CN111187212B - 一种免洗型光亲和链接体及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种免洗型光亲和链接体及制备方法和应用，4‑[3‑(三氟甲基)‑3H‑双吖丙啶‑3‑基]苄胺盐酸盐与(R)‑2‑((叔丁氧基羰基)氨基)‑4‑戊烯酸在EDC·HCl的缩合下，得到带Boc保护基的含有碳碳双键的光亲和链接体中间体；将带Boc保护基的含有碳碳双键的光亲和链接体中间体在三氟乙酸的作用下脱除保护基得到免洗型光亲和链接体。本发明的免洗型光亲和链接体分子制备方法简单，易于实现，并且收率较高。本发明中的免洗型光亲和链接体分子可以对靶向识别分子进行化学共价修饰构建光亲合探针分子，进而通过光交联技术对其靶标分子进行特异性共价标记，最后通过生物正交反应点亮荧光，从而实现对靶标分子的示踪。

Description

一种免洗型光亲和链接体及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种免洗型光亲和链接体及制备方法和应用。
背景技术
生物正交反应，指的是那些能够在活体细胞或组织中能够在不干扰生物自身生化反应条件下可以进行。这类反应可以在生物体内的生理条件下发生，不会与生物体系中存在的各种活性物质发生副反应，也不会对生物体和目标生物分子产生损伤。近些年来，其主要被应用对活体生物大分子进行特异性标记。首先将可参与特殊反应的功能基团引入到生物大分子中，然后通过与带有互补反应基团的标记物进行反应，从而实现对细胞内活性生物大分子的标记，以扩展了对细胞内生物体系的理解。
光亲和标记技术(PAL)是结合现代分子生物学、细胞生物学、药物化学、分析化学等多学科的优势，运用合成的光亲和探针分子，在特定波长光的照射下产生高活性的中间体，其可以直接与药物分子特异性结合的蛋白质进行不可逆共价交联从而实现对药物靶标蛋白分子的捕获。它是分子水平上研究配体与受体相互作用的核心工具之一，对阐明配体与受体相互作用机理以及药物新靶点的发现都有着巨大的推动作用。
近些年来，光亲和标记技术常被应用于分子靶标的示踪及确证分析。其中在对靶标分子的示踪方面，构建的探针分子在实现共价光捕获靶标分子后，常通过炔基与带有荧光基团的叠氮这一类型的生物正交反应来实现靶标分子的示踪。但是，当通过引入荧光基团来进行靶标分自的示踪时常会出现以下问题：①背景干扰大；②操作繁琐；③易出现假阳性结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免洗型的光亲和链接体及制备方法和应用，该光亲和链接体分子用于化学修饰靶向识别分子，通过光亲和标记技术从而实现高效的示踪靶向识别分子的靶标。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种含有碳碳双键的免洗型光亲和链接体，该光亲和链接体结构式如下：
Figure BDA0002361431540000021
一种含有碳碳双键的免洗型光亲和链接体的制备方法，包括以下步骤：
a)4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐与(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-戊烯酸在EDC·HCl的缩合下，得到带Boc保护基的含有碳碳双键的光亲和链接体中间体；
b)将带Boc保护基的含有碳碳双键的光亲和链接体中间体在三氟乙酸的作用下脱除保护基得到免洗型光亲和链接体；免洗型光亲和链接体的结构如下：
Figure BDA0002361431540000022
本发明进一步的改进在于，所述步骤a)的具体过程为：
将(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-戊烯酸、EDC·HCl以及NHS溶于无水二氯甲烷中，于0℃下搅滴加三乙胺，反应2h后，加入4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐进行反应，得到带Boc保护基的含有碳碳双键的光亲和链接体中间体。
本发明进一步的改进在于，所述步骤b)的具体过程为：
将带Boc保护基的含有碳碳双键的光亲和链接体中间体，溶于无水二氯甲烷中，于0℃下滴加三氟乙酸，并在0℃下反应1h后，室温反应24h，得到含有碳碳双键的免洗型光亲和链接体。
一种光亲和探针，该探针包括上述的含有碳碳双键的免洗型光亲和链接体。
一种如上所述的光亲和探针在细胞成像中的应用。
本发明进一步的改进在于，所述细胞为EGFR-HEK293细胞。
一种如上所述的光亲和探针在细胞示踪定位中的应用。
本发明进一步的改进在于，所述细胞为EGFR-HEK293细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过将光亲和基团三氟甲基取代的双吖丙啶、碳碳双键生物正交手柄连接，获得免洗型光亲和链接体分子。该链接体分子能够化学修饰靶向识别分子进而构建靶向识别分子光亲和探针，接下来探针分子中的碳碳双键生物正交手柄与四唑结构进行点击反应以产生荧光，从而达到示踪靶向识别分子与其靶标的相互作用。本发明的免洗型光亲和链接体分子制备方法简单，易于实现，并且收率较高。
本发明中的免洗型光亲和链接体分子可以对靶向识别分子进行化学共价修饰构建光亲合探针分子，进而通过光交联技术对其靶标分子进行特异性共价标记，最后通过生物正交反应点亮荧光，从而实现对靶标分子的示踪。该方法不需额外引入荧光分子，只有通过生物正交反应后才可以产生荧光，不需要洗涤除去过量的荧光分子，即背景干扰低，示踪准确度高，同时避免假阳性结果的出现，可以改善传统的生物正交反应引入荧光分子背景干扰大、操作繁琐的缺点。本发明的免洗型光亲和链接体能够用于构建生物大分子探针以及验证该探针进行示踪的可行性。
附图说明
图1为本发明提供的免洗型光亲和链接体的合成路线图。
图2为本发明提供的免洗型光亲和链接体与四氮唑化合物的荧光点亮合成路线图。
图3为细胞成像结果。
图1中，化合物1为4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐，化合物2为(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-戊烯酸，化合物3为(R)-(5-氧代-5-((4-(3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基)苄基)氨基)氨基-1-戊-3-基)氨基甲酸叔丁酯。
试剂与条件：(a)EDC·HCl,NHS,TEA,DCM,0℃to rt,24h；(b)TFA,DCM,0℃to rt,24h。
图2中，化合物1为(R)-(5-氧代-5-((4-(3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基)苄基)氨基)氨基-1-戊-3-基)氨基甲酸叔丁酯，化合物2为2-(4-甲氧基苯基)-5-苯基-2H-四唑。
试剂与条件：302nmUV，30min。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明通过使用4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐、(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-戊烯酸合成免洗型光亲和链接体分子该链接体可以用于化学修饰生物大分子，通过光亲和标记及生物正交反应高效标记靶标分子。
本发明提供的免洗型光亲和链接体的结构如下：
Figure BDA0002361431540000041
免洗型光亲和链接体
本发明所述的免洗型光亲和链接体名称如下：
(R)-3-氨基-N-(4-(3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基)苄基)-4-戊烯酰胺。
下面结合图1中所示的合成路线和具体的合成实施例来详细说明本发明提供的免洗型光亲合探针的光亲和链接体的制备方法。
参见图1，一种免洗型光亲和链接体分子的合成路线，包括以下步骤：
a)4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐与(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-戊烯酸在EDC·HCl的缩合下，得到含有带碳碳双键的中间体；
b)将带Boc保护基的含有碳碳双键的光亲和链接体中间体在三氟乙酸的作用下脱除保护基得到目标光亲和链接体。
所述步骤a)的具体操作为：
将(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-戊烯酸、EDC·HCl、NHS溶于无水二氯甲烷中，0℃下搅拌一段时间待体系冷却后，缓慢滴加三乙胺，反应2h后，加入4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐进行反应，得到含有碳碳双键的中间体粗品，经饱和碳酸氢钠洗涤三次、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥有机相，柱色谱分离即得；
所述步骤b)的具体操作为：
将带Boc保护基的含有碳碳双键的光亲和链接体中间体，溶于无水二氯甲烷中，0℃下搅拌待体系冷却，缓慢滴加三氟乙酸，在0℃下反应1h后，室温反应24h即得含有碳碳双键的免洗型光亲和链接体粗品，经饱和碳酸氢钠调节体系pH至中性，经萃取收集有机相，分别经饱和氯化钠、无水硫酸钠干燥洗涤有机相，减压旋干即得目标产物。
参见图2，免洗型光亲和链接体与四氮唑化合物的荧光点亮合成；
将2-(4-甲氧基苯基)-5-苯基-2H-四唑、免洗光亲和链接体溶于乙酸乙酯中，302nmUV照射30min，将反应物真空浓缩即得含有荧光片段的化合物。
上述免洗型光亲和链接体在示踪靶标分子方面的应用。
实施例1
该免洗型光亲和链接体中的制备过程如图1所示，
a)4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐与(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-戊烯酸在EDC·HCl的缩合下，得到含有带碳碳双键的中间体，具体过程如下：
将(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-戊烯酸(0.0430g,0.2000mmol)、EDC·HCl(0.0500g,0.2400mmol)、NHS(0.0300g,0.2400mmol)溶于3mL无水二氯甲烷中，0℃下搅拌一段时间待体系冷却后，缓慢滴加三乙胺(60.00μL,0.4400mmol)，反应2h后，加入4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐(0.05g,0.2000mmol)进行反应，得到含有碳碳双键中间体粗品，经饱和碳酸氢钠洗涤三次、饱和氯化钠洗涤、无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸去溶剂，得粗品，用层析柱分离纯化粗品，使用乙酸乙酯洗脱得到目标化合物，重0.04g，收率41.7％，得到带有碳碳双键的中间体；
LC-MS(ESI,m/z):413.43[M+H]+，411.37[M-H]—。
b)将带Boc保护基的含有碳碳双键的光亲和链接体中间体在三氟乙酸的作用下脱除保护基得到目标光亲和链接体，具体过程如下：
在0℃下，将带Boc保护基的含有碳碳双键的光亲和链接体中间体(0.0400g，0.0971mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中，0℃下搅拌待体系冷却，缓慢滴加三氟乙酸(3mL)，在0℃下反应1h后，室温反应24h即得含有碳碳双键的免洗型光亲和链接体粗品，经饱和碳酸氢钠调节体系pH至中性，经二氯甲烷萃取收集有机相，有机相分别经饱和氯化钠、无水硫酸钠干燥洗涤有机相，减减压蒸去溶剂，得到目标化合物，重0.02g，收率66.02％。
LC-MS(ESI,m/z):313.10[M+H]+，311.20[M-H]—。
实施例2
本发明的探针对细胞示踪定位或成像的原理为：生物正交反应路线如图2所示，反应具体过程如下：
将2-(4-甲氧基苯基)-5-苯基-2H-四唑(0.0800g,0.3200mmol)，免洗光亲和链接体(0.0100g,0.0320mmol)溶于6ml乙酸乙酯中，302nm UV照射30min，将反应物真空浓缩，柱色谱分离(P:E＝1:1)，产物约为0.04mg，产率为23.4％。
LC-MS(ESI,m/z):535.10[M+H]+，533.35[M-H]—。
实施例3
含有碳碳双键的免洗型光亲和链接体在光亲和标记技术方面的初步应用：
本发明以细胞因子作为靶向识别分子，利用免洗型光亲和链接体化学修饰细胞因子构建了光亲和探针分子，并且利用所构建的光亲合探针分子对一些高表达EGFR受体的细胞进行示踪定位成像分析。
其中，细胞因子为转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
具体的，EGF细胞因子光亲合探针的构建过程为：(1)配制I液：EGF细胞因子溶于1mL三蒸水中，4℃保存2h；(2)配制II液：将光亲和链接体、EDC、NHS溶于1mL三蒸水中。4℃活化2h；将II液缓慢加入I液中，4℃反应24h后，4℃下透化24h，冷冻干燥即得EGF光亲和探针分子。
含有碳碳双键的免洗型光亲和链接体在细胞原位荧光示踪标记方面的应用：
利用上述设计合成的EGF光亲合探针分子能够对高表达EGFR-HEK293细胞进行细胞成像分析。
具体细胞成像步骤如下：
1.细胞种板：每孔细胞密度为3.3*105细胞/ml，37℃孵育过夜；
2.细胞给药：每孔探针浓度为1μM，5μL，37℃孵育1h；
3.洗涤：利用PBS洗涤三次高表达EGFR-HEK293细胞，除去过量探针分子；
4.光交联及细胞固定：洗涤完成后，将高表达EGFR-HEK293细胞置于距离紫外等3cm下的冰盘中紫外照射30min,光交联完成后，在室温下，在细胞中加入1ml 3.7％多聚甲醛(925ul4％多聚甲醛+75ul PBS)，固定30分钟，用PBS洗涤两次(轻微搅拌1-2分钟)，在室温下，用含2％BSA的PBS(含0.05％Tween-20)封闭30分钟，并用PBS(含0.05％Tween-20)洗涤两次。每次5分钟，轻轻晃动。
5.点击成像：各孔中，分别按顺序添加以下试剂：175μL PBS,20μLPBS，震荡混合,302nm UV光照射30min。
6.DAPI复染：各孔中均加入10μL 1μg/ml DAPI，染色10min，PBS洗涤3次，20min/次
7.封片：在各组加入5μL抗荧光淬灭封片剂，周围加指甲油封片。
8.荧光显微镜进行检测。
参见图3，可以看出，本发明的EGF免洗型光亲合探针分子能够对高表达EGFR-HEK293细胞进行细胞成像。
本发明提出了一类用于免洗型的光亲和链接体，其建立在一类可发生荧光点亮的生物正交反应的基础上，在光反应活性基团三氟甲基苯基双吖丙啶的基础上引入荧光点亮生物正交手柄碳碳双键，通过其与四氮唑化合物的生物正交反应来点亮荧光，从而实现在光捕获后的靶标示踪分析，以消除原有的需要引入荧光基团的生物正交反应的示踪分析的缺点，从而减少背景干扰，简化操作，同时避免假阳性结果的出现。

Claims (5)

1.一种含有碳碳双键的免洗型光亲和链接体，其特征在于，该光亲和链接体结构式如下：
Figure FDA0002937261810000011
2.一种含有碳碳双键的免洗型光亲和链接体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐与(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-戊烯酸在EDC·HCl的缩合下，得到带Boc保护基的含有碳碳双键的光亲和链接体中间体；
b)将带Boc保护基的含有碳碳双键的光亲和链接体中间体在三氟乙酸的作用下脱除保护基得到免洗型光亲和链接体；免洗型光亲和链接体的结构如下：
Figure FDA0002937261810000012
3.根据权利要求2所述的一种含有碳碳双键的免洗型光亲和链接体的制备方法，其特征在于，所述步骤a)的具体过程为：
将(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-戊烯酸、EDC·HCl以及NHS溶于无水二氯甲烷中，于0℃搅拌下滴加三乙胺，反应2h后，加入4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苄胺盐酸盐进行反应，得到带Boc保护基的含有碳碳双键的光亲和链接体中间体。
4.根据权利要求2所述的一种含有碳碳双键的免洗型光亲和链接体的制备方法，其特征在于，所述步骤b)的具体过程为：
将带Boc保护基的含有碳碳双键的光亲和链接体中间体，溶于无水二氯甲烷中，于0℃下滴加三氟乙酸，并在0℃下反应1h后，室温反应24h，得到含有碳碳双键的免洗型光亲和链接体。
5.一种光亲和探针，其特征在于，该探针包括权利要求1所述的含有碳碳双键的免洗型光亲和链接体。
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