)를 산출하였다. 여과액을 농축하여 건조함으로 써, 수확물 6B (131 g)를 산출하였다. 수확물 6A의 2차 재결정화를 수행하여 순수한 생성물 6 (172 g)을 산출하였다. 2차 재결정화 여과액으로부터의 잔류물 (40 g)은 NMR로 측정하였을 때 95 %를 초과하는 순도의 생성물 6을 포함하였다. NMR 분석에서 상당량의 원하지 않는 생성물을 포함하는 것으로 나타났기 때문에, 생성물 6B는 더 이상 처리하지 않았으며, 그에 따라 화합물 5로 다시 재활용되었다.

¹H-NMR (CD₂Cl₂) δ: 8.14, 7.88, 7.69, 7.57, 7.41 (벤조에이트 수소), 7.80-7.72 (프탈이미도 수소), 7.34 및 7.00 (S-방향족 수소), 5.93 (H-3), 5.79 (H-1), 4.77 및 3.99 (H-6), 4.47 (H-2), 4.03-3.99 (H-5), 3.91 (H-4), 3.25 (OH), 2.31 (S-Ph-Me 기). 이에 따라, NMR 스펙트럼은 상기에 나타낸 바와 같은 생성물 6의 구조를 입증하였다.

단량체 (I)의 제조

생성물 6 (171.9 g; 275.6 mmol)을 콜리딘 (41.7 g; 344.5 mmol; 1.25 당량)을 함유하는 최소한의 메틸렌클로라이드 (350 mL)에 용해시켰다. t-BDMS-트리플레이트 (80.0 g; 303.1 mmol; 1.1 당량)를 첨가 깔대기를 사용하여 (50분에 걸쳐) 적 가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 메틸렌클로라이드로 희석하고, 빙냉수, 0.5 M 수성 HCl (빙냉), 이어서 수성 포화 NaHCO₃를 사용하여 순차적으로 세척하였다. 다음에, 그것을 MgSO₄로 건조하고, 여과한 후, 농축하여 백색의 고체 (207 g)로서 단량체 (I)을 산출하였다. 생성물을 무수 톨루엔에 용해시키고, 농축하여 건조한 후, 글리코실화 반응에 사용하였다. 회수된 단량체 (I) 생성물 207 g은 203.4 g으로 계산된 이론적 수율과 본질적으로 동일하였다.

¹H-NMR (CD₂Cl₂) δ: 8.16-7.41 (벤조에이트 수소, 프탈이미도 수소), 7.30 및 6.95 (S-방향족 수소), 5.97 (H-3), 5.82 (H-1), 4.89 및 4.49 (H-6), 4.40 (H-2), 4.14 (H-4), 4.01 (H-5), 2.30 (S-Ph-Me 기), 0.80 (규소 상의 t-부틸 기), 0.09 및 -0.16 (규소의 메틸 기). 이에 따라, NMR 스펙트럼은 상기에 나타낸 바와 같은 단량체 (I)의 구조를 입증하였다.

실시예 3

단량체 (II)의 합성

중간 화합물 7의 제조

출발 글리코시드에 EtOH 미량물질이 없도록 하기 위하여, 화합물 3 (60.0 g; 126 mmol)을 톨루엔에 용해시켜 증발시켰다. 다음에, 그것을 MeOH (6.5 g; 202 mmol; 1.6 당량)를 함유하는 무수 CH₂Cl₂ (500 ml)에 용해시켰다. 사염화 주석 (SnCl₄; 18.4 g; 70.5 mmol; 0.56 당량)을 CH₂Cl₂ (25 ml)로 희석하여 적가하였다. 반응 혼합물을 빙수에 붓고, 잘 흔들었다. 이것을 한번 더 반복한 다음, 유기 층을 수성 포화 NaHCO₃로 2회 세척하고, MgSO₄로 건조하여, 여과한 후, 농축하였다. 조생성물을 고온 EtOH로부터 재결정화하여, 생성물 7의 결정 (43.1 g)을 산출하였다. 생성물 7의 조수율 49.8 g은 56.6 g으로 계산된 이론적 수율의 88 %인 반면, 43.1 g의 재결정화 생성물 7 수율은 76 %이었다.

¹H-NMR (CD₂Cl₂) δ: 7.86-7.74 (프탈이미도 수소), 5.78 (H-3), 5.31 (H-1), 5.18 (H-4), 4.31 (H-2), 4.34 및 4.20 (H-6), 3.88 (H-5). 2.20, 2.03, 1.86 (아세틸 기의 메틸). 이에 따라, NMR 스펙트럼은 상기에 나타낸 바와 같은 생성물 7의 구조를 입증하였다.

중간 생성물 8의 제조

생성물 7 (141.0 g; 314 mmol)을 MeOH (1000 ml)에 현탁시키고, NaOMe (0.5 M, 10 ml)를 첨가하였다. 메틸 글리코시드 생성물 7은 MeOH에 쉽게 용해되지 않았다. 염기성을 확인하기 위하여 용액을 시험하였다. 반응액을 밤새 교반하였다. 용액이 투명해졌다. TLC (EtOAc-헥산-EtOH = 10:20:1)에 의해 반응 혼합물을 조사한 결과, 출발 물질이 사라졌으며 극성 생성물 (원형에 가까움)이 형성되었음을 나타내었다. 용액을 술폰산 수지로 중화하고, 여과한 후, 농축하여 건조하였다. 생성물 8로 지칭되는 잔류물의 중량은 105.3 g이었으며, 약간의 메탄올을 포함하는 것으로 추정되었다.

생성물 8의 조수율 105.3 g은 101.3 g으로 계산된 이론적 수율과 본질적으로 동일하였다. ¹H-NMR (CD₃OD) δ: 7.85-7.80 (프탈이미도 수소), 5.07 (H-1), 4.21 (H-2), 3.94 (H-3), 3.92 및 3.74 (H-6), 3.40 (H-5), 3.40 (OCH₃), 3.38 (H-4). 이에 따라, NMR 스펙트럼은 상기에 나타낸 바와 같은 생성물 8의 구조를 입증하였다.

단량체 (II)의 제조

생성물 8 (조생성물; 105.3 g)을, 톨루엔-DMF를 사용하여 증발시킨 후에, CH₂Cl₂ (500 ml)에 현탁시켰다. 먼저 피리딘 (61.8 g; 782 mmol; 2.5 당량)을 첨가하고, 이어서 벤조일 클로라이드 (88 g; 626 mmol; 2.0 당량)을 혼합물에 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. 다음에, 이것을 CH₂Cl₂로 희석하고, H₂O, 1 M HCl (2 ×), 이어서 포화 중탄산 나트륨 수용액을 사용하여 순차적으로 세척한 후, MgSO₄로 건조하여, 여과하고, 농축하였다. EtOAc-헥산 = 3:8을 용리액으로서 사용하는 실리카 겔 상에서의 크로마토그래피에 의해 생성물을 정제하였다. 정제된 생성물의 중량은 116.1 g이었다. NMR로 측정하였을 때, 생성물은 약 90 % 순수하였다. 이 생성물의 일부 (21.1 g)를 디에틸에테르-헥산으로부터 결정화하여 단량체 (II)의 순수한 결정질 물질 (13.8 g)을 수득하였다. ¹H-NMR (CD₂Cl₂) δ: 8.15, 7.92, 7.67, 7.56, 7.42 (벤조에이트 수소), 7.83-7.74 (프탈이미도 수소), 5.93 (H-3), 5.40 (H-1), 4.82 및 4.72 (H-6), 4.43 (H-2), 4.03-3.92 (H-5, H-4), 3.50 (OCH₃), 3.33 (OH). 이에 따라, NMR 스펙트럼은 상기에 나타낸 바와 같은 단량체 (II)의 구조를 입증하였다.

실시예 4

유도체화 글루코사민 이당체의 합성

올리고글루코사민 유도체의 구조 특성화:

하기하는 결합된 생성물의 구조는 양성자 NMR 및 질량 분광측정법에 의해 하기와 같이 확인되었다. 프탈이미도 글루코사민 단위체의 수소 H-3 및 H-1의 화학적 이동은 양성자 NMR 스펙트럼에서 5 내지 6.5 ppm 사이의 화학적 이동으로 출현하였다. 수소 H-3는 약 8-10 Hz의 결합 상수를 가지는 이중선의 이중선(doublet of doublet)으로서 출현하였다. 이당체 내지 오당체에 있어서는, 이러한 수소 신호의 수를 계수하는 것에 의해 올리고글루코사민의 길이가 용이하게 확인될 수 있다. 6 이상의 올리고글루코사민 유도체에서는 이러한 수소에 대한 신호들이 겹치기 시작한다. 그러나, 충분한 수의 이러한 신호들을 식별하여 구조를 확인할 수 있다. 아노머 수소에 대해서도 유사한 관찰 결과가 나타나는데, 이것은 약 8-8.5 Hz의 결합 상수를 가지는 이중선으로 출현함으로써 β-글리코시드 구성을 확인시켜준다. 또한, 말단 글루코사민 단위체 H-4의 화학적 이동은 해당 탄소가 하이드록실 기를 보유하는 경우 3.5 ppm 부근에서 출현한다. 이것은 이 위치에서의 글리코실화에 의해 3.7 ppm으로 이동된다. 따라서, H-4는 글리코실화 반응의 성공을 확인시켜주는 리포터 기(reporter group)로서 사용될 수 있다. 구조에 대한 추가적 인 증거는 생성물의 MALDI 및 전기분무 질량 스펙트럼 데이터에 의해 수득되었으며, 각 화합물에 대하여 이들을 나타내었다.

2분자체 생성물 9의 합성

모두 톨루엔으로 1회 미리 증발시켜 놓은 단량체 (I) (80.6 g, 109.3 mmol, 1.2 당량) 및 단량체 (II) (48.4 g, 91.1 mmol)를 3-구 500 ml 플라스크에서 CH₂Cl₂ (150 mL)에 용해시켰다. 4A 분자 체를 첨가하였다 (5 g). 혼합물을 질소 대기 하에서 강력하게 교반하면서 -60 ℃로 냉각하였다. 10분 후, N-요오도숙신이미드 (NIS; 44.3 g; 196.7 mmol; 2.2 당량)을 건조 분말로서 첨가하고, 이어서 메틸렌클로라이드 중 트리플산 (TfOH; 13.7 g, 91.1 mmol, 1.0 당량) 및 메틸트리플레이트 (14.9 g, 54.8 mmol, 1.0 당량)의 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 -55 ℃에서 추가적인 4시간 동안 방치하였다. 추가적인 100 ml의 트리플산/메틸트리플레이트 용액을 반응 혼합물에 적가하여 점도를 감소시켰다. 반응 혼합물을 셀라이트 패드(celite pad)를 통하여 여과 동안 철저하게 교반되는 1:1 포화 티오황산 나트륨-중탄산 나트륨 용액을 포함하는 필터 플라스크로 냉장 여과하였다. 플라스크와 필 터 상의 잔류물을 메틸렌클로라이드로 헹구고, 합친 여과액을 하기와 같이 후처리하였다. 여과액을 분별 깔대기(separatory funnel)로 부었다. 내용물을 철저하게 혼합하고, 수용액을 분리한 후, 유기 층을 포화 티오황산 나트륨 수용액, 이어서 물, 및 포화 중탄산 나트륨 수용액으로 1회 더 세척하였다. 다음에, 용액을 황산 마그네슘으로 건조하고, 여과하여 농축하였다. 조생성물의 중량은 111.1 g이었다. 조 생성물을 용리액으로서 에틸 아세테이트-헥산을 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의한 분리에 적용함으로써, 분석적으로 순수한 샘플을 제조하였다. ¹H-NMR (CD₂Cl₂) δ: 8.17-7.19 (프탈이미도 및 벤조에이트 수소), 6.11 및 5.76 (2 × H-3), 5.74 및 5.31 (2 × H-1), 4.36 및 4.32 (2 × H-2), 4.32 및 3.93 (2 × H-4), 3.90 및 3.53 (2 × H-5), 4.65, 4.38, 4.12, 및 3.63 (4 × H-6), 3.38 (OCH₃), 0.68 (t-부틸), -0.12, -0.40 (2 × CH₃). 질량 분광측정법: 분자량 계산치 1144.37; 관측치 M+Na = 1167.5. 이에 따라, NMR 스펙트럼은 상기에 나타낸 바와 같은 생성물 9의 구조를 입증하였다. 그대로의 조생성물을 다음 단계에 사용하였으며, 거기에서 tBDMS의 완전한 제거가 수행되었다.

실시예 5

사슬 연장을 위한 이당체 생성물 9로부터의 규소 기의 제거

중간 생성물 10의 제조

생성물 9 (111.1 g)을 THF (350 ml)에 용해시켰다. 이 용액에 아세트산의 1 M 용액 (110 ml) 및 THF 중 n-테트라부틸암모늄 플루오라이드의 1 M 용액 (110 ml)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 용매로서 EtOAc:Hex:EtOH = 4:8:1을 사용하는 TLC에 의해 반응의 완료를 확인한 결과, 반응이 완료되었음을 나타내었다. 고진공 (가열 없이) 상에서 반응 용매를 증발시키고, 잔류물을 CH₂Cl₂에 용해시킨 후, 물, 1 M 수성 HCl, 10 % 티오황산 나트륨 수용액, 그리고 최종적으로 포화 수성 NaHCO₃를 사용하여 순차적으로 세척하였다. 다음에, 용액을 MgSO₄로 건조하고, 여과하여 농축하였다. 생성되는 고체를 디에틸에테르로 처리하자 아교질의 물질이 생성되었다. 상청액을 여과하고, 디에틸에테르를 사용하여 아교질 물질을 반복적으로 세척하였다. 여과액에 헥산을 첨가하여 소정의 에테르 가용성 생성물을 침전시키고, 이것을 여과하였다 (분획 B, 5.9 g). 에테르-헥산으로부터의 최종 여과액을 농축하여 건조하였다 (분획 C).

NMR 스펙트럼은 분획 B 생성물이 원하는 주요 이당체와 함께 약 5 %의 규소 불순물 (0 ppm 부근의 피크)을 가진다는 것을 나타내었다. 분획 A는 tBDMS 불순물 및 테트라부틸암노늄 유도체로 약 10 % 오염되어 있었다. 따라서, 분획 A를 600 ml의 에테르에 재현탁시키고, 약 10분 동안 혼합하여 여과한 후, 과정을 한번 더 반복하였다 (회수된 고체의 중량은 77.3 g이었음). 생성물을 에틸 아세테이트에 용해시키고 헥산을 이용하여 생성물을 침전시키는 것에 의해, 이 고체를 한번 더 정제하였다 (회수된 생성물의 중량은 71.7 g이었음). 여과액을 합치고 헥산을 첨가하여, 나머지 생성물을 침전시킴으로써, 추가적인 10.8 g의 생성물을 회수하였다. ¹H-NMR (CD₂Cl₂) δ: 8.12-7.14 (프탈이미도 및 벤조에이트 수소), 6.14 및 5.73 (2 × H-3), 5.72 및 5.34 (2 × H-1), 4.37 및 4.34 (2 × H-2), 4.10 및 3.69 (2 × H-4), 3.97 및 3.44 (2 × H-5), 4.66, 4.18, 4.12-4.06 (4 × H-6), 3.38 (OCH₃), 3.35 (OH). 질량 분광측정법: 분자량 계산치 1030.98; 관측치 M+Na = 1053.1. 이에 따라, NMR 스펙트럼은 상기에 나타낸 바와 같은 생성물 10의 구조를 입증하였다.

실시예 6

유도체화 글루코사민 삼당체의 합성

3분자체 생성물 11의 합성

단량체 (I) (88.6 g; 120 mmol; 1.5 당량) 및 생성물 10 (82.5 g; 80.0 mmol)을 플라스크에서 CH₂Cl₂ (100 ml)에 용해시켰다. 분자 체 (4A, 5.0 g)를 첨가하였다. 플라스크를 -55 ℃의 워터 배스에 넣고, 15분 동안 교반하였다. 강력한 교반을 유지하면서 냉장 용액에 NIS (48.6 g; 216 mmol)를 분말로서 첨가하였다. 첨가 깔대기를 이용하여, 모두 함께 CH₂Cl₂ (5 ml)에 용해시킨 메틸 트리플레이트 (13.1 g; 80 mmol; 1.0 당량) 및 TfOH (12 g; 80 mmol; 1.9 당량)의 용액을 냉장 용액에 적가하였다 (60분에 걸침). -60 ℃ 내지 -50 ℃에서 6시간 후, 반응 혼합물을 삼각 플라스크(Erienmeyer flask)에 들어 있는 포화 중탄산 나트륨 및 포화 티오황산 나트륨 수용액 (1:1, 400 ml) 상에 붓고, 철저하게 교반하였다. 추가적 인 메틸렌클로라이드 (200 ml)를 첨가하고, 10분 동안 내용물을 철저하게 혼합한 후, 수용액을 분리하고, 유기 층을 0.6 % 표백 수용액, 탈이온수, 및 포화 중탄산 나트륨 수용액으로 세척하였다. 다음에, 용액을 MgSO₄로 건조하고, 여과하여 농축하였다.

삼당체로부터 과량 단량체의 불순물을 제거하기 위하여, 조생성물을 디에틸에테르 (600 ml)에 현탁시킨 후, 고체를 철저하게 혼합하고 상청액을 여과하였다. 이 과정을 3회 반복하고, 잔류물을 최종적으로 메틸렌클로라이드에 용해시킨 다음, 농축하여 건조함으로써, 93.5 g의 생성물 11을 산출하였다. 여과액에, 약 40 % 부피의 헥산을 첨가하고, 침전된 물질을 여과한 후, 메틸렌클로라이드에 재용해시키고, 진공 하에서 농축하여 건조함으로써, 추가량의 화합물 11 (26.0 g)을 수득하였다. ¹H-NMR (CD₂Cl₂) δ (선택된 수소 화학적 이동만을 기록하였음): 8.13-7.12 (프탈이미도 및 벤조에이트 수소), 6.03, 5.88, 및 5.62 (3 × H-3), 5.64, 5.48, 및 5.29 (3 × H-1), 3.77 (말단 글루코사민 단위체의 H-4), 3.90 (말단 글루코사민 단위체의 H-5), 4.63 (말단 글루코사민 단위체의 H-6), 3.35 (OCH₃), 0.64 (t-부틸), -0.18, -0.33 (규소 단위체의 2 × CH₃). 질량 분광측정법: 정확한 분자량 계산치 1643.49; 관측치 M+Na = 1666.3. 이에 따라, NMR 스펙트럼은 상기에 나타낸 바와 같은 생성물 11의 구조를 입증하였다.

실시예 7

추가적인 사슬 연장을 위한 삼당체 생성물 11로부터의 규소 기의 제거

중간체 12의 제조

생성물 11을 최소한의 THF (500 ml)에 용해시켰다. 이 용액에, 아세트산의 1 M 용액 (150 ml) 및 THF 중 n-테트라부틸암모늄 플루오라이드의 1 M 용액 (150 ml) 을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시켜 건조하고, 잔류물을 메틸렌클로라이드에 재용해시킨 후, 탈이온수, 1 M HCl, 1 % 표백 수용액 (암갈색 색상을 제거하기 위함), 및 포화 중탄산 나트륨 용액을 사용하여 순차적으로 세척한 다음, 농축하여 건조하였다.

비극성의 규소 및 기타 불순물을 제거하기 위하여, 고체를 최소한의 에틸 아세테이트에 용해시켰다. 헥산을 적가하였다 (최종 용매 비율 EtOAc-헥산은 17:14이었음). 이것은 아교질의 물질을 생성시켰다. 액체를 여과하고, 아교질 물질을 EtOAc (200 ml)에 재용해시킨 후, 상기한 바와 같이 헥산 (100 ml)으로 침전시켰다. 최종적으로, 디에틸에테르를 첨가하여 아교질 물질을 고체화한 후, 고체를 여과하였다. 고체를 메틸렌클로라이드에 재용해시키고, 농축하여 건조함으로써, 81.4 g의 생성물 12를 산출하였다.

여과액 EtOAc-헥산-에테르를 농축하여 건조하였다. 잔류물을 디에틸에테르에 현탁시키고, 잘 흔들어 여과하였다. 이 과정을 2회 반복하였다. 최종적으로, 침전물을 메틸렌클로라이드에 용해시키고, 농축하여 건조함으로써, 추가적인 생성물 12 (16.5 g)을 수득하였다. ¹H-NMR (CD₂Cl₂) δ (선택된 수소 화학적 이동만을 기록하였음): 8.08-7.16 (프탈이미도 및 벤조에이트 수소), 6.03, 5.92, 및 5.59 (3 × H-3), 5.67, 5.48, 및 5.29 (3 × H-1), 3.56 (말단 글루코사민 단위체의 H-4), 3.91 (말단 글루코사민 단위체의 H-5), 4.63 (말단 글루코사민 단위체의 H-6), 3.35 (OCH₃), 3.01 (OH), 0.64. 질량 분광측정법: 정확한 분자량 계산치 1529.41; 관측치 M+Na = 1553.4. 이에 따라, NMR 스펙트럼은 상기에 나타낸 바와 같은 생성물 12의 구조를 입증하였다.

실시예 8

유도체화 글루코사민 사당체의 합성

4분자체 생성물 13의 합성

티오글리코시드 단량체 (I) (37.4 g; 50.7 mmol) 및 삼당체 생성물 12 (45.6 g; 29.8 mmol)를 플라스크에서 CH₂Cl₂ (150 ml)에 용해시켰다. 분자 체 (4A, 10.0 g)를 첨가하였다. 플라스크를 -55 ℃의 배스에 넣고, 15분 동안 교반하였다. 강력한 교반을 유지하면서 냉장 용액에 NIS (20.5 g; 91.25 mmol)를 분말로서 첨가하였다. 첨가 깔대기를 이용하여, 모두 함께 CH₂Cl₂ (20 ml)에 용해시킨 메틸 트리플레이트 (4.9 g; 29.8 mmol) 및 TfOH (4.5 g; 29.8 mmol)의 용액을 냉장 용액에 적가하였다 (60분에 걸침). -60 ℃에서 6시간 후, 반응 혼합물을 삼각 플라스크에 들어 있는 포화 중탄산 나트륨 및 포화 티오황산 나트륨 수용액 (1:1, 400 mL) 상에 붓고, 철저하게 교반하였다. 추가적인 메틸렌클로라이드 (200 ml)를 첨가하고, 10분 동안 내용물을 철저하게 혼합한 후, 수용액을 분리하고, 유기 층을 10 % 티오황산 나트륨 수용액, 1 % 표백 수용액, 및 포화 중탄산 나트륨 수용액을 사용하여 순차적으로 세척하였다. 다음에, 용액을 MgSO₄로 건조하고, 여과하여 농축하였다 (75.1 g).

사당체로부터 과량 단량체의 불순물을 제거하기 위하여, 조생성물을 디에틸에테르 (600 ml)에 현탁시킨 후, 고체를 철저하게 혼합하고 상청액을 여과하였다. 이 과정을 3회 반복하고, 잔류물을 최종적으로 메틸렌클로라이드에 용해시킨 후, 농축하여 건조하였다 (13 A, 54.2 g).

여과액에, 약 40 % 부피의 헥산을 첨가하고, 침전된 물질을 여과한 후, 메틸렌클로라이드에 재용해시키고, 농축하여 건조함으로써, 5.8 g의 생성물 13 B를 산출하였다. 13 A와 13 B의 NMR 분석에서 이들이 거의 동일한 것으로 나타났기 때문에, 이들을 합쳤다. ¹H-NMR (CD₂Cl₂) δ (선택된 수소 화학적 이동만을 기록하였음): 8.09-7.03 (프탈이미도 및 벤조에이트 수소), 6.00, 5.83, 5.76, 및 5.62 (4 × H-3), 5.62, 5.42, 5.41, 및 5.27 (4 × H-1), 3.74 (말단 글루코사민 단위체의 H-4), 3.88 (말단 글루코사민 단위체의 H-5), 4.60 (말단 글루코사민 단위체의 H-6), 3.33 (OCH₃), 0.63 (t-부틸), -0.19, -0.34 (규소 단위체의 2 × CH₃). 질량 분광측정법: 정확한 분자량 계산치 2142.62; 관측치 M+Na = 2166.4. 이에 따라, NMR 스펙트럼은 상기에 나타낸 바와 같은 생성물 13의 구조를 입증하였다.

실시예 9

벤조일 및 프탈이미도 보호 기의 그의 아세테이트로의 전환

13으로부터의 아세틸화 생성물 15의 합성

생성물 13을 하이드라진에 용해시키고, 105 ℃로 가열하였다. 20시간 후, 반응 혼합물을 농축하여 건조하였다. 다음에, 잔류물을 메틸렌클로라이드로 광범위하게 세척하여 부산물을 제거하고 생성물 14를 산출하였다.

생성물 14를 동일 부피의 아세트산 무수물을 함유하는 최소량의 무수 피리딘에 용해시켰다. 소량의 4-N,N-디메틸아미노 피리딘을 첨가하고, 반응액을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 다음에, 이것을 빙수 상에 붓고, 메틸렌클로라이드로 추출하였다. 메틸렌클로라이드 층을 빙냉 1 M 수성 염산, 그리고 이어서 포화 중탄산 나트륨 용액으로 세척하였다. 다음에, 이것을 무수 황산 마그네슘 상에서 건조하고, 감압 하에서 농축하여 생성물 15를 수득하였다.

실시예 10

탈실릴화 및 말단 프탈이미도-글루코사민 단위체의 첨가

탈-실릴화 생성물 16의 합성

사당체 15를 최소한의 THF에 용해시키고, 이어서 THF 중 아세트산의 1 M 용액 및 THF 중 테트라부틸암모늄플루오라이드의 1 M 용액을 첨가한 후, 실온에서 교반하였다. 18시간 후, NMR로 반응의 진행을 점검하여 반응의 완료를 점검하였다. 반응 혼합물을 증발시켜 건조하고, 메틸렌클로라이드에 재용해시킨 후, 포화 티오황산 나트륨 용액, 1 M HCl, 및 포화 중탄산 나트륨 용액을 사용하여 순차적으로 세척한 다음, 농축하여 건조하였다.

비극성의 규소 불순물을 제거하기 위하여, 고체를 에틸 아세테이트 (400 ml)에 용해시켰다. 침전된 물질을 교반하면서 헥산 (400 ml)를 적가하였다. 침전물을 여과하고, 과정을 한번 더 반복한 후, 이어서 1:1 EtOAc-헥산으로 고체를 최종 세척한 다음, 건조하여 생성물 16을 수득하였다.

사당체의 글리코실화

사당체 생성물 17의 합성

티오글리코시드 단량체 (실시예 2의 생성물 4; 생성물 16에 대하여 2 몰당량) 및 사당체 생성물 16을 4A 분자 체를 함유하는 최소한의 CH₂Cl₂에 용해시켰다. 용액을 -60 ℃로 냉각하고, 잘 교반하였다. -60 ℃에서 10분 후, NIS (4분자체 16 에 대하여 3.5 몰당량)를 빠르게 첨가하였다. 5분 후, 함께 CH₂Cl₂ (20 ml)에 용해시킨 트리플산 (1 당량) 및 메틸 트리플레이트 (1 당량)의 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 -60 ℃에서 추가적인 5시간 동안 방치하였다. 반응 혼합물을 삼각 플라스크에 들어 있는 포화 중탄산 나트륨 및 포화 티오황산 나트륨 수용액 (1:1, 500 ml) 상에 붓고 철저하게 교반하였다. 추가적인 메틸렌클로라이드를 첨가하고, 10분 동안 내용물을 철저하게 혼합한 후, 수용액을 분리하고, 유기 층을 1 % 표백 수용액, 10 % 티오황산 나트륨 수용액, 및 포화 중탄산 나트륨 수용액을 사용하여 순차적으로 세척하였다. 다음에, 용액을 MgSO₄로 건조하고, 여과한 후, 농축하였다. 잔류 고체를 최소한의 EtOAc에 용해시키고, 이어서 헥산을 적가하였다. 액체 부분을 여과하고, 불용성 물질을 EtOAc에 재용해시킨 다음, 헥산에서 다시 침전시켰다. 최종적으로, 디에틸에테르를 첨가하여 아교질 물질을 고체화하고, 잔류물을 에테르로 세척하여 건조함으로써, 생성물 17을 수득하였다.

실시예 11

O-아세틸 및 N-프탈이미도 기의 제거와 지질키토올리고당으로의 전환

생성물 18의 합성

생성물 17을 MeOH에 현탁시킨 다음, NaOMe (0.5 M)를 첨가하고, 실온에서 2일 동안 교반하였다. 반응액을 산성 수지로 중화시키고, 농축하여 건조하였다. 다음에, MR-에틸렌디아민 수지를 함유하는 n-부탄올에 생성물을 현탁시키고, 100 ℃로 24시간 동안 가열하였다. 고온 용액을 셀라이트 패드 상으로 여과한 후, 1:1 메탄올-물로 세척하였다. 합쳐진 여과액을 농축하여 건조함으로써, 생성물 18을 수득하였다.

지질키토올리고당 19의 합성:

말단 글루코사민 단위체 아민 기의 아미드화를 위하여, 생성물 18을 2E,9Z-헥사데카디에노산을 함유하는 최소한의 물에 용해시켰다. 에틸-(N,N-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 (1 당량) 및 N-하이드록시벤즈트리아졸 (1 당량)을 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 산성 수지의 컬럼으로 통과시키고, 여과액을 농축하여 건조함으로써, 생성물 19를 수득하였다.

실시예 12

지질키토올리고당 4분자체의 합성

실시예 8의 사당체 13 생성물(25 g)을 무수 메탄올 (900 ml)에 현탁시켰다. 나트륨 메톡사이드 용액 (0.5 M, 20 ml)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1일 동안 교반하여, 진한 백색의 침전물을 형성시켰다. 다음에, 반응 혼합물을 가열하여 환류시킴으로써, 모든 고체가 용해되도록 하였다. 72시간 환류시킨 후, 반응 플라스크에는 많은 양의 침전물이 다시 형성되었다. 가열을 중지하고, 플라스크를 냉각한 후, 침전된 물질을 여과하고, 메탄올로 세척하였다. 침전된 생성물의 중량은 11.2 g이었다. 양성자 NMR에 의해 이것을 생성물 20으로서 식별하였다.

에틸렌디아민 메리필드 수지(Merrifield resin) (152 g)를 함유하는 메탄올 (1 L)에서 5일 동안 생성물 20 (11.2 g)을 환류시켰다. 다음에, 가온된 반응 혼합물을 여과하고, 메탄올로 세척하였다. 반응되지 않은 출발 물질은 고체로서 남아 있는 반면, 메탄올 여과액은 생성물을 함유하고 있었다. 이것을 농축하여 건조하고, 고체를 아세트산 무수물 (6 ml) 및 트리에틸아민 (6 ml)를 함유하는 메탄올 (175 ml)에 현탁시킨 후, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 백색의 침전물이 플라스크에 형성되었으며, 이것을 여과하였다. 여과액을 H+ 수지 (10 g)로 처리하고, 여과한 후, 농축하여 건조함으로써, 생성물 21 (6.7 g)을 수득하였다. 양성자 NMR에 의해 이것을 생성물 21로서 식별하였다.

생성물 21을 테트라하이드로퓨란 (100 ml)에 현탁시키고, 아세트산의 1 M 용액 및 테트라부틸암모늄 플루오라이드 (각각 5 ml)를 첨가하였다. 실온에서 24시간 교반 후에도, 혼합물은 흐린 상태로 남아 있었다. 생성물의 용해를 돕기 위하여 N,N-디메틸포름아미드 (10 ml)를 첨가하고, 반응액을 65 ℃에서 3일 동안 교반 한 다음, 농축하여 건조하였다. 다음에, 생성되는 생성물을 메탄올 (100 ml)에 현탁시키고, 에틸렌디아민 메리필드 수지 (25 g)을 첨가하였다. 반응액을 75 ℃로 가열하고, 44시간 동안 교반하였다. 반응액을 실온으로 냉각시키고, 여과하였다. 생성물 22를 함유하는 여과액을 농축하여 건조하였다 (2.2 g). 양성자 NMR에 의해 이것을 생성물 22로서 식별하였다.

EDC (.28 g) 및 HOBt-H₂O (.20 g)을 함유하는 N,N-디메틸포름아미드 (10 ml) 중 지방산 C18:1 또는 C16:1 (.37 g)의 용액을 DMF 중 생성물 16 (1.0 g)의 현탁액에 첨가하였다. 추가적인 N,N-디메틸포름아미드 (10 ml)를 첨가하여 올리고머를 완전히 용해시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반한 다음, 80 ℃로 2시간 동안 가열하자, 진한 겔이 형성되었다. 겔을 메탄올로 희석하고, 생성물 (C18:1로부터는 생성물 23, 그리고 C16:1로부터는 생성물 24)을 함유하는 젤라틴성 물질을 여과하였다. 잔류물을 메탄올로 반복하여 세척하고, 이어서 물로 세척하였다. 여과지 상의 잔류물을 수집하여 건조함으로써, 생성물 23 (520 mg) 또는 생성물 24 (552 mg)를 수득하였다. 양성자 NMR에 의해 이것을 생성물 23 및 24로서 식별하였다.

Claims

a) 비양성자성 용매 중에서 구조 C의 화합물을 구조 B의 화합물과 혼합하고, 약 0 ℃ 내지 약 -78 ℃ 사이의 온도에서 용액을 교반하여 제1 혼합물을 형성시키는 것;

b) a)의 혼합물에 N-할로이미드에서 선택되는 제1 활성화제를 첨가하여 제2 혼합물을 형성시키는 것;

c) 제2 혼합물에 퍼플루오로알킬 술폰산에서 선택되는 제2 활성화제를 첨가하고, 임의로 메틸 퍼플루오로알킬 술포네이트에서 선택되는 반응물을 첨가하여 제3 혼합물을 형성시키는 것;

d) 약 0 ℃ 내지 약 -78 ℃ 사이의 온도에서 제3 혼합물을 반응시켜 에스테르 기 및 N-프탈이미도 기를 포함하는 생성물을 형성시키는 것;

e) d)의 생성물을 단리하는 것;

f) 단리된 e)의 생성물로부터 에스테르 기 및 N-프탈이미도 기를 제거함으로써 탈-에스테르화 및 탈-N-프탈이미도 생성물을 형성시키는 것;

g) f)의 생성물을 단리하는 것;

h) 단리된 g)의 생성물의 말단 당 단위체의 아미노 기를 화학식 R¹COX (여기서, 산 및 산 할로겐화물에 대하여 각각 X = OH 또는 할로겐화물이며, R¹은 H, C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 아르알킬, 모노, 디 또는 폴리알케닐, 모노, 디 또는 폴리알키닐 기에서 선택됨)의 산 또는 산 할로겐화물과 선택적으로 반응시켜 지질키토올리고당을 형성시키는 것; 및

i) 지질키토올리고당을 단리하는 것

을 포함하는, 구조 A를 가지는 지질키토올리고당 화합물의 합성 방법:

(여기서, 개별적인 기 R¹, R² 및 R³는 독립적으로 H 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 아르알킬, 모노, 디 또는 폴리알케닐, 모노, 디 또는 폴리알키닐 기에서 선택되며; R⁴는 단당류, 술페이트 및 포스페이트에서 선택되고; n은 0 내지 약 20임),

(여기서, R¹은 H, C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 및 아르알킬 기에서 선택됨),

(여기서, 개별적인 기 R¹ 및 R²는 독립적으로 H 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 및 아르알킬 기에서 선택되며; R⁴는 단당류, 술페이트 및 포스페이트에서 선택되고; n은 0 내지 약 19임).
제 1항에 있어서, 제1 활성화제가 N-할로숙신이미드인 방법.
제 2항에 있어서, N-할로숙신이미드가 N-요오도숙신이미드인 방법.
제 1항에 있어서, 퍼플루오로알킬 술폰산이 화학식 B의 화합물에 대하여 약 0.25 몰당량 이상의 양인 방법.
제 4항에 있어서, 퍼플루오로알킬 술폰산이 화학식 B의 화합물에 대하여 약 등몰당량의 양인 방법.
제 1항에 있어서, 퍼플루오로알킬 술폰산이 트리플산인 방법.
제 1항에 있어서, 메틸 퍼플루오로알킬술포네이트가 메틸트리플레이트인 방법.
제 1항에 있어서, a) 및 d)의 온도가 약 -20 ℃ 내지 약 -70 ℃인 방법.
제 1항에 있어서, a) 및 d)의 온도가 약 -50 ℃ 내지 약 -60 ℃인 방법.
제 1항에 있어서, e)의 생성물의 에스테르기가 알콜 중 금속 알콕사이드와의 트랜스에스테르화에 의해 제거되며, e)의 생성물의 N-프탈이미도 기가 환류 조건 하에서 아민 또는 디아민과 반응시킴으로써 제거되는 방법.
제 1항에 있어서, h)의 반응이 염기 촉매와 산 할로겐화물을 사용하여, 또는 카르보디이미드 및 N-하이드록시벤즈트리아졸에 의해 활성화된 지방산을 사용하여 수행되는 방법.
a) 구조 D의 화합물을 제공하는 것;

b) 구조 D 화합물의 에스테르 기 및 내부 N-프탈이미도 기를 제거하는 것;

c) 구조 D 화합물의 내부 당 단위체 상의 아미노 기를 아실화 반응물과 선택적으로 반응시켜 N-아실 유도체 생성물을 제조하는 것;

d) N-아실 유도체 생성물을 테트라-N-알킬 암모늄 플루오라이드와 반응시키고 이어서 환류 조건 하에서 아민 또는 디아민과 반응시켜, (c)의 N-아실 유도체 생성물의 말단 당 단위체 상의 실릴 기와 에스테르 및 N-프탈이미도 기를 제거함으로써, 탈-실릴화 및 탈-N-프탈이미드화 생성물을 생성시키는 것;

e) 염기 촉매의 존재 하에, 카르보디이미드 및 N-하이드록시벤즈트리아졸로 활성화된 지방산, 또는 화학식 R¹COX (여기서, X는 할로겐화물이며, R¹은 H 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 아르알킬, 모노, 디 또는 폴리알케닐, 모노, 디 또는 폴리알키닐 기에서 선택됨)의 산 할로겐화물을 사용하여 (d)의 탈-N-프탈이미드화된 생성물의 말단 아미노 기를 아실화함으로써, 지질키토올리고당을 형성시키는 것; 및

f) 지질키토올리고당을 단리하는 것

을 포함하는, 구조 A를 가지는 지질키토올리고당 화합물의 합성 방법:

(여기서, 개별적인 기 R¹, R² 및 R³는 독립적으로 H, 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 아르알킬, 모노, 디 또는 폴리알케닐, 모노, 디 또는 폴리알키닐 기에서 선택되며; R⁴는 단당류, 술페이트 및 포스페이트에서 선택되고; n은 0 내지 약 20임),

(여기서, R¹은 H, 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 및 아르알킬 기에서 선택됨).
제 12항에 있어서, (c)의 아실화제가 아세트산 무수물인 방법.
제 12항에 있어서, (d)의 테트라-N-알킬 암모늄 플루오라이드가 테트라-n-부틸 암모늄 플루오라이드이며, 디아민이 메리필드 수지에 결합된 에틸렌 디아민인 방법.
구조 B를 가지는 화합물:

(여기서, 개별적인 기 R¹ 및 R²는 독립적으로 H 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 및 아르알킬 기에서 선택되며; R⁴는 단당류, 술페이트 및 포스페이트에서 선택되고; n은 0 내지 약 19임).
구조 A로 표시되는 화학적 합성 지질키토올리고당을 포함하는 조성물:

(여기서, 개별적인 기 R¹ 및 R²는 독립적으로 H 및 C₁ 내지 C₂₀ 알킬, 아릴, 아르알킬, 모노, 디 또는 폴리알케닐, 모노, 디 또는 폴리알키닐 기에서 선택되며; R³는 C₁₂ 내지 C₂₀ 알킬, 모노, 디 또는 폴리알케닐, 및 모노, 디 또는 폴리알키닐 기에서 선택되고; R⁴는 단당류, 술페이트 및 포스페이트에서 선택되며; n은 0 내지 약 20임).
하기의 구조로 표시되는 화학적 합성 지질키토올리고당을 포함하는 조성물:

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하기의 구조로 표시되는 화학적 합성 지질키토올리고당을 포함하는 조성물:

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