CZ2010229A3

CZ2010229A3 - Efektivní zpusob biotinylace aminosloucenin pomocí syntézy na pevné fázi pro potreby afinitní chromatografie

Info

Publication number: CZ2010229A3
Application number: CZ20100229A
Authority: CZ
Inventors: Soural@Miroslav; Hlavác@Jan; Hradil@Pavel
Priority date: 2010-03-29
Filing date: 2010-03-29
Publication date: 2010-09-08
Also published as: CZ302669B6

Abstract

Imobilizované deriváty biotinu obecného vzorce 8, kde n predstavuje pocet ethylenoxy jednotek a nabývá hodnot 1-5, symbol Pol predstavuje polystyrenovou pryskyrici tvorenou kopolymerem styrenu a divinylbenzenu a symbol R predstavuje methyl, 4-methylfenyl, trifluoromethyl skupinu, a zpusob jejich prípravy syntézou na pevné fázi.

Description

Efektivní způsob biotinylace aminosloučenin pomocí syntézy na pevné fázi pro potřeby afinitní chromatografie.

Oblast techniky:

Vynález se týká přípravy a použití imobilizovaných derivátů biotinu s navázanými různě dlouhými řetězci polyethylenglykolu s využitím principu syntézy na pevné fázi. Popsaný koncept syntézy na pevné fázi umožňuje efektivní přípravu daných derivátů a jejich následné použití pro jednoduché navázání sloučenin obsahujících ve své struktuře reaktivní aminoskupinu. Takto derivatizované látky mohou být po odštěpení z pevné fáze použity pro zachycení na stacionární fází pokryté avidinem. Komplex vzniklý specifickou vazbou avidinbiotin případně streptavidin-biotin je pak metodou afinitní chromatografie využíván především ve farmaceutickém výzkumu při identifikaci molekulárních cílů potenciálních léčiv.

Dosavadní stav techniky

Derivatizace biologicky aktivních sloučenin molekulou biotinu je známý prostředek pro jejich studium za účelem identifikace enzymů, s kterými dané sloučeniny interagují, což výrazně přispívá ke zjištění mechanismu účinku těchto látek v buněčném systému. Biotinylované deriváty lze snadno imobilizovat metodou nekovalentní biospecifické interakce na chromatografické koloně vybavené stacionární fázi pokrytou avidinem/streptavidinem. Při následném použití mobilní fáze obsahující buněčný lyzát dochází k zachycení cílových enzymů na koloně, jejich následné eluci a identifikaci. Tento druh separační metody se nazývá afinitní chromatografie a patří mezi nej frekventovanější metody studia molekulárních cílů nových typů biologicky aktivních sloučenin (tj. potenciálních léčiv).

Za nej vhodnější typ derivátů biotinu používaných pro modifikaci látek za účelem jejich studia afinitní chromatografíí jsou považovány deriváty obecné struktury 1, kde lineární řetězec (tzv. raménko) sestávající se z různého počtu ethylenoxy jednotek je na jednom konci derivatizován biotincm, přičemž druhý konec řetězce je zakončen vhodnou funkční skupinou umožňující derivatizaci příslušné látky. Vhodný počet ethylenoxy jednotek (tj. délka raménka) není přesně definován, neboť se jedná o proměnlivou veličinu závislou na způsobu interakce mezi studovanou látkou a cílovým enzymem.

• · · · • · » ·

X = ΝΗ, Ο Υ = COOH, ΝΗ₂ OH, OSO₃Me, OSO₃Ph...

Pro derivatizaci látek obsahujících ve své struktuře reaktivní aminoskupinu jsou v literatuře nejčastěji popisovány deriváty 1 (nebo jejich analoga s alternativní strukturou raménka) obsahující terminální karboxylovou skupinu. Níže jsou uvedeny některé příklady takových derivátů.

V literatuře je hojně popsána příprava a použití derivátů 2 pomocí syntézy v roztoku. Některé z těchto derivátů jsou i komerčně dostupné.

Znázorněný typ raménka (tj. pouze na bázi uhlíkatého skeletu) však není považován pro účely afmitní chromatografie za zcela vhodný z důvodů jeho efektivního zkrácení způsobeného hydrofobními interakcemi methylenových skupin a nebude mu proto zde věnována další pozornost. Uvedeny budou pouze některé konkrétní příklady derivátů s raménkem na bázi ethylenoxy jednotek nebo deriváty s raménky podobné struktury, která jsou prostá hydrofobních interakcí a jsou obecně považována z pohledu struktury za optimální.

V literatuře je např. popsána příprava derivátu 3 v roztoku a jeho následné použití pro studium glykokonjugátů (McReynolds, Katherine D.; Hadd, Michael J.; Gervay-Hague, Jacquelyn, Bioconjugate Chemistry 1999, 10(6), 1021-1031).

• » • · s

Popsána je také syntéza derivátu 4 v roztoku a jeho použití pro studium protein-fosfoinositid vazebných interakcí (Gong, Denghuang; Smith, Matthew D.; Manna, Debasis; Bostic, Heidi E.; Cho, Wonhwa; Best, Michael D, Bioconjugate Chemistry 2009, 20(2), 310-316).

Derivát 5 s raménkem obsahujícím disulfídickou vazbu byl připraven syntézou v roztoku pomocí biotinu, ethylendiaminu a merkaptoethanolu ve výtěžku 72% a použit pro studium βlaktamáz. (Marchand-Brynaert, Jacqueline; Bouchet, Michele; Touillaux, Roland; Beauve, Cecile; Fastrez, Jacques, Tetrahedron 1996, 52(15), 5591-606).

Popsána je rovněž syntéza derivátu 6 s raménkem obsahujícím dvě ethylenoxy jednotky a další jednotku na bázi amidu. Derivát byl použit pro studium interakcí proteinů (TresterZedlitz, Michelle; Kamada, Katsuhiko; Burley, Stephen K.; Fenyoe, David; Chait, Brian T.; Muir, TomW, Journal of the Američan Chemical Society 2003, 125(9), 2416-2425).

• · · ·

Kromě derivátů s karboxylovou skupinou je v literatuře popsána např. i struktura sloučeniny 7 s terminálním reaktivním methansulfonovým esterem, který je rovněž vhodný pro derivatizaci aminosloučenin. Příprava derivátu 7 však není popsána, látka je sice komerčně dostupná, avšak pouze v miligramovém množství.

Podstata A^ynálezu

Předmětem předloženého vynálezu jsou imobilizované deriváty biotinu obecného vzorce 8

kde n představuje počet ethylenoxy jednotek a nabývá hodnot 1-5, symbol Pol představuje polystyrénovou pryskyřici tvořenou kopolymerem styrenu a divinylbenzenu a symbol R představuje methyl, 4-methylfenyl. trifluoromethyl skupinu.

• « · 1

Podstatou vynálezu je dále příprava daných derivátů pomocí syntézy na pevné fázi, přičemž tato syntéza zahrnuje následující kroky (viz. Schéma 1):

• Imobilizaci 2-(2-aminoethoxy)-ethanolu pomocí reduktivní aminace na polymerní pryskyřici obsahující navázaný 4-oxy-2-methoxybenzaldehyd za vzniku derivátu 9 • Acylaci derivátu 2-(2-aminoethoxy)-ethanolu 9 biotinem za vzniku sloučeniny 10 • Esterifikaci hydroxyskupiny ve sloučenině 10 pomocí chloridu kyseliny methansulfonové, /7-toluensulfonové nebo trifluoromethansulfonanhydridem za vzniku sloučeniny 8a • Reakci esteru sulfonové kyseliny 8a s alkalickými solemi diethylenglykolu, triethylenglykolu nebo tetraethylenglykolu za vzniku sloučeniny 11 • Esterifikaci hydroxyskupiny ve sloučenině 11 působením methansulfonylchloridu, ptoluensulfonylchloridu nebo trifluormethansulfonanhydridu za vzniku sloučenin 8b-d

Předmětem vynálezu je rovněž způsob použití derivátů 8a-d, kdy sloučeniny typu 8 jsou podrobeny reakci se sloučeninou obsahující primární nebo sekundární aminoskupinu za vzniku látek 12 a následně působením kyseliny trifluoroctové je odštěpen polymer za vzniku sloučenin 13.

Syntéza na pevné fází ve srovnání se syntézou v roztoku obecně poskytuje řadu výhod. Mezi největší výhody patří především jednoduché instrumentální vybavení a jednoduché experimentální provedení syntézy, dále snadná příprava malých množství látek (i při mnohastupňových syntézách) a zejména velmi jednoduchá izolace produktů syntézy. Zvláště poslední dvě jmenované výhody mají zásadní význam pro použití syntézy na pevné fázi pro účel popsaný ve vynálezu, neboť biotinylované látky pro studium afinitní chromatografií je často potřeba syntetizovat v omezeném množství, přičemž vlivem nepříznivých vlastností produktů může docházet ke značným ztrátám a obtížím při jejich izolaci.

To, že biotinylační jednotka je imobilizovaná na pevné fázi, tedy přináší výhody především v jednoduché a rychlé přípravě, snadné manipulaci s připravenými systémy a jednoduché finální izolaci cílových produktů. Vzhledem ktomu, že pouze některé typy biotinylačních jednotek pro derivatizaci látek v roztoku jsou komerčně dostupné a to většinou ' · ’ < V ,.

fc · ', , ;

···· ·· ·· ·· *» · ·ť v malém množství za nepříznivou cenu, představuje popsaný vynález efektivní způsob alternativního řešení dané problematiky.

V neposlední řadě je výhodou popsané metodiky její variabilita. Volbou reaktantů lze měnit sterické parametry cílových derivátů, tj. délku raménka, která může při provedení afinitní chromatografie značným způsobem ovlivňovat kvalitu interakce mezi studovanou látkou a cílovým enzymem. Jednoduchým způsobem tedy lze připravit a kombinovat jednotlivé typy biotinylačních jednotek.

Popsaný koncept syntézy na pevné fázi, který přináší výše uvedené praktické výhody jak při vlastní přípravě, tak při použití derivátů 8a-8d, nebyl dosud v literatuře popsán.

Schéma 1 • · · · • * • »

Příklady provedení vynálezu

Podstata přípravy a použití derivátů podle vynálezu je blíže objasněna v následujících příkladech. Tyto příklady mají pouze ilustrativní charakter a v žádném případě neomezují rozsah vynálezu.

Postup přípravy derivátů 8:

Příklad 1

Příprava mobilizovaného derivátu 8a (n = 1)

300 mg Aminomethylové pryskyřice vybavené BAL linkerem (loading systému 0.63 mmol/g) bylo suspendováno v roztoku 10% kyseliny octové v suchém ALV-dimethylformamidu (DMF) (3 ml) obsahujícího 1 mmol 2-(2-aminoethoxy)-ethanolu. Reakční směs byla třepána přes noc za laboratorní teploty. Poté byl přidán 1 mmol triacetoxyborohydridu sodného v roztoku 5% kyseliny octové v suchém DMF (1.5 ml). Reakční směs byla třepána 3 hodiny za laboratorní teploty, poté promyta 3 x DMF, následně třepána 10 min. s roztokem 10% piperidinu v DMF (3 ml), promyta 3 x DMF a 3 x dichloromethanem (DCM). Obdržená pryskyřice byla třepána v DMF (3 ml) obsahující 1 mmol 1-hydroxybenzotriazolu (BtOH), 1 mmol N,N'diisopropylkarbodiimidu (DIC) a 1 mmol biotinu přes noc za laboratorní teploty, poté byla pryskyřice promyta 3 x DMF a 3 x pyridinem. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0.2M roztoku methansulfonylchloridu v pyridinu (3 ml) dvě hodiny za laboratorní teploty, pak promyta 3 x suchým DMF, 3 x suchým DCM a vysušena v proudu dusíku.

Analýza produktu:

Vzhledem k tomu, že mesylester není zcela rezistentní vůči podmínkám štěpení z pevné fáze, je vhodnější provést nejprve derivatizaci modelovým aminem. 10 mg pryskyřice bylo třepáno v 0.5M roztoku piperidinu v DMF (1 ml) přes noc za laboratorní teploty, pak byla pryskyřice \ .λ; ·:.

• · · · · · 4 · «· , _s promyta 3 x DMF, 3 x DCM a třepána v 50%-ním roztoku kyseliny trifluoroctové (TFA) v DCM (0.5 ml). Poté byl vzorek odpařen dosucha v proudu dusíku a odparek analyzován pomocí HPLC-UV-MS, přičemž byl detekován odpovídající produkt, ESI-MS míz = 399.6, [M+H]⁺. čistota 97%.

Příklad 2

Příprava imobilizovaného derivátu 8b (n = 3)

300 mg Aminomethylové pryskyřice vybavené BAL linkerem (loading systému 0.63 mmol/g) bylo suspendováno v roztoku 10% kyseliny octové v suchém (DMF) (3 ml) obsahujícího 1 mmol 2-(2-aminoethoxy)-ethanolu. Reakční směs byla třepána přes noc za laboratorní teploty. Poté byl přidán 1 mmol tríacetoxyborohydridu sodného v roztoku 5% kyseliny octové v suchém DMF (1.5 ml). Reakční směs byla třepána 3 hodiny za laboratorní teploty, poté promyta 3 x DMF, následně třepána 10 min. s roztokem 10% piperidinu v DMF (3 ml), promyta 3 x DMF a 3 x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v DMF (3 ml) obsahující 1 mmol BtOH, 1 mmol DIC a 1 mmol biotinu přes noc za laboratorní teploty, poté byla pryskyřice promyta 3 x DMF a 3 x pyridinem. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0.2M roztoku methansulfonylchloridu v pyridinu (3 ml) dvě hodiny za laboratorní teploty, pak promyta 3 x suchým DMF. Obdržená pryskyřice byla suspendována v 1M roztoku diethylenglykolátu lithného v DMSO (3 ml) (roztok byl připraven smícháním ekvivalentu BuLi a triethylenglykolu za laboratorní teploty), třepána přes noc za laboratorní teploty, poté promyta 3 x DMF, třepána 10 minut s 20%-ním roztokem kyseliny octové v DMF, promyta 3x DMF a 3 x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0.2M roztoku methansulfonylchloridu v pyridinu (3 ml) dvě hodiny za laboratorní teploty, pak promyta 3 x suchým DMF, 3 x suchým DCM a vysušena v proudu dusíku.

Analýza produktu:

Vzhledem k tomu, že mesylester není zcela rezistentní vůči podmínkám štěpení z pevné fáze, je vhodnější provést nejprve derivatizaci modelovým aminem. 10 mg pryskyřice bylo třepáno v 0.5M roztoku piperidinu v DMF (1 ml) 120 min. přes noc, pak byla pryskyřice promyta 3 x DMF, 3 x DCM a třepána v 50%-ním roztoku TFA v DCM (0.5 ml). Poté byl vzorek odpařen dosucha v proudu dusíku a odparek analyzován pomocí HPLC-UV-MS , přičemž byl detekován odpovídající produkt, ESI-MS míz = 500.7, [M+H]⁺. čistota 95%.

Příklad 3

Příprava mobilizovaného derivátu 8c (n = 4)

HN

Pol

300 mg Aminomethylové pryskyřice vybavené BAL linkerem (loading systému 0.63 mmol/g) bylo suspendováno v roztoku 10% kyseliny octové v suchém DMF (3 ml) obsahujícího 1 mmol 2-(2-aminoelhoxy)-ethanolu. Reakční směs byla třepána přes noc za laboratorní teploty. Poté byl přidán 1 mmol triacetoxyborohydridu sodného v roztoku 5% kyseliny octové v suchém DMF (1.5 ml). Reakční směs byla třepána 3 hodiny za laboratorní teploty, poté promyta 3 x DMF, následně třepána 10 min. s roztokem 10% piperidinu v DMF (3 ml), promyta 3 x DMF a 3 x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v DMF (3 ml) obsahující 1 mmol BtOH, 1 mmol DIC a 1 mmol biotinu přes noc za laboratorní teploty, poté byla pryskyřice promyta 3 x DMF a 3 x pyridinem. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0.2M roztoku methansulfonylchloridu v pyridinu (3 ml) dvě hodiny za laboratorní teploty, pak promyta 3 x suchým DMF. Obdržená pryskyřice byla suspendována v 1M roztoku triethylenglykolátu lithného v DMSO (3 ml) (roztok byl připraven smícháním ekvivalentu BuLi a triethylenglykolu za laboratorní teploty), třepána přes noc za laboratorní teploty, poté promyta 3 x DMF, třepána 10 minut s 20%-ním roztokem kyseliny octové v DMF, promyta 3 x DMF a 3 x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0.2M roztoku methansulfonylchloridu v pyridinu (3 ml) dvě hodiny za laboratorní teploty, pak promyta 3 x suchým DMF, 3 x suchým DCM a vysušena v proudu dusíku.

Analýza produktu:

Vzhledem k tomu, že mesylester není zcela rezistentní vůči podmínkám štěpení z pevné fáze, je vhodnější provést nejprve derivatizaci modelovým aminem. 10 mg Pryskyřice bylo třepáno v 0.5M roztoku piperidinu v DMF (1 ml) 120 min. za laboratorní teploty, pak byla pryskyřice promyta 3 x DMF, 3 x DCM a třepána v 50%-ním roztoku TFA v DCM (0.5 ml). Poté byl vzorek odpařen dosucha v proudu dusíku a odparek analyzován pomocí HPLC-UV-MS , přičemž byl detekován odpovídající produkt, ESI-MS m/z = 531.7, [M+H]~. čistota 94%.

Příklad 4

Příprava imobilizovaného derivátu 8d (n = 5)

300 mg Aminomethylové pryskyřice vybavené BAL linkerem (loading systému 0.63 mmol/g) bylo suspendováno v roztoku 10% kyseliny octové v suchém DMF (3 ml) obsahujícího 1 mmol 2-(2-aminoethoxy)-ethanolu. Reakční směs byla třepána přes noc za laboratorní teploty. Poté byl přidán 1 mmol triacetoxyborohydridu sodného v roztoku 5% kyseliny octové v suchém DMF (1.5 ml). Reakční směs byla třepána 3 hodiny za laboratorní teploty, poté promyta 3 x DMF, následně třepána 10 min. s roztokem 10% piperidinu v DMF (3 ml), promyta 3 x DMF a 3 x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v DMF (3 ml) obsahující 1 mmol BtOH, 1 mmol DIC a 1 mmol biotinu přes noc za laboratorní teploty, poté byla pryskyřice promyta 3 x DMF a 3x pyridinem. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0.2M roztoku methansulfonylchloridu v pyridinu (3 ml) dvě hodiny za laboratorní teploty, pak promyta 3 x suchým DMF. Obdržená pryskyřice byla suspendována v 2M roztoku tetraethylenglykolátu sodného v DMSO (3 ml) (roztok byl připraven smícháním ekvivalentu NaH a tetraethylenglykolu za laboratorní teploty), třepána přes noc za laboratorní teploty, poté promyta 3 x DMF, třepána 10 minut s 20%-ním roztokem kyseliny octové v DMF, promyta 3 x DMF a 3 x DCM. Obdržená pryskyřice byla třepána v 0.2M roztoku methansulfonylchloridu v pyridinu (3 ml) dvě hodiny za laboratorní teploty, pak promyta 3 x suchým DMF, 3 x suchým DCM a vysušena v proudu dusíku.

• · · · • · • s e

Analýza produktu:

Vzhledem k tomu, že mesylester není zcela rezistentní vůči podmínkám štěpení z pevné fáze, je vhodnější provést nejprve derivatizaci modelovým aminem. 10 mg pryskyřice bylo třepáno v 0.5M roztoku piperidinu v DMF (1 ml) 120 min. za laboratorní teploty, pak byla pryskyřice promyta 3 x DMF, 3 x DCM a třepána v 50%-ním roztoku TFA v DCM (0.5 ml). Poté byl vzorek odpařen dosucha v proudu dusíku a odparek analyzován pomocí HPLC-UV-MS, přičemž byl detekován odpovídající produkt, ESI-MS m/z = 575.8, [M+H]⁺, čistota 93%.

Příklad 5

Postup použití derivátů 8:

Obecný postup derivatizace aminoderivátů použitím mobilizovaných derivátů 8:

250 mg Výchozí aminomethylové pryskyřice bylo podrobeno syntéze derivátu 8 dle výše uvedených postupů. Výsledná pryskyřice byla třepána s roztokem 1 mmol příslušného aminoderivátů ve DMSO (2.5 ml) přes noc za laboratorní teploty. Obdržená pryskyřice byla promyta 3 x DMF, 3 x DCM a poté třepána v 50%-ním roztoku TFA v DCM (2.5 ml). Poté byla pryskyřice odfiltrována, filtrát odpařen dosucha v proudu dusíku a odparek sonifikován v diethyletheru. Vysrážená pevná látka byla odsáta a promyta diethyletherem. V případě, že vzhledem k rozpustnosti látky nebylo možné produkt vysrážet diethyletherem, byl odparek rozpuštěn v chloroformu (5 ml) a protřepán s 5%-ním roztokem hydrogenuhličitanu sodného (5 ml). Organická vrstva byla oddělena, vysušena síranem sodným a zahuštěna dosucha. V obou případech se výtěžky pohybují v rozmezí 60-90% teorie.

Příklady použití:

Studovaný aminoderivát	Biotinylační jedntoka	Sloučenina 13 m/z ([M+H]⁺) (HPLC-UV-MS)	Sloučenina 13 Čistota (%) (HPLC-UV-MS)
Propylamin	8a	417.6	93
Benzylamin	8a	465.6	92
Aminopropanol	8a	433.6	94
Propylamin	8b	461.7	96
Benzylamin	8b	509.7	95
Aminopropanol	8b	477.6	95
Propylamin	8c	505.6	97
Benzylamin	8c	553.7	95
Aminopropanol	8c	521.6	93
Propylamin	8d	549.7	92
Benzylamin	8d	597.7	91
Aminopropanol	8d	565.7	90

13

Struktura vybraných derwátů 13 byla potvrzena pomocí Ha C NMR spektroskopie.

Průmyslová využitelnost

Imobilizované deriváty obecného vzorce 8 jsou vhodné pro efektivní derivatizaci sloučenin obsahujících vc své struktuře reaktivní aminoskupinu a mohou tak sloužit k rutinní derivatizaci takových sloučenin a následnému studiu vzniklého systému pomocí afinitní chromatografie. To je využitelné zejména ve farmaceutickém výzkumu při určování molekulárního cíle biologicky aktivních látek.

Claims

1, Imobilizované deriváty biotinu obecného vzorce 8 vyznačující se tím,

Patentové nároky že n představuje počet ethylenoxy jednotek a nabývá hodnot 1-5, symbol Pol představuje polystyrénovou pryskyřici tvořenou kopolymerem styrenu a divinylbenzenu a symbol R představuje methyl, 4-methylfenyl, trifluoromethyl skupinu.

2. Způsob přípravy derivátů podle nároku 1 vyznačující se tím, že sloučeniny obecného vzorce 8 se připravují syntézou na pevné fázi (polymeru)

3. Způsob přípravy podle nároku 2 vyznačující se tím, že syntéza zahrnuje kroky:

• Imobilizaci 2-(2-aminoethoxy)-ethanolu pomocí reduktivní aminace na polymemí pryskyřici obsahující navázaný 4-oxy-2-methoxybenzaldehyd za vzniku derivátu 9 • Acylaci derivátu 2-(2-aminoethoxy)-ethanolu 9 biotinem za vzniku sloučeniny 10 • Esterifíkaci hydroxyskupiny ve sloučenině 10 pomocí chloridu kyseliny methansulfonové, p-toluensulfonové nebo trifluoromethansulfonanhydridem za vzniku sloučeniny 8a • Reakci esteru sulfonové kyseliny 8a s alkalickými solemi diethylenglykolu, triethylenglykolu nebo tetraethylenglykolu za vzniku sloučeniny 11 • Esterifíkaci hydroxyskupiny ve sloučenině 11 působením methansulfonylchloridu, ptoluensulfonylchloridu nebo trifluormethansulfonanhydridu za vzniku sloučenin 8b-d í /

4. Způsob použití derivátů podle nároku 1 vyznačující se tím, že sloučeniny typu 8 jsou podrobeny reakci se sloučeninou obsahující primární nebo sekundární aminoskupinu za vzniku látek 12 a následně působením kyseliny trifluoroctové je odštěpen polymer za vzniku sloučenin 13